2단계 PCR 및 차세대 16S rRNA 유전자 시퀀싱을 사용한 미생물 분석
2019년 10월 15일
여기에 설명된 16S rRNA 메타게놈 시퀀싱 및 자유롭게 사용할 수 있는 도구를 사용하여 분석하는 미생물군유전체 프로파일링을 위한 간소화된 표준 작동 절차입니다. 이 프로토콜은 미생물군유전체 분야를 새로운 연구자뿐만 아니라 더 높은 해상도에서 박테리아 프로파일링을 달성하기 위한 방법에 대한 업데이트를 요구하는 연구자들에게 도움이 될 것입니다.
미생물군유전체의 프로파일링은 건강과 질병에서 미생물군유전체의 역할을 정의하는 첫 번째 단계입니다. 여기에서는 16SR RNA 및 메타 게놈 시퀀싱 및 미생물군유전체 데이터 분석을 수행하면서 배설물 샘플 에서 고품질의 세균 DNA를 분리하는 간단한 절차를 설명하고 있습니다. 이 프로토콜은 미생물군유전체 분야의 새로운 연구자뿐만 아니라 미생물군유전체 분야에서 일하는 연구원들이 실험실에서 미생물군유전체 파이프라인을 확립하는 데 도움이 될 것입니다. 이 프로토콜은 비강, 구강 또는 동물 및 인간 피험자의 피부 샘플과 같은 다른 생체 표본에서 미생물군유전체프로파일링을 위해 확장될 수 있습니다. 모든 다운스트림 단계는 고품질 DNA에 따라 달라지기 때문에 비드 피킹이 가장 중요한 단계입니다. 불완전한 밀봉이 증폭된 제품을 압박하여 품질 이격 데이터를 낮게 유도할 수 있으므로 보존 플레이트의 적절한 밀봉이 중요합니다. 먼저 디바이더 박스를 70%에탄올로 소독합니다. 살균 된 칸막이 상자에 마우스를 놓고 최대 1 시간 동안 정상적으로 배변 할 수 있습니다. 멸균 집게를 사용하여 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 배설물 펠릿을 수집합니다. 튜브를 단단히 둘러싸십시오. 각 마우스에서 배설물을 수집 한 후 70 %의 에탄올로 집게를 살균한 다음 게미시달 일회용 물티슈로 멸균하십시오. 200밀리그램의 배설물 펠릿을 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 0.1 밀리리터 유리 구슬을 넣고 비드 튜브를 비드 치균질균제에 넣고 실온에서 45초 동안 시료를 균질화하여 초당 4.5미터의 속도로 균일화합니다. 키트 제조업체의 지침에 따라 DNA를 추출하고 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리관에서 DNA를 엘ute하십시오. DNA를 격리한 후, 불소계에 DNA의 마이크로리터 1을 적재하여 격리된 DNA를 정량화한다. 설정 16S 리보소말 RNA 유전자 증폭 PCR1 96-Well PCR 플레이트, 25 마이크로 리터 반응 부피를 사용하여. 멀티 채널 파이펫을 사용하여 40 나노 그램의 DNA, 2X 고충실도 폴리머라제 효소 믹스의 13.5 마이크로 리터, 버퍼 함유, 전방 및 역 프라이머에 DNTP를 추가합니다. PCR 플레이트를 상단에서 아래쪽으로 네 개의 가장자리를 따라 제대로 밀봉합니다. 그리고 20에서 1000 배 G에서 원심 분리기
전체 스크립트를 보고 수천 개의 과학 동영상에 액세스하세요
개요
본 논문은 16S rRNA 메타게놈 시퀀싱을 통한 마이크로바이옴 프로파일링의 상세 방법론을 제시합니다. 초보 연구자와 숙련된 연구자 모두를 대상으로 하며, 본 프로토콜은 접근 가능한 도구를 사용하여 정확한 박테리아 프로파일링을 달성하는 방법에 대한 인사이트를 제공합니다.
주요 연구 구성 요소
연구 분야
- 마이크로바이옴 분석
- 메타게놈 시퀀싱
- 박테리아 프로파일링
배경
- 건강과 질병에서의 마이크로바이옴의 역할
- 고품질 DNA 분리의 중요성
- 다양한 생물학적 시료에서의 응용
사용된 방법
- 16S rRNA 시퀀싱 프로토콜
- 분변 시료 준비 및 DNA 추출
- 분석을 위한 무료 생물정보학 도구의 활용
주요 결과
- 고품질 박테리아 DNA의 성공적인 분리
- 시퀀싱을 위한 견고한 라이브러리 제작
- 연구자가 마이크로바이옴 파이프라인을 구축할 수 있도록 하는 상세한 안내
결론
- 본 연구는 마이크로바이옴 프로파일링을 위한 종합적인 프로토콜을 제공합니다.
- 이는 건강 연구와 관련된 마이크로바이옴 방법론에 대한 이해를 높여줍니다.
자주 묻는 질문
산업계 주요 관련성
마이크로바이옴 프로파일링은 염증성 및 대사성 질환의 타겟 검증을 위한 기초 단계로, 병인 기전에 대한 미생물의 기여도에 관한 가설 수립을 가능하게 합니다. 본 프로토콜은 복잡한 생체 시료로부터 고해상도 분류학적 데이터를 제공함으로써 전임상 모델 개발을 지원하며, 마이크로바이옴 표적 중재법의 기전적 리스크 감소를 용이하게 합니다. 표준화된 워크플로우는 마이크로바이옴 조절 치료 프로그램의 발견 단계부터 리드 물질 식별 단계까지 중개 연구의 연속성을 향상시킵니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 표적 검증
- 과학적 가치: 전임상 모델에서 특정 박테리아 분류군을 질병 표현형과 연결함으로써 치료 가설의 검증을 가능하게 합니다.
- 운영적 가치: 재현 가능한 미생물 군집 프로파일링을 제공하여 표적 우선순위 설정 및 경로 명확화 작업을 지원합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 과학적 가치: 분석 표준화 및 바이오마커 발굴 이니셔티브에 적합한 정량적이고 고해상도인 분류학적 결과물을 생성합니다.
- 운영적 가치: 다양한 샘플 유형 및 처리 조건에서 마이크로바이옴 변화를 스크리닝하기 위한 확장 가능하고 재사용 가능한 파이프라인을 구축합니다.
중개 및 전임상 연구
- 과학적 가치: 치료제 후보 물질에 반응하여 나타나는 마이크로바이옴의 변화를 종단적으로 추적함으로써 질병 관련 시스템 특성 분석을 지원합니다.
- 운영적 가치: DADA2 및 Phyloseq과 같은 표준화된 데이터 형식과 분석 도구를 통해 교차 기능적 협업을 촉진합니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
이 방법은 리드 최적화 전 단계에서 표적 선정 및 기전 연구에 활용 가능한 마이크로바이옴 데이터를 제공함으로써 초기 발굴 워크플로우에 통합됩니다.
- 발견 생물학: 속 및 종 수준의 정밀한 분류학적 할당을 통해 가설 검증 및 경로 규명을 지원합니다.
- 스크리닝: 실험 조건의 신뢰할 수 있는 비교를 가능하게 하는, 분석 준비가 완료된 재현 가능한 미생물 프로파일을 제공합니다.
- 분석: 통계적 비교 및 바이오마커 상관관계를 지원하는 정량적 서열 변이 및 다양성 지표를 제공합니다.
- 중개 연구: 연구 단계 전반에 걸쳐 일관된 마이크로바이옴 모니터링을 가능하게 하여 발견 단계의 결과를 전임상 검증으로 연결합니다.
- 기업 내 재사용: 여러 치료 영역에 적용 가능한 마이크로바이옴 분석을 위해 표준화된 부서 간 협업 역량을 구축합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 숙주-미생물 상호작용의 기전적 모호성을 줄임으로써 표적 검증의 예측 신뢰도를 높입니다.
- 운영적 가치: 표준화된 2단계 PCR 및 생물정보학 분석을 통해 재현성과 확장성을 보장합니다.
- 전략적 가치: 질병 모델에서 마이크로바이옴 매개 혼란 변수를 조기에 감지하여 go/no-go 결정 능력을 향상시킵니다.
- 포트폴리오 영향: 마이크로바이옴 표적 기전의 유효성에 대한 데이터 기반 통찰력을 제공하여 위험 조정된 연구 진전을 지원합니다.
실행 시 고려 사항
- PCR 설정 및 DADA2 기반 분석을 위해 분자 생물학 및 생물 정보학 전문 지식이 필요합니다.
- 메타게놈 처리를 위한 차세대 염기서열 분석(NGS) 인프라 및 계산 리소스 접근 권한에 따라 달라집니다.
- 시료 처리, DNA 추출 및 시퀀싱 라이브러리 제작에 대한 팀 간 표준화가 필수적입니다.
- 구강 또는 피부 시료와 같은 비분변 생체 시료로 프로토콜을 확장할 때 적응 고려 사항이 포함됩니다.
- 저함량 분류군 검출에 영향을 미치는 PCR 편향 및 시퀀싱 깊이와 관련된 실질적인 제약 사항이 포함됩니다.
바이오 제약 FAQ
Chapters in this video
0:04
Title
1:25
Extraction of DNA from Fecal Sample
2:29
16S rRNA Gene Amplification (PCR1) and DNA Library Construction (PCR2)
3:57
Clean-up of Indexed PCR (PCR2) and Quantification
6:03
Sequence Analysis
7:49
Results: Quality Profile and Statistical Analysis
9:29
Conclusion
