Name: 질소 고정 열대 카나바세아 나무 파라스포니아 앤더슨이 변형, 게놈 편집 및 현상형 화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 22 s
Description: 학습하세요 Parasponia andersonii의 안정적 형질전환 및 CRISPR/Cas9 게놈 편집 프로토콜을 통해 질소 고정 뿌리 혹 형성 메커니즘을 연구하는 방법을 배우세요. 이 기술은 식물-근류균 공생 유전자 네트워크 분석에 필수적입니다.

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저자는 애드진 데이터베이스를 통해 골든 게이트 복제 부품을 사용할 수 있도록 마크 유레스, 소피엔 카문과 실베스트레 마릴론넷을 인정하고 싶어. 또한, 우리는 이 제임스, P. 하도바, 그리고 P. J. 히겐스 P. 앤더슨이 씨앗에 감사드립니다. 이 작품은 과학 연구를위한 네덜란드 기구에 의해 지원되었다 (NWO-VICI 교부금 865.13.001; NWO-오픈 공모전 은 819.01.007) 및 인도네시아 공화국의 연구, 기술 및 고등 교육부 (RISET-PRO 보조금 8245-ID).

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저자는 공개 할 것이 없다.

콩과 식물과 먼 관련 칸나바세아 속 Parasponia질소 고정 뿌리 줄기와 내인 대 관계를 설정할 수 있는 식물 종의 유일한 두 clades를 나타냅니다 및 루트 작은 혹을 형성. 두 clades의 종 사이 비교 연구 는 이 공생을 허용하는 핵심 유전 네트워크에 통찰력을 제공하기 위하여 높게 관련있습니다. 현재, 유전 연구는 주로 콩과 식물에서 이루어집니다. 특히 두 가지 모델 종 M. 트렁카툴라와 L. japonicus. 추가 실험 플랫폼을 제공하고 비 콩과 함께 비교 연구를 용이하게하기 위해, 우리는 P. andersonii에서안정적인 변환 및 역유전 분석을위한 자세한 프로토콜을 여기에 설명합니다. 제시된 프로토콜은 T0 형질전환 P. 앤더슨이 라인의 시험관 내 전파를 사용하여 A. tumefaciens 공동 재배 후 4 개월 이내에 표현형 분석을 시작할 수 있습니다. 이는 콩류(33)의 안정적인 변형을 위해 확립된현재 프로토콜보다 실질적으로 빠르다. 이것은 P. 앤더슨이 매력적인 연구 모델을 만든다.
여기에 설명된 프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계가 포함되어 있습니다. 첫 번째는 종자 발아와 관련이 있습니다. 발아를 위한 P. andersonii 씨앗을 준비하려면 씨앗을 열매에서 분리해야합니다. 이것은 티슈 페이퍼 또는 차 체 의 내부에 열매를 문지르는 것으로 수행됩니다. 이 절차는 종자 코트의 손상을 방지하기 위해 부드럽게 수행되어야합니다. 종자 털이 손상되면 표백제가 멸균 중에 씨앗에 들어갈 수 있어 종자 생존가능성이 줄어듭니다. 종자 휴면을 깰, 씨앗은 10 일 온도 주기를 실시한다. 그러나,이 치료에도 불구하고 발아는 완전히 동기화되지 않습니다. 일반적으로, 첫 번째 씨앗 후 복사 출현을 보여 7 일, 하지만 다른 발아 하는 데 몇 일 이상 걸릴 수 있습니다.
변환 절차의 임계점은 시작 물질의 선택과 공동 재배 단계의 지속 기간에 관한 것입니다. 효율적인 변환에 도달하기 위해, 그것은 시작 재료로 비 살균 온실 재배 식물의 건강하고 젊은 줄기 또는 petioles를 사용하는 것이 가장 좋습니다. 젊은 가지의 성장을 유도하기 위해, 파라스포니아 나무를 2-3 개월마다 손질하고 일년에 한 번 나무를 새로 고치는 것이 좋습니다. 또한 공동 재배 단계는 2 일 동안만 수행해야합니다. 장기간 공동 재배는 A. tumefaciens에 의해 조직 이식의 과잉 식민지를 촉진하고 일반적으로 변환 효율을 감소시킨다. A. tumefaciens에 의해 과잉 식민지를 방지 하기 위해 그것은 또한 정기적으로 이식 재배 하는 판을 새로 고침 하는 것이 중요 하다. 과잉 식민지가 발생하는 경우, 조직 이식은 씻어 수 (섹션 3.8 참조) A. tumefaciens 세포를 제거하기 위해. 세척에 사용되는 SH-10 용액에 표백제를 첨가하는 것이 좋습니다 (최종 농도 : ~ 2 % 하이포 염화산). 이 추가 세척 단계는 심하게 감염된 이식(그림 2B)에서작동하지 않을 수 있다는 점에 유의해야 합니다. CRISPR/Cas9 구성을 가진 변환이 제한된 수의 putatively 형질전환 된 싹을 산출하거나 특정 유전자의 돌연변이 발생이 재생에 문제를 일으킬 것으로 예상되는 경우, 빈 벡터 제어 구조를 포함하는 것이 좋습니다. 긍정적 인 제어. 마지막으로, 선택된 모든 형질전환 라인이 독립적인 T-DNA 통합 이벤트에서 발생하도록 하는 것이 중요합니다. 따라서, 우리는 이식의 각 측면에서 단 하나의 putatively-transgenic 촬영을 지시합니다. 그러나 이렇게 하면 잠재적인 회선이 줄어듭니다. 많은 라인이 요구되는 경우에, 연구원은 이 캘리 가 니 (≥2 mm)의 크기와 배양이 칼리를 독립적으로 배양 할 때 원래 의 외식에서 putatively 변형 된 칼리를 분리하기로 결정할 수 있습니다. 이러한 방식으로, 여러 라인은 잠재적 인 형질 전환 라인의 수를 제기 각 배양에서 분리 될 수있다.
현재 프로토콜에서, P. andersonii의 형질 전환 라인은 시험관 내 전파를 통해 식물적으로 전파된다. 이것의 장점은 많은 형질전환 식물이 비교적 짧은 기간에 생성될 수 있다는 것이다. 그러나 이 방법에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 첫째, 시험관 내 전파를 통한 T0 형질전환라인의 유지는 노동집약적이며 원치 않는 유전적 또는 후생유전학적 변화를 초래할 수 있다34,35. 둘째, T0 라인은 여전히 항생제 내성 카세트를 포함하는 T-DNA의 사본을 함유한다. 이렇게 하면 각 재변환에 대해 서로 다른 선택 마커가 필요하므로 가능한 재변환 횟수가 제한됩니다. 현재, 우리는 카나마이신 또는 히그로 마이신 선택을 사용하여 변형을 테스트했습니다 (데이터는 표시되지 않음). 더욱이, T0 형질전환 선에 있는 Cas9 인코딩 서열 및 sgRNAs의 존재는 보완 연구 결과를 복잡하게 합니다. 상보성 공산학은 가능하지만 sgRNA 표적 부위(들)가 보체화 구조의 유전자 편집이 방지되도록 돌연변이되어야 한다. 셋째, T0 라인으로 작업의 단점은 CRISPR / Cas9 돌연변이가 키메라 될 수 있다는 것입니다. 키메라 돌연변이 선의 표현형 분석을 방지하기 위해, 우리는 적어도 3 개의 다른 싹에 시험관 내 전파 후 지질 형질 분석반복하는 것이 좋습니다. 여기에 기재된 프로토콜을 사용하여 수득된 키메라 돌연변이체의 수는 제한적이지만, 이들은 때때로10을관찰한다. T0 라인작업의 한계를 극복하기 위해 P. andersonii 돌연변이 선은 생성적으로 전파될 수 있습니다. P. 앤더슨 나무는 디오이와 바람 수분2. 이것은 각 형질전환 선이 남성과 여성의 꽃이 한 개인에 생성되도록 조작될 필요가 있고, 이후에 교차 수분이 일어나지 않는 것과 같이 성장한다는 것을 의미합니다. P. andersonii는 빠르게 성장하는 나무이므로 열대 온실에서 상당한 양의 공간이 필요합니다 (28 °C, ~ 85 % 상대 습도). 따라서 기술적으로 가능하지만 P. andersonii 형질전환 라인의 생성 전파는 물류적으로 어렵습니다.
프로토콜 섹션에서, 우리는 P. 앤더슨의절제에 대한 3 가지 방법을 설명 . 플레이트와 파우치 시스템의 장점은 뿌리가 쉽게 접근 할 수 있다는 것입니다, 이는 박테리아의 반점 접종을 허용하고 시간이 지남에 따라 다음 적두 형성을 할 수있다. 그러나, 플레이트 시스템은 매우 노동 집약적, 대규모 끄덕임 실험에 덜 적합하게. 파우치 시스템의 단점은 곰팡이 오염을 방지하기가 어렵다는 것입니다. 파우치는 멸균되지 않으므로 주머니의 위쪽 절반에서 곰팡이 성장이 종종 관찰됩니다. 그러나, 이것은 P. andersonii 성장에 영향을 미치지 않으며, 그러므로 끄덕인 asays를 방해하지 않습니다. 또한 파우치 시스템은 모종에만 적합합니다. 여러 시도에도 불구 하 고, 우리는 파우치에 체 외 전파를 통해 얻은 식물을 성장 수 없습니다.
여기에 기술된 P. andersonii 역유전학 파이프라인은 기존 A. 근성 계근형변환 방법(11)에 비해 상당한 개선을 제공한다. 기재된 절차를 사용하여, 안정적인 형질전환 라인을 효율적으로 생성할 수 있고 시험관 내 전파를 통해 유지될 수 있다. 대조적으로, A. 뿌리 줄기 변환은 일시적이며 형질전환 뿌리의 형성만을 초래합니다. 각 형질전환 뿌리는 독립적인 형질전환에서 유래하기 때문에, A. 근위계 형질전환계 분석제는 실질적인 현상기 변화때문에 손해를 입는다. 이 변화는 시험관 내 전파도 변화의 어떤 수준을 생성하지만, 안정적인 라인의 경우 훨씬 적습니다. 이 감소된 변이 및 다중 식물이 각 안정한 선에 대해 표현될 수 있다는 사실 때문에, 안정된 선은 A. rhizogenes-형질전환된 뿌리에 비해 정량적 분석에 더 적합합니다. 부가적으로, 안정한 형질전환은 내인성 호르몬 균형에 영향을 미치는 궤적(rol)을 유도하는 A. 뿌리줄기(rol)의 도입에 의존하지 않는다15. 따라서, 안정한 선은 A. 뿌리줄기-형질전환된 뿌리에 비해 호르몬 항상성에 관여하는 유전자의 역유전적 분석에 더 적합하다. 연구 모델로서 P. andersonii의 더 일반적인 이점은 최근 전체 게놈 중복 (WGD)을 경험하지 않았다는 것입니다. 모델 콩류 를 포함하는 콩과 식물 파필리오노마데아제 서브 패밀리 M. 트렁카툴라 와 L. japonicus,뿐만 아니라 모델 트리포러스 트리코카르파 경험 WGDs ~ 65를 포함하는 살리카과 (주문 말피기알레스) 백만 년 전36,37. 이러한 WGDs에서 유래 하는 많은 paralogous 유전자 복사본 M. truncatula의게놈에 유지 됩니다., L. japonicus 와 P. trichocarpa37,38,39,생성 역유전분석을 복잡하게 할 수 있는 중복성. P. 앤더슨은 최근 WGD를 경험하지 않았기 때문에, P. andersonii에 역 유전 분석은 paralogous 유전자 사본의 중복 기능에 의해 덜 영향을 받을 수 있습니다.
종합하면, 우리는 P. andersonii에서역유전 분석을위한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜을 사용하여, 단일 돌연변이 라인은 2-3 개월10의기간 내에 효율적으로 생성 될 수있다. 이 프로토콜은 다른 식물 종40,41,42에도시된 바와 같이 동시에 다른 유전자를 표적화하는 sgRNAs의 다중화를 통해 더 높은 차수돌연변이를 생성하도록 확장될 수 있다. 추가적으로, 여기에서 기술된 안정한 변환 절차는 CRISPR/Cas9 유전자 표적화에 한정되지 않습니다 그러나 또한 구조물의 그밖 모형을 소개하기 위하여 이용될 수 있었습니다 (예를 들면, 프로모터 리포터 assays, 자궁 외 발현 또는 trans를 위해- 보완)을 참조하십시오. 우리는 질소 고정 뿌리 줄기 또는 내분근 성 균류와 상호 공생을 연구하는 비교 연구 모델로 P. andersonii를 설립했다. 그러나, 여기에 설명 된 프로토콜은 또한 이 열대 나무의 생물학의 다른 측면을 연구하는 도구를 제공합니다, 이러한 나무 형성등, 이중 성적 꽃의 개발 또는 칸 나베아 과 특정 보조 대사 산물의 생합성.

파라스포니아 앤더슨은 대마초 가족 (칸 나바세아)에 속하는 열대 나무이며 파푸아 뉴기니와여러 태평양 제도 1,2,3이원산지입니다. 4개의 추가 파라스포니아 종과 함께, 그것은 뿌리 줄기와 질소 고정 결절 공생을 확립할 수 있는 유일한 비 콩구도 혈통을 나타냅니다. 이 공생은 콩과 식물 (Fabaceae) 모델 메디카고 트렁카툴라와 로터스 japonicus에서잘 연구되어 결절 형성및 기능의 분자유전적 특성에 대한 상세한 지식을 습득한 결과 4. 또한, 콩류의 뿌리 같은혹 공생이 훨씬 더 오래되고 광범위하게 관절 성 진균 공생5에 기초한다는것이 입증되었습니다. 생리학 비교는 콩류, 파라스포니아의질소 고정 결절 공생뿐만 아니라, 디아조영양 프랭키아 박테리아를 호스트 소위 actinorhizal 식물 종, 공유 진화 기원을 가지고 있음을 시사 6,7,8. 콩과 엽 결절 형성에 관여하는 것으로 확인된 유전자가 보존된 유전적 기초의 일부인지 여부를 결정하기 위해 비콩콩종 종에 대한 연구가 필수적입니다. 이를 위해, 우리는 비교 연구 모델로 P. andersonii를 사용하는 것이 제안, 콩과 식물과 함께, 근본적인 루트 결절 형성 및 기능의 핵심 유전 네트워크를 식별하기 위해.
P. 앤더슨이 화산 언덕의 경사면에서 찾을 수있는 개척자입니다. 그것은 한 달에 45cm의 성장 속도를 충족하고 10미터 9까지의 길이에 도달 할 수 있습니다. P. 앤더슨 나무는 별도의 남성과 여성의 꽃 3,10의형성에 의해 촉진되는 바람 수분된다. 우리는 최근에 P. andersonii의디플로이드 게놈(2n= 20; 560 Mb/1C)을 시퀀싱하고, 2개의 추가파라스포니아 종의 초안 게놈 서열을 조립하였다; P. 리거다와 P. 루고사6. 이 밝혀 ~35,000 P. 앤더슨 유전자 모델 >20,000 직교 그룹에서 클러스터 될 수 있는 M. 트렁카툴라에서유전자와 함께, 콩 (글리신최대), 애기장대탈리아나, 삼림 딸기 ( 프라가리아 베스카), 트레마 오리엔탈리스, 블랙 코튼 포플러(포퓰러스트리코카르파)및 유칼립투스(유칼립투스그랜디스)6. 추가적으로, M. truncatula와 P. andersonii 사이 전사체 비교는 두 종 6에 있는 결절 강화한 표현 패턴을표시하는 290 putative orthologues의 세트를 확인했습니다. 이것은 비교 연구를위한 훌륭한 자원을 제공합니다.
P. andersonii 뿌리와 결절에서 유전자 기능을 연구하기 위해, 아그로박테리움 뿌리줄기유전자-매개 뿌리 형질전환에 대한 프로토콜이11개확립되었다. 이 프로토콜을 사용하여, 형질전환 뿌리를 방위하는 복합 식물은 비교적 짧은 시간 프레임에서 생성될 수 있다. 이 방법은, 또한, 또한, 12,13,14에널리 적용된다. 그러나 이 방법의 단점은 루트만 변환되고 각 형질전환 루트가 독립적인 변환 이벤트를 나타내므로 상당한 변동이 발생한다는 것입니다. 또한 변환은 일시적이며 형질전환 선은 유지 될 수 없습니다. 이것은 A. 뿌리 줄기-기반 루트 변환CRISPR /Cas9 매개 게놈 편집에 덜 적합합니다. 또한, A. 뿌리 줄기 유전자는 식물 게놈에 그것의 뿌리를 유도 하는 궤 적 (rol) 유전자를 전송, 한 번 호르몬 항상성을 방해 표현15. 이것은 A. 뿌리 줄기-변형 된 뿌리에서 식물 호르몬의 역할을 연구하는 것이 도전적입니다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 우리는 최근 P. andersonii10의 아그로박테리움 투메파시엔-기반변환 및 CRISPR/Cas9 매개 돌연변이 유발에 대한 프로토콜을 개발했다.
여기에서는 P. andersonii를위해 개발된 A. tumefaciens-기반변환 절차 및 역유전학 파이프라인에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 또한, 우리는 공생 상호 작용을 연구하기 위한 분석학을 포함하여 형질전환 식물의 하류 처리를 위한 프로토콜을 제공합니다. 여기에 설명된 프로토콜을 사용하여, 2-3개월 동안 다중 형질전환 라인을 생성할 수 있다. CRISPR/Cas9 매개 돌연변이 발생과 함께, 이것은 녹아웃 돌연변이 라인의 효율적인 생성을 가능하게 합니다. 이러한 돌연변이 선은 체외(10,16,17)에서식물적으로 전파될 수 있으며, 이는 변형 시술 후 4개월에 자형질 특성화를 시작하기에 충분한 물질을 생성할 수 있게 한다. 10. 함께, 절차의이 세트는 어떤 실험실이 열대 나무의 생물학의 잠재적으로 다른 측면뿐만 아니라, 비소 질 및 균체 연관이해겨냥 연구를위한 연구 모델로 P. andersonii을 채택 할 수 있어야합니다.

<table><tbody><tr><td>시그마-알드리치</td><td>N0640</td><td>NAA</td><td></td></tr><tr><td>두체파 생화학</td><td>M1503.0250</td><td>MES</td><td></td></tr><tr><td>시그마-알드리치</td><td>D134406</td><td>아세토시링곤</td><td></td></tr><tr><td>두체파 생화학자</td><td>X1402.1000</td><td>X-Gal</td><td></td></tr><tr><td>머크</td><td>101236</td><td>핵산 전기영동 겔</td><td></td>을 위해</tr><tr><td>-</td><td>-</td><td>파우치 상자 재료, 행거</td><td></td></tr><tr><td>Merck</td><td>101188</td><td>NH4NO3</td><td></td></tr><tr><td>Sigma-Aldrich</td><td>B3408-1G</td><td>BAP</td><td></td></tr><tr><td>Merck</td><td>100156</td><td>H3BO3</td><td></td></tr><tr><td>Thermo-Fisher</td><td>ER1011</td><td>Golden Gate 클로닝 어셈블리</td><td></td>Thermo-Fisher에서 제한 효소로 사용</tr><tr><td></td><td>15561020</td><td>Golden Gate 복제 어셈블리</td><td></td>에 사용되는</tr><tr><td>Merck</td><td>137101</td><td>CaCl2&middot; 2H2O</td><td></td></tr><tr><td>Duchefa Biochemie</td><td>C0111.0025</td><td>C16H16N5O7S2Na</td><td></td></tr><tr><td>Thermo-Fisher</td><td>K1231</td><td>유전형 분석 절차에서 평활구 PCR 앰플리콘 클로닝에 사용</td> Agronutrition AP2011 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>Rhizophagus irregularis DAOM 197198 (1,000 포자/mL) 함유, mychorrization 분석</td><td></td>에 사용됨</tr><tr><td>Merck</td><td>102790</td><td>CuSO4&middot; 5H2O</td><td></td></tr><tr><td>Duchefa Biochemie</td><td>D1004.1000</td><td>식물 조직 배양 한천 기반 매체</td><td></td>에 사용</tr><tr><td>Merck</td><td></td><td>105101 K2HPO4</td><td></td></tr><tr><td>VWR Chemicals</td><td>20302.293</td><td>Na2&middot; EDTA</td><td></td></tr><tr><td>Duchefa Biochemie</td><td>M0803.1000</td><td>C6H14O6Thermo-Fisher</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>ER0291</td><td>Golden Gate 클로닝 어셈블리</td><td></td>에서 제한 효소로 사용</tr><tr><td>Merck</td><td>100983</td><td>C2H5OH</td><td></td></tr><tr><td>VWR 화학 물질</td><td>BDH9232-500G</td><td>EDTA</td><td></td></tr><tr><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z377600-1PAK</td><td>셀로판 멤브레인</td><td></td></tr><tr><td>Biomatters, Ltd.</td><td>sgRNA의 인실리코 클로닝 및 설계를 위한</td> <td>R9 이상의</td> 생물정보학 소프트웨어 Mega International-기술 정보 https://mega-international.com/tech-info/ Sigma-Aldrich 65882 결절 조직 고정에 사용 VWR Chemicals 24385.295-Vink 219341 파우치 상자 재질, 하단 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td> 부분</td><td></td></tr><tr><td>Leica Biosystems</td><td>14702218311</td><td>플라스틱 임베딩</td><td></td>용 템플릿으로 사용됨</tr><tr><td>Merck</td><td>100317</td><td>HCl</td><td></td></tr><tr><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5386-1G</td><td>IBA</td><td></td></tr><tr><td>Merck</td><td>103862</td><td>C6H5FeO7</td><td></td></tr><tr><td>Merck</td><td>103965</td><td>FeSO4O&middot; 7H2O</td><td></td></tr><tr><td>Duchefa Biochemie</td><td>I1401.0005</td><td>IPTG</td><td></td></tr><tr><td>Duchefa Biochemie</td><td>K0126.0010</td><td>&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>시그마-알드리치</td><td>L2000</td><td>&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>머크</td><td>105886</td><td>MgSO4O&middot; 7H2O</td><td></td></tr><tr><td>Merck</td><td>105934</td><td>MnCl2&middot; 4H2O</td><td></td></tr><tr><td>Merck</td><td>102786</td><td>MnSO<4<>/sub>O</td><td></td></tr><tr><td>Duchefa Biochemie</td><td>M1002.1000</td><td>박테리아 배양에 사용 한천 기반 매체</td><td></td></tr><tr><td>Manutan</td><td>92007687</td><td>파우치 재료</td><td></td></tr><tr><td>Paraxisdienst</td><td>130774</td><td>탄성 밀봉 호일</td><td></td></tr><tr><td>Pull Rhenen</td><td>Agra-Perlite No.3</td><td>결절 분석을 위해 냄비에서 성장 기질로 사용</td> VWR Chemicals 391-0581 셀로판 멤브레인의 용기로 사용 Thermo-Fisher F130WH 유전형 형질 전환 라인 Addgene 50337 Level 0 terminator, 3'<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> </td><td></td><td> UTR, 35s (콜리플라워 모자이크 바이러스)</td><td></td></tr><tr><td>Addgene </td><td>48017</td><td>End-link 2 2 level one part를 level 2 acceptor</td><td></td>로 조립</tr>하기 <tr>위한<td>Addgene </td><td>48018</td><td>3 level one part를 level 2 acceptor로 조립하기 위한 End-link 3 Addgene</td> 48001 Level 1 acceptor.<td></td></tr><tr><td> </td><td></td><td> 위치 5. 정방향</td><td></td></tr><tr><td>Addgene </td><td>48007</td><td>Level 1 Acceptor. 위치 1. 역방향</td><td></td></tr><tr><td>Addgene </td><td>50268</td><td>레벨 0 프로모터 (0.4 kb), 35s (콜리플라워 모자이크 바이러스) + 5' UTR, &오메가; (담배 모자이크 바이러스)</td><td></td></tr><tr><td>Addgene </td><td>46966</td><td>CRISPR/Cas9 모듈</td><td></td>설계에 사용</tr><tr><td>Addgene </td><td>46968</td><td>CRISPR/Cas9 모듈</td><td></td>설계에 사용</tr><tr><td>Addgene </td><td>50334</td><td>Level 0 Kanamycin/Neomycin/Paromomycin resistance cassette</td><td></td></tr><tr><td>Topzeven</td><td>-</td><td>포자 현탁액</td><td></td>세척용 필터로 사용</tr><tr><td>Sigma-Aldrich</td><td>8.17003</td><td>PEG400</td><td></td></tr><tr><td>Duchefa Biochemie</td><td>E1674.0001</td><td>Parasponia 식물/묘목</td><td></td>을 키우는 화분</tr><tr><td>Merck</td><td>104871</td><td>KH2PO4</td><td></td></tr><tr><td>Merck</td><td>105033</td><td>KOH</td><td></td></tr><tr><td>Merck</td><td>105153</td><td>K2SO4O</td><td></td></tr><tr><td>Van Leusden bv. </td><td>-</td><td>mychorrhization assay</td><td></td>의 성장 기질로 사용</tr><tr><td>Duchefa Biochemie</td><td>S0225.0050</td><td>SH-basal salt medium</td><td></td></tr><tr><td>Duchefa Biochemie</td><td>S0411.0250</td><td>SH-vitamin mixture</td><td></td></tr><tr><td>Lehle Seeds</td><td>VIS-02</td> 안정 형질전환 <td></td>Merck 137017 NaCl<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>의 세척 단계에서 비이온 계면 활성제로 사용<td>VWR Chemicals</td><td>89230-072</td><td>C6H11NaO7</td><td></td></tr><tr><td>Merck</td><td>106521</td><td>Na2MoO4&middot; 2H2O</td><td></td></tr><tr><td>Merck</td><td>106574</td><td>Na2HPO4&middot; 7H2O</td><td></td></tr><tr><td>Merck</td><td>567549</td><td>NaH2PO4&middot; H2O</td><td></td></tr><tr><td>Sigma-Aldrich</td><td>239313</td><td>Na2SO4O</td><td></td></tr><tr><td>Duchefa Biochemie</td><td>S0809.5000</td><td>C12H22O11</td><td></td></tr><tr><td>Thermo-Fisher</td><td>B69</td><td>Golden Gate 클로닝 어셈블리</td><td></td></tr><tr><td>Thermo-Fisher</td><td>EL0013</td><td>에 사용Golden Gate 클로닝 어셈블리</td><td></td>에 사용</tr><tr><td>Kulzer-Mitsui Chemicals Group</td><td>64708806</td><td>메틸 메타크릴레이트 기반 수지 분말</td><td></td></tr><tr><td>Kulzer-Mitsui Chemicals Group</td><td>64709003</td><td>HEMA(2-하이드록시에틸 메타크릴레이트) 기반 수지 용액</td><td></td></tr><tr><td>Kulzer-Mitsui Chemicals Group</td><td>66022678</td><td>메틸 메타크릴레이트 기반 수지 솔루션</td><td></td></tr><tr><td>Merck</td><td>1159300025</td><td>&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>아크로스</td><td>189350250</td><td>&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>VWR Chemicals</td><td>663684B</td><td>폴리소르베이트 20</td><td></td></tr><tr><td>스타우트 퍼스펙스</td><td></td> <td>파우치 박스 재질, 뚜껑</td><td></td></tr><tr><td>Duchefa Biochemie</td><td>Y1333.1000</td><td>&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>머크</td><td>108816</td><td>ZnCl2</td><td></td></tr><tr><td>Alfa Aesar</td><td>33399</td><td>ZnSO4O&middot; 7H2O</td><td></td></tr></tbody></table>

질소 고정 열대 카나바세아 나무 파라스포니아 앤더슨이 변형, 게놈 편집 및 현상형 화

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

파라스 포니아 앤더슨은 대마초 가족 (칸 나바 세아)에 속하는 빠르게 성장하는 열대 나무입니다. 4종의 추가 종과 함께, 리조비움과 질소 고정 결절 공생을 확립할 수 있는 유일한 알려진 비콩구종 혈통을 형성한다. 콩과 식물과 P. 앤더슨 ii 사이의 비교 연구는 뿌리 줄이 형성의 기본 유전 네트워크에 귀중한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 비교 연구를 촉진하기 위해, 우리는 최근에 P. andersonii 게놈을 시퀀싱하고 아그로박테리움 투메파시엔스-중재 된 안정적인 변환 및 CRISPR / Cas9 기반 게놈 편집을 확립했습니다. 여기에서는 P. andersonii를위해 개발된 변형 및 게놈 편집 절차에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 또한, 우리는 종자 발아 및 공생 표현형의 특성화에 대한 절차를 설명합니다. 이 프로토콜을 사용하여, 안정적인 형질전환 돌연변이 라인은 2-3 개월의 기간에서 생성될 수 있다. T0 형질전환 선의 식물성 체외 전파는 A. tumefaciens 공동 재배 후 4 개월에 표현형 실험을 시작할 수 있습니다. 따라서, 이 프로토콜은 몇 가지 명확한 이점을 제공하지만, P. andersonii에사용할 수있는 일시적인 Agrobacterium 뿌리 형성-기반 루트 변환 방법보다 약간 더 오래 걸립니다. 함께, 여기에 설명 된 절차는 P. andersonii이 열대 나무의 생물학의 잠재적으로 다른 측면뿐만 아니라 공생 협회를 이해하는 것을 목표로 연구를위한 연구 모델로 사용할 수 있습니다.

Parasponia andersonii는 대마초 가족 (칸 나바세아)에 속하는 빠르게 성장하는 열대 나무이며, rhizobium와 관련하여 질소 고정 뿌리 작은 혹을 형성 할 수 있습니다. 여기에서, 우리는 Agrobacterium tumefaciens-중재된 안정한 변환 및 CRISPR/Cas9 기지를 둔 게놈 편집에 근거를 둔 P. andersonii에 있는 역유전 분석을 위한 상세한 프로토콜을 기술합니다.

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae). Together with 4 additional species, it forms the ...

파라스포니아는 대마초 가족의 열대 나무로, 리조비움으로 질소 고정 공생을 확립 할 수 있습니다. 파라스포니아와 콩류 사이의 비교 연구는 rhizobium 심바이오시스의 기본 핵심 유전 네트워크에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 이 프로토콜을 통해, 파라스포니아 앤더슨II 안정적인 형질전환 돌연변이 선은 2~3개월의 기간동안 생성될 수 있다.이러한 선은 시험관 내 전파를 통해 효율적으로 전파될 수 있습니다. 이 프로토콜은 이 열대 나무의 생물학의 다른 측면뿐만 아니라 rhizobial 공생뿐만 아니라 연구하는 실험 플랫폼을 제공합니다. 조직 배양 및 분자 복제의 기본 기술은이 프로토콜을 구현하기에 충분합니다.이를 통해 모든 실험실에서 Parasponia를 연구 모델로 조정할 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 박사 과정 학생 티티스 워드니와 유다 로스완자야와 함께 우리 연구소의 기술자 인 마리즈케 하토그와 함께 할 것입니다. 파라스포니아 앤더슨이 나무를 성장하려면 씨앗을 발아하는 것으로 시작하십시오.파라스포니아 베리에서 씨앗을 제거하여 차 체 안쪽을 문지르거나 티슈 페이퍼에 스쿼시하여 제거하십시오. 15~20분 동안 4%의 하이포염소표백제를 사용하여 씨앗을 소독한 다음, 멸균된 물로 씨앗을 6번 세척합니다. 씨앗을 200 마이크로리터 PCR 튜브를 멸균하고 튜브를 멸균물로 채우고 씨앗을 침수합니다.원고 의 지시에 따라 열 순환기에서 10 일 동안 튜브를 배양하십시오. 10일 배양 후 씨앗을 SH-0 플레이트로 옮기고, 건조를 방지하기 위해 탄성 밀봉 호일 2층으로 닫습니다. 섭씨 28도에서 16시간, 8시간 1박 주기로 3~4주 동안 배양합니다.모종들이 첫 번째 진정한 잎 세트를 개발하면 상업용 포팅 토양으로 채워진 냄비로 옮기고 반투명 플라스틱 컵으로 덮어 탈수를 방지합니다. 냄비는 섭씨 28도, 상대 습도 85% 또는 온실을 16시간, 8시간 야간 처방에 놓습니다. 1 주일 후, 플라스틱 컵을 제거합니다.정기적으로 냄비에 물을, 나무 성장을 유지하기 위해 비료로 보충. 온실에서 자란 나무에서 5~8센티미터의 젊은 가지를 수확하여 건강하고 감염되지 않은 가지만 사용하도록 하여 변화를 준비하십시오. 잎을 잘라 각 쁘띠올 끝에 잎 조직의 1 센티미터 제곱을 떠나.폴리소르바테 20방울을 함유한 2%의 하이포염소산 표백제로 15분 동안 조직을 소독한 다음, 오토클레이브 물로 8회 헹구는 다슈염소표백제. 침투 배지의 25 밀리리터에서 약 5의 광학 밀도로 아그로박테리움 세포를 재중단한다. 줄기와 쁘띠올 조직을 세포 현탁액 내부의 1센티미터 조각으로 자른다.잎 조직을 제거하고 10~30분 동안 세포 현탁액의 줄기와 쁘띠올 조각을 배양합니다. 멸균 된 필터 용지에 조직 조각을 건조하고 원고 의 지시에 따라 준비 된 응원 매체에 배치합니다. 이틀 동안 21도에서 어둠 속에서 접시를 배양하십시오.이틀 후, 곰팡이 또는 세균 오염을 위해 접시를 검사하고 오염 된 접시를 폐기하십시오. 원고 방향에 따라 제조된 SH-10 배지의 10 밀리리터로 조직 조각을 전달한다. 조직을 배지에 10분 이상 방치하고 2~3분마다 부드럽게 교반하여 씻습니다.원고 의 지시에 따라 세포taxime와 카나마이신으로 응원 매체를 준비하고 접시를 붓습니다. 필터 용지의 멸균 조각에 조직을 건조하고 접시에 전송합니다. 16시간, 8시간 야간 식이요법으로 섭씨 28도에서 7일간 접시를 배양합니다.이틀마다 곰팡이 또는 세균 오염을 위해 플레이트를 확인하십시오. 오염이 발생하면 감염되지 않은 조직 조각을 신선한 접시로 옮깁니다. 7 일 후, 원고 방향에 따라 준비 된 전파 매체에 조직 조각을 전송하고 16 시간, 8 시간 밤 처방에서 섭씨 28도에서 배양.트랜스제닉 싹이 발생할 때까지 일주일에 한 번 플레이트를 새로 고치며 감염되지 않은 조직 조각만 새로운 플레이트로 옮기십시오. 일단 putative 형질 전환기 촬영은 적어도 1 센티미터 길이, 항생제와 전파 매체에서 독립적으로 싹과 배양을 잘라. 촬영이 독립적인 변혁을 나타내도록 하려면 각 쪽에서 단 한 번의 촬영만 하면 됩니다.약 10개의 싹을 전파 매체의 신선한 접시에 놓고 탄성 밀봉 호일 의 두 층으로 접시를 닫음으로써 조직을 전파한다. 16시간, 8시간 야간 식이요법으로 섭씨 28도에서 접시를 배양하고 4주마다 이 단계를 반복합니다. 촬영이 길이1센티미터에 도달하면 베이스에 자르고 응원 매체에 놓습니다.촬영의 기저 끝을 매체에 삽입하여 촬영을 똑바로 세워 놓습니다. 한 접시에 약 10개의 촬영이 가능합니다. 리코비움 접종을 준비하여 시작합니다.메소리조비움 plurifarium BOR2의 단일 식민지에서 액체 YEM 배지의 10 밀리리터를 접종하고, 이틀 동안 섭씨 28도에서 배양. 이 배양을 사용하여 더 많은 양의 액체 YEM 배지를 접종하십시오. 일단 재배되면 박테리아 배양을 3, 500 배에서 10 분 동안 원심분리하여 세포를 수확합니다.액체 EKM 배지에서 세균 펠릿을 다시 중단하고 광학 밀도를 결정합니다. 약 20 개의 냄비에 충분한 EKM 배지 3 리터를 준비하고 rhizobial 서스펜션으로 접종하십시오. 매체를 1.25킬로그램의 펄라이트와 섞고, 이 혼합물210그램을 첨가하여 반투명 폴리프로필렌 냄비를 멸균합니다.각 냄비에 1~3개의 파라스포니아 앤더슨ii 화분을 심고, 제어 구조로 변형된 화분으로 여러 냄비를 준비한다. 냄비의 몇 가지 무게, 빛 노출에서 뿌리를 보호하기 위해 각 냄비의 바닥을 커버. 4~6주 동안 16시간, 8시간 야간 식이요법으로 섭씨 28도의 기후성장실에서 냄비를 배양합니다.일주일에 한 번, 물 손실을 결정하기 위해 여러 냄비의 무게. 물 손실이 10 밀리리터를 초과하는 경우, 손실을 보상하기 위해 초순수물로 보충하십시오. 인큐베이션 후, 펄라이트에서 뿌리를 청소하고 쌍안경을 사용하여 결절 번호를 결정합니다.이 기술은 성공적으로 Agrobacterium 균주 AGL1와 파라스포니아 앤더슨의 petioles 및 세그먼트를 변환하는 데 사용되었습니다. 첫째, 조직 이출은 2 일 동안 아그로 박테리움과 공동 재배된다. 장기간의 공동 재배는 세균과 식민지화를 초래하며 예방해야 합니다.몇 주 후, 작은 녹색 마이크로 칼리는 원래의 상처 표면을 따라 관찰된다. 이 칼리는 변화의 시작 후 6 ~ 8 주에 하나 이상의 putatively 변환 촬영을 성장하고 개발하고 있습니다. 변형 효율성은 젊고 빠르게 성장하는 지점에서 조직 이출을 위해 성숙한 가지에서 65 에서 75%까지 조직 이식에 대한 10에서 30 %까지 다양합니다.트랜스제닉 촬영은 시험관 내 전파를 통해 곱할 수 있으며, 이는 한 달 이내에 수십 개의 촬영을 유발합니다. 이러한 촬영은 약 2주 안에 뿌리 형성을 유도하고 실험에 사용될 수 있는 식물을 산출하는 뿌리 매질에 배치될 수 있다. 안정적인 변환 실험을 시작할 때는 건강한 분기를 소스 재료로 선택하는 것이 중요합니다.파라스포니아 T0 형질전환선은 시험관내에서 전파된다. 따라서, 철저하게 유전자형 파라스포니아 형선에 필수적이다. 실험 모델로 파라스포니아를 설립하면 두 개의 먼 관련 결속 계보, 파라스포니아 및 콩류 사이의 비교 분석을 가능하게 합니다.이것은 rhizobium 심바이오시스의 근본적인 유전 네트워크를 보존하는 것을 확인할 수 있었습니다. 파라스포니아는 또한 목재 형성, 양성애자 꽃의 발달 또는 칸나비아아에 특이적 이차 대사산물의 생합성과 같은 다른 연구 주제를 연구하는 귀중한 모델이 될 수 있습니다.

transforming-genome-editing-phenotyping-nitrogen-fixing-tropical

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

DNA 조립체를 사용하여, 여러 CRISPR 벡터가 CRISPR 다수의 구성을 하나 복제 반응에 병렬로 구성 될 수있는 간단한 작업 벡터. 토마토 털이 뿌리는 CRISPR 경로를 확인하고 돌연변이 물질을 생성 할 수있는 훌륭한 모델 시스템입니다.

토마토 털이 뿌리의 생성에 의한 높은 처리량 CRISPR 벡터 건설 및 DNA 수정의 특성

발기인 식 분석은 유전자 규정의 이해 및 대상 유전자의 spatiotemporal 식 개선에 중요 한. 여기 우리는 식별, 격리, 식물 발기인을 복제 하는 프로토콜을 제시. 또한, 우리는 일반적인 콩 털이 뿌리에 결 절 특정 발기인의 특성을 설명합니다.

식물 발기인 분석: 식별 및 일반적인 콩에서 루트 결 절 특정 발기인의 특성

이 프로토콜에 복사 번호 유사의 전체 게놈 배열 기반 비교 genomic 교 잡 (CGH) 분석 수행에 관심이 있는 연구자에 대 한 실험 단계 및 시 약, 장비, 및 분석 도구에 대 한 정보 제공 식물입니다.

어레이 기반 비교 Genomic 교 잡 플랫폼 효율적인 탐지의 복사 번호 유사 빠른 중성자 유도 개자리속 truncatula 돌연변이에 대 한

소 Cas9를 활용 하 여 복잡 한 ribonucleoprotein (RNP)은 정확 하 고 효율적인 게놈 편집에 대 한 강력한 방법입니다. 여기, 우리가 강조의 유틸리티 세포와 생물의 광범위 한 범위에 걸쳐 기본 인간 세포 등 모두 클래식 하 고 모형 유기 체를 신흥.

향상 된 게놈 세포와 유기 체에서 다양 한 Cas9 Ribonucleoprotein 편집

Agrobacterium 중재 변환 꽃 딥 메서드를 사용 하 여 성공적으로 extremophyte 모델 Schrenkiella parvula의 안정적인 유전자 변형 라인을 만드는 데 사용할 수 있습니다. 선물이 프로토콜에서 애기 thaliana, 다른 성장 습관을 고려 하 고는 extremophyte의 생리 적 특성에 대 한 수정.

식물 성장 및 Extremophyte Schrenkiella parvula 의 꽃-딥 변환 Agrobacterium 중재

다양한 연구 분야에서 모델 종으로 다용도로 적용되기 때문에 좁은 잎 질경이 (Plantago lanceolata)의 유전자 변형 툴킷이 필요합니다.  여기에서 Agrobacterium tumefaciens 매개 형질전환을 사용하여 형질전환 효율이 20%인 안정적인 형질전환 계통을 생성하는 프로토콜이 제시됩니다.

Agrobacterium tumefaciens - 좁은 잎 질경이의 매개 유전자 변형

본 연구에서는 대나무에서 아그로박테리움(Agrobacterium)을 매개로 하는 식물 유전자 발현 및 유전자 편집 방법의 새로운 방법을 개발하였다. 이 방법은 대나무의 유전자 기능 검증의 효율성을 크게 향상시켰으며, 이는 대나무 번식 과정을 가속화하는 데 중요한 의미를 갖습니다.

플란타에 위치 Moso Bamboo Leaves의 유전자 발현 및 유전자 편집

이 프로토콜은 애기장대(Arabidopsis) 1차 꽃차례 줄기와 Brassica napus hypocotyls를 사용한 털이 많은 뿌리 유도를 설명합니다. 털이 많은 뿌리는 배양되어 형질 전환 식물을 재생하기 위한 이식 식물로 사용될 수 있습니다.

Arabidopsis thaliana와 Brassica napus의 털이 많은 뿌리 변형 및 재생

이 논문은 곤충병원성(EPN: 곤충기생) 선충이자 신흥 유전 모델인 Steinernema hermaphroditum 에서 CRISPR-Cas9 매개 게놈 공학을 시연합니다. 기술이 설명한 기술은 돌연변이를 생성하는 데 유용하며, 상리공생 및 기생 공생과 관련된 선충 생물학의 유전자 기능을 밝히는 데 도움을 줍니다.

곤충병원성 선충 Steinernema hermaphroditum 의 CRISPR-Cas9 기반 돌연변이 유발과 돌연변이 계통의 유지

여기에서는 세포 분리에서 염기서열분석 결과의 기본 분석에 이르기까지 게놈 전체 포유류 복제 타이밍을 매핑하기 위한 비교적 빠르고 간단한 접근 방식을 설명합니다. 대표적인 복제 프로그램의 게놈 맵은 프로토콜에 따라 제공됩니다.

DNA 콘텐츠 측정에 의한 포유 동물 복제 타이밍의 게놈 전체의 결정

학습하세요 Parasponia andersonii의 안정적 형질전환 및 CRISPR/Cas9 게놈 편집 프로토콜을 통해 질소 고정 뿌리 혹 형성 메커니즘을 연구하는 방법을 배우세요. 이 기술은 식물-근류균 공생 유전자 네트워크 분석에 필수적입니다.

질소 고정 열대 카나바세아 나무 파라스포니아 앤더슨이 변형, 게놈 편집 및 현상형 화

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