Name: 유세포측정에 의한 유독성 응력 후 γH2AX 및 세포자멸의 세포 주기별 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: 학습하세요 유세포측정을 이용한 γH2AX 및 세포자멸의 세포 주기별 분석 방법으로 DNA 이중가닥 파손과 세포 주기 분포를 정량적으로 평가합니다. 이 기법은 방사선생물학 및 임상 종양학에서 치료 반응과 부작용을 연구하는 데 활용됩니다.

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우리는 독일 암 연구 센터 (DKFZ)의 흐름 세포 측정 시설 팀에게 그들의 지원에 감사드립니다.

<ol><li>Jensen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+non-small+cell+lung+cancer+with+intensity-modulated+radiation+therapy+in+combination+with+cetuximab%3A+the+NEAR+protocol+%28NCT00115518%29%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Treatment of non-small cell lung cancer with intensity-modulated radiation therapy in combination with cetuximab: the NEAR protocol (NCT00115518).</a> BMC Cancer. 6, 122(2006).</li>
<li>Oertel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Glioblastoma+and+Carcinoma+Xenograft+Tumors+Treated+by+Combined+Radiation+and+Imatinib+%28Gleevec%29%5BTitle%5D)+AND+%22Strahlentherapie+und+Onkologie%22%5BJournal%5D)">Human Glioblastoma and Carcinoma Xenograft Tumors Treated by Combined Radiation and Imatinib (Gleevec).</a> Strahlentherapie und Onkologie. 182 (7), 400-407 (2006).</li>
<li>Timke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+Vascular+Endothelial+Growth+Factor+Receptor%2FPlatelet-Derived+Growth+Factor+Receptor+Inhibition+Markedly+Improves+Radiation+Tumor+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Combination of Vascular Endothelial Growth Factor Receptor/Platelet-Derived Growth Factor Receptor Inhibition Markedly Improves Radiation Tumor Therapy.</a> Clinical Cancer Research. 14 (7), 2210-2219 (2008).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimodal+glioblastoma+treatment+consisting+of+concurrent+radiotherapy%2C+temozolomide%2C+and+the+novel+TGF-%CE%B2+receptor+I+kinase+inhibitor+LY2109761%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Trimodal glioblastoma treatment consisting of concurrent radiotherapy, temozolomide, and the novel TGF-β receptor I kinase inhibitor LY2109761.</a> Neoplasia. 13 (6), 537-549 (2011).</li>
<li>Blattmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suberoylanilide+hydroxamic+acid+affects+expression+in+osteosarcoma%2C+atypical+teratoid+rhabdoid+tumor+and+normal+tissue+cell+lines+after+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Strahlentherapie+und+Onkologie%22%5BJournal%5D)">Suberoylanilide hydroxamic acid affects expression in osteosarcoma, atypical teratoid rhabdoid tumor and normal tissue cell lines after irradiation.</a> Strahlentherapie und Onkologie. 188 (2), 168-176 (2012).</li>
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<li>Rodgers, K., McVey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Error-Prone+Repair+of+DNA+Double-Strand+Breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Error-Prone Repair of DNA Double-Strand Breaks.</a> Journal of Cellular Physiology. 231 (1), 15-24 (2016).</li>
<li>Ciccia, A., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+Damage+Response%3A+Making+It+Safe+to+Play+with+Knives%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The DNA Damage Response: Making It Safe to Play with Knives.</a> Molecular Cell. 40 (2), 179-204 (2010).</li>
<li>Rothkamm, K., Krüger, I., Thompson, L. H., Löbrich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+of+DNA+double-strand+break+repair+during+the+mammalian+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Pathways of DNA double-strand break repair during the mammalian cell cycle.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (16), 5706-5715 (2003).</li>
<li>Escribano-Díaz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cell+Cycle-Dependent+Regulatory+Circuit+Composed+of+53BP1-RIF1+and+BRCA1-CtIP+Controls+DNA+Repair+Pathway+Choice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">A Cell Cycle-Dependent Regulatory Circuit Composed of 53BP1-RIF1 and BRCA1-CtIP Controls DNA Repair Pathway Choice.</a> Molecular Cell. 49 (5), 872-883 (2013).</li>
<li>Bakr, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+crosstalk+between+DNA+damage+response+proteins+53BP1+and+BRCA1+regulates+double+strand+break+repair+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Radiotherapy+and+Oncology%22%5BJournal%5D)">Functional crosstalk between DNA damage response proteins 53BP1 and BRCA1 regulates double strand break repair choice.</a> Radiotherapy and Oncology. 119 (2), 276-281 (2015).</li>
<li>Mladenov, E., Magin, S., Soni, A., Iliakis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double-strand-break+repair+in+higher+eukaryotes+and+its+role+in+genomic+instability+and+cancer%3A+Cell+cycle+and+proliferation-dependent+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA double-strand-break repair in higher eukaryotes and its role in genomic instability and cancer: Cell cycle and proliferation-dependent regulation.</a> Seminars in Cancer Biology. 37-38, 51-64 (2016).</li>
<li>Lopez Perez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+response+of+clinical+carbon+ion+versus+photon+radiation+in+human+glioblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Radiotherapy+and+Oncology%22%5BJournal%5D)">DNA damage response of clinical carbon ion versus photon radiation in human glioblastoma cells.</a> Radiotherapy and Oncology. 133, 77-86 (2019).</li>
<li>Oertel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+suberoylanilide+hydroxamic+acid+with+heavy+ion+therapy+shows+promising+effects+in+infantile+sarcoma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+oncology%22%5BJournal%5D)">Combination of suberoylanilide hydroxamic acid with heavy ion therapy shows promising effects in infantile sarcoma cell lines.</a> Radiation oncology. 6 (1), 119(2011).</li>
<li>Blattmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suberoylanilide+hydroxamic+acid+affects+%CE%B3H2AX+expression+in+osteosarcoma%2C+atypical+teratoid+rhabdoid+tumor+and+normal+tissue+cell+lines+after+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Strahlentherapie+und+Onkologie%22%5BJournal%5D)">Suberoylanilide hydroxamic acid affects γH2AX expression in osteosarcoma, atypical teratoid rhabdoid tumor and normal tissue cell lines after irradiation.</a> Strahlentherapie und Onkologie. 188 (2), 168-176 (2012).</li>
<li>Thiemann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+efficacy+of+the+histone+deacetylase+inhibitor+suberoylanilide+hydroxamic+acid+in+combination+with+radiotherapy+in+a+malignant+rhabdoid+tumor+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+Oncology%22%5BJournal%5D)">In vivo efficacy of the histone deacetylase inhibitor suberoylanilide hydroxamic acid in combination with radiotherapy in a malignant rhabdoid tumor mouse model.</a> Radiation Oncology. 7 (1), 52(2012).</li>
<li>Nicolay, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+retain+their+defining+stem+cell+characteristics+after+exposure+to+ionizing+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Oncology+Biology+Physics%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells retain their defining stem cell characteristics after exposure to ionizing radiation.</a> International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 87 (5), 1171-1178 (2013).</li>
<li>Nicolay, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+are+resistant+to+carbon+ion+radiotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells are resistant to carbon ion radiotherapy.</a> Oncotarget. 6 (4), 2076-2087 (2015).</li>
<li>Nicolay, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+exhibit+resistance+to+topoisomerase+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+letters%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells exhibit resistance to topoisomerase inhibition.</a> Cancer letters. 374 (1), 75-84 (2016).</li>
<li>Nicolay, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+maintain+their+defining+stem+cell+characteristics+after+treatment+with+cisplatin%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells maintain their defining stem cell characteristics after treatment with cisplatin.</a> Scientific Reports. 6, 20035(2016).</li>
<li>Nicolay, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+are+sensitive+to+bleomycin+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells are sensitive to bleomycin treatment.</a> Scientific Reports. 6, 26645(2016).</li>
<li>Rühle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cisplatin+radiosensitizes+radioresistant+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Cisplatin radiosensitizes radioresistant human mesenchymal stem cells.</a> Oncotarget. 8 (50), 87809-87820 (2017).</li>
<li>Münz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mesenchymal+stem+cells+lose+their+functional+properties+after+paclitaxel+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Human mesenchymal stem cells lose their functional properties after paclitaxel treatment.</a> Scientific Reports. 8 (1), 312(2018).</li>
<li>Rühle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Radiation+Resistance+of+Human+Multipotent+Mesenchymal+Stromal+Cells+Is+Independent+of+Their+Tissue+of+Origin%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Oncology+Biology+Physics%22%5BJournal%5D)">The Radiation Resistance of Human Multipotent Mesenchymal Stromal Cells Is Independent of Their Tissue of Origin.</a> International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 100 (5), 1259-1269 (2018).</li>
<li>Dean, P. N., Jett, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mathematical+analysis+of+DNA+distributions+derived+from+flow+microfluorometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mathematical analysis of DNA distributions derived from flow microfluorometry.</a> Journal of Cell Biology. 60 (2), 523-527 (1974).</li>
<li>Fox, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+for+the+computer+analysis+of+synchronous+DNA+distributions+obtained+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">A model for the computer analysis of synchronous DNA distributions obtained by flow cytometry.</a> Cytometry. 1 (1), 71-77 (1980).</li>
<li>Costes, S. V., Boissière, A., Ravani, S., Romano, R., Parvin, B., Barcellos-Hoff, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+features+that+discriminate+between+foci+induced+by+high-+and+low-LET+radiation+in+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+Research%22%5BJournal%5D)">Imaging features that discriminate between foci induced by high- and low-LET radiation in human fibroblasts.</a> Radiation Research. 165 (5), 505-515 (2006).</li>
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<li>Lopez Perez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superresolution+light+microscopy+shows+nanostructure+of+carbon+ion+radiation-induced+DNA+double-strand+break+repair+foci%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB%22%5BJournal%5D)">Superresolution light microscopy shows nanostructure of carbon ion radiation-induced DNA double-strand break repair foci.</a> FASEB. 30 (8), 2767-2776 (2016).</li>
<li>Schipler, A., Iliakis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double-strand-break+complexity+levels+and+their+possible+contributions+to+the+probability+for+error-prone+processing+and+repair+pathway+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">DNA double-strand-break complexity levels and their possible contributions to the probability for error-prone processing and repair pathway choice.</a> Nucleic Acids Research. 41 (16), 7589-7605 (2013).</li>
<li>Stenerlow, B., Hoglund, E., Carlsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+fragmentation+by+charged+particle+tracks%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Space+Research%22%5BJournal%5D)">DNA fragmentation by charged particle tracks.</a> Advances in Space Research. 30 (4), 859-863 (2002).</li>
<li>Friedland, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+track-structure+based+evaluation+of+DNA+damage+by+light+ions+from+radiotherapy-relevant+energies+down+to+stopping%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Comprehensive track-structure based evaluation of DNA damage by light ions from radiotherapy-relevant energies down to stopping.</a> Scientific Reports. 7, 45161(2017).</li>
<li>Pang, D., Chasovskikh, S., Rodgers, J. E., Dritschilo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+DNA+Fragments+Are+a+Hallmark+of+Heavy+Charged-Particle+Irradiation+and+May+Underlie+Their+Greater+Therapeutic+Efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Short DNA Fragments Are a Hallmark of Heavy Charged-Particle Irradiation and May Underlie Their Greater Therapeutic Efficacy.</a> Frontiers in Oncology. 6, 130(2016).</li>
<li>Böcker, W., Iliakis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+Methods+for+analysis+of+foci%3A+validation+for+radiation-induced+gamma-H2AX+foci+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+Research%22%5BJournal%5D)">Computational Methods for analysis of foci: validation for radiation-induced gamma-H2AX foci in human cells.</a> Radiation Research. 165 (1), 113-124 (2006).</li>
<li>Löbrich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B3H2AX+foci+analysis+for+monitoring+DNA+double-strand+break+repair%3A+Strengths%2C+limitations+and+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">γH2AX foci analysis for monitoring DNA double-strand break repair: Strengths, limitations and optimization.</a> Cell Cycle. 9 (4), 662-669 (2010).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

추천된 방법은 사용하기 쉽고 이중 가닥 브레이크(DSB) 유도 및 수리, 세포 주기 효과 및 세포 사멸을 포함한 DNA 손상 반응의 빠르고 정확하며 재현 가능한 측정을 제공합니다. 이러한 끝점의 조합은 개별 적인 비약적인 비고지 보다는 그들의 상호 관계의 더 완전한 그림을 제공합니다. 이 방법은 방사선 생물학, 치료 및 보호, 그리고 종양학 (예를 들어, 환경 위험 요소 평가, 약물 스크리닝 및 유전 평가)의 분야에서 포괄적 인 유전 독성 분석법으로 널리 적용 될 수 있습니다. 종양 세포의 불안정성).
이 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 셀의 고정입니다. 명확하게 정의된 세포 집단과 다른 세포 주기 단계의 최적 분해능을 가진 깨끗한 견본을 장악하기 위하여는, 배양 용기에서 분리하고 완전히 둥근 모양을 형성하기 위하여 부착된 세포를 충분히 시간을 주는 것이 중요합니다. 세포는 세포 덩어리없이 단일 세포 현탁액으로 고정 용액으로 옮겨져야한다. 그(것)들을 분리하기 위하여는, 세포는 ...

종양학의 목표는 정상적인 세포를 손상시키지 않고 암세포를 죽이거나 비활성화하는 것입니다. 많은 치료는 직접 또는 간접적으로 암세포에서 유전자 독성 스트레스를 유도하지만, 일부는 정상 세포에서 확장됩니다. 화학요법 또는 표적 약물은 종종 방사선 요법과 결합되어 조사된종양 1, 2,3,4,5의방과민성을 향상시킵니다. 방사선 선량은 정상적인 조직 손상을 최소화합니다.
이온화 방사선 및 기타 유독성 제제는 염기 수정, 가닥 가교 및 단일 또는 이중 가닥 파손을 포함한 다양한 종류의 DNA 손상을 유발합니다. DNA 이중 가닥 나누기 (DSBs)는 가장 심각한 DNA 병변이고 그들의 유도는 방사선과 방사선 화학요법에 있는 각종 세포 성 약의 세포 살해 효력의 열쇠입니다. DSB는 게놈의 무결성을 해칠뿐만 아니라 돌연변이 6,7의형성을촉진합니다. 따라서, 다른 DSB 수리 경로, 및 세포 사멸 과 같은 돌이킬 수없는 손상된 세포를 제거하는 메커니즘은 진화 중에 개발되었다. 전체 DNA 손상 반응(DDR)은 DNA 손상 인식 및 세포 주기 검거로부터 DNA 복구, 프로그램된 세포 사멸 또는 수리 실패시불활성화에 이르는 신호 경로의 복잡한 네트워크에 의해 조절된다 8.
제시된 유동 세포 측정 방법은 DSB 유도 및 수리뿐만 아니라 수리 실패의 결과를 포함하는 하나의 포괄적 인 분석에서 유독성 스트레스 후 DDR을 조사하기 위해 개발되었습니다. 그것은 고전적인 subG1 분석 및 caspase-3 활성화의 더 구체적인 평가를 사용하여 세포 주기 및 세포 사멸의 유도의 분석과 널리 적용되는 DSB 마커 γH2AX의 측정을 결합합니다.
하나의 분석에서 이러한 엔드포인트의 조합은 시간, 인건비 및 비용 비용을 감소시킬 뿐만 아니라 Caspase-3 활성화뿐만 아니라 DSB 유도 및 수리의 세포 주기별 측정을 가능하게 합니다. 이러한 분석은 독립적으로 수행 된 분석으로는 불가능하지만, 유독성 스트레스 후 DNA 손상 반응에 대한 포괄적 인 이해를 위해 매우 관련이 있습니다. 세포성 화합물과 같은 많은 항암제는 세포 분열에 대해 지시되며 그 효율은 세포 주기 단계에 크게 의존합니다. 상이한 DSB 수리 공정의 가용성은 또한 수리 정확도에 중요한 세포 주기 단계 및 경로 선택에 따라 달라지며, 차례로셀9,10,11의운명을 결정합니다. 12. 또한, DSB 수준은 유독성 화합물 또는 방사선의 투여량뿐만 아니라 세포의 DNA 함량에 의존하기 때문에 DSB 수준의 세포 주기별 측정은 풀화 분석보다 더 정확하다.
이 방법은 교모세포종13에서 내성 메커니즘을 극복하고 골육종14,15에서 이온화 방사선과 표적 약물 간의 상호 작용을 해부하기 위해 다른 방사선 요법의 효능을 비교하는 데 사용되었습니다. 및 비정형 테라로이드 라브도이드 암16. 또한, 기재된 방법은 중간엽 줄기세포17,18,19,20,21, 22,23,24,이는 치료 유도 정상 조직 손상의 수리에 필수적이며 재생 의학에서 잠재적 인 응용 프로그램을 갖는다.

<table><tbody><tr><td>1,000 &마이크로; L 필터 팁</td><td>Nerbe plus</td><td>07-693-8300</td><td></td></tr><tr><td>100-1,000 &micro; L 피펫</td><td>Eppendorf</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>12 mm x 75 mm 튜브, Cell Strainer Cap 포함, 35 &micro; m 메쉬 기공 크기</td><td>BD Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 튜브</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; L 필터 팁</td><td>Nerbe 플러스</td><td>07-662-8300</td><td></td></tr><tr><td>20-200 &마이크로; L 피펫</td><td>Eppendorf</td><td>3123000055</td><td></td></tr><tr><td>4',6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>200 &micro에서 물에 용해; g/mL 및 부분 표본을 -20 &deg로 저장합니다. C</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-H2A.X Phospho (Ser139) 항체, RRID: AB_2248011</td><td>BioLegend</td><td>613406</td><td>1:20</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Rabbit Anti-Active Caspase-3 항체, AB_1727414</td><td>BD Pharmingen</td><td>560626</td><td>Dilute 1:20</td></tr><tr><td>BD FACSClean solution</td><td>BD Biosciences</td><td>340345</td><td>측정 후 세포분석기 세척 루틴</td></tr><tr><td>BD FACSRinse solution</td><td>BD Biosciences</td><td>340346</td><td>측정 후 세포분석기 세척 루틴</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Biochrom</td><td>L 182</td> 1<td>배 농도로 물에 용해</td></tr><tr><td>안정적인 글루타민을 함유한 Dulbecco's Modified Eagle's Medium</td><td>Biochrom</td><td>FG 0415</td><td>프로토콜에 사용되는 예시 세포주에 대한 일상적인 세포 배양 재료</td></tr><tr><td>에탄올 앱솔루트</td><td>VWR</td><td>20821.330</td><td></td></tr><tr><td>Excel 소프트웨어</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS Superior (소 태아 혈청)</td><td>Biochrom</td><td>S 0615</td> FlowJo v10 소프트웨어 LLC 온라인 주문 <td>프로토콜에 사용되는 예시 세포주를 위한 일상적인 세포 배양 재료</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td>염색된 샘플에서 현미경 슬라이드의 선택적 준비를 위한 임베딩 배지</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> 접힌 셀룰로오스 필터, 등급 3hw NeoLab 11416 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSRII 또는 LSRFortessa cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MG132</td><td>Calbiochem</td><td>474787</td><td>apoptosis positive control</td></tr><tr><td>Multifuge 3SR+</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>AppliChem</td><td>A3813</td><td>4.5% 용액을 신선하게 준비합니다. 80 &deg로 가열하여 PBS에서 희석하십시오. C는 흄 후드 아래에서 천천히 교반합니다. 열 손실을 방지하기 위해 플라스크를 알루미늄 호일로 덮으십시오. 용액을 실온으로 식히고 최종 부피를 조정하십시오. 용액을 셀룰로오스 필터에 통과시킵니다.</td></tr><tr><td>Phospho-Histone H3 (Ser10) (D2C8) XP Rabbit mAb (Alexa Fluor&reg; 555 Conjugate) RRID: AB_10694639</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#3475</td><td>Dilute 3:200</td></tr><tr><td>PIPETBOY acu 2</td><td>Integra Biosciences</td><td>155 016</td><td></td></tr><tr><td>혈청학적 피펫, 10 mL</td><td>Corning</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>혈청학적 피펫, 25 mL</td><td>Corning</td><td>4489</td><td></td></tr><tr><td>혈청학적 피펫, 5 mL</td><td>Corning</td><td>4487</td><td></td></tr><tr><td>SuperKillerTRAIL (modified TNF related apoptosis-inducing ligand)</td><td>Biomol</td><td>AG-40T-0002-C020</td><td>세포사멸 양성 대조군</td></tr><tr><td>T25 세포 배양 플라스크</td>를 위한 선택적 약물 <td>Greiner bio-one</td><td>690160</td> Trypsin/EDTA PAN Biotech P10-025500 <td>프로토콜에 사용된 예시 세포주를 위한 일상적인 세포 배양 물질</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>프로토콜에 사용된 예시 세포주에 대한 일상적인 세포 배양 물질</td></tr><tr><td>U87 MG 교모세포종 세포</td><td>ATCC</td><td>ATCC-HTB-14</td><td>프로토콜에 사용된 예시 세포주</td></tr></tbody></table>

유세포측정에 의한 유독성 응력 후 γh2ax 및 세포자멸의 세포 주기별 측정

Cell Cycle-specific Measurement of &#947;H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

제시된 방법 또는 약간 변형된 버전은 임상 종양학에서 사용된 것과 같이 각종 항암 처리의 특정 처리 반응 그리고 부작용을 공부하기 위하여 고안되었습니다. 방사선 요법과 다수의 항암 제에 의해 유도된 바와 같이, 유독성 스트레스 후 DNA 손상 반응의 정량적 및 세로 분석을 가능하게 한다. 이 방법은 DNA 손상 반응의 모든 단계를 커버, DNA 이중 가닥 휴식의 유도 및 수리를위한 엔드 포인트를 제공 (DSBs), 세포 주기 체포 및 수리 실패의 경우 세포 사멸에 의한 세포 사망. 이 측정을 결합하는 것은 세포 주기 의존적인 처리 효력에 관하여 정보를 제공하고, 이렇게 DNA 손상에 대하여 세포 증식과 대처 기계장치 사이 상호 작용의 심층적인 연구를 허용합니다. 화학요법제 및 이온화 방사선을 포함한 많은 암 치료제의 효과는 특정 세포 주기 단계에 따라 제한되거나 강하게 변화하기 때문에, 상관분석은 치료 효과를 평가하기 위한 강력하고 실행 가능한 방법에 의존합니다. 세포 주기 특정 방식으로 DNA에. 이것은 단일 엔드포인트 어세이와 제시된 방법의 중요한 이점으로는 불가능합니다. 이 방법은 임의의 특정 세포주에 제한되지 않으며 다수의 종양 및 정상 조직 세포주에서 철저히 시험되었다. 종양 세포의 유전적 불안정성 평가, 약물 스크리닝 및 평가를 포함하여 방사선 종양학 외에 종양학의 많은 분야에서 포괄적인 유전독성 분석술로 널리 적용될 수 있다.

인간 U87 또는 LN229 교모세포종 세포를 광자 또는 탄소 이온 방사선의 4Gy로 조사하였다. 세포 주기 특이적 γH2AX 수준 및 세포자멸은 여기에 제시된 유세포측정 방법을 사용하여 조사 후 최대48시간까지 상이한 시점에서 측정하였다(도 3). 두 세포주에서, 탄소 이온은 더 느린 감소와 동일한 물리적 용량에서 광자 방사선에 비해 24~48시간에서 유의하게 상승된 γH2AX 피크 수준을 유도하였다(도4A). 이것은 탄소 이온이 덜 효율적으로 수리된 광자보다 DNA 이중 가닥 파손(DSB)의 피크 수치가 더 높다는 것을 나타냈습니다. 두 방사선 유형 모두에 대해, γH2AX 수준은 G1 세포에서 가장 높았는데, 아마도 DSB 수리가 세포 주기의 이 단계에서 비상동성 종단 접합의 경로로 제한되기 때문일 것이다.
더 높은 DSB 유도 속도 및 ...

제시된 방법은 DNA 이중 가닥 나누기 (DSBs), 세포 주기 분포 및 세포 자멸의 정량 분석을 결합하여 DSB 유도 및 수리의 세포 주기 별 평가뿐만 아니라 수리 실패의 결과를 가능하게합니다.

유세포측정에 의한 유독성 응력 후 γH2AX 및 세포자멸의 세포 주기별 측정

The presented method or slightly modified versions have been devised to study specific treatment responses and side effects of various anti-cancer ...

이 방법은 세포 주기 의존적 치료 효과에 대한 정보를 제공하고 DNA 손상에 대한 세포 증식과 대처 메커니즘 간의 상호 작용에 대한 심층 연구를 허용하고 심도 있게 연구합니다. 이 방법은 이중 가닥 프랙 인식 및 수리, 세포 주기 효과 및 세포 사멸에 의한 최종 세포 사멸을 포함한 DNA 손상 반응에서 중요한 엔드포인트를 하나의 포괄적인 분석으로 결합합니다. 우리는 임상 종양학에 있는 방사선 화학 요법 처리의 특정 처리 반응 그리고 부작용을 조사하기 위하여 이 기술을 주로 이용했습니다.분석은 방사선 생물학 및 방사선 요법의 필드에 있는 상관 관계 연구에 아주 유용합니다, 그러나 또한 종양학의 각종 그밖 지역에 적용될 수 있습니다. 표준 세포 수집 절차에 따라 배양으로부터 세포를 수집한 후, PBS의 1 밀리리터에서 펠릿을 다시 분리한다. 그리고 후드에 고정 솔루션의 두 밀리리터로 세포를 전송합니다.실온에서 10 분 잠복 후, 원심 분리에 의해 세포를 수집하고 상체를 데칭한다. 세포를 단일 셀 현탁액으로 고정하고 모든 샘플에 대해 고정 시간을 일정하게 유지하는 것이 중요합니다. 부착 셀에게 분석을 위해 잘 둥근 세포를 얻기 위해 분리할 충분한 시간을 줍니다.그런 다음 70 %의 에탄올의 세 밀리리터에서 세포를 두드리고 다시 눌러 펠릿을 풀어 놓습니다. 염색하기 전에 세포를 세척하고, 원심분리에 의해 세포를 퇴적시키고, 두드려 펠릿을 풀어주세요. 그런 다음 세안용 3밀리리터와 1밀리리터의 세척용으로 2회 연속 세척으로 세포를 다시 중단합니다.각 세척 사이에 상체를 폐기합니다. 마지막 세척 후, 조심스럽게 펠릿을 방해하지 않고 슈퍼 나탄을 흡인하고 관심의 항체 칵테일의 100 마이크로 리터에 윤센트 펠릿을 다시 중단. 실온에서 1 시간 후, 원심 분리에 의해 세포를 수집하고 조심스럽게 펠릿을 방해하지 않고 슈퍼 나탄을 흡인.그런 다음, 느슨한 펠릿을 DNA 염색 용액의 100~250 마이크로리터로 재중단하고 35마이크로미터 메쉬 모공 크기로 샘플 튜브의 세포 스트레이너 캡을 통해 세포를 분배한다. 흐름 세포측정에 의해 세포를 분석하려면 사이토미터 창에서 매개 변수 탭을 열고 표에 표시된 대로 매개 변수를 선택합니다. 다음으로 워크시트 창을 열고 표시된 대로 플롯을 만듭니다.제어 샘플을 사이토미터에 로드하고 실행 버튼을 누릅니다. 브라우저 창에서 첫 번째 튜브를 선택하고 튜브 이름을 클릭합니다. 검사기 창의 파라미터 탭에서 전방 및 측면 분산 및 DAPI에 대한 검출기 전압을 조정합니다.대기 버튼을 눌러 소프트웨어의 워크시트 설정을 계속합니다. 다각형 게이트 도구를 사용하여 측면 분산 영역 플롯과 전방 분산 영역에서 셀의 모집단을 정의하고 사각형 게이트 도구를 사용하여 DAPI 영역 플롯대 DAPI에서 단일 셀의 모집단을 정의합니다. 제어 G를 눌러 채우기 계층 구조를 표시하고 기본 게이트 이름을 클릭하여 이름을 변경합니다.그런 다음 모든 히스토그램을 마우스 오른쪽 으로 클릭하여 컨텍스트 메뉴에서 표시 개체 수와 단일 셀을 선택합니다. 제어 및 처리된 샘플을 획득하여 항체 결합 형광에 대한 검출기 전압을 최적화하여 전체 동적 신호 범위를 커버합니다. 샘플을 측정하려면 사이토미터의 실행 버튼을 누르고 소프트웨어의 획득 대시보드를 사용하여 샘플을 측정합니다.그런 다음 파일, 내보내기 및 실험을 선택하여 대화 상자에서 디렉터리 내보내기를 선택하여 데이터를 도트 FCS 파일로 저장합니다. 데이터를 평가하려면 도트 FCS 파일을 유량 사이토메트릭 분석 소프트웨어의 샘플 브라우저에 드래그앤드롭합니다. 그리고 다각형 도구를 사용하여 전방 및 측면 분산 영역 플롯에서 셀의 인구를 정의하고 분석에서 이물질을 제외합니다.DAPI 영역 플롯대 DAPI에서 사각형 도구를 사용하여 단일 셀의 모집단을 정의하고 분석에서 셀 이중 또는 덩어리를 제외합니다. DAPI 영역 히스토그램에서, 비섹터 도구를 사용하여 정상적인 DNA 함량을 저하된 DNA를 가진 세포로부터 정상적인 DNA 함량을 구별한다. 공구 생물학 및 세포 주기를 선택하여 세포 주기 모델링 도구를 열고 딘 제트 폭스를 선택하여 G 1 S 및 G 2M 단계에서 세포의 주파수를 추정합니다.세포 주기 집단의 DAPI 영역 플롯 대 DAPI와 함께 DAPI에서 G 1 S 및 G 2 및 M 상 게이트를 생성하여 세포 주기 특정 감마 H 2 A X 측정을 가능하게 한다. 이중 섹터 도구를 사용하여 세포 주기 집단의 Alexa 555 영역 히스토그램에서 인포히스톤 H 3개의 양성 및 음수 세포를 구별하고 단일 세포의 개체수의 알렉사 647 영역 히스토그램에서 CAS 베이스 3개의 양성 및 음수 세포를 구별한다. 컨트롤 T를 눌러 테이블 편집기를 열고 표시된 대로 테이블을 구성합니다.그런 다음 파일을 선택하여 메뉴 리본의 출력 섹션에서 형식과 대상을 설정하고 데이터를 스프레드 시트로 내보냅니다. 탄소 이온은 교모세포종 세포에서 더 높은 감마 H 2 AX 피크 수준을 유도하여 더 느리게 감소하고 동일한 물리적 용량에서 광자 방사선에 비해 24~48시간 동안 현저하게 상승합니다. 탄소 이온과 광자 방사선 모두에 대해, 감마 H 2 AX 수준은 DNA 이중 가닥 파손 복구가 세포 주기에서 이 단계에서 결합하는 비균성 종말의 통로로 제한되기 때문에 G 1상 세포에서 가장 높았다.더 높은 이중 가닥 파손 유도 속도와 느린 수리 운동에 따라, 탄소 이온은 G 2 상에서 더 강하고 오래 지속되는 세포 주기 체포와 광자보다 더 높은 세포 주기 체포를 유도합니다. 치료 효과의 강도에 따라, 다른 세포 주기 단계의 해상도 어려울 수 있습니다. 일부 세포주에서, DAPI 농도는 세포 주기 단면도의 질에 큰 영향을 미치고 조정될 필요가 있습니다.슬라이드는 혈류 세포측정 후 나머지 샘플로부터 제조하여 감마 H 2 AX 포시의 개수, 크기 및 모양을 평가하고 초점과 파핵 감마 H 2 AX 염색을 구별할 수 있다. 우리의 방법을 사용하여, 우리는 중간엽 줄기 세포가 이온화 방사선 및 투포아소머제 억제에 상대적으로 저항하지만 교묘한에 민감하다는 것을 보여줄 수 있었습니다. PFA 연기가 독성이기 때문에 고정 솔루션을 준비할 때와 고정 단계에서 항상 연기 후드를 사용하십시오.또한 DAPI를 취급할 때 장갑을 착용해야 합니다.

cell-cycle-specific-measurement-h2ax-apoptosis-after-genotoxic-stress

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

분자 마커로 γH2AX 형성을 사용하여 DNA 이중 스트랜드 줄무늬의 부량 방사선 생물학에서 매우 중요한 도구가되었습니다. 여기 우리는 방사선에 노출 후 세포의 γH2AX foci의 부량위한 immunofluorescence 분석의 사용을 보여줍니다.

Ionising 방사선에 대한 응답으로 γH2AX Foci의 부량

γH2AX foci을 바탕으로 DNA 이중 가닥 나누기의 Quantitation는 조직 radiosensitivity 방사선 수정 화합물의 효과 평가를 위해, 특히 방사선 생물학에서 매우 중요한 도구가되었습니다. 여기 우리는 조직 샘플에서 γH2AX foci의 quantitation위한 immunofluorescence 분석의 사용을 보여줍니다.

조직 샘플에서 γH2AX Foci의 Quantitation

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DNA Double-Strand Break 분석을 위한 면역형광 현미경 검사

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면역형광에 의한 DNA 수리 단백질 상호작용의 시각화

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인간 말초 림프구에서 γH2AX 및 53BP1의 이중 면역형광

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유세포측정에 의한 유독성 응력 후 γH2AX 및 세포자멸의 세포 주기별 측정

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