Name: 질병 모델에서 조혈 세포의 연구를 위한 렌티바이러스 CRISPR/Cas9 매개 게놈 편집 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-03T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: 배우세요 CRISPR/Cas9와 렌티바이러스를 이용한 조혈 줄기세포 게놈 편집 방법입니다. 이 기술은 murine HSPC에서 특이적 유전자 변형을 신속하고 경제적으로 수행하여 혈액 질환 연구에 활용됩니다.

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S. S. 미국 심장 협회 박사 후 펠로우십 17POST33670076에 의해 지원되었다. K. W.는 NIH 보조금 R01 HL138014, R01 HL141256 및 R01 HL139819에 의해 지원되었습니다.

동물 과목과 관련된 모든 절차는 버지니아 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.
1. 렌티바이러스 입자의 생성 및 정제
참고 : 최적화 된 가이드 RNA를 포함하는 렌티 바이러스 입자는 Addgene에서 제공하는 자세한 프로토콜에 의해 생성 될 수있다: <https://media.addgene.org/cms/파일/Zhang_lab_LentiCRISPR_library_protocol.pdf;> 고티터 렌티바이러스 준비 및 저장을 위한 최적화된 방법은다른 곳에서 17,18에대해 논의된다. 간단히 말해서, 렌티바이러스는 HEK 293T 세포내로 렌티바이러스 벡터 플라스미드, psPAX2 및 pMD2.G의 공동 형질감염에 의해 생성된다. 배양 상급제는 48 시간 후 형질 감염에서 수집되고 초원심분리에 의해 농축된다. 렌티바이러스 적전기는 시판되는 qPCR 기반 분석법에 의해 결정된다. 이 절차는 생체 안전 등급 II 캐비닛에서 수행해야합니다.
<ol><li>콜라겐 1:200 용액 준비 (0.0005%) 1x PBS에서.</li>
	<li>6개의 웰 플레이트를 콜라겐 용액으로 코팅하고 37°C에서 배양하고, 5%CO2를 ~30분 동안 배양한다.</li>
	<li>종자 293T 세포는 웰당 1 x 106 세포의 밀도로 37°C에서 배양하고, 5%CO2를 ~2시간 동안 배양한다.</li>
	<li>1개의 우물을 위한 3개의 형질감염 플라스미드의 혼합물을 준비하기 위하여는, 렌티바이러스 벡터의 0.9 μg, psPAX2의 0.6 μg 및 pMD2.G의 0.3 μg를 결합하고, 그 다음 탈이온수를 추가하여 10 μL의 총 부피를 달성한다. 웰 수에 따라 양을 조정합니다. 각 플라스미드의 양과 비율은 연구자의 요구에 맞게 더욱 최적화되어야 할 수도 있습니다.</li>
	<li>1x PBS 50 μL과 희석된 PEI MAX(1.0 mg/mL)를 플라스미드 혼합물에 조심스럽게 넣고 실온에서 15분 동안 배양합니다(표1).</li>
	<li>혼합물에 DMEM 1 mL을 추가합니다.</li>
	<li>6웰 플레이트로부터 의 매질, 플라스미드 혼합물 1 mL을 첨가하고, 37°C에서 배양하고, 5%CO2를 ~3시간 동안 배양한다.</li>
	<li>미디어를 신선한 DMEM 2 mL로 교체하고 37°C에서 배양하고 24시간 동안 5%CO2를 배양합니다.</li>
	<li>신선한 DMEM 1 mL을 추가하고 37 °C에서 배양하고 추가 24 시간 동안 5 % CO2를 배양하십시오 (총 배양 시간은 48 시간).</li>
	<li>배양 상급체를 3,000 x g에서 3,000 x g에서 15분 동안 원심분리기로 옮기고 자유 부동 세포를 제거한다.</li>
	<li>0.45 μm 필터를 통해 상급체를 걸.입니다.</li>
	<li>여과액을 폴리프로필렌 원심분리기로 옮김을 옮김.</li>
	<li>4 °C에서 72,100 x g의 초원심 분리기는 3 시간 동안 r최대값으로.</li>
	<li>조심스럽게 상류를 흡인, 흰색 펠릿 뒤에 떠나.</li>
	<li>폭기 없이 혈청이 없는 조혈 세포 팽창 배지의 100 μL로 펠릿을 다시 일시 중단합니다.</li>
	<li>10 μL aliquot를 유지하여 바이러스 성기를 측정하고 필요한 때까지 나머지 모든 알리쿼트(aliquots)를 -80°C에서 저장합니다.</li>
	<li>10 μL 바이러스 성 aliquot를 사용하여 제조자의 지시에 따라 qPCR 기반 분석법으로 바이러스를 적정화.</li>
</ol>2. 마우스 골수에서 계보 음성 세포의 격리 및 변환(그림 1A)
참고 : 일반적으로 충분한 세포를 분리하기 위해 각 마우스에서 경골, 대퇴골 및 휴머니 쌍을 수확합니다. 골반과 척추 뼈는 또한 계보 음성 세포의 근원으로 수확될 수 있습니다.
<ol><li>골수 세포의 격리<ol>
<li>8-10주 된 수컷 CRISPR/Cas9 노크인 마우스를 5% 이소플루란에 의해 자궁 경부 탈구를 한 다음 70% 에탄올로 피부를 소독합니다.</li>
		<li>해부 가위를 사용하여 흉곽 바로 아래의 피부에 가로 절개를하고 다리와 팔을 노출하기 위해 양방향으로 피부를 벗겨냅니다.</li>
		<li>엉덩이 관절을 분리하여 엉덩이 뼈에서 하반신을 조심스럽게 분리하십시오. 대퇴골 머리를 따라 잘라 엉덩이에서 대퇴골을 완전히 제거합니다. 뼈 골피를 그대로 유지하면서, 대퇴골과 경골을 분리하기 위해 관절에서 무릎을 탈구하고 잘라. 발목 관절을 탈구하고 발과 여분의 근육을 벗겨냅니다.</li>
		<li>해부 가위를 사용하여 어깨 위로 잘라 상지분리합니다. 어깨를 탈구한 다음 팔꿈치 관절을 잘라 상완골 뼈를 수확합니다.</li>
		<li>셀룰로오스 섬유 물티슈를 사용하여 대퇴골, 경골 및 후머리에서 근육을 조심스럽게 제거하십시오. 이 과정에서 뼈가 부러지지 않도록 추가 예방 조치를 취하십시오.</li>
		<li>분리된 뼈를 RPMI가 들어 있는 50mL 원추형 튜브에 넣고 얼음 위에 놓습니다. 참고: 다음 단계는 생체 안전 등급 II 캐비닛에서 수행해야 합니다.</li>
		<li>뼈를 멸균 된 100mm 배양 접시로 옮니다.</li>
		<li>무딘 집게로 뼈를 잡고 해부 가위를 사용하여 조심스럽게 두 골피를 잘라냅니다. 참고 : 부족한 절단은 골수의 불완전한 플러시로 이어질 것입니다, 지나치게 공격적인 절단은 세포 손실의 결과로.</li>
		<li>얼음처럼 차가운 RPMI로 10 mL 주사기를 채우고 22G 바늘을 사용하여 샤프트의 골수를 새로운 100mm 배양 접시로 씻어 내보웁니다. 참고: 뼈 샤프트가 잘 플러시된 경우 골격은 흰색과 반투명이 됩니다. 그렇지 않은 경우 뼈 끝을 다시 자르고 다시 플러시하십시오.</li>
		<li>모든 골수가 수집된 후, 18G 바늘로 10 mL 주사기를 통해 골수를 여러 번 통과시킴으로써 단세포 현탁액을 만든다. 10x를 반복하여 단일 셀 현탁액을 확인합니다.</li>
		<li>70 μm 세포 스트레이너를 통해 50 mL 원엽 튜브로 세포 현탁액을 필터링합니다.</li>
		<li>310 x g에서 4 °C에서 10 분 동안 원심 분리기.</li>
		<li>상판액을 흡인하고 다음 세포 분리 공정을 위해 최적화된 분리 버퍼의 적절한 부피에서 세포 펠릿을 재중단한다.</li>
	</ol></li>
	<li>계보 음성 세포의 격리 및 렌티바이러스 전염 참고: 마우스 계보 음성 세포는 Cas9 형질전환 마우스3,또는 마우스의 다른 변종으로부터 분리되어, 제조사의 지침에 따라 계보 고갈 키트를 사용한다. 전형적으로, 계보 음성 세포는 전체 골수 핵세포의 2%-5%를 차지하고, 순도는 일반적으로 격리 다음 90% 이상입니다. 분리된 계보-음성 세포는 20 ng/mL 재조합 murine TPO 및 50 ng/mL 재조합 뮤린 SCF로 보충된 혈청 없는 조혈 세포 확장 배지에서 배양된 다음, 16시간 동안 렌티바이러스 벡터로 트랜스듀에 감염 (MOI) = 100.<ol>
<li>계보 음성 세포를 분리하려면 제조업체의 지침에 따라 리니지 셀 고갈 키트를 사용하십시오.</li>
		<li>격리 후 혈청없는 조혈 세포 확장 배지의 1 mL에서 계보 음성 세포를 다시 중단합니다.</li>
		<li>1.5 x 106 셀 / mL (5 x 105 계보 음성 세포 / 마우스)의 밀도에서 6 개의 웰 플레이트로 세포를 시드하십시오.</li>
		<li>재조합 뮤린 TPO와 SCF를 각각 20 ng/mL 및 50 ng/mL의 최종 농도로 우물에 추가합니다.</li>
		<li>37°C에서 5%CO2에서 ~2시간 동안 사전 배양된 세포.</li>
		<li>MOI = 100, 4 μg/mL 폴리브렌, 페니실린/스트렙토마이신을 웰에 넣고 37°C에서 배양하고, 16-20h에 대해 5%CO2를 배양한다(그림1B).</li>
		<li>다음 날, 렌티바이러스 를 15 mL 원추형 튜브로 수혈하고 10 분 동안 300g에서 원심 분리기를 수집합니다.</li>
		<li>조심스럽게 상판을 흡인하고 마우스 당 RPMI의 200 μL에서 펠릿을 다시 중단하십시오. 쥐로 이식 될 때까지 RT에서 세포를 유지 (섹션 3).</li>
	</ol></li>
</ol>3. 의도적으로 조사 된 마우스로 변환 된 세포의 이식
<ol><li>골수 이식의 날에, 8 슬라이스 파이 케이지에 받는 마우스를 놓고 전신 조사의 두 복용량에 노출 (550 Rad/dose, 총 복용량 = 1100 Rad), 각 조사 세션 사이 약 4 시간.</li>
	<li>두 번째 조사 세션 후, 인슐린 주사기를 사용하여 레트로 궤도 정맥 신경총 (총 200 μL)을 통해 각 마취 된 수용자 마우스에 형질 전환 계보 음성 세포를 주입합니다(그림 1C).</li>
	<li>조사 후, 마우스는 살균 케이지에 보관하고 14 d에 대한 항생제로 보충 부드러운 식단과 식수를 제공해야합니다.</li>
	<li>골수 이식 후 3-4 주에서 말초 혈액을 분석하여 형질 전환 된 기증자 세포의 생착을 확인하십시오 (섹션 4).</li>
</ol>4. 말초 혈액의 키메라증 평가
<ol><li>5% 이소플루란으로 마우스를 마취시키고 모세관을 사용하여 레트로 궤도 정맥에서 혈액 샘플을 얻고K2EDTA 튜브로 수집합니다(모세관 의 부피는 다음 분석에 충분합니다).</li>
	<li>K2EDTA 튜브에서 20 μL의 혈액을 5 mL 둥근 바닥 폴리스티렌 시험관으로 옮기고 얼음위에 올려 놓습니다.</li>
	<li>적혈구를 lyseRBC 라시스 버퍼의 1.5 mL를 추가합니다. 얼음에 5 분 동안 배양.</li>
	<li>라시스 버퍼를 중화하려면 FACS 버퍼(1.5 mL/샘플)로 샘플을 세척합니다.</li>
	<li>4 °C에서 5 분 동안 r최대에서 609 x g의 원심 분리기. 상급제는 버리십시오.</li>
	<li>어둠 속에서 20 분 동안 RT에서 단일 클론 항체 (100 μL FACS 버퍼 / 샘플에서 희석)의 칵테일로 세포를 배양하십시오. 항체의 전체 목록은 위의 재료 섹션에 제공됩니다.</li>
	<li>FACS 버퍼 (2 mL / 샘플)로 세포를 한 번 씻으하십시오. 4 °C에서 5 분 동안 r최대 (1,800 rpm)에서 609 x g의 원심 분리기. 상급체를 완전히 버리십시오.</li>
	<li>4 °C에서 10 분 동안 고정 버퍼 (100 μL / 튜브)를 포함하는 파라 포름 알데히드로 세포를 고정하십시오.</li>
	<li>FACS 버퍼 (3 mL / 샘플)로 세포를 한 번 씻으하십시오. 4 °C에서 5 분 동안 r최대 (1,800 rpm)에서 609 x g의 원심 분리기. 상급체를 완전히 버리십시오.</li>
	<li>FACS 버퍼의 400 μL에서 펠릿을 일시 중단합니다.</li>
	<li>유세포 분석에 의한 분석까지 시료를 4°C로 유지합니다.</li>
</ol>

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<li>Fuster, J. J., Walsh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+Mutations+and+Clonal+Hematopoiesis%3A+Unexpected+Potential+New+Drivers+of+Age-Related+Cardiovascular+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulatory+Research%22%5BJournal%5D)">Somatic Mutations and Clonal Hematopoiesis: Unexpected Potential New Drivers of Age-Related Cardiovascular Disease.</a> Circulatory Research. 122, 523-532 (2018).</li>
<li>Kahn, J. D., et al. PPM1D truncating mutations confer resistance to chemotherapy and sensitivity to PPM1D inhibition in hematopoietic cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKahn%2C+JD+%22Blood%22">Blood</a>. , (2018).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

이 프로토콜의 장점은 기존의 마우스 형질전환 접근법에 비해 신속하고 매우 비용 효율적인 방식으로 조혈 세포에서 특정 돌연변이를 수용하는 동물 모델을 생성한다는 것입니다. 이 방법론은 조혈 세포 유전자 조작을 가진 마우스의 생성을 1 달 안에 가능하게 한다는 것을 것을을 발견되었습니다. 이 프로토콜에는 추가 고려가 필요한 몇 가지 중요한 단계가 있습니다.
gRNA 서열의 스크리닝
생체 외에서 gRNAs를 테스트하여 생체 내 실험을 수행하기 전에 편집 효율성을 평가하는 것이 좋습니다. gRNA의 효율은 무세포 생체외 전사 및 스크리닝 시스템을 사용하여 시험됩니다. 전사된 gRNA는 아가로즈 겔 전기동동을 사용하여 재조합 Cas9 단백질이 있는 템플릿 DNA를 분리할 때의 효율성을 측정함으로써 검증된다. 시판되는 키트는 이러한 목적으로 사용할 수 있습니다.
<p class="jove_content"...

혈액학 및 면역학에 있는 많은 연구 결과는 Mx1-Cre, Vav-Cre 및 그 외와 같은 조혈 계통 특정 Cre 드라이버를 이용하는 종래의 조건부 형질전환/녹아웃 마우스를 포함하여 유전자 변형마우스의 가용성에 의존합니다 1,2,3,4,5. 이러한 전략은 시간이 많이 걸리고 재정적으로 부담이 될 수있는 새로운 마우스 균주의 설립을 필요로한다. 게놈 편집 기술의 혁명적 인 발전은 적절한 기술 전문 지식으로 3-4 개월 만에 새로운 마우스 균주의 생성을 가능하게하는 동안6,7,8,9 실험을 추구하기 전에 마우스 콜로니를 증폭하는 데 훨씬 더 많은 시간이 필요합니다. 또한 이러한 절차는 비용이 많이 듭니다. 예를 들어, 잭슨 연구소는 균주당 $16,845(2018년 12월 현재)에 녹아웃 마우스 생성 서비스의 현재 가격을 나열합니다. 따라서, 종래의 뮤린 형질전환 접근법보다 더 경제적이고 효율적인 방법이 더 유리하다.
정기적으로 간격을 두는 짧은 palindromic 반복 /CRISPR 관련 단백질 9 (CRISPR / Cas9) 기술은 신속하고 효율적인 RNA 기반, 서열 특정 게놈 편집을위한 새로운 도구의 개발을 주도하고있다. 원래 침입 병원체 DNA를 파괴하는 세균 적응 면역 메커니즘으로 발견, CRISPR / Cas9 시스템은 진핵 세포와 동물 모델에서 게놈 편집의 효과를 높이기 위해 도구로 사용되어왔다. 다양 한 접근 조혈 줄기 세포에 CRISPR/Cas9 기계를 전송 하는 데 사용 되었습니다 (즉, 전기 천 공, 핵, lipofection, 바이러스 전달, 그리고 다른 사람).
여기서, 렌티바이러스 시스템은 Cas9 발현 뮤린 조혈 줄기 세포를 효과적으로 감염시키고 가이드 RNA 발현 구조, 프로모터, 조절 서열 및 인코딩하는 유전자를 함께 포장하는 능력으로 인해 세포를 트랜스듀싱하는 데 사용된다. 형광 리포터 단백질 (즉, GFP, RFP). 이 방법을 사용하여, 마우스 조혈 줄기 세포의 생체 내 유전자 편집이 달성되었으며, 그 다음으로 조사된 마우스10에서골수의 성공적인 재구성이 이루어졌다. 본 연구에 채택된 렌티바이러스 벡터는 리포터 유전자로부터 상류에 내부 리보좀 진입 부위를 가진 공통 코어 EF1a 프로모터로부터 Cas9 및 GFP 리포터 유전자를 발현한다. 가이드 RNA 서열은 별도의 U6 프로모터로부터 발현된다. 이 시스템은 후보 클론 조혈 드라이버 유전자 Tet2 및 Dnmt3a10에서삽입 및 결실 돌연변이를 생성하는 데 사용된다. 그러나,이 방법에 의한 환전 효율은 상대적으로 낮다 (~5%-10%) 벡터 인서트(13Kbp)의 크기가 커서 변환 효율을 제한하고 생산 중 바이러스 역가를 줄입니다.
다른 연구에서는, 더 큰 바이러스 RNA 크기가 바이러스 생산 및 전염 효율 모두에 부정적인 영향을 미친다는 것을 보여주었습니다. 예를 들어, 삽입 크기의 1kb 증가는 바이러스 생산을 ~50% 감소시키는 것으로 보고되고, 형질전환 효율은 마우스 조혈 줄기세포(11)에서50% 이상으로 감소할 것이다. 따라서, 시스템의 효율을 향상시키기 위해 바이러스 삽입물의 크기를 가능한 한 많이 줄이는 것이 유리하다.
이러한 단점은 Cas9 단백질이 구성적 또는 유도성 방식으로 발현되는 Cas9 형질전환 마우스를 채택함으로써 극복될 수 있다12. 구성CRISPR/Cas9 노크인 마우스는 유비쿼터스 방식으로 Rosa26 궤양에서 CAG 프로모터로부터 Cas9 엔도뉴클레아제 및 EGFP를 표현한다. 따라서, 코어 EF1a 프로모터의 제어 하에 U6 프로모터 및 RFP 리포터 유전자의 제어 하에 sgRNA를 이용한 컨스트럭트는 렌티바이러스 벡터를 이용하여 게놈 편집을 달성할 수 있다. 이 시스템으로, 조혈 줄기 세포의 유전자는 성공적으로 편집되었습니다, ~ 90% 형질 전환 효율을 보여주는. 따라서, 이 프로토콜은 표적 유전자 돌연변이가 조혈 계통내로 도입되는 마우스를 만드는 신속하고 효과적인 방법을 제공한다. 우리의 실험실은 주로 심혈 관 질환 과정에서 클론 조혈의 역할을 연구하기 위해 기술의이 유형을 사용하는 동안13,14,15,그것은 또한 혈액학의 연구에 적용 악성16. 더욱이, 이 프로토콜은 HSPC에 있는 DNA 돌연변이가 조혈 계통에 있는 그밖 질병 또는 발달 프로세스에 어떻게 영향을 미치는지의 분석으로 확장될 수 있습니다.
견고한 렌티바이러스 벡터 시스템을 확립하기 위해서는 조혈 세포의 전염 및 이식에 대한 높은 역가 바이러스 성 주식 및 최적화된 조건이 필요합니다. 프로토콜에서, 지침은 섹션 1에서 높은 역가 바이러스 주식의 제조에 제공되며, 섹션 2에서 뮤린 조혈 줄기 세포의 배양 조건을 최적화하고, 섹션 3에서 골수 이식 방법을 평가하고, 평가합니다. 섹션 4의 접착.

<table><tbody><tr><td>RPMI Medium 1640 (1X)</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td>Medium</td></tr><tr><td>Sulfamethoxazole 및 Trimethoprim 주사</td><td>TEVA</td><td>0703-9526-01</td><td></td></tr><tr><td>1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGE</td><td>EXELINT</td><td>26028</td><td>일반 공급</td></tr><tr><td>293T 세포</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216--</td><td>세포주</td></tr><tr><td>APC-anti-mouse Ly6C (클론 AL-21)</td><td>BD Biosciences</td><td>560599</td><td>항 체</td></tr><tr><td>APC-Cy7-anti-mouse CD45R (RA3-6B2)</td><td>BD Biosciences</td><td>552094</td><td>항체 BD</td></tr><tr><td>Luer-Lok 일회용 주사기, 10 ml</td><td>BD</td><td>309604</td><td>일반 공급</td></tr><tr><td>BD Microtainer 혈액 수집 튜브, K2EDTA 추가</td><td>BD Bioscience</td><td>365974</td><td>일반 공급</td></tr><tr><td>BD Precisionglide 바늘, 18 G</td><td>BD</td><td>305195</td><td>일반 공급</td></tr><tr><td>BD Precisionglide 바늘, 22 그램&nbsp;</td><td>BD</td><td>305155</td><td>일반 공급</td></tr><tr><td>BV510-anti-mouse CD8a (클론 53-6.7)</td><td>Biolegend</td><td>100752</td><td>항체</td></tr><tr><td>BV711-anti-mouse CD3e (클론 145-2C11)</td><td>Biolegend</td><td>100349</td><td>항체</td></tr><tr><td>콜라겐 송아지 피부</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9007-34-5</td><td>일반 공급</td></tr><tr><td>Corning Costar 초저 첨부 다중 웰 플레이트, 6 웰&nbsp;</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS3471</td><td>일반 공급</td></tr><tr><td>CRISPR/Cas9 넉인 마우스</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>028555</td><td>마우스</td></tr><tr><td>DietGel 76A</td><td>Clear H2O</td><td>70-01-5022</td><td>일반 공급</td></tr><tr><td>Dulbecco' 의 변형된 독수리' s 매체(DMEM) - 고포도</td>당 <td>Sigma Aldrich</td><td>D6429</td><td>매체</td></tr><tr><td>eBioscience 1X RBC 용해 완충액</td><td>Thermo fisher Scientific</td><td>00-4333-57</td><td>용액</td></tr><tr><td>Falcon 100mm TC-Treated Cell Culture Dish</td><td>Life Sciences</td><td>353003</td><td>일반 공급</td></tr><tr><td>Falcon 5 mL 둥근 바닥 폴리스티렌 시험관</td><td>Life Sciences</td><td>352054</td><td>일반 공급</td></tr><tr><td>Falcon 50 mL 원뿔형 원심분리기 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>352098 일반 공급</td></tr><tr><td>Falcon 6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate&nbsp;</td><td>생명 과학</td><td>353046</td><td>일반 공급</td></tr><tr><td>Fisherbrand 마이크로 헤마토크리트 모세관</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22-362566</td><td>일반 공급</td></tr><tr><td>Fisherbrand 멸균 세포 여과기, 70 &mu; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td>일반 공급</td></tr><tr><td>FITC-anti-mouse CD4 (Clone RM4-5)</td><td>Invitrogen</td><td>11-0042-85</td><td>항체</td></tr><tr><td>고정 완충액</td><td>BD Bioscience</td><td>554655</td><td>솔루션</td></tr><tr><td>가이드-it Compete sgRNA 스크리닝 시스템</td><td>클론텍</td><td>632636</td><td>키트</td></tr><tr><td>이소테시아(이소플루란) 솔루션</td><td>Henry Schein</td><td>29404</td><td>솔루션</td></tr><tr><td>Lenti-X qRT-PCR 적정 키트&nbsp;</td><td>Takara</td><td>631235</td><td>Kit</td></tr><tr><td>Lineage Cell Depletion Kit, mouse</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-858</td><td>Kit</td></tr><tr><td>Millex-HV 주사기 필터 유닛, 0.45 mm</td><td>Millipore Sigma</td><td>SLHV004SL</td><td>일반 공급</td></tr><tr><td>PBS pH7.4 (1X)</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>Solution</td></tr><tr><td>PE-Cy7-anti-mouse CD115 (Clone AFS98)</td><td>eBioscience</td><td>25-1152-82</td><td>항체와 관련상품</td></tr><tr><td>PEI MAX</td><td>Polysciences</td><td>24765-1</td><td>솔루션</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 혼합물</td><td>Lonza</td><td>17-602F</td><td>솔루션</td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5-anti-mouse Ly6G (Clone 1A8)</td><td>BD Biosciences</td><td>560602</td><td>항체</td></tr><tr><td>pLKO5.sgRNA.EFS.tRFP&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>57823</td><td>Plasmid</td></tr><tr><td>pMG2D</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td>Plasmid</td></tr><tr><td>Polybrene 감염/트랜스펙션 시약</td><td>Sigma Aldrich</td><td>TR-1003-G</td><td>솔루션</td></tr><tr><td>폴리프로필렌 원심분리기 튜브</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>326823</td><td>일반 공급</td></tr><tr><td>psPAX2&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td>플라스미드</td></tr><tr><td>RadDisk &ndash; 설치류 조사기 디스크</td><td>Braintree Scientific</td><td>IRD-P M</td><td>일반 공급</td></tr><tr><td>재조합 쥐 SCF</td><td>Peprotech</td><td>250-03</td><td>솔루션</td></tr><tr><td>재조합 쥐 TPO&nbsp;</td><td>페프로텍&nbsp;</td><td>315-14</td><td>솔루션</td></tr><tr><td>StemSpan SFEM</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>09600</td><td></td></tr><tr><td>솔루션 TOPO TA 클로닝 키트, One Shot TOP10 화학적으로 유능한 대장균</td><td>써모 피셔 Scientific</td><td>K457501</td><td>키트</td></tr>, <tr><td>좀비 아쿠아 고정 가능한 생존력 키트</td><td>, BioLegend</td><td>423102</td><td>솔루션&nbsp;</td></tr></tbody></table>

질병 모델에서 조혈 세포의 연구를 위한 렌티바이러스 crispr/cas9 매개 게놈 편집

Lentiviral CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing for the Study of Hematopoietic Cells in Disease Models

기존의 종족 형성 접근법을 사용하여 조혈 줄기 세포에서 유전자를 조작하는 것은 시간이 많이 걸리고 비용이 많이 들며 도전적일 수 있습니다. 게놈 편집 기술 및 렌티바이러스 매개 이식 유전자 전달 시스템의 발전으로부터 이익을 얻는 효율적이고 경제적인 방법은 조혈 줄기 세포에서 유전자가 특별히 조작되는 마우스를 확립하는 데 설명되어 있습니다. 렌티바이러스는 Cas9 발현 계보 음성 골수 세포를 특정 유전자 및 적색 형광 리포터 유전자(RFP)를 표적으로 하는 가이드 RNA(gRNA)로 트랜스듀싱한 다음, 이들 세포는 Lethally-조사된 C57BL/6 마우스로 이식됩니다. 비표적GRNA를 발현하는 렌티바이러스로 이식된 마우스는 대조군으로 사용된다. 형질전환된 조혈 줄기 세포의 생착은 말초 혈액의 RFP 양성 백혈구의 유세포 분석으로 평가된다. 이 방법을 사용하여 이식 후 4 주에 골수성 세포의 ~ 90 % 이식 및 ~ 70 %의 림프세포를 달성 할 수 있습니다. 게놈 DNA는 RFP 양성 혈액 세포로부터 분리되고, 표적 부위 DNA의 일부는 게놈 편집을 검증하기 위해 PCR에 의해 증폭된다. 이 프로토콜은 조혈-조절 유전자의 높은 처리량 평가를 제공하고 조혈 세포 침범을 가진 다양한 마우스 질환 모델로 확장될 수 있다.

전술한 프로토콜을 사용하여, 마우스당 약 0.8-1.0 x 108개의 골수 세포를 수득하였다. 우리가 얻는 계보 음성 세포의 수는 마우스 당 대략 3 x 106 세포입니다. 전형적으로, 골수 계보-음성 세포의 수율은 총 골수 핵 세포의 4%-5%입니다.
형질전환된 세포의 키메리즘(RFP-양성)은 말초 혈액의 유세포측정에 의해 평가된다(도2A,B). 혈액은 레트로 궤도 정맥으로부터 분리되고 적절한 마커는 각 조혈 세포 집단(즉, 호중구, 단핵구, T 세포 등)의 정체성을 결정하는 데 사용됩니다. (그림3A,B). 게놈 DNA는 RFP 양성 혈액 세포로부터 분리될...

설명된 것은 CRISPR/Cas9 시스템에 의한 뮤린 조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC)의 고효율 게놈 편집을 위한 프로토콜로 조혈 시스템 별 유전자 수정을 통해 마우스 모델 시스템을 신속하게 개발합니다.

질병 모델에서 조혈 세포의 연구를 위한 렌티바이러스 CRISPR/Cas9 매개 게놈 편집

Manipulating genes in hematopoietic stem cells using conventional transgenesis approaches can be time-consuming, expensive, and challenging. Benefiting ...

우리는 조혈 줄기 세포에서 특히 유전자 조작으로 마우스를 확립하는 효율적이고 경제적인 방법을 개발했습니다, 게놈 편집 기술과 렌즈바이러스 매개 트랜스진 전달 시스템을 사용하여. 이 프로토콜의 장점은 기존의 마우스 형질 전환 접근법에 비해 신속하고 비용 효율적인 방식으로 조혈 세포에서 특정 돌연변이를 수용하는 동물 모델을 만들 수 있다는 것입니다. 절차를 시연하는 것은 잉 왕, 내 실험실에서 연구원이 될 것입니다.렌티바이러스 입자를 생성하려면 콜라겐 용액으로 6개의 웰 플레이트를 코딩하고 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 30분 동안 배양하는 것으로 시작합니다. 그런 다음, 293T 세포를 접시에 넣고 또 다른 2시간 동안 배양한다. 한편, 렌티바이러스 벡터0.9 마이크로그램, psPAX20.6 마이크로그램 및 pMD20.3 마이크로그램을 결합하여 3개의 트랜스펙트 플라스미드의 혼합물을 준비한다.G와 잘 당 10 마이크로 리터로 디온화. 이어서, 1X PBS 50마이크로리터와 희석된 PEI MAX 5마이크로리터를 플라스미드 혼합물에 조심스럽게 추가하고, 15분 동안 실온에서 혼합물을 배양한다. 인큐베이션 후 DMEM의 밀리리터 1개를 추가합니다.6 개의 우물 플레이트에서 미디어를 흡인하고 각 우물에 플라스미드 혼합물 1 밀리리터를 추가합니다. 접시를 3시간 더 배양합니다. 미디어를 신선한 DMEM으로 교체하고 24시간 동안 배양합니다.신선한 DMEM 1밀리리터를 추가하고 24시간 추가로 배양합니다. 총 48시간 인큐베이션 후, 상체관을 50밀리리터 튜브로 옮기고 원심분리기를 15분 동안 3000회 G로 이송하여 자유 부동 세포를 제거합니다. 0.45 마이크로미터 필터와 초원심분리기를 3시간 동안 필터링합니다.조심스럽게 상류체를 흡인하고 흰색 펠릿을 남깁니다. 혈청이 없는 조혈 세포 팽창 배지의 100 마이크로리터로 펠릿을 다시 중단합니다. 10 마이크로리터 알리쿼터를 보관하여 바이러스 성 티터를 측정하고 나머지 현탁액을 영하 80°C에 보관하십시오.뼈를 격리한 후 RPMI가 있는 50밀리리터 원추형 튜브에 넣고 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 바이오 안전 캐비닛에서 뼈를 멸균 100mm 배양 접시로 옮킨다. 그런 다음 무딘 집게로 뼈를 잡고 해부 가위를 사용하여 두 epiphyss를 조심스럽게 자른다.얼음 차가운 RPMI로 10 밀리리터 주사기를 채우고 22 게이지 바늘을 사용하여 샤프트에서 골수를 새로운 100mm 배양 접시로 플러시합니다. 모든 골수가 수집 된 후, 18 게이지 바늘로 10 밀리리터 주사기를 통해 골수를 통과하여 단일 세포 현탁액을 합니다. 70 마이크로미터 세포 여과기를 통해 셀 서스펜션을 50밀리리터 원내 튜브로 필터링합니다.그런 다음 원고 의 지시에 따라 튜브를 원심 분리하고 슈퍼 나티튜트와 흡인합니다. 최적화된 분리 버퍼의 적절한 부피로 셀 펠릿을 다시 일시 중단합니다. 계보 음성 세포를 격리하려면 제조업체의 지침에 따라 계보 세포 고갈 키트를 사용하십시오.혈청이 없는 조혈 세포 팽창 배지에서 격리된 계보 음성 세포를 다시 중단한다. 2시간 동안 5%의 이산화탄소로 37도의 세포에 사전 배양합니다. 그런 다음 원고 방향에 따라 렌즈바이러스를 추가하고 다른 16 ~ 20 시간 동안 인큐베이터에 세포를 둡니다.다음 날, 15 밀리리터 원추형 튜브에서 렌티바이러스 변환 된 세포를 수집하고 10 분 동안 300 배 G에서 원심 분리합니다. NHA 지침에 따르면, 리스 그룹 레벨 2에서 렌티 바이러스 벡터를 처리하는 것이 중요합니다. 시설 규정에 따라 주의사항을 취해야 합니다.조심스럽게 슈퍼 나티를 흡인하고 마우스 당 RPMI의 200 마이크로 리터에서 펠릿을 다시 중단. 생쥐로 이식될 때까지 세포를 실온에서 유지하십시오. 두 번째 조사 세션 후, 레트로 궤도는 인슐린 주사기를 사용하여 각 마취 마우스에 추론 된 네거티브 세포를 주입합니다.골수 이식 후 3~4주 후에 모세관 튜브를 사용하여 레트로 궤도 정맥에서 혈액 샘플을 채취한다. 혈액 20 마이크로리터를 둥근 바닥 폴리스티렌 테스트 튜브로 옮기고 얼음 위에 놓습니다. RBC 용해 후, 실온에서 20 분 동안 어둠 속에서 단일 클론 항체의 칵테일로 세포를 배양하십시오.인큐베이션 후, 세척, 수정 및 원심분리및 FACS 버퍼의 400 마이크로리터에서 세포 펠릿을 다시 중단한다. 혈중 세포측정에 의한 분석이 될 때까지 샘플을 섭씨 4도에서 유지합니다. 리니지 음성 세포 변환의 성공은 RFP의 유동 세포 측정 검출으로 평가될 수 있다.체외 배양 7일 후, 평균적으로 세포의 75.7%가 전염된다는 것이 입증되었습니다. 유동 세포질은 또한 변환및 비유도 조혈 줄기 세포로 재구성 한 후 마우스 말초 혈액을 분석하는 데 사용되었습니다. 호중구의 평균 94.8%, 단핵구의 93.5%, B 세포의 82.7%가 RFP를 발현한다.RFP 양성 혈액 세포로부터의 유전체 DNA는 서열 분석을 위해 PCR 증폭 및 하위 복제되었습니다. 다양한 돌연변이가 검출되고 클론의 69%는 프레임 또는 조기 정지 돌연변이에서 보여줍니다. 이 절차로 성공하려면 높은 바이러스 백신 재고의 준비와 조혈 세포의 트랜스포메이션 및 이식을위한 최적화 된 조건이 필요합니다.우리는 심장 혈관 질병의 법칙을 연구하기 위해이 기술을 적용했습니다. 그러나 혈액학적 악성 종양을 연구하는 것도 유용합니다. 이 방법을 사용하면 고효율이고 높은 방식으로 조혈 시스템에서 새로운 유형의 유전자 기능을 연구 할 수 있습니다.우리는 형질 전환 마우스의 가용성을 통해 이것을 수집합니다.

lentiviral-crisprcas9-mediated-genome-editing-for-study-hematopoietic

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

타겟된 유전자 CRISPR/Cas9를 사용 하 여 편집 크게 유전자의 생물 학적 기능에 대 한 이해를 촉진 했다. 여기, 우리가 그들의 종양 활동을 공부 하기 위하여 모델 calreticulin 돌연변이 cytokine 종속 조 혈 모 세포에서에 CRISPR/Cas9 방법론을 활용 합니다.

CRISPR/Cas9를 사용 하 여 유전자 돌연변이 Calreticulin Cytokine 종속 조 혈 모 세포에서의 종양 활동을 조사 하기 위해 편집

프로토콜에 대 한 빠른 마우스에서 유전자 장애 CRISPR/Cas9-중재 하 고 인간의 기본 조 혈 모 세포가이 문서에서 설명 하는. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins sgRNAs 녹음 방송 생체 외에서 그리고 상업적인 Cas9를 통해 생성 된 electroporation 통해 소개 된다. 높은 편집 효율성 제한 시간 및 금융 비용으로 달성 된다.

CRISPR/Cas9에 의해 Murine 인간과 조 혈 조상 세포의 고효율 유전자 장애

소 Cas9를 활용 하 여 복잡 한 ribonucleoprotein (RNP)은 정확 하 고 효율적인 게놈 편집에 대 한 강력한 방법입니다. 여기, 우리가 강조의 유틸리티 세포와 생물의 광범위 한 범위에 걸쳐 기본 인간 세포 등 모두 클래식 하 고 모형 유기 체를 신흥.

향상 된 게놈 세포와 유기 체에서 다양 한 Cas9 Ribonucleoprotein 편집

타겟 DNA epigenome 나타냅니다 편집 강력한 치료 접근. 이 프로토콜에 설명 합니다 생산, 정화, 그리고 모든-에-하나의 lentiviral 벡터 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC)에서 epigenome 편집 응용 프로그램에 대 한 CRISPR-dCas9-DNMT3A transgene 은닉의 농도-신경 파생.

인간으로 Epigenome 편집 도구의 효율적인 배달 lentiviral 벡터 플랫폼 유도 만능 줄기 세포 유래 질병 모델

여기에 제시된 것은 튜브 전기포공을 이용한 포유류 세포에서 효율적인 CRISPR/Cas9 리보뉴클레오단백질 매개 유전자 편집을 위한 프로토콜이다.

CRISPR/Cas9 리보뉴클레오단백질-튜브 전기포공에 의한 정밀 유전자 편집

본 프로토콜은 생체 내에서 유전자 편집 세포의 강력한 생착을 위한 최적화된 조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC) 배양 절차를 설명합니다.

유전자 치료 애플리케이션을 위한 조혈 줄기 및 전구 세포의 CRISPR/Cas9 유전자 편집

조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC)의 체세포 돌연변이를 충실하게 모델링하는 새로운 전략은 조혈 줄기 세포 생물학 및 혈액 악성 종양을 더 잘 연구하는 데 필요합니다. 여기에서는 CRISPR/Cas9의 사용과 이중 rAAV 공여체 형질도입을 결합하여 HSPC에서 이형접합체 기능 획득 돌연변이를 모델링하는 프로토콜이 설명됩니다.

인간 조혈 줄기 및 전구 세포에서 발암성 이형접합체 기능 획득 돌연변이 공학

제시된 방법은 고효율 렌티바이러스 매개 유전자 전달 시스템을 사용하여 L2HGDH 유전자를 표적으로 하는 sgRNA를 안정적으로 발현하는 인간 배아 줄기 세포(hESC) 계통 H9에서 CRISPR 매개 유전자 knockout의 생성을 설명합니다.

CRISPR-Cas9 매개 유전자 결실은 feeder-free 조건에서 배양된 인간 만능 줄기 세포에서 발생합니다.

THP-1 세포주는 다양한 생물학 관련 연구 분야에서 인간 단핵구/대식세포의 기능을 조사하기 위한 모델로 널리 사용됩니다. 이 논문에서는 효율적인 CRISPR-Cas9 기반 엔지니어링 및 단일 세포 클론 분리를 위한 프로토콜에 대해 설명하여 강력하고 재현 가능한 표현형 데이터를 생성할 수 있습니다.

THP-1 세포의 전기천공법 기반 CRISPR-Cas9 매개 유전자 녹아웃 및 단일 세포 클론 분리

여기에서는 CRISPR/Cas9 기술과 Cell Counting Kit-8(CCK-8) 분석을 통합하여 조혈 줄기 세포 및 전구 세포의 비정상적인 증식 능력에 중요한 후보 유전자를 식별하는 프로토콜을 제시합니다.

CRISPR/Cas9 기술과 세포 계수를 결합한 조혈 줄기 및 전구 세포의 비정상 성장 관련 유전자 평가

배우세요 CRISPR/Cas9와 렌티바이러스를 이용한 조혈 줄기세포 게놈 편집 방법입니다. 이 기술은 murine HSPC에서 특이적 유전자 변형을 신속하고 경제적으로 수행하여 혈액 질환 연구에 활용됩니다.

질병 모델에서 조혈 세포의 연구를 위한 렌티바이러스 CRISPR/Cas9 매개 게놈 편집

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