Name: 해리 된 기본 해 마 문화에서 조미료 수용 체 인신 매매를 연구 하는 항 체 먹이 접근 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: 배우세요 항체 먹이 접근법을 이용해 해리된 일차 해마 신경세포에서 글루타메이트 수용체의 세포 표면 발현과 내면화를 정량 분석하는 방법을. 이 기법은 시냅스 가소성의 분자 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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우리는 Nikon A1 공초점 현미경의 사용과 실험 계획 및 분석에 있는 그들의 도움을 위한 고급 현미경 검사법에 대한 노스웨스턴 센터에 감사드립니다. 이 연구는 NIGMS (T32GM008061) (A. M. C.) 및 NIA (R00AG041225) 및 뇌 행동 연구 재단 (#24133)에서 NARSAD 젊은 조사자 보조금에 의해 지원되었다 (A. S. -C.).

해마 1 차 적인 문화 준비에 관련 된 작업 검토 하 고 노스 웨스턴 대학 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 (프로토콜 #IS00001151).
1. 라벨링 전 준비
<ol><li>
준비 및 기본 해 마 문화의 유지 보수
	<ol>
<li>폴리-D-리신 코팅(0.1 mg/mL) 18mm 커버 안경에 도금된 150,000개의 세포 밀도로 1차 해마 배양을 준비합니다. 해리 된 신경 배양 준비를위한 우수한 가이드는7,8. 참고: 필요한 경우, 배양체는 제제에서 신경교 증식을 피하기 위해 시토신 아라비노사이드(Ara-C, DIV1로부터 10 mM)로 처리될 수 있다. 참고: 피브로넥틴(1 mg/mL) 또는 라미닌(5 mg/mL)과 같은 대체 코팅 시약은 폴리-D-리신 대신에 사용될 수 있다.</li>
		<li>B27 및 2 mM L-글루타민으로 보충된 신경기저 배지의 2 mL/웰에서 37°C 및 5% CO2에서 세포 인큐베이터에서 배양체를 유지한다. 참고: 원하는 경우 L-글루타민(예를 들어, 글루타맥스)을 대체할 수 있습니다.</li>
		<li>매주, 미디어의 절반 볼륨을 제거 하 고 보충 된 신경 기 저 기 미디어의 동일한 볼륨으로 대체.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
선택 사항: 돌연변이 및/또는 에피토프 태그 수용체의 형질전환 참고: 뉴런은 수용체 발현을 허용하기 위해 분석 시점 보다 적어도 3-4일 전에 형질 감염되어야 한다. 젊은 뉴런의 사용 [시험관내 일 6-9 (DIV6-9)] 이전 (DIV15-20) 뉴런 보다 더 나은 형혈 효율 결과, 하지만 형질 감염 된 세포의 충분 한 수 (>20) 고용 된 DIV에 관계 없이 달성 될 수 있다.<ol>
<li>12웰 플레이트의 각 웰에 대해, B27 없이 신선한 신경기저 물자 100 μL에 대한 관심의 구성을 포함하는 플라스미드의 1.5 μg를 희석하거나 미세원심지 튜브에 글루타민 보충제를 함유하고 빠르게 소용돌이치면서 혼합한다. 참고: 성공적인 형질 감염의 경우, 사용되는 신경 기저 매체가 병 개봉 후 1 주일 이내에 가능한 한 신선하다는 것이 중요합니다.</li>
		<li>두 번째 미세 원심 분리튜브에서, 1 μL의 적절한 지질 시약1 μL을 신선한 신경기저 물자 100 μL에 섞고 부드럽게 섞습니다. 참고: 지방 흡입 시약 혼합물을 소용돌이하지 마십시오. 신선한 지방 흡입 시약을 사용하면 형질 감염 효율을 향상시킬 수 있습니다.</li>
		<li>실온 (RT)에서 5 분 동안 튜브를 배양하십시오.</li>
		<li>지방 흡입 시약 혼합물을 DNA 혼합물에 드롭 와이즈로 넣고 부드럽게 섞고 RT에서 20 분 동안 배양하십시오.</li>
		<li>각 웰의 미디어 볼륨을 컨디셔닝된 미디어의 1mL로 조정합니다.</li>
		<li>지질 시약 -DNA 혼합물을 웰에 떨어 뜨립니다.</li>
		<li>세포를 인큐베이터로 되돌리고 단백질 발현을 위해 적어도 3-4일을 허용한다. 참고: 아래에 설명된 내재화 및 재활용 프로토콜의 목적을 위해, 해마 뉴런은 DIV11-12에서 세포 외 도메인(GFP-GluN2B)에서 GFP로 태그가 지정된 GluN2B를 발현하고 DIV15-16에서 이미지화한 구문으로 형질 감염되었습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
선택 사항: 고정 될 때까지 조절 된 매체에서 약물 (만성 또는 급성)으로 세포를 배양하십시오. 참고 : 급성 치료를 위해 라벨링하기 전에 세포 치료를 시작하십시오. 사용되는 약물 치료 프로토콜에 따라, 세포는 섹션 2 동안 약물 함유 매체에서 유지될 수 있다. 이 예에서, DIV21 셀은 표면 발현 AMPAR 9을증가시키기 위해 cLTP 프로토콜의 적용을 받았다.<ol>
<li>세포외 용액(ECS)을 위해 컨디셔닝된 미디어를 교환합니다.</li>
		<li>300 μM 글리신으로 세포를 ECS로 RT에서 3 분 동안 치료하십시오. 대조군으로서, 자매 커버슬립을 ECS(글리신 제외)로 치료하십시오.</li>
		<li>37°C ECS로 세포를 3x 세척하고 섹션 2를 계속하기 전에 20 분 동안 세포 인큐베이터에 ECS (글리신 없이)로 세포를 반환합니다. 참고: ECS (mM) : 150NaCl, 2 CaCl 2, 5 KCl, 10 HEPES, 30 포도당, 0.001 TTX, 0.01 스트리크닌, 및 0.03 피크로톡신 을 pH 7.4에서.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 표면 발현 수용체의 라이브 라벨링
<ol><li>
라벨링을 위한 커버슬립 준비
	<ol>
<li>시약을 절약하고 조작을 용이하게하기 위해, 파라핀 필름 덮인 트레이까지 커버립셀 측면을 전송합니다. 참고: 시료를 건조시키지 않는 것이 중요합니다.</li>
		<li>인큐베이션 및 세척 단계를 위해 37°C에서 컨디셔닝된 매체를 저장하고 유지합니다. 참고: 18mm 커버슬립의 경우, 항체 라벨링을 위한 75-100 μL의 배양과 내재화/재활용을 위한 120-150 μL의 인큐베이션을 권장합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
1 차적인 항체를 가진 표면 수용체의 표지
	<ol>
<li>RT에서 15 분 동안 컨디셔닝 된 매체로 희석 된 원발성 항체로 세포를 배양합니다. 참고: GFP 태그가 있는 수용체의 경우, 1:1000의 희석에서 토끼 항 GFP 항체를 사용하였습니다. 내인성 GluA1의 경우, 1:200 희석에서 마우스 항-GluA1을 사용하였습니다.</li>
		<li>진공 파이펫을 사용하여 항체 함유 매체를 조심스럽게 흡인하고 컨디셔닝 된 매체로 세포를 세 번 세척하십시오. 참고: 컨디셔닝된 매체를 사용할 수 없는 경우, 모든 세척 단계는 1 mM MgCl2 및 0.1 mM CaCl2를포함하는 PBS+[인산완식염수(PBS)]을 사용하여 수행될 수 있다. 부드러운 진공 흡인을 사용할 수 없는 경우 마이크로파이펫을 이용한 수동 흡인이 수행될 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 표면표현 (그림 2)
<ol><li>
표면 발현 수용체의 이차 항체 라벨링
	<ol>
<li>PBS+로 한 번 씻으십시오.</li>
		<li>PBS에서 4% 파라포름알데히드(PFA) 및 4% 자당을 7-8분 동안 배양하여 세포를 고정시. 참고: 메탄올 배양과 같은 다른 고정 방법과 달리 PFA는 혈장 막을 투과하지 않으므로 표면 발현 분석에 적합합니다. 최적의 결과를 얻으려면 갓 준비한 PFA를 사용하십시오. -20°C에서 4°C 또는 장기(최대 30일) 저장에서 PFA를 단기 보관하는 것은 적절한 고정을 위해 허용된다. 주의 사항: PFA는 알려진 발암 물질이다. 취급 시 적절한 개인 보호 장비와 안전 후드를 사용하십시오.</li>
		<li>일반 PBS로 세포를 세 번 씻으하십시오. 참고: 또는, 0.1 M 글리신은 PBS 대신 PFA세척에 사용될 수 있으며, 글리신은 제제에서 배경을 증가시킬 수 있는 잔류 고정제를 담금질한다.</li>
		<li>RT에서 30분 동안 PBS에서 10% 정상 염소 혈청(NGS)으로 배양하여 비특이적 결합 부위를 차단합니다. 참고: 차단 시간은 라벨링에 악영향을 주지 않고 연장할 수 있습니다.</li>
		<li>형광 태그이차 항체를 1시간 동안 PBS에서 3% NGS로 희석하여 1차 항체 표지 수용체(즉, 표면 발현)를 라벨로 바쳤다. 참고: 이들 예에서, 1:500 의 알렉사 555-컨쥬게이트 이차 항체:GFP 표지 수용체및 GluA1용 염소 항마우스에 대한 염소 항토끼를 사용하였다.</li>
		<li>PBS 3x로 셀을 세척하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
세포 내 수용체의 라벨링
	<ol>
<li>RT에서 5-10 분 동안 PBS에서 0.25 % 트리톤 X-100으로 세포를 투과시. 참고: 항체 표지의 초기 라운드가 모든 표면 에피토프를 차지하는지 확인하기 위해, 이 투과 단계는 자매 배양에서 건너뛸 수 있다. 이 경우 세포 내 수용체에 대한 신호를 얻지 않아야합니다. 또한, 이전 섹션 2(즉, 배양에서 혈장 막의 무결성을 보여주는) 내부 수용체가 표지되지 않은지 확인하기 위해, 투과 단계는 자매 배양물에서 건너뛰고, 1차 항체에 대하여 세포내 단백질(예를 들어, PSD-95 또는 MAP2)은 2.2.1단계에서 이용될 수 있다. 이러한 조건하에서 이 기본 신호에서 신호를 얻지 않아야 합니다. 이 때, 토끼 항 PSD-95 항체(1:500)를 사용하였다.</li>
		<li>RT에서 30 분 동안 PBS에서 10 % NGS로 블록.</li>
		<li>섹션 2.2에서 사용되는 동일한 1 차 항체로 투과 세포를 배양하여 세포 내 수용체를 라벨링하여 RT에서 1 시간 동안 PBS에서 3% NGS로 희석하였다. 참고: 세포내 수용체 표지화를 위한 항체 희석은 표면 발현 수용체 를 표지하는 데 필요한 것과 다를 수 있다. GluA1의 예에서, 동일한 항체 희석(1:200)을 사용하였다.</li>
		<li>PBS로 세포를 3배 세척합니다.</li>
		<li>두 번째 형광 태그이 붙은 이차 항체를 PBS에서 3% NGS로 희석하여 RT에서 1시간 동안 라벨. 참고: 이들 예에서, 염소 항마우스 알렉사 647-컨쥬게이트 이차 항체(GluA1용)의 1:500 희석을 사용하였다.</li>
		<li>PBS로 세포를 3배 세척합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 내적화 (그림3)
<ol><li>
항체 표지 표면 수용체의 내재화
	<ol>
<li>표면 발현 수용체 및 항체 세척(섹션 2.2)의 라벨링 후, 항체 없이 컨디셔닝된 매체에 세포를 유지하고 이를 인큐베이터(37°C)로 돌려 보내 내재화를 허용한다. 참고: NMDA 수용체의 경우, 내면화를 위해 30 분이 권장됩니다. 대조군으로서, 자매 배양은 내재화 과정 동안 4°C에서 컨디셔닝된 배지로 유지될 수 있다. 최소한의 수용체 내변은 이러한 조건하에서 발생해야합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
표면 수용체의 라벨링
	<ol>
<li>PBS+로 세포를 한 번 씻으십시오.</li>
		<li>7-8 분 동안 PBS에서 4 % PFA 및 4 % 자당으로 세포를 수정하십시오. 주의 사항: PFA를 취급할 때는 적절한 개인 보호 장비와 안전 후드를 사용하십시오.</li>
		<li>일반 PBS로 세포를 3배 씻으소서.</li>
		<li>비특이적 결합을 방지하기 위해 RT에서 30 분 동안 PBS에서 10 % NGS로 차단하십시오.</li>
		<li>형광 태그이 붙은 이차 항체를 가진 배양 샘플은 1차 항체 표지 수용체(즉, 내면화되지 않은 표면 발현 수용체)에 라벨을 붙이기 위해 RT에서 1시간 동안 PBS에서 3% NGS로 희석하였다. 참고: 이 예에서, 알렉사 555-컨쥬게이트 염소 항토끼 이차 항체(1:500)를 라벨링에 사용하였다.</li>
		<li>PBS로 세포를 3배 세척합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
내중화 된 수용체의 라벨링
	<ol>
<li>5-10 분 동안 PBS에서 0.25 % 트리톤 X-100으로 세포를 투과시.</li>
		<li>RT에서 30분 동안 PBS에서 10% NGS로 배양하여 비특이적 결합을 차단합니다.</li>
		<li>형광 태그이 차항체와 배양 이차 항체는 내부화 항체 표지 수용체를 라벨RT에서 1 시간 동안 PBS에서 3 % NGS에서 희석. 참고: 이 예에서, 알렉사 647-공액 염소 항-토끼 이차 항체(1:500)는 라벨링에 사용된다.</li>
		<li>PBS로 세포를 3배 세척합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 재활용(그림 4)
<ol><li>
항체 표지 표면 수용체의 내재화
	<ol>
<li>표면 발현 수용체 및 항체 세척(섹션 2.2)의 라벨링 후, 항체 없이 컨디셔닝된 매체에 세포를 유지하고 이를 인큐베이터(37°C)로 돌려 보내 내재화를 허용한다. 참고: NMDA 수용체의 경우, 내면화를 위해 30 분이 권장됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
안정된 표면 발현 수용체 차단
	<ol>
<li>내면화되지 않은 표면 발현 수용체에 부착된 1차 항체에 대한 에피토프를 차단하기 위해, 공채되지 않은 Fab anti-IgG(H+L) 항체 단편을 가진 세포를 배양(섹션 2.2에서 사용되는 1차 에 대하여) 컨디셔닝 된 매체에서 희석( RT에서 20 분 동안 20 μg / mL) 이 처리는 이차 항체와의 미래 상호 작용을 방지합니다. 참고: 이 예에서는 염소 토끼 방지 팹 조각이 사용되었습니다. 참고: 대조군 실험: 표면 발현 수용체의 완전한 차단이 발생했는지 확인하기 위해, 자매 커버슬립은 Fab유무에 관계없이 배양될 수 있다. 배양은 Fab 처리 직후에 고정되어야 하며, 두 배양체는 Alexa 555-컨쥬게이트 이차 항체로 배양된다. Fab 배양 된 세포에서 알렉사 555 신호는 적절한 항체 차단을 나타냅니다.</li>
		<li>컨디셔닝 된 매체로 셀을 3 x 씻으하십시오.</li>
		<li>80 μM 다이나조를 함유하는 컨디셔닝 된 매체를 가진 세포를 배양하여 추가 내재화를 방지하고 세포를 인큐베이터 (37 °C)로 돌려 보내 내재된 수용체의 재활용을 허용합니다. 다이나소레는 다이너닌을 억제하여 내재화를 방지하는 GTPase 억제제입니다. 참고: NMDAR 재활용시 45분 이내 권장됩니다. Dynasore는 다이너닌 의존적 내재화 프로세스(예: NMdARs 내재화)를 독점적으로 차단합니다. 그러나, 다른 시 냅 스 단백질의 내재화 (다이너 민-독립) 여전히 Dynasore의 존재에서 발생할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
재활용 수용체 의 라벨링
	<ol>
<li>PBS+로 세포를 한 번 씻으십시오.</li>
		<li>7-8 분 동안 PBS에서 4 % PFA 및 4 % 자당으로 세포를 수정하십시오. 주의 사항: PFA를 취급할 때는 적절한 개인 보호 장비와 안전 후드를 사용하십시오.</li>
		<li>PBS로 세포를 3배 세척합니다.</li>
		<li>비특이적 결합을 방지하기 위해 RT에서 30 분 동안 PBS에서 10 % NGS로 차단하십시오.</li>
		<li>첫 번째 형광 태그이 붙은 이차 항체를 가진 라벨 세포는 RT에서 1 시간 동안 PBS에서 3 % NGS로 희석되었습니다. 참고: 이 예에서, 알렉사 555-컨쥬게이트 염소 항토끼 항체(1:500)를 라벨링에 사용하였다.</li>
		<li>PBS로 세포를 3배 세척합니다. 참고: PBS (5-10 분)로 더 오래 세차하면 준비의 배경을 줄이는 데 도움이 될 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
내중화 된 수용체의 라벨링
	<ol>
<li>5-10 분 동안 PBS에서 0.25 % 트리톤 X-100으로 세포를 투과시.</li>
		<li>RT에서 30 분 동안 PBS에서 10 % NGS로 블록.</li>
		<li>두 번째 형광 태그이 붙은 이차 항체를 PBS에서 3% NGS로 희석하여 RT에서 1시간 동안 라벨. 참고: 이 예에서, 알렉사 647-컨쥬게이트 염소 항토끼 항체(1:500)를 라벨링에 사용하였다.</li>
		<li>PBS로 세포를 3배 세척합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 샘플 장착 및 이미징
<ol><li>커버립셀 측을 적절한 장착 매체의 12-15 mL 에 부드럽게 놓아 셀을 장착한다. 참고: 과도한 장착 매체를 포부하면 이미지 품질이 향상됩니다.</li>
	<li>적절한 공초점 현미경상에서 세포. 참고: 뉴런의 전체 두께를 포괄하는 0.35 μm 단계로 60배 배율로 z 스택을 이미지화하는 것이 좋습니다.</li>
</ol>7. 시간 고려 사항
<ol><li>이것은 여러 지점에서 중지할 수 있는 긴 프로토콜입니다. 원하는 경우, 습한 챔버에서 4°C에서 하룻밤 동안 차단 및 1차 항체 배양 단계를 수행한다.</li>
	<li>
또는 원하는 경우 전자레인지 티슈 프로세서를 사용하여 고정 후 배양 시간을 크게 단축하십시오. 모든 단계에서 "켜기" 설정의 경우 30°C에서 150W를 사용합니다.
	<ol>
<li>차단하려면 2분 "켜기", 1분 "끄기", 2분 "켜기"에서 프로세서를 실행합니다.</li>
		<li>1차 및 2차 항체 인큐베이션 단계의 경우 프로세서를 3분 "켜기", 2분 "끄기" 및 3분 "켜기"로 실행합니다. 참고: 우리는 프로토콜에 위의 변경을함으로써 품질의 차이를 관찰하지 않습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. 이미지 분석
<ol><li>그것은 여러 파일 형식과 호환되기 때문에, 이미지 분석을 수행하기 위해 FIJI <https://fiji.sc/>를 사용하는 것이 좋습니다. 우리의 데이터에 대 한, 니콘 ND2 파일 형식의 이미지 취득 했다.</li>
	<li>FIJI에서 미리 선택한 다양한 매개 변수를 쉽게 일괄 처리할 수 있는 매크로 스크립트가 제공됩니다. 다음 단계는 매크로에 포함됩니다. 참고: 이들 예에서는, "통합 강도"를 측정했다.</li>
	<li>피지에서 이미지 파일을 열고 별도의 채널.</li>
	<li>Z-투영 각 채널 스택최대 강도 투영으로.</li>
	<li>각 채널에 대해 낮은 임계값을 설정합니다. 참고: 임계값은 각 실험 데이터 집합에 대해 경험적으로 결정해야 합니다. 각 채널은 별도의 낮은 임계값을 가질 수 있지만 동일한 데이터 집합의 모든 이미지에 대해 채널 임계값을 일관되게 유지하는 것이 중요합니다.</li>
	<li>3~5개의 보조 또는 삼차 모수석을 선택하고 관심 영역(ROI)으로 저장합니다.</li>
	<li>표면 및 세포내 채널에서 각 ROI의 통합 밀도를 측정합니다.</li>
	<li>표면 채널의 통합 밀도 값을 세포내 채널로 나누어 각 ROI에 대한 신호를 정규화합니다.</li>
	<li>모든 제어 및 실험 이미지에 대한 측정을 반복하고 실험 값을 정규화하여 제어 값(예: GluN2B WT 또는 글리신 조건 없음)을 제어합니다.</li>
</ol>

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저자는 공개 할 것이 없다.

세포와 그 환경 사이의 상호 작용 (예를 들어, 다른 세포와의 통신, 다른 자극에 대한 반응 등),은 세포 표면에서 수용체의 올바른 발현에 크게 의존합니다. 표면 발현 수용체 함량의 신속하고 미세 조정된 조절은 끊임없이 변화하는 환경에 대한 적절한 세포 반응을 가능하게 합니다. 뉴런의 경우, 합성적으로 발현된 수용체의 수, 국소화 및 소단위 조성의 변화는 시냅스 통신, 시냅스 가소성, 시냅스 생성 및 시냅스 가지치기3, 5,10. 따라서, 수용체 표면 발현의 정확한 분석 및 그 조절의 기초가 되는 메커니즘은 연구의 중요한 주제이다.
수용체 표면 발현을 연구할 수 있는 여러 가지 양식이 존재합니다. 일반적으로, 이들은 3개의 주요 범주에 속합니다: (i) 표면 발현된 수용체 인구의 생화확적인 격리, (ii) 표면에...

세포는 특정 세포 국소화에 단백질을 동원하고 그들의 기능에 엄격한 spatiotemporal 규정을발휘하기 위하여 인신 매매의 적극적인 프로세스를 이용합니다 1. 이 과정은 다른 환경 자극에 세포 응답 수용 체 활성화에 의해 트리거 된 세포 내 캐스케이드에 의존 으로, 막 전 수용 체에 대 한 특히 중요 하다. 세포는 수용체 세포 인신 매매 조절을 통해 세포 표면에서 발현되는 수용체의 밀도, 국소화 및소단위 조성을 변경함으로써 이러한 반응을 수정할 수 있다 2. 플라즈마 막에 새로 합성 된 수용체의 삽입, 내분비증 및 기존 수용체의 재활용은 표면 발현 수용체의 순 풀을 결정하는 인신 매매 과정의 예2. 많은 분자 기계장치는 단백질 인산화, 유비퀴틴화, 또는 palmitoylation 2와 같은 단백질 단백질 상호 작용 및번역 후 수정을 포함하여 단백질 인신 매매를 통제하기 위하여 협력합니다.
수용체 인신 매매의 조절은 고도로 전문화된 구조물을 가진 강하게 편광된 세포에서 특히 요구됩니다. 패러다임의 예는 글루타메이트 수용체(GluRs)의 규제된 인신매매에 의한 뉴런 기능의 조절이다3,4. 조미료, 주요 흥분 성의 신경 전달 물질, 바인딩 및 시 냅 스 신경 전달 및 시 냅 스 가소성 등 기본적인 생리 신경 기능을 제어 하는 표면 표현 된 GluRs를 활성화. 변경된 GluR 인신 매매가 신경 발달 장애에서 신경 퇴행성 질환에 이르기까지 광범위한 신경 병증에서 관찰되었다는 사실은이 과정의 중요성을강조5. 따라서, GluR 인신 매매를 제어하는 분자 사건을 이해하는 것은 연구의 많은 분야에서 관심입니다.
이 프로토콜에서, 항체 공급 기반 방법은 1 차적인 해마 뉴런에서 표면 발현 글루스의 수준을 정량화하고 관찰된 순 표면 발현에서 내재화 및 재활용의 변화가 어떻게 초래되는지 평가하기 위해 사용된다. 특정 돌연변이를 품고 있는 외인성 수용체의 약리학 및/또는 과발현의 사용은 이 프로토콜이 다른 환경 자극에 근본적인 신경 적응을 기초로 하는 분자 기계장치를 공부하기 위한 특히 강력한 접근을 만듭니다. 이 프로토콜의 유용성의 마지막 예는 환경의 다단계 변화(예: 질병 모델)가 이러한 모델의 표면 발현 검사를 통해 GluR 인신 매매에 미치는 영향을 연구하는 것입니다.
특정 한 예를 사용 하 여, 그것은 처음에 생리 적 시 냅 스 자극을 모방 하는 약리학 조작 을 입증 [화학 LTP (cLTP)] 내 인 성 GluA1 소부의 표면 발현을 증가 하는 글러스 (AMPARs)의 6. NMDA 형 글루어 (NMDARs)의 GluN2B 하위 단위의 과발광 인광 모방 형태의 인신 매매는 또한이 프로토콜이 특정 번역 후 인신 매매의 규제를 연구하는 데 사용할 수있는 방법을 예시하기 위해 분석됩니다. 수정. 이러한 특정 예가 사용되지만, 이 프로토콜은 항원 세포 외 도메인을 소유한 다른 GluRs 및 기타 수용체 및 단백질에 쉽게 적용될 수 있다. 세포외 도메인에 사용할 수 있는 항체가 없는 경우, 세포외 에피토프 태그(예를 들어, 플래그-, Myc-, GFP 태그 등)의 과발현단백질은 단백질 라벨링을 지원할 수 있다.
현재 프로토콜은 특정 GluR 아류형 밀도를 정량화하고 특정 항체를 사용하여 트래피킹을 위한 지침을 제공합니다. 이 프로토콜은 1) 총 GluR 표면 발현, 2) GluR 내재화 및 3) GluR 재활용을 연구하는 데 이용될 수 있다. 각 과정을 개별적으로 연구하려면 섹션 1과 2로 시작하여 섹션 3, 4 또는 5를 계속하는 것이 좋습니다. 모든 경우에 6과 8절(그림1)으로 마칩니다.

<table><tbody><tr><td>직경 18mm #1.5 두께의 커버 안경</td><td>Neuvitro</td><td>GG181.5</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 555-conjugated goat anti-mouse secondary</td><td>Life Technologies</td><td>A21424</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 555-conjugated goat anti-rabbit secondary</td><td>Life Technologies</td><td>A21429</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 647-conjugated goat anti-mouse secondary</td><td>Life Technologies</td><td>A21236</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 647-conjugated goat anti-rabbit secondary</td><td>Life Technologies</td><td>A21245</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates</td><td>Corning</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>Dynasore</td><td>Tocris</td><td>2897</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>글리신</td><td>토크리스</td><td>0219</td><td></td></tr><tr><td>염소 안티 토끼 팹 단편</td><td>시그마</td><td>SAB3700970</td><td></td></tr><tr><td>헤페스</td><td>시그마</td><td>H7006</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>시그마</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>시그마</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>리포펙타민 2000</td><td>인비트로젠</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>마우스 항-GluA1 항체</td><td>Millipore</td><td>MAB2263</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S6546</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Media</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>NGS</td><td>Abcam</td><td>Ab7481</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM999</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Pelco BioWave</td><td>Ted Pella</td><td>36500</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Alfa Aesar</td><td>43368</td><td></td></tr><tr><td>Picrotoxin</td><td>Tocris</td><td>1128</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine hydrobromide</td><td>Sigma</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Life Technologies</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-GFP 항체</td><td>Invitrogen</td><td>A11122</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-PSD-95 항체</td><td>세포 신호 전달</td><td>2507</td><td></td></tr><tr><td>스트리크닌</td><td>토크리스</td><td>2785</td><td></td></tr><tr><td>슈크로오스</td><td>시그마</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>슈퍼프로스트 플러스 현미경 슬라이드</td><td>피셔</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>시그마</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>TTX</td><td>토크리스</td><td>1078</td><td></td></tr></tbody></table>

해리 된 기본 해 마 문화에서 조미료 수용 체 인신 매매를 연구 하는 항 체 먹이 접근

An Antibody Feeding Approach to Study Glutamate Receptor Trafficking in Dissociated Primary Hippocampal Cultures

외부 자극에 대한 세포 반응은 주어진 순간에 세포 표면에서 발현되는 수용체 세트에 크게 의존합니다. 따라서, 표면 발현 수용체의 집단은 지속적으로 적응하고 엄격한 조절 메커니즘에 따라 달라질 수 있다. 생물학에서 가장 많이 연구된 인신매매 사건 중 하나인 패러다임의 예는 글루타메이트 수용체(GluRs)의 시냅스 발현을 조절하는 것이다. GluRs는 중추 신경계에서 흥분성의 신경 전달의 대부분을 중재하고 시냅스 및 뉴런 수준 (예를 들어, 시냅스 가소성)에서 생리 적 활성 의존적 인 기능 및 구조적 변화를 제어합니다. 표면 표현 GluRs의 수, 위치 및 소단위 조성에 있는 수정은 신경 기능에 깊이 영향을 미치고, 사실, 이 요인에 있는 변경은 다른 신경병증과 연관됩니다. 여기에 제시된 것은 해리된 해마 1차 뉴런에서 GluR 인신매매를 연구하는 방법이다. "항체 공급" 접근법은 표면 및 내부 막에서 발현된 GluR 집단을 차별화하기 위해 사용됩니다. 살아있는 세포에 표면 수용체를 표지하고 수용체 내균증 및 / 또는 재활용을 허용하기 위해 다른 시간에 고정함으로써, 이러한 인신 매매 과정을 평가하고 선택적으로 연구 할 수 있습니다. 이것은 GluR 인신 매매에 영향을 미치는 자극 및 분자 메커니즘에 대 한 귀중 한 정보를 얻기 위해 약리학 접근 또는 변경 된 수용 체의 과발현과 함께에서 사용할 수 있는 다양 한 프로토콜. 유사하게, 다른 수용체 또는 표면 발현 단백질을 연구하기 위해 용이하게 적응될 수 있다.

글루타메이트 수용체 인신 매매를 연구하는 이 프로토콜은 세포 표면에서 발현되는 수용체와 내부 막에서 발현되는 수용체의 차동 라벨링에 기초한다. 분리는 막 투과 전후에 수용체를 표지하고, 동일한 원발성 항체를 사용하지만, 이차 항체를 다른 형광부로 공액화함으로써 달성된다. 프로토콜을 포함하는 선택적 단계에 의해 설명된 바와 같이, 이것은 내재화 및 재활용과 같은 다른 수용체 인신 매매 프로세스를 심문하는 매우다양한 방법이며, 조사관의 요구에 쉽게 적응할 수 있다 (그림 1) .
먼저, 뉴런 표면에서 발현되는 수용체의 정량화를 위한 방법이 제공된다. 이 프로토콜은 기저 표면 발현의 정량화뿐만 아니라 다른 약물이나 돌연변이가 표면 발현 수용체의 기저 수준을 변경하는 분자 메커니즘을 연구 할 수 있습니다. 표면 발현 ...

이 문서는 조미료 수용 체를 연구 하는 방법을 제시 (GluR) 해리 된 기본 해 마 문화에서 인신 매매. 약리학적 접근법과 함께 내인성 또는 과발현 수용체를 라벨링하는 항체 공급 접근법을 사용하여, 이 방법은 조절하여 GluR 표면 발현을 조절하는 분자 메커니즘의 식별을 허용합니다. 내재화 또는 재활용 프로세스.

Cellular responses to external stimuli heavily rely on the set of receptors expressed at the cell surface at a given moment. Accordingly, the population ...

외부 자극에 대한 세포 반응은 주어진 순간에 세포 표면에 발현되는 단백질 세트에 크게 의존합니다. 따라서, 이들 단백질의 수, 서브세포 국소화 및 서브유닛 조성물은 동적으로 조절된다. 여기서, 우리는 내재화 및 재활용이 재개되는 한, 세포 배양에서 표면 발현 수용체의 수준을 정량화하기 위해 항체 공급 접근법을 사용할 것입니다.이것은 표면 표현 단백질의 규칙의 기계론적인 정보를 제공하는 매우 다재다능한 프로토콜입니다. 우리의 예에서, 우리는 1 차적인 해마 뉴런에 있는 글루타민 수용체를 공부할 것입니다. 이 프로토콜은 항문 외 세포 외 에피토프를 소유하는 모든 단백질에 적응할 수 있고, 항체를 사용할 수 없는 경우에, 태그된 구조물의 transvection는 특정 돌연변이를 표지하고 공부하는 둘 다유용할 수 있습니다.우리의 예에서, 우리는 내인성 GluA1에 대하여 항체를 사용하고, 이 절차를 시작하기 B.To glu12를 태그하고, 커버 전표 세포 측을 파라핀 필름 커버 트레이로 옮기고, 시약을 저장하고, 조작을 용이하게 합니다. 인큐베이션 및 세척 단계를 위해 조건부 미디어를 섭씨 37도에서 저장하고 유지관리합니다. 조건부 매체, 실온에서 15분 동안 희석된 1차 항체로 세포를 배양한다.그 후, 진공 파이펫을 사용하여 미디어를 포함하는 항체를 조심스럽게 흡인시키고, 조건부 된 매체로 세포를 세 번 세척한다. 세포내 수용체 발현과 세포 내 수용체 발현을 연구하는 경우 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 이 단계 후 paraformaldehyde로 세포를 수정합니다. 항체 없이 조절된 매체에서 세포를 유지하고, 내산화를 허용하기 위해 섭씨 37도에서 인큐베이터로 돌려보라고 한다.내재화 프로세스를 공부하는 경우 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 이 단계 후 paraformaldehyde로 세포를 수정합니다. 내산화되지 않은 표면 발현 수용체에 부착된 1차 항체상의 에피토프를 차단하기 위해, 조건부 에서 희석된 Fab 안티-IgG 항체 단편을 사용하여 세포를 인큐베이션하여 실온에서 20분 동안 한다. 그 후, 조절된 매체로 세포를 세 번 씻는다.세척된 우물을 80마이크로몰러 Dynasore가 포함된 조건부 매체로 배양하여 섭씨 37도에 내부화된 수용체의 재활용을 허용합니다. 라이브 셀에 대한 수정을 완료 한 후 PBS 플러스로 한 번 세포를 씻으시다. 세포에 PBS에 4%의 파라포름알데히드와 4%의 자당의 용액을 추가하고, 세포를 고치기 위해 실온에서 연기 후드에 인큐베이션을 7~8분 간 배양한다.그런 다음 일반 PBS로 셀을 세 번 씻으시면 됩니다. PBS에 10%의 일반 염소 세럼의 용액을 세포에 추가하고 실온에서 30분 동안 배양하여 비특이적 결합 부위를 차단합니다. 다음으로, 1시간 동안 실온에서 PBS에서 3%NGS로 희석된 형광 태그이차항체를 사용하여 세포를 배양하여 1차 항체 라벨 수용체에 라벨을 부착한다.그 후 PBS로 셀을 세 번 씻으시면 됩니다. 세포내 수용체에 라벨을 붙이려면 PBS에서 0.25%의 TritonX용액을 추가하고 실온에서 5~10분 동안 배양하여 세포를 침투합니다. 그런 다음 실온에서 10%NGS로 30분 동안 차단합니다.표면대 총체를 연구하는 경우 이전에 사용한 동일한 1차 항체로 세포를 배양하고, PBS에서 3%NGS로 희석하여 1시간 동안 실온에서 세포내 수용체에 라벨을 부착합니다. 다음으로, PBS로 세포를 세 번 씻는다. 두 번째 형광 태그 이차 항체를 가진 라벨, PBS에서 3%NGS에 희석, 1 시간 동안 실온에서.이 후에 는 PBS로 세포를 세 번 씻는다. 먼저 커버 슬립, 셀 사이드를 12~15마이크로리터에 배치하여 셀을 장착합니다. 그런 다음 적절한 공초점 현미경으로 세포를 이미지화하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세포를 분석합니다.글루타민산 수용체 인신 매매를 연구하는 이 프로토콜은 수용체의 차동 라벨링에 기초하여, 세포 표면에 표현되고, 내부 막에서 발현된 것. 공초점 심상을 습득한 후, 형광 신호는 화학 LTP에 따라 세포내 집단에 비해 표면 발현의 증가를 쉽게 정량화할 수 있다. PSD-95에 대한 신호는 비과성 세포에서 얻어질 수 없으며, 플라즈마 멤브레인의 무결성을 입증할 수 있다.이는 표면 GluA1에 대해 얻은 신호가 실제로 표면 발현 수용체에 해당한다는 것을 나타낸다. 중요한 것은, 내재화된 GluA1에 대한 최소한의 신호는 비과구화 조건하에서 관찰될 수 있으며, 이는 모든 표면 에피토프가 항체 라벨링의 초기 라운드에 의해 점유되고 있음을 보여준다. 내면화 된 수용체는 다음 식별됩니다.이 예는 S1480에서 GluN2B 인산화가 수용체 내산화를 촉진한다는 것을 강조합니다. 인산 돌연변이 S1480E는 야생형 수용체에 비해 내화비가 훨씬 더 높은 것으로 나타났다. 예상대로, 대조군 내산화 수용체에 대한 신호는 얻어지지 않습니다.다음으로, 재활용 수용체와 내부 수용체가 확인됩니다. 생성된 재활용 비율은 GluN2B S1480E가 NMDAR 재활용에 영향을 미치지 않는다는 것을 보여줍니다. 컨트롤에서, 팹 차단이 없는 경우, 표면 발현 GluN2B에 대해 강한 신호를 관찰할 수 있다.이러한 신호는 Fab 처리 배양에서 사라지며, 차단 프로토콜이 표면 발현 에피토프를 완전히 차단하기에 충분하며, 재활용 후 관찰된 표면 신호가 실제로 혈장 막에 다시 인신매매된 수용체에 해당한다는 것을 입증한다. 현재 프로토콜은 표면 발현 단백질의 조절을 연구하는 데 사용할 수있는 방법 중 하나일 뿐입니다. 다른 방법은 여기에서 얻은 데이터를 확장하거나 확인하기 위해 취할 수 있습니다.그(것)들은 생화확적인 방법, biotinylation로, 생활 화상 진찰 기술, 또는 전기 생리학 또는 칼슘 화상 진찰 같이 기능적인 접근으로 포함합니다. 우리는 PFA를 사용하여 수용체의 국소화를 동결, 그러나 PFA는 알려진 발암 물질, 그래서 연기 후드에서 PFA를 사용하여 단계를 수행하는 것이 중요합니다, 적절한 PPE를 착용하면서.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오는 1차 해마 신경 세포에서 글루타메이트 수용체의 이동을 연구하기 위한 항체 섭식 접근 방식을 보여줍니다. 이 접근 방식을 사용하면 원형질과 내막 모두에서 수용체 집단을 관찰할 수 있습니다. 이러한 subsets 간의 구별은 동일한 1차 항체를 사용하지만 다른 형광단에 접합된 2차 항체를 사용하여 막 투과화 전후의 수용체를 라벨링함으로써 달성됩니다.

해마 뉴런에서 글루타메이트 수용체 이동을 연구하기 위한 체외 기술

우리는 특정 폴리 클로 날 항체를 세포 에피토프를 사용하여 신경을 생활의 표면에 단백질을 레이블하는 방법을 설명합니다. 세포 표면에 결합 된 항체에 의해 연속적 endocytosis를 통해 내부화 단백질은 단백질의 나머지와 구별 또는 배양 중에 표면에 매매 될 수있다.

라이브 배양 된 신경 세포의 항체 수유 후 세포 표면과 내면 단백질의 차등 라벨링

여기에서 우리는 GABA 해마 신경 세포에있는 수용체 표면의 현지화 및 엔도 사이토 시스를 측정하기 위해-bungarotoxin을 α에 결합 형광 알렉사 염료의 사용을 보여줍니다. α-bungarotoxin, 세포막 단백질의 세포 내 이입 매매 분석을 달성 할 수있는 바인딩 짧은 세포 태그 베어링 구조의 사용을 통해.

GABA 수용체 막 현지화 및 인신 매매를 연구하는 α-Bungarotoxin 바인딩 사이트 태그를 사용하여

개체 발생 과정 억제 GABA 성 시냅스의 형성을 좌표 공동 분자 메커니즘은 크게 알려져 있지 않다. 이러한 프로세스를 연구하기 위해, 우리는 기능 GABA의 수용체를 표현 안정적으로 형질 전환 된 인간 배아 신장 293 (HEK293) 세포와 함께 배양 한 배아 매체 가시 GABA 성 신경 세포를 통합하는 공동 문화 모델 시스템을 개발했다.

공동 문화 모델, 설립 GABA 성 중간 가시 신경 세포 및 HEK293 세포에서 억제 시냅스 형성 안정적으로 GABA를 표현 수용체

1차 해마 뉴런의 저밀도 배양은 일반적으로 신경 영양 인자를 공급하고 수명을 유지하기 위해 신경교 공급층을 필요로 합니다. 여기에서는 고밀도 뉴런 공급층(neuronal feeder layer)이 있는 곳에서 유리 커버슬립에서 초저밀도 뉴런을 배양하는 단순화된 방법을 설명하며, 이는 특정 뉴런 자율 메커니즘의 연구를 용이하게 합니다.

매우 낮은 밀도에 대한 단순화 된 방법, 장기 차 해마 신경 세포 문화

이 논문은 신경전달물질 수용체의 발현을 정량화하는 방법과 광유전학 도구의 바이러스 전달과 동결-파괴 복제 면역 표지 기술의 조합을 사용하여 식별된 시냅스 전후 요소로 시냅스에서 분석된 패턴을 설명합니다.

Optogenetic 및 동결 골절 복제 Immunolabeling는 마우스 편도체에서 글루타메이트 수용체의 입력 특정 배열을 검사하기 위해 결합

여기서는 토닉과 효소 결합 된 미세 배열 (MEA)를 사용하여 생체 내 세포 외 글루타메이트 phasic 변화를 측정하는 공간적 및 시간적 정확한 방법에 대한 설치 소프트웨어 탐색 및 데이터 분석을 기술한다.

효소 기반의 바이오 센서를 사용하면 알츠하이머 병 마우스 모델에서 토닉과 Phasic이 품목을 측정하는

이 프로토콜의 목표는 더 큰 규모에 NMDA 수용 체 (NMDAR)의 연구를 촉진 하기 위하여 작은 분자의 modulatory 효력의 검사 및 치료 응용 프로그램입니다.

글리신/D-떠들고와 조미료에 감도와 NMDA 수용 체를 공부 하는 높은 처리량 칼슘-플럭스 분석 결과

신경 흥분의 엔도-동적 과정 및 exocytosis 흥분 성의 ionotropic 글루타민 산 염 수용 체의 통해 변조 될 수 있습니다. 여기에 설명 된 표면 및 내부 수용 체 인구 풀 측정에 대 한 접근, 하이 콘텐츠 분석 결과가입니다.

AMPA 모니터링을 위한 하이 콘텐츠 분석 결과 수용 체 매매

자가 면역 뇌염은 중추 신경계의 항체 매개 질환의 새로운 범주입니다. 해마 뉴런은 이러한 항체를 발견하고 특성화하는 데 사용할 수 있습니다. 이 논문은 환자의 혈청 및 뇌척수액에서 자가항체를 결정하기 위한 일차 세포 배양 및 면역염색을 위한 프로토콜을 제공한다.

자가면역뇌염과 관련된 새로운 병원성 항체를 검출하고 연구하기 위한 해마 신경 배양

배우세요 항체 먹이 접근법을 이용해 해리된 일차 해마 신경세포에서 글루타메이트 수용체의 세포 표면 발현과 내면화를 정량 분석하는 방법을. 이 기법은 시냅스 가소성의 분자 메커니즘 연구에 활용됩니다.

해리 된 기본 해 마 문화에서 조미료 수용 체 인신 매매를 연구 하는 항 체 먹이 접근

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