Name: 예쁜꼬마선충의 세포구조와 세포세포형태를 연구하기 위한 정량적 접근법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: 배우세요 C. elegans에서 시냅스 크기와 근육 형태를 정량 분석하는 방법을 CellProfiler와 Fiji 소프트웨어를 활용하여. 이 기법은 유전자 돌연변이가 세포 구조에 미치는 영향을 객관적으로 평가하는 데 활용됩니다.

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노이만 연구소의 회원들에게 귀중한 토론과 의견을 주신 것에 감사드립니다. 일부 균주는 연구 인프라 프로그램의 NIH 사무실 (P40 OD010440)에 의해 투자되는 CGC에 의해 제공되었다. 저자는 C. 예쁜 꼬마에대한 풍부한 정보에 대한 WormBase 감사, 모나시 마이크로 이미징인정, 모나시 대학, 계측의 제공에 대한, 교육 및 기술 지원. 이 작품은 CMTAA 연구 보조금 (2015 및 2018)에 의해 지원되었으며, NHMRC 프로젝트 보조금 1101974 및 1099690 B.N에 수여.

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</ol>

저자는 경쟁적인 이해관계가 없다고 선언합니다.

형태학적 변화는 눈에 띄는 차이의 수동 계산을 통해 자주 평가되거나 야생 형 표현형에 비해 결함을 결정하기 위해 임의의 임계값을 사용하여 평가되었습니다. 그러나 최근에는 형태학의 비교 연구를 통해 세포 및 세포 내 하위 수준변화를 편견 없는 방식으로 정확하게 측정하고 설명하는 정량적 방법이 사용되고 있습니다. 표현형 간의 미묘하면서도 생물학적으로 관련된 차이를 식별하는 능력은 환경 적 요인이나 유전 질환으로 인한 형태학의 변화를 제어하는 기본 분자 메커니즘을 이해하는 강력한 수단입니다. C. elegans 유전학의 성장용이성과 다기능성과 결합된 계산 능력 및 현미경 이미징 해상도의 지속적인 증가는 정교하면서도 자유로운 이미징 소프트웨어의 조합을 위한 완벽한 플랫폼을 제공했습니다. 섬세한 공초점 이미지로. 여기에서, 우리는 시냅스 크기 및 단백질 국소화, 신체 벽 근육 지역 및 섬유 길이 및 다양한 유전 적 배경에서 미토콘드리아 형태를 평가하고 정량화하는 방법을 입증했습니다.
<p class="jove_co...

선충 제 Caenorhabditis (C. 예쁜 꼬마)는 점점 인간 질병에 관련 된 생물학적 및 분자 과정을 밝히기 위해 모델 시스템으로 활용. 성인 선충은 몸 길이가 1mm에 불과하며 최대 300 개의 계란1의 큰 무리를 생성 할 수 있습니다. 부화 후, C. 예쁜 꼬마는 성인기에 도달하는 데 3-4 일이필요하며 2 주 에서 2 주 정도 살 수 있습니다. 배양의 용이성 으로 인해, C. elegans는 현재 인간 질병에 대한 치료법을 식별하기 위해 비용 효율적이고 신속한 약물 스크리닝을 수행하기위한 생체 내 동물 모델 중 가장 인기있는 모델 중 하나입니다. 또한, 그것의 유전 보존, 잘 정의 된 행동 패러다임, 형광 또는 가벼운 현미경 검사법에 대한 투명한 몸, 유전 조작의 용이성은 쉽게 유전자 돌연변이의 세포 및 분자 결과의 연구를 쉽게 달성 할 수 3. C. elegans 게놈은 인간 유전자와 약 60-80 %의 정형 외과를 공유하며, 그 유전자의 약 40 %는 질병과 관련된 것으로 알려져 있습니다. C. 예쁜꼬마선충에서 모델링되고 연구된 몇몇은 신경퇴행성 질환 (알츠하이머병, 파킨슨병, 근위축성 측삭 경화증, 샤르코-마리-투스 질환), 근육 관련 질환( Duchenne 근 이영양증), 및 대사 성질환 (고혈당증) 2,4. 대부분의 인간 장애에서, 질병 유도 된 세포 및 세포 국소화 및 형태 학적 변화가 발생, 이는 선충 모델에서 쉽게 평가 될 수있다.
형광 마커는 현미경의 밑에 동적 시각화를 위한 조직 및 세포기관을 표지하기 위하여 널리 이용되었습니다. 그러나, C. elegans에서는,유전 돌연변이 때문에 형태학적 불규칙성을 평가하는 전통적인 방법은 시각적인 설명에 크게 의존했습니다. 질적 평가는 현상형 설명의 넓은 범위를 커버 할 수 있지만 (시냅스 형태, GFP 응집, 특정 축삭 모양, 근육 섬유 두께, 기타) 형태 변화의 조감도를 제공, 그들은 덜 적합 다른 그룹에 걸쳐 작은 변화를 비교. 또한, 정성적 평가는 형태학적 이상에 대한 과대 평가 또는 과소 평가로 이어질 수 있는 시각적, 주관적 평가를 기반으로 합니다. 마지막으로, 정성적 관찰은 개인마다 크게 달라질 수 있으므로 데이터 복제에 어려움을 겪을 수 있습니다.
최근에는 이미지를 정량적으로 분석할 수 있는 사용자 친화적이고 쉽게 사용할 수 있는 여러 가지 계산 알고리즘이 개발되었습니다. 그러나, C. elegans 연구에서, 특히 바디 벽 근육 및 미토콘드리아와 관련하여 몇몇 형태학 연구를 위한 그 같은 심상 분석 소프트웨어의 이용은 뒤쳐졌습니다. C. elegans에있는 근본적인 구조 분석을 개량하기 위하여는, 쉽게 유효한, 오픈 소스 심상 분석 소프트웨어의 몇몇은 근육 미토콘드리아, 바디 벽 근육 및 시냅스에 대한 유전 돌연변이의 효력을 정량적으로 비교하기 위하여 시험되었습니다 형태학. 이러한 실험 절차는 이러한 프로그램(피지, ilastik, CellProfiler, SQUASSH)이 시냅스 크기 및 시냅스 단백질 국소화, 신체 벽 근육 영역 및 섬유질 길이, 및 미토콘드리아 크기의 변화를 평가하는 데 어떻게 사용될 수 있는지 자세히 설명하고, 선충에 있는 유전 돌연변이 결과로 원형.

<table><tbody><tr><td>한천</td><td>Merck</td><td>1.01614.1000</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Leica</td><td>TCS SP8</td><td>도립 플랫폼</td></tr><tr><td>형광 현미경</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>Zeiss Axio Imager M2</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslips #1</td><td>Thermo scientifique</td><td>MENCS22221GP</td><td></td></tr><tr><td>Glass 커버슬립 #1.5</td><td>Zeiss</td><td>474030-9000-000</td><td>Made by SCHOTT</td></tr><tr><td>유리 슬라이드</td><td>Thermo scientifique</td><td>MENS41104A/40</td><td></td></tr><tr><td>Light LED</td><td>Schott</td><td>KL 300 LED</td><td></td></tr><tr><td>스테레오 현미경</td><td>Olympus</td><td>SZ51</td><td></td></tr><tr><td>트립톤(카제인의 펩톤)</td><td>Merck</td><td>107213</td><td>용해성 육수(LB) 배지</td></tr><tr><td>효모 추출물 성분</td><td>Merck</td><td>103753</td><td>Lysogeny Broth(LB) 매체</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Merck</td><td>106404</td><td>원료 Lysogeny Broth(LB) 매체</td></tr><tr><td>펩톤(육류의 펩톤)</td><td>Merck</td><td>107214</td><td>선충 성장 배지(NGM) 한</td></tr><tr><td>천 Sigma</td><td></td><td>A1296</td><td>성분 선충 성장 배지(NGM) 한천</td></tr> 염화<tr><td>나트륨</td> <td>성분Merck</td><td>106404</td><td>선충 성장 배지(NGM) 성분</td></tr> 한천 <tr><td>콜레스테롤</td><td>시그마</td><td>C8667-25G</td><td>선충 성장 배지(NGM) 성분 한천</td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>Merck</td><td>102382</td><td>선충 성장 배지(NGM) 성분 한천</td></tr><tr><td>황산마그네슘</td><td>Merck</td><td>105886</td><td>선충 성장 배지(NGM) 원료 한천</td></tr><tr><td>인산이칼륨</td><td>Merck</td><td>105101</td><td>선충 성장 배지 (NGM) 성분 한천</td></tr><tr><td>이수소 인산염 머</td><td>크</td><td>104873</td><td>선충 성장 배지 (NGM) 원료 한천</td></tr><tr><td>인산이 나트륨</td><td>머크</td><td>106586</td><td>M9 완충</td></tr><tr><td>액 성분 염화나트륨</td><td>머크</td><td>106404</td><td>M9 완충</td></tr>액 성분 인<tr><td>산</td><td>이수소 칼륨Merck</td><td>104873</td><td>M9 완충</td></tr>액 원료 <tr>황<td>산 마그네슘</td><td>Merck</td><td>105886</td><td>M9 완충</td></tr>액 <tr><td>원료 파스퇴르 피펫</td><td>Corning</td><td>CLS7095D5X-200EA</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>Corning</td><td>CLS430589-500EA</td><td></td></tr><tr><td>플래티넘 와이어</td><td>Sigma</td><td>267201-2G</td><td></td></tr><tr><td>주걱</td><td>Met-app</td><td>2616</td><td></td></tr><tr><td>테트라미솔 염산염</td><td>시그마</td><td>L9756-5G</td><td></td></tr></tbody></table>

예쁜꼬마선충의 세포구조와 세포세포형태를 연구하기 위한 정량적 접근법

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

근본적인 질병의 발달을 위한 세포 기계장치를 정의하는 것은 새로운 치료법의 발달을 위해 필수적입니다. 이 기계장치를 해명하기 위하여 빈번하게 이용되는 전략은 후보 유전자에 있는 돌연변이를 소개하고 조직과 세포 기관의 형태에 있는 변경을 질적으로 기술하기 위한 것입니다. 그러나, 질적 설명은 미묘한 표현형 차이를 포착하지 않을 수 있습니다, 인구에있는 개인에 걸쳐 표현형 변화를 잘못 표현 할 수 있습니다, 자주 주관적으로 평가된다. 여기서, 정량적 접근법은 시판되는 생체 이미지 처리 소프트웨어와 결합된 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 사용하여 선충 제대인 예쁜꼬마선충에서 조직 및 소기관의 형태를 연구하기 위해 기술된다. 시냅스 무결성에 영향을 미치는 표현형의 정량적 분석(크기 및 통합 형광 수준), 근육 발달(근육 세포 크기 및 미오신 필라멘트 길이), 미토콘드리아 형태(원형 및 크기)를 이해하기 위해 수행되었습니다. 이 세포 구조에 유전 돌연변이의 효력. 이러한 정량적 접근법은 선충뿐만 아니라 다른 모델 유기체에서 다른 조직 및 세포기관의 형태를 정량적으로 평가하는 데 쉽게 사용될 수 있기 때문에 여기에 기술된 응용 분야에 한정되지 않는다.

C. 예쁜꼬마선충은 단순성, 알려진 세포 계수, 투명성 및 사용 가능한 도구로 인해 다양한 조직 및 세포기관의 형태를 연구하기위한 이상적인 모델 유기체입니다. 여기에서는 살아있는 형광 이미징 및 무료 생체 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 시냅스와 근육을 포함한 세포기관(예: 미토콘드리아) 및 조직을 연구하기 위한 정량적 접근법을 제공합니다.
MEC-17 발현의 엄격한 규제는 정상적인 시냅스 개발을 위해 필요합니다.
신경계에서 알파-튜툴린 아세틸-트랜스퍼라제 MEC-1714,15,16의 기능을 더 이해하기 위해, 우리는 단백질17을과발현하는 C. elegans의 <...

이 연구는 자유롭게 사용할 수있는 이미지 처리 도구를 사용하여 C. elegans에서 시냅스 크기와 현지화, 근육 형태 및 미토콘드리아 모양의 정량적 측정을 설명합니다. 이 접근은 C. elegans에 있는 미래 연구 결과가 유전 돌연변이 결과로 조직과 세포기관 구조 변경의 넓이를 정량적으로 비교하는 것을 허용합니다.

Defining the cellular mechanisms underlying disease is essential for the development of novel therapeutics. A strategy frequently used to unravel these ...

조직 과 세포기관의 형태학에 있는 변경을 정량화하는 기능은 유전 돌연변이의 충격 뿐만 아니라 유전자 기능을 이해하는 것을 위해 중요합니다. 우리의 프로토콜은 선충, C.elegans에서 시냅스, 근육 및 미토콘드리아의 형태를 주관적으로 평가하는 데 사용할 수있는 소프트웨어를 얼마나 자유롭게 사용할 수 있는지 설명합니다. 많은 이전 연구는 형태 학적 변화를 비교하기위한 질적 방법에 의존했다.그러나 미묘한 표현성 차이를 포착하지 못하고 변경 내용을 과소 평가할 수 있으며 주관적으로 평가되기 때문에 문제가 될 수 있습니다. 우리의 정량적 방법은 형태학적 변화를 평가하기 위한 보다 강력하고 편향된 수단을 제공합니다. 이 방법은 유전자 기능 및 질병 관련 돌연변이의 결과를 정의하기 위하여 그밖 세포 구조물 또는 모형 유기체에 있는 형태학적 변경을 공부하기 위하여 쉽게 이용될 수 있었습니다.먼저 이미징슬라이드를 준비합니다. 녹인 아가로즈 한 방울을 현미경 슬라이드에 놓고 즉시 다른 현미경 슬라이드로 물방울을 눌러 아가로즈를 부드럽게 평평하게 합니다. 아가로즈를 1분 동안 건조하게 한 다음 두 슬라이드를 조심스럽게 분리하고 고형패드를 슬라이드 중 하나에 둡니다.현미경 단계에 슬라이드를 놓고 아가로즈 패드의 중앙에 마취제의 5 ~ 10 밀리리터 드롭을 추가합니다. 열 살균 된 선택을 사용하여 용액이 건조되기 전에 스톡 플레이트에서 마취 액으로 10 ~15 마리의 동물을 신속하게 이송하십시오. 그런 다음 아가로즈 패드 바로 위에 위치하여 커버슬립을 바르고 부드럽게 떨어 뜨립니다.488 나노미터 및 552 나노미터 광학 펌핑 반도체 다이오드 레이저와 결합된 라인 스캐닝 공초점 현미경으로 시냅스 영역을 이미지 캡처 소프트웨어가 장착되어 있습니다. 웜을 찾은 후 40배율로 전환하고 침수 매체를 적용합니다. 552 나노미터 레이저, 태그RFP 형광로에 대한 1 %의 전력, 488 나노미터, GFP 형광에 대한 2 %의 전력으로 형광을 흥미진진하게 시냅스 영역을 시각적으로.하이브리드 광검출기를 사용하여 이미지를 캡처하고 형광의 과다 노출을 방지하기 위해 이득을 설정합니다. Z 스택 이미지를 수집하여 목표에 따라 최적의 Z 단계 크기를 사용하여 전체 시냅스를 덮습니다. 시냅스 영역을 분석하려면 이미지를 CellProfiler 3.1.5 소프트웨어에 로드하는 것으로 시작됩니다.NameAndType 모듈을 설정하고 UIS-115 트랜스진으로부터 발현된 확산 태그RFP를 사용하여 시냅스 영역을 손 정의로 결정한다. 파이프라인에 MeasureObjectSizeShape 및 MeasureObjectIntensity 모듈을 추가하여 손으로 정의된 시냅스의 크기와 형광을 측정합니다. 그런 다음 계산매 모듈을 추가하고 JSIS37으로부터 얻은 통합 강도 단위를 UIS-115로부터 획득한 것으로 분할하여 상대적 통합 형광 강도를 계산합니다.완료되면 모든 측정 및 계산을 내보낼 수 있습니다. 근육 세포 영역 피지 소프트웨어에서 이미지를 열고 신중 하 게 단일 경사 근육 세포 주위 추적 폴리 곤 선택을 사용 하 여 측정 합니다. 트레이싱을 개선하기 위해 앵커 점을 드래그하여 끝에 다각형의 선을 조정합니다.소프트웨어 상단의 분석 탭으로 이동하여 측정값을 클릭하여 선택한 영역을 계산합니다. 분해되거나 누락된 영역이 있는 근육 세포의 경우 다각형 선택 도구를 사용하여 누락된 영역을 추적하고 측정을 다시 클릭합니다. 간격이 여러 개 있는 경우 각 간격을 별도로 추적합니다.전체 셀의 영역에 대한 갭 영역의 비율을 계산합니다. 비율이 높은 것은 근육 퇴행성의 더 높은 범위를 나타냅니다. 누락된 영역이 없는 경우 비율은 0으로 계산됩니다.탄력성을 열고 새 프로젝트 만들기 에서 픽셀 분류를 선택합니다. 그런 다음 프로젝트의 이름을 변경하고 저장합니다. 입력 데이터 탭으로 이동하여 새 추가를 클릭한 다음 별도의 이미지를 추가합니다.팝업 창을 TIF 파일로 폴더로 직접 설정하고 원하는 이미지를 선택합니다. 기능 선택 탭에서 피처 선택 을 클릭하여 녹색 틱 된 상자에 표시된 모든 픽셀 피처를 선택합니다. 이 단계의 픽셀 선택은 다음 단계에서 다른 픽셀 클래스를 구별하는 데 사용됩니다.트레이닝 패널을 사용하여 개별 GFP 표현 미오신 필라멘트와 원치 않는 배경을 구분합니다. 레이블 추가를 클릭하고 필라멘트 사이의 원치 않는 배경과 공간을 스크롤링하여 분류자 교육을 시작합니다. 두 번째 레이블을 추가하고 필라멘트로 이름을 바꿉니다.라이브 업데이트를 클릭하여 분류가 올바르게 수행되었는지 확인합니다. 필요한 경우, 훈련을 미세 조정하기 위해 더 많은 크롤링을 추가합니다. 교육 분류기가 수행되면 예측 내보내기 패널로 이동하여 확률을 소스로 내보내기 이미지 설정 선택으로 클릭합니다.컷아웃 하위 영역 x와 y가 틱되어 c가 선택되지 않았는지 확인합니다. 0과 하나를 c의 시작 및 중지 값으로 선택하고 데이터 형식을 서명되지 않은 8비트로 변환합니다. 다시 정규화한 다음 출력 파일 비디오를 png로 변경하여 원하는 대로 파일 및 디렉터리의 이름을 바꿉니다.내보내기 설정 창을 닫고 방금 분할된 이미지를 내보냅니다. 그런 다음 피지 소프트웨어에서 png 파일을 엽니 다. 기본 설정을 사용하여 이미지의 임계값을 조정하고 골격화 플러그인을 적용하여 별도의 결과 테이블을 만듭니다.이 프로토콜은 시냅스 개발에서 알파 튜룰린 아세틸 트랜스퍼라제 MEC-17의 기능을 탐구하는 데 사용되었습니다. 후방/측면 마이크로튜블러 또는 PLM 시냅스의 이미지의 정량적 분석은 MEC-17의 과발현이 정상적인 뉴런 기능을 방해한다는 것을 나타낸다. MEC-17을 과발현하는 야생형 대조군 동물에 비해 시냅스 영역과 시냅스 무결성이 현저히 감소했습니다.이러한 기술은 또한 CMT2 관련 유전자에 있는 돌연변이를 운반하는 Charcot-Marie-Tooth 모형 2 또는 CMT2의 C.elegans 모형을 분석하기 위하여 이용되었습니다. 신체 벽 근육 형태에 대한 시각적 평가는 야생 형 대조군에 비해 시험 동물의 결함에 2.5 ~ 3.5 배 증가를 나타났다. fzo-1 및 unc-116에 돌연변이를 가진 동물은 근육 감소, 세포 파편의 축적 및 근육 섬유 변성의 손실을 경험했습니다.dyn-1에 있는 돌연변이를 가진 동물이 근육 형태에 있는 현저하게 더 적은 결점을 경험하는 동안. fzo-1 및 unc-116 돌연변이체는 야생형 동물에 비해 총 단일 세포 면적에 대한 갭 비율과 극적으로 짧은 평균 섬유 길이의 비율이 5~ 6배 증가하는 것을 나타냈다. 샘플 간의 비교를 위해서는 이미지 수집을 위한 최적의 조건을 결정하고 이러한 조건이 일관되게 사용되는지 확인하는 것이 중요합니다.이 기술은 연구원이 양적 접근과 다른 유전 배경에 걸쳐 형태학적 변화를 비교할 수 있게 합니다. 이렇게 하면 주관성이 줄어들므로 생성된 데이터의 표현성을 향상시키는 데 도움이 됩니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이미징 C. 엘레간스</emEpifluorescent 현미경과 오픈 소스 소프트웨어를 사용> 태아

기본<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; 방법 : 동기화 및 전망

시냅스에서 신경 전달 물질 수용체 클러스터의 풍부한 강력히 시냅스 강도에 영향을 미칩니다. 이 방법에서는 단일 시냅스 해상도로 가로, 세로, 높이로 fluorescently-라벨이 신경 전달 물질 수용체를...

에서 시냅틱 형광의 자동 부량<em&gt; C. elegans</em

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SegElegans를 사용한 C. elegans 형광 이미지의 자동 분석

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예쁜꼬마선충의 세포구조와 세포세포형태를 연구하기 위한 정량적 접근법

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