Name: RNA 시퀀싱을 사용하는 원형 RNA 식별 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-14T11:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: 배우세요 circRNA 시퀀싱 라이브러리 준비를 위한 최적화된 방법으로 RNase R 처리와 입력량 평가를 포함합니다. 이 프로토콜은 다양한 샘플 유형에서 원형 RNA를 효과적으로 식별하여 발현 분포와 기능적 역할 연구에 활용됩니다.

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우리는 인간의 뇌 조직의 제공에 대한 선 시의 배너 태양 건강 연구소 뇌와 신체 기증 프로그램 (BBDP)에 감사드립니다. BBDP는 국립 신경 장애 및 뇌졸중 연구소 (U24 NS072026 파킨슨 병 및 관련 장애에 대한 국가 뇌 및 조직 자원), 노화에 대한 국립 연구소 (P30AG19610 애리조나 알츠하이머 병 핵심 센터), 건강 서비스의 애리조나 부서 (계약 211002, 애리조나 알츠하이머 연구 센터), 애리조나 생물 의학 연구위원회 (계약 4001, 0011, 05-901 및 1001 애리조나 파킨슨 병 컨소시엄) 및 마이클 J. 파 킨 슨 병의 연구에 대 한 폭스 재단27. 이 연구는 또한 DHS와 애리조나 주 (ADHS 교부금 # ADHS14-052688)에 의해 지원되었다. 우리는 또한 안드레아 슈미트 (배너 연구)와 신시아 레슈가 (TGen) 행정 지원을 주셔서 감사합니다.

이 연구는 인간의 복지에 대한 모든 제도적, 국가적, 국제적 지침을 준수하여 수행되었습니다. 뇌 조직은 애리조나 주 선시티에 있는 배너 선 건강 연구소 뇌 및 신체 기증 프로그램에서 얻어졌습니다. 두뇌와 바디 기증 프로그램의 운영은 서부 기관 검토 위원회 (WIRB 프로토콜 #20120821)에 의해 승인됩니다. 모든 주체 또는 법정 대리인은 통보된 동의서에 서명했습니다. 상업적(비뇌) 생물표본은 프로테오제넥스로부터 구입하였다.
1. RNase R 치료
참고: 다음 단계에서, 반응 부피는 총 부피 50 μL로 조정된다. 이것은 RNA 정리 및 농축기 키트에 사용되는 최소 샘플 부피입니다(재료 표참조). 부가적으로, 여기서 설명된 최적화된 프로토콜은 총 RNA의 4 μg의 입력량에 대한 것이다. RNase R 치료를 위한 더 긴 배양 시간은 입력량 >4 μg에 권장됩니다.
<ol><li>총 RNA를 39 μL RNase 불물에서 4 μg로 미세 원심 분리 튜브에 희석하고 파이펫팅을 통해 잘 섞습니다.</li>
	<li>별도의 튜브에서 RNase R을 1X RNase R 반응 버퍼로 2 U/μL의 작동 농도로 희석합니다. 즉시 사용하기에 충분합니다.</li>
	<li>파이펫 39 μL의 총 RNA 및 10x RNase R 반응 버퍼의 5 μL을 1.5 mL 반응 튜브에 넣고 파이펫팅에 의해 잘 혼합된다 (50 μL은 총 반응 량이 될 것이다). 다음으로 RNase R(2 U/μL)의 6μL을 추가합니다.</li>
	<li>파이펫을 전체 반응 량(50 μL)으로 조정하고 10회 위아래로 파이펫팅하여 잘 섞습니다.</li>
	<li>튜브를 37°C 수조에 10분 동안 놓습니다.</li>
	<li>튜브를 얼음 위에 놓고 즉시 RNA 정화 및 농도(섹션 2)를 진행합니다.</li>
</ol>2. RNA 정화 및 농축기 키트를 사용하여 RNA 정화
참고: 고품질 RNA (RIN>8, DV200>80%)를 사용하는 경우, RNase R 치료는 RNA의 약 60%의 손실을 초래할 수 있습니다. 4 μg 입력을 사용하여, 처리된 RNA의 2-2.5 μg가 섹션 1 후에 남아 있는 것으로 추정된다.
<ol><li>시작하기 전에, 버퍼 농축액에 100% 에탄올 48 mL를 첨가하여 RNA 세척 버퍼를 준비하고 파이펫팅을 통해 잘 섞는다. 정화 컬럼을 수집 튜브에 넣고(재료 표참조) 튜브 랙에 놓습니다. 참고: 다음 모든 단계에 대해 다음 원심 분리 설정을 사용합니다: 10,000-16,000 x g. DNase I 치료가 이미 수행된 경우 이 단계에서 DNase I 치료를 건너뜁니다.</li>
	<li>RNase R 처리 된 샘플에 2 개의 RNA 결합 버퍼를 추가하고 파이펫팅 (총 부피 : 150 μL)으로 잘 혼합하십시오.</li>
	<li>RNA 결합 버퍼 및 RNase R 처리 된 샘플 혼합물에 1 부피 1 부피를 추가하고 파이펫팅 (총 부피 : 300 μL)으로 잘 섞습니다.</li>
	<li>전체 볼륨을 컬럼으로 전송하고 30초 동안 컬럼을 원심분리합니다.</li>
	<li>400 μL의 RNA 준비 버퍼를 컬럼에 직접 추가하고, 30초 동안 컬럼을 원심분리하고, 흐르는 흐름을 폐기합니다.</li>
	<li>700 μL의 RNA 세척 버퍼를 컬럼에 직접 추가하고, 30초 동안 컬럼을 원심분리하고, 흐르는 흐름을 폐기합니다.</li>
	<li>400 μL의 RNA 세척 버퍼를 컬럼에 직접 넣고 2분 동안 컬럼을 원심분리하고 컬럼을 신선한 RNase 프리 1.5 mL 튜브로 옮김을 옮김을 넣습니다.</li>
	<li>열 필터 바로 위에 파이펫 팁을 잡고 물이 기둥 필터에만 닿도록 하여 11 μL의 RNase-free 물을 컬럼에 직접 추가합니다.</li>
	<li>실온에서 1 분 동안 컬럼을 배양하고 원심 분리기를 1 분 동안 배양합니다.</li>
	<li>컬럼을 폐기하기 전에 RNase 가없는 튜브에서 흐르는지 확인하십시오. 용출이 성공하면 샘플을 -80°C에 저장하거나 즉시 라이브러리 준비를 진행합니다. 약 10 μL의 최종 총 용출 부피가 라이브러리 시공에 사용됩니다. 참고: 중지 지점: RNA를 -80°C에서 최대 7일 간 방치한 후 라이브러리 준비를 계속하십시오.</li>
</ol>3. circRNA 도서관 준비
참고: 이 섹션에서 사용되는 대부분의 시약을 포함하는 키트용 재료 표를 참조하십시오.
<ol><li>rRNA 고갈 및 단편화<ol>
<li>정제된 RNA의 10 μL을 2.10단계에서 새로운 96웰 0.3 mL PCR 플레이트에서 깨끗한 우물로 옮김. 잘, 5 μL의 rRNA 결합 버퍼를 넣고 5 μL rRNA 제거 믹스를 추가합니다. 부드럽게 파이펫을 위아래로 10회 부드럽게 섞어주세요.</li>
		<li>미리 프로그래밍된 사전 가열된 열자전거 블록에서 68°C에서 5분 동안 인큐베이션합니다. 5 분 배양을 완료 한 후, 벤치에 접시를 놓고 실온에서 1 분 동안 배양하십시오.</li>
		<li>접시에서 씰을 제거합니다. 35 μL의 와르텍스실 온온 rRNA 제거 비드를 시료에 넣습니다. 파이펫을 45μL로 조정하고 파이펫을 10~20배 위아래로 조정하여 완전히 혼합합니다. 실온에서 1 분 동안 인큐베이팅 플레이트.</li>
		<li>플레이트를 마그네틱 스탠드로 옮기고 스탠드에서 1분 동안 또는 용액이 지워지때까지 인큐베이팅합니다. 모든 상판(~45 μL)을 동일한 플레이트또는 새 플레이트에 새 우물로 옮김(작업중인 샘플 수에 따라 다름).</li>
		<li>RNA 정화 구슬을 소용돌이(재료 표참조)가 잘 분산될 때까지, 각 샘플에 99 μL의 구슬을 추가한다. 파이펫을 위아래로 10배 섞어 보시고 섞어보시다. 접시를 실온에서 10 분 동안 배양합니다.</li>
		<li>플레이트를 마그네틱 스탠드로 옮기고 5분 간 추가로 인큐베이션하거나 용액이 지워지때까지 배양합니다. 우물에서 상급자 모두를 제거하고 버린다.</li>
		<li>마그네틱 스탠드에 여전히 플레이트를 장착한 후, 구슬을 방해하지 않고 새로 준비된 80% EtOH의 200 μL을 웰에 추가합니다. 30 s에 대 한 배양, 다음 제거 하 고 에탄올을 폐기. 총 2회 를 반복합니다.</li>
		<li>각 우물에 11 μL의 용출 버퍼를 추가하고 파이펫을 위아래로 10회 섞어 보입니다. 실온에서 2분 동안 인큐베이션한 다음 용액이 지워지지 때까지 자기 스탠드로 옮김(1-5분).</li>
		<li>상급물의 8.5 μL을 우물에서 동일한 플레이트 또는 새 판에 새 우물로 옮김. 엘루트, 프라이머, 프래그먼트 하이 믹스의 8.5 μL을 각 웰 함유 시료에 추가합니다. 파이펫을 위아래로 10회 완전히 섞어 줍니다.</li>
		<li>사전 프로그래밍된 사전 가열된 열자전거 블록에서 94°C에서 8분 동안 인큐베이션합니다. 4 °C에 도달하면 열자전거에서 제거하고 원심 분리기를 짧게 제거하십시오. 참고: 신디사이징 퍼스트 스트랜드 cDNA 프로토콜을 즉시 진행합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>cDNA 합성<ol>
<li>제조중인 각 샘플에 대해, 9 μL 첫 번째 스트랜드 합성 믹스를 역전사 1 μL과 혼합합니다(재료 표참조). 혼합물의 8 μL을 샘플에 추가합니다. 파이펫을 위아래로 6번 섞어 섞으세요.<ol>
<li>밀봉 플레이트 및 다음과 같은 파라미터를 사용하여 미리 프로그램된 예열 열사이클러 블록상에서 배양: 10분 동안 25°C, 15분 동안 42°C, 15분 동안 70°C, 4°C 홀드. 즉시 두 번째 가닥 합성을 진행합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>각 샘플에 5 μL의 재서스펜션 버퍼를 넣고 20 μL의 두 번째 스트랜드 마킹 마스터 믹스를 추가합니다. 전체 볼륨을 6회 위아래로 파이펫합니다.</li>
		<li>플레이트를 밀봉하고 1시간 동안 16°C로 설정된 사전 가열된 열열 사이클러 블록상에 인큐베이션한다. 배양 후, 열자전거에서 플레이트를 제거하고 실온에 평형화시키십시오.</li>
		<li>소용돌이 PCR 정제 비드 (재료 표참조) 및 샘플의 각 우물에 90 μL 비드를 추가합니다. 파이펫을 위아래로 10회 완전히 섞어 줍니다. 실온에서 10분 동안 배양합니다.</li>
		<li>비드/샘플 믹스를 마그네틱 스탠드에 옮기고 5분 동안 또는 액체가 깨끗해질 때까지 배양합니다. 장식품을 제거하고 폐기하십시오.</li>
		<li>각 샘플에 80% EtOH의 200 μL을 추가합니다. 30 초 동안 실온에서 자기 스탠드에 샘플을 인큐베이터하십시오. 1x를 반복합니다.</li>
		<li>구슬이 실온에서 6분 동안 건조되도록 한 다음 마그네틱 스탠드에서 제거합니다.</li>
		<li>19.5 μL의 재서스펜션 버퍼에서 비드를 다시 일시 중단합니다. 파이펫을 위아래로 10회 완전히 섞어 줍니다. 실온에서 2 분 동안 배양 한 다음 자기 스탠드로 옮기고 추가로 1 분 동안 또는 액체가 지워지때까지 배양하십시오.</li>
		<li>17.5 μL의 상판을 새로운 우물/새 플레이트로 옮김. 참고: 즉시 진행되지 않으면 샘플을 -20°C에서 최대 7일 동안 보관할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>도서관 준비<ol>
<li>상급물질을 함유한 각 우물에 12.5 μL의 A-테일링 믹스를 추가합니다. 전체 볼륨을 위아래로 10회 파이펫하여 혼합합니다.</li>
		<li>다음 파라미터를 사용하여 37°C로 설정된 미리 프로그래밍된 예열 열사이클러 블록상에서 반응을 인큐베이션합니다: 30분 동안 37°C, 5분 동안 70°C, 4°C 홀드. 시료가 4°C에 도달하면 즉시 어댑터 결찰을 진행합니다.</li>
		<li>각 샘플에 2.5 μL의 재서스펜션 버퍼, 2.5 μL의 고유 RNA 어댑터 및 2.5 μL의 결찰 믹스를 추가합니다. 파이펫을 위아래로 10배 섞어 보시고 섞어보시다.</li>
		<li>30°C에서 10분 동안 미리 프로그래밍된 예열 열자전거 블록에 샘플을 인큐베이트합니다.</li>
		<li>각 시료에 5 μL의 스톱 리감 버퍼를 추가하고 파이펫을 위아래로 섞어 보도록 합니다.</li>
		<li>각 샘플에 42 μL의 혼합 PCR 정제 구슬을 넣고 완전히 섞습니다. 3.2.6 단계부터 3.2.10 단계까지 를 따르되, 재서스펜션 부피를 52 μL로 변경하고 최종 용출 볼륨을 50 μL로 변경하십시오.</li>
		<li>3.3.6단계에서 50 μL 용출을 사용하여 PCR 정제 비드 프로토콜을 다시 반복하지만 재서스펜션 부피를 22 μL로 변경하고 최종 용출 볼륨을 20 μL로 변경합니다. 참고: 즉시 진행되지 않으면 샘플을 -20°C에서 최대 7일 동안 보관할 수 있습니다.</li>
		<li>각 샘플에 PCR 프라이머 칵테일 5 μL과 PCR 마스터 믹스 25 μL을 추가합니다. 위아래로 10번 파이펫팅하여 섞으세요. 다음 파라미터를 사용하여 미리 프로그램된, 예열된 열사이클러 블록에 대한 반응을 배양한다: 30s에 대한 98°C; 이어서 10s에 대한 98°C의 8사이클, 30s에 대한 60°C, 30s에 대한 72°C; 72°C를 5분 동안 유지한 다음 4°C를 유지합니다. 참고: 시퀀싱을 위해 충분한 양의 라이브러리를 생성하려면 총 PCR 사이클 수를 최적화해야 할 수 있습니다.</li>
		<li>잘 혼합된 PCR 정제 비드 의 50 μL을 추가하고 30 μL의 최종 용출 부피로 재서스펜션 부피를 32.5 μL로 변경하는 것을 제외하고, PCR 비드 정제(단계 3.2.4 ~ 3.2.9)에 대한 프로토콜을 따르십시오. 참고: 샘플은 -20 °C에서 보관해야합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>핵산 분석기를 이용한 정량화 및 품질 관리<ol>
<li>테이프와 시약이 실온에서 30분 동안 평형화되도록 하십시오.</li>
		<li>2 μL의 라이브러리를 HS D1000 버퍼의 2 μL과 혼합하고 호환되는 웰 플레이트에 추가합니다.</li>
		<li>호환 되는 호일 씰로 단단히 밀봉하고 2,000 rpm에서 1 분 동안 소용돌이를 밀봉하십시오.</li>
		<li>소프트웨어 프롬프트에 따라 분석기에서 스핀다운 및 로드 플레이트를 돌이켜야 합니다. 참고: 라이브러리의 크기는 약 260bp여야 합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>4. 데이터 분석 워크플로우
<ol><li>82bp 의 쌍을 이루는 엔드 판독을 생성하는 RNA-seq 라이브러리(재료 표 참조)를 시퀀스. bcl2fastq 도구(v0.2.19)를 사용하여 기본 호출 파일(.bcl) 형태로 원시 시퀀싱 데이터를 FASTQ로 변환합니다.</li>
	<li>circRNAs를 감지합니다. 참고: 이전에 보고된 증거에 기초하여 앙상블 circRNA 검출 접근법은 단일 검출 도구21,22를사용하는 것에 비해 더 잘 수행된다는 것을, 우리는 circRNA 검출을 위한 다중 공구를 사용하는 것이 좋습니다. 여기서 circRNAs는 find_circ, CIRI, CIRCexplorer, Mapsplice, KNIFE 및 DCC의 6개의 기존 circRNA 예측 알고리즘을 사용하여 각 알고리즘에 권장되는 매개 변수 설정을 적용하여 확인되었습니다.<ol>
<li>개발자가 제공한 지침을 사용하여 Linux 고성능 컴퓨팅 클러스터에 각 circRNA 검색 알고리즘을 다운로드하여 설치합니다.</li>
		<li>RNA-seq FASTQs를 각 공구에 권장되는 정렬자를 활용하여 기준 게놈(GRCh37)에 맞춥습니다.</li>
		<li>정렬 다음, 각각의 권장 매개 변수 설정을 적용하여 circRNA 검출 알고리즘을 실행합니다.</li>
		<li>각 도구는 각 샘플/테스트 조건에서 검색된 후보 수를 정량화하기 위해 감지된 circRNAs 목록과 함께 다중 열 결과 파일을 출력하고 circRNA 좌표를 추출하고 이로부터 읽기를 지원합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>CIRI, Mapsplice 및 DCC에 의한 circRNA 좌표 출력을 다른 세 알고리즘과 일치하도록 0기반 좌표로 변환합니다.</li>
	<li>두 개 이상의 지원 읽기 또는 다운스트림 분석 및 비교가 있는 circRNAs를 선택합니다. 표 1은 각 샘플에 대해 생성된 총 시퀀싱 판독 횟수와 함께 연구에서 평가된 모든 매개 변수를 요약합니다.</li>
	<li>각 샘플/테스트 조건에 대해 해당 라이브러리에 대해 생성된 매핑된 읽기 수(백만개)로 정규화된 검색된 circRNAs 수를 계산합니다. 대표 결과에 자세히 설명된 대로 상자 플롯의 다양한 도구/샘플에서 결과를 요약합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+RNAs+are+the+predominant+transcript+isoform+from+hundreds+of+human+genes+in+diverse+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types.</a> PloS One. 7 (2), e30733(2012).</li>
<li>Jeck, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+RNAs+are+abundant%2C+conserved%2C+and+associated+with+ALU+repeats%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats.</a> RNA. 19 (2), 141-157 (2013).</li>
<li>Memczak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+RNAs+are+a+large+class+of+animal+RNAs+with+regulatory+potency%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency.</a> Nature. 495 (7441), 333-338 (2013).</li>
<li>Sanger, H. L., Klotz, G., Riesner, D., Gross, H. J., Kleinschmidt, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viroids+are+single-stranded+covalently+closed+circular+RNA+molecules+existing+as+highly+base-paired+rod-like+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Viroids are single-stranded covalently closed circular RNA molecules existing as highly base-paired rod-like structures.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 73 (11), 3852-3856 (1976).</li>
<li>Nigro, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scrambled+exons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Scrambled exons.</a> Cell. 64 (3), 607-613 (1991).</li>
<li>Salzman, J., Chen, R. E., Olsen, M. N., Wang, P. L., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-type+specific+features+of+circular+RNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Cell-type specific features of circular RNA expression.</a> PLoS Genetics. 9 (9), e1003777(2013).</li>
<li>Du, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxo3+circular+RNA+promotes+cardiac+senescence+by+modulating+multiple+factors+associated+with+stress+and+senescence+responses%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Foxo3 circular RNA promotes cardiac senescence by modulating multiple factors associated with stress and senescence responses.</a> European Heart Journal. 38 (18), 1402-1412 (2016).</li>
<li>Capel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+transcripts+of+the+testis-determining+gene+Sry+in+adult+mouse+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Circular transcripts of the testis-determining gene Sry in adult mouse testis.</a> Cell. 73 (5), 1019-1030 (1993).</li>
<li>Hansen, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNA-dependent+gene+silencing+involving+Ago2-mediated+cleavage+of+a+circular+antisense+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">miRNA-dependent gene silencing involving Ago2-mediated cleavage of a circular antisense RNA.</a> The EMBO Journal. 30 (21), 4414-4422 (2011).</li>
<li>Hansen, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+RNA+circles+function+as+efficient+microRNA+sponges%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges.</a> Nature. 495 (7441), 384-388 (2013).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exon-intron+circular+RNAs+regulate+transcription+in+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 22 (3), 256-264 (2015).</li>
<li>Tan, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+landscape+of+circular+RNA+expression+in+the+human+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">A landscape of circular RNA expression in the human heart.</a> Cardiovascular Research. 113 (3), 298-309 (2016).</li>
<li>Zhong, Z., Lv, M., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+differential+circular+RNA+expression+profiles+reveals+the+regulatory+role+of+circTCF25-miR-103a-3p%2FmiR-107-CDK6+pathway+in+bladder+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Screening differential circular RNA expression profiles reveals the regulatory role of circTCF25-miR-103a-3p/miR-107-CDK6 pathway in bladder carcinoma.</a> Scientific Reports. 6, 30919(2016).</li>
<li>Gao, Y., Wang, J., Zhao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CIRI%3A+an+efficient+and+unbiased+algorithm+for+de+novo+circular+RNA+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">CIRI: an efficient and unbiased algorithm for de novo circular RNA identification.</a> Genome Biology. 16, 4-014-0571-0573(2015).</li>
<li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MapSplice%3A+accurate+mapping+of+RNA-seq+reads+for+splice+junction+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">MapSplice: accurate mapping of RNA-seq reads for splice junction discovery.</a> Nucleic Acids Research. 38 (18), e178(2010).</li>
<li>Szabo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistically+based+splicing+detection+reveals+neural+enrichment+and+tissue-specific+induction+of+circular+RNA+during+human+fetal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Statistically based splicing detection reveals neural enrichment and tissue-specific induction of circular RNA during human fetal development.</a> Genome Biology. 16, 126-015-0690-0695(2015).</li>
<li>Cheng, J., Metge, F., Dieterich, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+identification+and+quantification+of+circular+RNAs+from+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Specific identification and quantification of circular RNAs from sequencing data.</a> Bioinformatics. 32 (7), 1094-1096 (2016).</li>
<li>Zhang, X. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementary+sequence-mediated+exon+circularization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Complementary sequence-mediated exon circularization.</a> Cell. 159 (1), 134-147 (2014).</li>
<li>Rybak-Wolf, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+RNAs+in+the+mammalian+brain+are+highly+abundant%2C+conserved%2C+and+dynamically+expressed%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Circular RNAs in the mammalian brain are highly abundant, conserved, and dynamically expressed.</a> Molecular Cell. 58 (5), 870-885 (2015).</li>
<li>Ji, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanded+Expression+Landscape+and+Prioritization+of+Circular+RNAs+in+Mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Expanded Expression Landscape and Prioritization of Circular RNAs in Mammals.</a> Cell Reports. 26 (12), 3444-3460 (2019).</li>
<li>Hansen, T. B., Venø, M. T., Damgaard, C. K., Kjems, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+circular+RNA+prediction+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Comparison of circular RNA prediction tools.</a> Nucleic Acids Research. 44 (6), e58(2016).</li>
<li>Zeng, X., Lin, W., Guo, M., Zou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+overview+and+evaluation+of+circular+RNA+detection+tools%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">A comprehensive overview and evaluation of circular RNA detection tools.</a> PLoS Comput Biol. 13 (6), e1005420(2017).</li>
<li>Sekar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ACValidator%3A+a+novel+assembly-based+approach+for+in+silico+validation+of+circular+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">ACValidator: a novel assembly-based approach for in silico validation of circular RNAs.</a> bioRxiv. , (2019).</li>
<li>Westholm, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+drosophila+circular+RNAs+reveals+their+structural+and+sequence+properties+and+age-dependent+neural+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of drosophila circular RNAs reveals their structural and sequence properties and age-dependent neural accumulation.</a> Cell Reports. 9 (5), 1966-1980 (2014).</li>
<li>Szabo, L., Salzman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+circular+RNAs%3A+bioinformatic+and+experimental+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Detecting circular RNAs: bioinformatic and experimental challenges.</a> Nature Reviews Genetics. 17 (11), 679-692 (2016).</li>
<li>Zheng, Y., Ji, P., Chen, S., Hou, L., Zhao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+full-length+circular+RNAs+enables+isoform-level+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of full-length circular RNAs enables isoform-level quantification.</a> Genome Medicine. 11 (1), 2(2019).</li>
<li>Beach, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arizona+study+of+aging+and+neurodegenerative+disorders+and+brain+and+body+donation+program%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathology%22%5BJournal%5D)">Arizona study of aging and neurodegenerative disorders and brain and body donation program.</a> Neuropathology. 35 (4), 354-389 (2015).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

본 연구에서, 시판되는 2개의 라이브러리 준비 키트, 전처리 옵션 및 입력 RNA 양은 circRNA 염기서열 분석 라이브러리의 시공을 위한 circRNA 농축 프로토콜을 최적화하기 위해 시험되었다. 이 연구의 평가에 기초하여, circRNA 염기서열 분석 라이브러리를 만드는 중요한 단계및 중요한 단계의 숫자는 명백하다. 우리의 평가는 검출된 circRNAs의 증가수에 의해 반영되는 RNase R 전처리의 유용성을 확인합니다. 전반적으로, RNase R 전처리 및 4 μg의 입력 RNA와 함께 일루미나 TruSeq 라이브러리 키트를 사용할 때 circRNAs의 더 높은 다양성이 관찰되었다. 이러한 결과는 RNase R 농축 단계가 circRNAs2의검출에 유익하다는 이전 연구 결과와 일치합니다.
circRNA 라이브러리 구조의 추가 주요 양상으로는 RNA가 추출한 조직의 유형뿐만 아니라 시퀀싱에 사용할 수 있는 총 RNA의 양이 포함됩니...

원형 RNA(CircRNAs)는 진핵 전사체1,2,3에서그들의 만연한 발현을 감안할 때 주목을 받고 있는 내인성, 비코딩 RNA이다. 그(것)들은 exons가 서로 에 다시 접합할 때 형성되고, 그러므로 처음에 접합유물4,5로여겨졌습니다 . 그러나, 최근 연구에 따르면 circRNAs는 세포 유형, 조직 및 발달 단계 특이적 발현3,6을 나타내고 진화적으로 보존되는2,3. 더욱이, 이들은 단백질-단백질 상호작용7,마이크로RNA(miRNA) 결합3,8,9,10,및 부모 유전자전사(11)의조절에 관여한다.
고전적인 RNA 염기서열 분석(RNA-seq)에서, circRNAs는 mRNA를 위한 폴리-A 선택의 결과로 라이브러리 시공 도중 완전히 손실될 수 있거나 그들의 낮은 풍부도를 감안할 때 격리하기 어려울 수 있습니다. 그러나, 최근 circRNA 특성화 연구는 CircRNAs2,12,13을풍부하게 하기 위해 RNase R을 이용한 전처리 단계를 통합했다. RNase R은 선형 RNA를 소화하는 외분비증으로, 원형 RNA 구조를 남깁니다. CircRNA 농축 프로토콜은 RNase R 전처리 단계의 유무에 관계없이 시판되는 두 개의 전체 전사체 라이브러리 구성 키트에서 데이터를 생성 및 비교하고 다양한 양의 총 RNA 입력(1 ~ 4 μg)을 사용하여 최적화되었습니다. 최적화된 프로토콜은 5개의 상이한 뇌 영역(소뇌 [BC], 열등한 정수리 엽 [IP], 중간 측두엽 [MG], 후두 피질 [OC] 및 우수한 전두엽 자이러스 [SF]) 및 4개의 다른 조직 유형(간[LV], 폐[LU]] 및 파프린스 [LN]에 걸쳐 circRNAs의 풍부를 평가하는 데 사용되었다. RNA-seq 라이브러리는 짝을 이루고 데이터를 6개의 상이한 circRNA 예측 알고리즘을 사용하여 분석했다: find_circ3,CIRI14,Mapsplice15,나이프16,DCC17,및 CIRCexplorer18. 우리의 분석에 기초하여, RNase R 전처리 및 4 μg 총 입력 RNA를 가진 좌초된 총 RNA 라이브러리 준비 키트를 사용할 때 가장 많은 고유 circRNAs가 검출되었다. 최적화된 프로토콜은 여기에 설명되어 있습니다. 이전에 보고 된 바와 같이19,20,circRNAs의 가장 높은 농축은 다른 조직 유형에 비해 뇌에서 관찰되었다.

<table><tbody><tr><td>1,000 &마이크로; L 파이펫 팁</td><td>Rainin</td><td>GP-L1000F</td><td></td></tr><tr><td>20 &micro; L 파이펫 팁</td><td>Rainin</td><td>SR L 10F</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; L 피펫 팁</td><td>Rainin</td><td>SR L 200F</td><td></td></tr><tr><td>2200 TapeStation 액세서리(호일 커버)</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5154</td><td></td></tr><tr><td>2200 TapeStation 액세서리(팁)</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5153</td><td></td></tr><tr><td>마이크로플레이트용 접착 필름</td><td>VWR</td><td>60941-064</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP 비드 450 mL</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63882</td><td>PCR 정제</td></tr><tr><td>Eppendorf twin.tec 96-Well PCR 플레이트</td><td>VWR</td><td>951020401</td><td></td></tr><tr><td>고감도 D1000 시약</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5585</td><td></td></tr><tr><td>고감도 D1000 ScreenTape</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5584</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 2500 염기서열분석 시스템</td><td>Illumina</td><td>SY-401-2501</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 3000/4000 PE 클러스터 키트</td><td>Illumina</td><td>PE-410-1001</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 3000/4000 SBS Kit (150 cycles)</td><td>Illumina</td><td>FC-410-1002</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 4000 Sequencing System</td><td>Illumina</td><td>SY-401-4001</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq PE Rapid Cluster Kit v2</td><td>Illumina</td><td>PE-402-4002</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq Rapid SBS Kit v2 (50 cycle)</td><td>Illumina</td><td>FC-402-4022</td><td></td></tr><tr><td>Kapa Total RNA Kit</td><td>Roche</td><td>KK8400</td><td></td></tr><tr><td>분자생물학 등급 에탄올</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP28184</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Assay Tubes</td><td>공급 센터 by Thermo Fischer</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA High Sense Assay Kit</td><td>Supply Center by Thermo Fischer</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>RNA cleanup and concentrator - 5</td><td>Zymo</td><td>RCC-100</td><td>정제 컬럼, 수집 튜브 포함</td></tr><tr><td>RNAClean XP 비드</td><td>Beckman Coulter Genomics</td><td></td><td>RNA Cleanup beads</td></tr><tr><td>Rnase R</td><td>Lucigen</td><td>RNR07250</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript II Reverse Transcriptase 10,000 units</td><td>ThermoFisher (LifeTech)</td><td>18064014</td><td></td></tr><tr><td>TapeStation 2200</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>핵산 분석기</td></tr><tr><td>TElowE</td><td>VWR</td><td>10128-588</td><td></td></tr><tr><td>섹션 3 Two-Compartment Divided Tray에 사용된 TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit</td><td>Illumina</td><td>20020596</td><td>Kit</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>3054-1004</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Water</td><td>Supply Center by Thermo Fischer</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>Universal control RNA</td><td>Agilent</td><td>740000</td><td></td></tr></tbody></table>

rna 시퀀싱을 사용하는 원형 rna 식별

Identification of Circular RNAs using RNA Sequencing

원형 RNA (circRNAs)는 마이크로 RNA (miRNA) 규정, 단백질 상호 작용의 중재 및 부모 유전자 전사의 조절을 포함하는 기능에 관여하는 비 코딩 RNA의 부류입니다. 고전적인 차세대 RNA 염기서열 분석(RNA-seq)에서 circRNAs는 전형적으로 mRNA 라이브러리의 시공 동안 폴리-A 선택의 결과로 간과되거나 매우 낮은 풍부함에서 발견되며, 따라서 분리 및 검출하기 가 어렵습니다. 여기서, circRNA 라이브러리 시공 프로토콜은 라이브러리 제제 키트, 전처리 옵션 및 다양한 총 RNA 입력 량을 비교하여 최적화되었다. RNase R 전처리 및 가변 적인 양의 총 RNA 입력(1~ 4 μg)을 사용 하 여 2 개의 시판 된 전체 전사체 라이브러리 준비 키트를 테스트 했습니다. 마지막으로, 여러 조직 유형; 간을 포함 하 여, 폐, 림프절, 그리고 췌 장; 뿐만 아니라 여러 뇌 영역; 소뇌, 열등한 정수리 엽, 중간 측두엽, 후두 피질 및 우수한 전두엽 자이러스를 포함; 조직 모형에 걸쳐 circRNA 풍부를 평가하기 위하여 비교되었습니다. 6개의 서로 다른 circRNA 검출 도구(find_circ, CIRI, Mapsplice, KNIFE, DCC 및 CIRCexplorer)를 사용하여 생성된 RNA-seq 데이터를 분석한 결과 RNase R 전처리 및 4 μg RNA 입력을 사용한 총 RNA 라이브러리 준비 키트가 최적임을 밝혀냈습니다. circRNAs의 가장 높은 상대 수를 식별하는 방법. 이전 사실 인정과 일치, circRNAs의 가장 높은 농축 다른 조직 유형에 비해 뇌 조직에서 관찰 되었다.

시판되는 범용 제어 RNA(UC)를 사용하여 생성된 데이터와 두 개의 라이브러리 준비 키트를 사용하여 생성된 데이터는 둘 다 프로토콜에서 리보 고갈 단계를 포함하고, 먼저 평가되었다. 분석 워크플로우(데이터 분석 워크플로우, 섹션 4)를 사용하여 전체적으로 Kapa 데이터 집합에 비해 TruSeq 데이터 집합에서 더 많은 수의 circRNAs가 검출되었습니다(그림1). 리보소말 RNA(rRNA) 백분율은 낮은 입력 량(1, 2 ug)에 대한 두 키트의 데이터 세트에서 5% 미만이었지만, Kapa 데이터 세트는 4, 5 및 10 ug 입력에 대한 더 높은 rRNA 함량을가졌다(표 2). 따라서, 검출된 circRNAs 및 rRNA 고갈 효율의 수에 기초하여, 추가의 실험은 TruSeq 키트를 사용하여 수행되었다.
다음으로, RNase R 전처리의 유의성RR 전처리 및 비처리 라이브러리로부터 생성된 ...

원형 RNA (circRNAs)는 단백질 사이 전사 규칙 그리고 중재 상호 작용에 있는 역할을 할 수 있는 비 코딩 RNA입니다. circRNA 염기서열 분석 라이브러리의 구성을 위한 상이한 파라미터의 평가에 이어, RNase R 전처리와 함께 좌초된 총 RNA 라이브러리 제제를 활용한 프로토콜이 컴파일되고 여기에 제시된다.

RNA 시퀀싱을 사용하는 원형 RNA 식별

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs involved in functions including micro-RNA (miRNA) regulation, mediation of protein-protein ...

이 프로토콜은 키트 유형, RNase R 처리, 입력 금액 및 circRNA 검출에 미치는 영향과 같은 circRNA 라이브러리 준비의 주요 측면을 평가한 결과입니다. 최적의 circRNA 검출을 가능하게 하고 사용자의 요구에 따라 조정 가능한 매개 변수에 대한 데이터를 제공합니다. 다른 견본 모형에 있는 circRNAs를 확인하는 것은 우리가 그들의 표현의 분포를 더 잘 이해하고 이 분자의 기능적인 역할을 delineating를 위한 무대를 설정하는 것을 도울 것입니다.이 방법은 모든 총 RNA 샘플에 적용될 수 있다. 프로토콜을 시작하기 전에 RNA 샘플을 얼음 위에 유지하는 것이 중요합니다. 준비 전에 Agilent Bio analyzer 또는 TapeStation에서 RIN 및 DV200 값을 평가하고 RNA로 작업할 때 적절한 절차를 따릅니다.RNase 가 없는 물의 39 마이크로리터에 총 RNA를 4 마이크로그램으로 희석하고 혼합하기 위해 위아래로 파이프팅하는 것으로 시작합니다. 별도의 튜브에서 1x RNase R 버퍼를 사용하여 RNase R을 마이크로리터 당 2 단위의 작동 농도로 희석하십시오. 파이펫 39 마이크로리터의 총 RNA및 10x RNase R 반응 버퍼의 5개의 마이크로리터를 1.5 마이크로리터 반응 튜브로 혼합하고 혼합한다.희석 된 RNase R.의 6 마이크로 리터를 추가 한 다음 파이펫을 전체 반응 볼륨으로 조정하고 10 배 위아래로 파이펫을 사용하여 용액을 혼합합니다. 튜브를 섭씨 37도 의 수조에 10 분 동안 놓고 전체 반응 량이 수조에 침지되도록하십시오. 그런 다음 튜브를 얼음 위에 놓고 RNA 정화 및 농도를 즉시 진행합니다.시작하기 전에, 100% 에탄올의 48 밀리리터와 농축물을 혼합하여 RNA 세척 버퍼를 준비하고, 정화 컬럼을 수집 튜브에 배치한다. 준비가 되면, RNase R 처리 된 샘플에 RNA 결합 버퍼의 두 볼륨을 추가하고 잘 혼합. 총 300 마이크로리터를 혼합물에 100% 에탄올150 마이크로리터를 추가하고 전체 부피를 기둥으로 옮기고 원심분리기를 30초 간 전달합니다.흐름을 제거하고 400 마이크로리터의 RNA 준비 버퍼를 컬럼에 직접 추가합니다. 30초 동안 원심분리기를 제거하고 흐름을 폐기합니다. 그런 다음 700 마이크로리터의 RNA 워시 버퍼를 컬럼에 넣고 30초 동안 원심분리기를 넣고 흐름을 폐기합니다.워시 버퍼의 400 마이크로리터를 추가하면 원심분리기를 2분 간 추가하고 컬럼을 신선한 RNase 가 없는 1.5밀리리터 튜브로 옮겨 넣습니다. 기둥 필터 바로 위에 파이펫 팁을 붙이면 RNase가 없는 물 11마이크로리터를 기둥에 직접 추가하십시오. 샘플이 실온에서 1 분 동안 앉아서 원심 분리하여 1 분 동안 앉게하십시오.1.5 밀리리터 튜브에 흐름이 있는지 확인하고 컬럼을 폐기하십시오. 정제 된 RNA 샘플은 영하 80도에서 저장하거나 도서관 준비를 위해 즉시 사용할 수 있습니다. 정제된 총 RNA의 10마이크로리터를 96웰 PCR 플레이트에서 깨끗한 우물로 옮는다.rRNA 바인딩 버퍼의 5 마이크로 리터를 추가 한 다음 rRNA 제거 믹스의 5 마이크로 리터다음 부드럽게 시약을 혼합하기 위해 위아래로 파이펫. 플레이트를 밀봉하고 사전 프로그래밍되고 예열된 열순환기 블록에서 섭씨 68도에서 5분간 인큐베이션하십시오. 인큐베이션 후, 접시가 실온에 1 분 동안 앉게하십시오.플레이트에서 씰을 제거하고, 샘플에 소용돌이 실온 rRNA 제거 구슬의 35 마이크로 리터를 추가합니다. 파이펫을 45마이크로리터로 조정하고 파이펫을 10~20회 위아래로 조정하여 철저히 섞습니다. 접시가 실온에 1 분 동안 앉게하십시오.플레이트를 마그네틱 스탠드로 옮기고 1분 동안 또는 용액이 지워지도록 배양합니다. 상체를 플레이트의 새로운 우물로 옮기. 그런 다음 마그네틱 스탠드에서 플레이트 스탠드로 플레이트를 옮기합니다.소용돌이 RNA 정화 구슬은 잘 분산 될 때까지 구슬을 청소하고 샘플에 구슬 99 마이크로 리터를 추가합니다. 파이펫을 위아래로 섞고 실온에서 10분 동안 플레이트를 배양합니다. 접시를 자기 스탠드로 옮기고 5분 동안 또는 용액이 지워질 때까지 그대로 두고 우물에서 모든 상퍼를 제거하고 폐기합니다.플레이트가 마그네틱 스탠드에 남아 있는 동안, 비드를 방해하지 않고 신선하게 준비된 80%에탄올 200마이크로리터를 우물에 넣습니다. 에탄올을 30초 동안 우물에 두고 제거하여 버립니다. 11 마이크로리터의 용출 버퍼를 웰에 넣고 파이펫을 위아래로 섞어 넣습니다.플레이트를 실온에서 2분간 배양한 다음 다시 마그네틱 스탠드로 옮기고 용액이 지울 때까지 보관하십시오. 동일한 플레이트에 있는 새로운 우물에 수퍼티의 8.5 마이크로리터를 옮기고, 샘플을 포함하는 각 웰에 Elute, 프라이머, 단편 높은 믹스의 8.5 마이크로리터를 추가합니다. 파이펫을 10회 위아래로 위아래로 섞어 플레이트를 밀봉하고, 섭씨 94도로 예열된 열순환기에서 8분간 배양합니다.샘플을 섭씨 4도로 냉각하고, 열순환기에서 플레이트를 제거하고, 원심분리기를 간단히 제거합니다. 두 개의 라이브러리 준비 키트, TruSeq와 KAPA, 이 프로토콜에 대 한 평가 되었다. 전반적으로, TruSeq 키트를 사용할 때 원형 RNA의 더 높은 수와 리보소말 RNA의 낮은 백분율이 검출되었기 때문에 TruSeq는 추가 실험을 위해 선택되었습니다.RNase R 전처리의 중요성은 전처리 및 비처리 라이브러리에서 생성된 데이터를 비교하여 평가하였다. 예상대로, 비처리 된 라이브러리에 비해 전처리 된 라이브러리에서 더 많은 수의 원형 RNA가 일관되게 확인되었습니다. 입력 RNA의 양은 원형 RNA의 더 높은 다양성을 검출하기 위해 최적화되었다.라이브러리는 1, 2, 4 마이크로그램의 입력 RNA를 사용하여 제조되었고, 총 RNA의 4마이크로그램을 사용할 때 원형 RNA 종의 가장 높은 다양성을 관찰하였다. 최적화된 프로토콜은 4명의 건강한 기증자에서 5개의 두뇌 지구에 있는 원형 RNA 풍부를 비교하고 6명의 건강한 기증자에게서 그밖 조직 모형을 위해 이용되었습니다. 전반적으로, 원형 RNase의 높은 풍부는 다른 조직 모형에 비해 두뇌에서 관찰되었습니다.장갑착용, RNase 와이프 또는 스프레이로 벤치 및 파이펫을 철저히 청소하고 프로토콜을 시작하기 전에 건조시 와 파이펫을 철저히 청소하고, RNA를 사전에 얼음에 보관하는 등 RNA와 함께 작업할 때 적절한 절차를 따르는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 확인된 circRNA 접합의 Sanger 시퀀싱과 같은 직교 유효성 검사를 수행할 수 있습니다. 새로운 circRNAs의 발견과 그들의 존재의 추가 증거는 그들의 생물학 기능을 탐구하기 위한 연구의 새로운 지역을 개척합니다.

identification-of-circular-rnas-using-rna-sequencing

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

우리는 원형 RNA를 생성하는 리포터 유전자를 복제하고 분석합니다. 이러한 리포터 유전자는 선형 접합을 분석하고 Alu 요소를 포함하는 구성물보다 큽합니다. 원형 RNA를 조사하기 위하여는, 구조물은 세포로 형질 감염되고 결과 RNA는 선형 RNA의 제거 후에 RT-PCR를 사용하여 분석됩니다.

원형 RNA를 분석하기 위해 미니유전자를 포함하는 Alu 요소 사용

여기에서, 우리는 포유류 세포에서 내인성 RNA 결합 사이트 또는 RNA의 "발자국"을 풍부하게 하는 프로토콜을 제시합니다:단백질 (RNP) 복합체. 이 접근은 RNP 소단위의 2개의 면역 강절을 관련시키고 그러므로 나란히 RNA 면역 침전이라고 불립니다 (RIPiT).

RNA의 발자국 의 식별:연속RNA 면역 침전을 통한 단백질 복합체 시퀀싱 (RIPiT-Seq)

우리는 원형 RT-PCR, 정량적 RT-PCR, RNA 5' 폴리포스파타제 처리 및 북부 블롯을 결합하여 원형 RT-PCR 기반 전략을 제시합니다. 이 프로토콜은 불안정한 5' 삼인산염의 영향을 최소화하기 위한 정규화 단계를 포함하며, 옥수수 미토콘드리아에 안정적으로 축적된 1차 및 처리된 전사체를 차별하고 매핑하는 데 적합하다.

원형 RT-PCR 기반 전략을 사용하여 옥수수 미토콘드리아의 기본 및 처리된 성적증명서의 차별 및 매핑

이 프로토콜은 발산 프라이머를 사용하여 세포에서 원형 RNA(circRNA) 수준을 정밀하게 정량하기 위한 디지털 액적 PCR(dd-PCR)의 자세한 방법을 설명합니다.

디지털 액적 PCR을 사용한 원형 RNA의 정량화

여기에 제출된 프로토콜은 숙주-병원체 상호작용을 연구하는 RNA 시퀀싱 전사체 데이터에서 circRNA를 예측하고 기능적으로 특성화하는 데 필요한 완전한 인실리코 파이프라인을 설명합니다.

인 실리코 숙주-병원체 상호작용 중 circRNA의 식별 및 특성화

절대 정량 RNA 염기서열분석(AQRNA-seq)은 생물학적 혼합물에서 모든 소형 RNA의 환경을 정량화하기 위해 개발된 기술입니다. 여기에서는 AQRNA-seq의 라이브러리 준비 및 데이터 처리 단계를 모두 시연하여 기아 유발 휴면 기간 동안 Mycobacterium bovis BCG의 전달 RNA(tRNA) 풀의 변화를 정량화합니다.

small RNA 정량을 위한 AQRNA-seq

단일 셀의 순서는 고해상도 게놈 변화를 해결하기위한 점점 인기 액세스 도구입니다. 우리는 하나의 셀에 복사 번호 변경을 식별하기 위해 단일 셀 시퀀싱을 사용하는 프로토콜을 제공합니다.

단일 셀 시퀀싱을 사용하여 복사 번호 수선의 검출

여기에서는 생체 내에서 분자 내 및 분자간 RNA-RNA 상호 작용의 게놈 전체 매핑을 가능하게하는 P soralen crosslinked, Ligated 및 S - selected Hysbrids (SL)의 S equencing 방법을 자세히 설명합니다. SPLASH는 효모, 박테리아 및 인간을 포함한 유기체의 RNA 상호 작용을 연구하는 데 적용 할 수 있습니다.

Biotinylated Psoralen을 사용하여 RNA-RNA 상호 작용을 세계적으로 매핑

갤럭시 다윗은 생물 정보학 교육을받지 않은 상태에서 연구자들은 분석하고 RNA-SEQ 데이터를 해석 할 수 있도록 인기있는 도구로 등장했다. C. elegans의 연구원들은 RNA-SEQ 실험, 액세스를 수행 갤럭시를 사용하여 데이터 집합을 처리하고 DAVID를 사용하여 유전자 목록에서 의미있는 생물학적 정보를 얻을 수 있도록 우리는 프로토콜을 설명합니다.

의 Transcriptomic 분석<em&gt; C</em&gt;.<em&gt; 간스</em갤럭시 프로젝트에 턱시도 제품군을 통해&gt; RNA 시퀀싱 데이터

우리는 원래 전송 RNA 분석 플랫폼 자리 (유선형 플랫폼 관찰 하는 tRNA) 라는 설명 합니다. 자리 동시에 세포 수준의 생물 학적 샘플, 3 단계, 그리고 24 시간 이내에 모든 tRNAs 측정합니다.

신진 대사 라벨 및 Macroarrays를 사용 하 여 전송 RNAs의 프로 파일링

배우세요 circRNA 시퀀싱 라이브러리 준비를 위한 최적화된 방법으로 RNase R 처리와 입력량 평가를 포함합니다. 이 프로토콜은 다양한 샘플 유형에서 원형 RNA를 효과적으로 식별하여 발현 분포와 기능적 역할 연구에 활용됩니다.

RNA 시퀀싱을 사용하는 원형 RNA 식별

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