2단계 PCR 및 차세대 16S rRNA 유전자 시퀀싱을 사용한 미생물 분석

미생물군유전체의 프로파일링은 건강과 질병에서 미생물군유전체의 역할을 정의하는 첫 번째 단계입니다. 여기에서는 16SR RNA 및 메타 게놈 시퀀싱 및 미생물군유전체 데이터 분석을 수행하면서 배설물 샘플 에서 고품질의 세균 DNA를 분리하는 간단한 절차를 설명하고 있습니다. 이 프로토콜은 미생물군유전체 분야의 새로운 연구자뿐만 아니라 미생물군유전체 분야에서 일하는 연구원들이 실험실에서 미생물군유전체 파이프라인을 확립하는 데 도움이 될 것입니다. 이 프로토콜은 비강, 구강 또는 동물 및 인간 피험자의 피부 샘플과 같은 다른 생체 표본에서 미생물군유전체프로파일링을 위해 확장될 수 있습니다. 모든 다운스트림 단계는 고품질 DNA에 따라 달라지기 때문에 비드 피킹이 가장 중요한 단계입니다. 불완전한 밀봉이 증폭된 제품을 압박하여 품질 이격 데이터를 낮게 유도할 수 있으므로 보존 플레이트의 적절한 밀봉이 중요합니다. 먼저 디바이더 박스를 70%에탄올로 소독합니다. 살균 된 칸막이 상자에 마우스를 놓고 최대 1 시간 동안 정상적으로 배변 할 수 있습니다. 멸균 집게를 사용하여 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 배설물 펠릿을 수집합니다. 튜브를 단단히 둘러싸십시오. 각 마우스에서 배설물을 수집 한 후 70 %의 에탄올로 집게를 살균한 다음 게미시달 일회용 물티슈로 멸균하십시오. 200밀리그램의 배설물 펠릿을 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 0.1 밀리리터 유리 구슬을 넣고 비드 튜브를 비드 치균질균제에 넣고 실온에서 45초 동안 시료를 균질화하여 초당 4.5미터의 속도로 균일화합니다. 키트 제조업체의 지침에 따라 DNA를 추출하고 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리관에서 DNA를 엘ute하십시오. DNA를 격리한 후, 불소계에 DNA의 마이크로리터 1을 적재하여 격리된 DNA를 정량화한다. 설정 16S 리보소말 RNA 유전자 증폭 PCR1 96-Well PCR 플레이트, 25 마이크로 리터 반응 부피를 사용하여. 멀티 채널 파이펫을 사용하여 40 나노 그램의 DNA, 2X 고충실도 폴리머라제 효소 믹스의 13.5 마이크로 리터, 버퍼 함유, 전방 및 역 프라이머에 DNTP를 추가합니다. PCR 플레이트를 상단에서 아래쪽으로 네 개의 가장자리를 따라 제대로 밀봉합니다. 그리고 20에서 1000 배 G에서 원심 분리기