Name: 질병 관련 유전자의 발현을 조사하는 도구로 타우 세포 국소화의 변조 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: 배우세요 핵 타우 단백질의 세포질 오염 없이 분리하는 방법을 SH-SY5Y 신경모세포종 세포에서. 이 기술은 알츠하이머병 관련 유전자 발현 연구에 활용됩니다.

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1. 세포 배양
<ol><li>배양 SH-SY5Y 세포(인간 신경아세포종 세포주, CRL-2266) 완전한 배지(덜베코의 변형된 이글 배지:영양 혼합물 F12 [DMEM/F-12]를 10% 태아 소 혈청[FBS], 2 mML-글루타민, 100 U/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신으로 보충하였다. 37 °C 및 5 %CO2에서인큐베이터에서 세포를 유지합니다. 10cm 접시에 세포를 성장하고 수렴 할 때 분할.</li>
</ol>2. 세포 분화
<ol><li>SH-SY5Y 세포를 분화하기 위해 도금 다음날, 10 μM 레티노산(RA)을 첨가하여 5일 동안 배지를 완성합니다.</li>
	<li>6일째는 50 ng/mL BDNF, 2 mM L-글루타민으로 보충된 DMEM/F-12를 분화 배지로 대체합니다. FBS 나 항생제를 추가하지 마십시오.</li>
	<li>세포를 분화 배지에서 3일 동안 성장시다.</li>
</ol>3. 키메라 구조물 복제
<ol><li>타우서열 0N4R(383aa)의 3' 말단에서 프레임에 제한 효소 소화에 의해 복제하여 타우-NLS 구성을 생성하여 3xNLS(SV40NLS):5'-CCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 참고: 타우의 3' 끝에 있는 3xNLS는 XhoI 및 BamHI 제한 사이트를 멀티클로닝 사이트(MCS)로 악용하는 포유류 표현을 위해 pCMV-Tau 플라스미드로 복제됩니다.</li>
	<li>NES 서열의 3' 끝 부분의 프레임에서 제한 효소 소화에 의해 복제하여 타우-NES 구성을 생성한다: 5'-AGTGAGCTGCAGAACAAGAGAGAGAGATTGGGT박귀액타카-3'. 참고: 타우의 3' 끝에 있는 NES는 에코리 및 밤히 제한 사이트를 MCS로 악용하는 포유류 표현을 위해 pCMV-타우 플라스미드로 복제된다.</li>
	<li>3.1 단계 또는 3.2 단계에서 DNA 100 ng로 DH5alpha 대장균 균주를 변형시키고 LB-Agar 플레이트에서 100 mg / mL 암피실린으로 플레이트 세포를 변형시킵니다. 37 °C에서 하룻밤 자라게하십시오.</li>
	<li>단일 식민지를 선택하고 암피실린으로 LB의 5 mL로 세포를 스파이크. 세포가 밤새 교반에서 37 °C에서 성장하게하십시오.</li>
	<li>DNA 미니프렙(물자표)을사용하여 플라스미드를 추출하고 시열을 확인하여 시공을 확인하였다.</li>
	<li>암피실린으로 LB-Agar 플레이트에서 확인된 구성물 및 플레이트 셀로 DH5alpha E. 대장균 균주를 변환합니다. 37 °C에서 하룻밤 자라게하십시오.</li>
	<li>단일 식민지를 선택하고 암피실린으로 LB의 5 mL로 세포를 스파이크. 세포가 2 시간 동안 교반에서 37 °C에서 자라게하십시오.</li>
	<li>암피실린을 가진 LB의 200 mL에 단계 3.7에서 세포를 넣습니다. 37 °C에서 하룻밤 자라게하십시오.</li>
	<li>4 °C에서 10 분 동안 3,500 x g에서 세포를 펠렛.</li>
	<li>추출 플라스미드와 DNA 맥시프렙(재료표).</li>
</ol>4. 세포 감염
<ol><li>종자 400,000 세포는 6 웰 플레이트에서 1.1 단계 또는 8 웰 챔버 슬라이드에서 20,000 셀. 플레이트 4개의 샘플: 제어 세포는 빈 벡터로 형질감염되고, 세포는 태그가 지정되지 않은 타우로 형질전환되고, 세포는 타우-NLS로 형질감염되고 세포는 타우-NES로 형질감염된다.</li>
	<li>제조자의 지시에 따라, 8웰 챔버 슬라이드에 대해 각 웰 플레이트또는 200 ng의 DNA를 6웰 플레이트에 사용하여 각 웰에 대한 DNA의 트랜스펙트 400 ng를 파종한 다음날.<ol>
<li>RT에서 5분 동안 감소된 혈청 배지의 DNA와 양이온 지질을 250 μL(6-well 플레이트의 경우) 또는 25 μL(8웰 챔버 슬라이드의 경우)으로 별도로 배양합니다. 그런 다음 이를 결합하여 DNA-지질 복합체를 생성하고 20분 동안 배양한다.</li>
		<li>배양 배지를 신선한 완전한 배양 배지의 2 mL(6-웰 플레이트용) 또는 250 μL(8-well 챔버 슬라이드용)으로 교체합니다. DNA-지질 복합체를 세포에 추가하고 밤새 37°C에서 배양한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>대안적으로, 양이온성 시약폴리에틸렌민(PEI)을 가진 트랜스펙트 DNA.<ol>
<li>DNA 2 μg와 PEI 6 μL을 완전한 배양 배지 200 μL(6웰 플레이트의 각 우물에 대해), DNA 1 μg, PEI 3 μL과 완전한 배양 배지 100 μL(8웰 챔버 슬라이드의 각 우물)과 혼합하십시오. , RT에서 10 분 동안 소용돌이및 배양.</li>
		<li>혼합물을 세포에 첨가하고 도금 부피에 도달하기 위해 8웰 챔버 슬라이드에서 웰 당 6웰 플레이트 또는 150 μL의 완전한 배양 배지에 웰당 1.8 mL의 완전한 배양 배지를 추가한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>형질전환 후 다음날 배지를 변경하고 2.2단계에서 설명한 바와 같이 분화 매체를 추가한다.</li>
</ol>5. 면역 형광
<ol><li>배양 배지를 제거하고 1x PBS로 세포를 헹구다. 100% 얼음 차가운 메탄올로 세포를 흔들지 않고 3분 동안 고정시다. 고정 용액을 제거하고 1x PBS로 간략하게 씻으소서.</li>
	<li>실온(RT)에서 5분 동안 1x PBS에서 0.1% 비이온 계면활성제로 투과합니다. 간단히, 1 x PBS로 씻어, 3 번.</li>
	<li>차단 버퍼 (0.1 % 트웬20 및 PBS에서 1 % BSA)로 세포를 인큐베이션하여 궤도 셰이커에서 RT에서 30 분 동안 배양합니다.</li>
	<li>적절한 1차 항체(예를 들어, 마우스 단일클론 항-Tau13 항체)로 배양하여 궤도 셰이커상에서 4°C에서 하룻밤 동안 차단 완충액에서 1:500을 희석하였다. 항체 용액을 제거하고 1x PBS로 간단히 씻으하십시오.</li>
	<li>불소로 공액된 이차 항체(예를 들어, 염소 항마우스 항체가 알렉사 플루어 633에 공액화됨)를 RT에서 1시간 동안 차단 완충액에서 1:500 희석한 이차 항체와 배양하고 1x PBS로 3회 간음하였다.</li>
	<li>핵을 염색하기 위해, DAPI로 배양하여 RT. 워시에서 10분 동안 차단 완충액에서 1:20,000을 1x PBS로 3회 세척하였다. 안티페이드 장착 매체를 사용하여 슬라이드에 덮개를 장착합니다.</li>
</ol>6. 웨스턴 블롯
<ol><li>4.4단계에서 세포 펠릿을 수집하려면, 배지를 제거하고, PBS로 세포를 세척한다. 37°C에서 4분 동안 0.1% 트립신의 500 μL로 배양한다. 완전한 배지 및 재일시 중단 셀의 동일한 볼륨을 추가합니다.</li>
	<li>5 분 동안 500 x g에서 튜브와 원심 분리기에 세포를 수집합니다. 원심 분리의 끝에서 조심스럽게 상한을 제거합니다. PBS 1 mL, 원심 분리기를 5 분 동안 500 x g에 넣고 조심스럽게 상류를 제거하십시오. 세포 펠릿을 얼음에 저장하여 즉시 사용하거나 -80°C에서 동결하여 장기간 보관하십시오.</li>
	<li>총 단백질 추출물의 경우, 용해 완충액 (20 mM Tris-HCl pH 8, 20 mM NaCl, 10 % 글리세롤, 1 % 옥틸플레네옥시 폴리 (에틸렌 옥시)에탄올, 분지(재료 표),10 mM EDTA)로 보충 된 용해 완충액에서 얼음에 30 분 동안 세포 펠릿을 배양하십시오. 펠릿의 풍부에 따르면, 용해 완충제의 50 μL ~ 100 μL을 사용하십시오.<ol>
<li>추출물을 15분 동안 16,000 x g에서 원심분리합니다. 20 μg의 단백질과 4x Laemmli 완충액의 5 μL을 총 부피에서 혼합하고 100 °C에서 5 분 동안 끓여 SDS-PAGE용 단백질 샘플을 준비합니다. 참고: 샘플은 -20°C에서 보관할 수 있다.</li>
	</ol></li>
	<li>세포내 분획의 경우, 완전한 배지에서 6.2단계에서 세포를 재중단하고 각 샘플당 1 x 106셀을 수집합니다. 500 x g에서 10 분 동안 원심 분리기를 사용하여 다음 단계에 대한 세포 펠릿을 얻었다.<ol>
<li>세포내 구획을 분리하려면 키트 사양에 따라 분별합니다. 각 분획을 분리하기 위해, 6.4 단계에서 세포 펠렛을 해당 완충액, 원심분리기로 인큐베이션하고 상온자를 수집하고 6.4.1.1-6.4.1.5에 기재된 대로 펠릿에 다음 버퍼를 추가합니다. 세포질 추출 버퍼, 멤브레인 추출 버퍼, 핵 추출 버퍼, 핵 추출 버퍼 5 mM CaCl2 및 3 U/μL 마이크로 코칼 뉴클레아제 및 세포골격 추출 버퍼로 보충된 순서대로 추가합니다. 참고: 모든 버퍼는 프로테아제 억제제로 보충되어야 합니다. 셀 펠릿의 부피에 따라 버퍼 볼륨을 배율 조정합니다.<ol>
<li>세포분열 분획을 분리하기 위해, 4°C에서 프로테아제 억제제로 보충된 얼음-차가운 세포질 추출 완충액의 100 μL에 세포 펠릿을 배양하고, 10분 동안 부드러운 혼합을 한다. 원심분리기는 4°C에서 500 x g에서 5분 동안 5°C에서 5분 간, 상급을 미리 냉각된 튜브로 옮긴다.</li>
			<li>6.4.1.1 단계에서 펠릿에 프로테아제 억제제로 보충된 얼음-차가운 막 추출 완충액 100 μL을 추가하고, 4°C에서 10분 동안 부드러운 혼합으로 4°C에서 배양하고, 4°C에서 3,000 x g에서 원심분리기를 5분 동안 5분 동안 포근을 수집합니다.</li>
			<li>수용성 핵 분획의 경우, 6.4.1.2 단계 및 와류로부터 펠릿에 프로테아제 억제제를 보충한 50 μL의 핵 추출 버퍼를 추가합니다. 4°C에서 30분 동안 배양하고, 5,000 x g에서 5°C에서 원심분리기를 5분 동안 4°C에서 배양하고, 상한체를 수집한다.</li>
			<li>불용성 핵 분획의 경우, 프로테아제 억제제, CaCl2 및 마이크로코칼 뉴클레아제를 첨가한 50 μL의 핵 추출 버퍼를 6.4.1.3 단계 및 와류로부터 펠릿에 추가합니다. 37°C에서 5분 동안 배양한 다음 다시 소용돌이를 보습니다. RT에서 16,000 x g의 원심분리기를 5분 간 및 상급체를 수집합니다.</li>
			<li>세포골격 분획의 경우, 6.4.1.4 단계 및 와류로부터 펠릿에 프로테아제 억제물로 보충된 50 μL의 세포골격 추출 버퍼를 추가합니다. RT. 원심분리기에서 10 분 동안 튜브를 16,000 x g에서 5 분 동안 인큐베이션하고 상류를 수집하고 펠릿을 버립니다. 참고: 키트 프로토콜에 표시된 대로 셀 볼륨에 따라 버퍼 볼륨을 확장합니다. 인큐베이션 및 원심 분리 시간 및 온도22,23,24,25,26,27,28,29에대한 자세한 내용은 키트 프로토콜을 참조하십시오. 대안적으로, 세제를 사용하고 이온 강도 및 원심분리 속도를 증가시킴으로써, 세포질, 막 결합, 세포골격 및 핵 분획을 분리하는 임의의 표준방법(30)을 사용한다. 표준 핵 추출 버퍼를 이윤을 이루에 의해 용해성 핵 분획과 용해성 핵 분획을 분리합니다. 샘플은 -20°C에서 보관할 수 있다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>SDS-PAGE의 경우, 6.4.1.1-6.4.1.5 단계에서 얻은 세포 내 분획의 20 μL에 4x Laemmli 완충액 7 μL을 넣고 100 °C에서 5 분 동안 끓입니다.</li>
	</ol></li>
	<li>아크릴아미드 겔에 시료를 로드하고 120V. 단백질을 250 mA에서 90분 동안 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 전송하는 일정한 전압에서 전기 동거의 작업을 수행합니다.</li>
	<li>Ponceau 염색 용액에서 5 분 동안 멤브레인을 배양하여 적절한 단백질 젤 전기 동동및 성공적인 블로팅을 확인하십시오. 배경이 깨끗할 때까지 증류수로 멤브레인을 헹구어 줍니다. 트렌 20(TBST)으로 트리스 완충 식염수로 셰이커에서 10분 동안 계속 세척하여 얼룩을 제거합니다.</li>
	<li>셰이커에서 RT에서 1 시간 동안 차단 용액 (TBST의 5 % 우유)으로 멤브레인을 배양하십시오. TBST로 3회 5회 세척합니다.</li>
	<li>4 °C에서 하룻밤 동안 차단 용액 (TBST에서 1 % 우유)에서 1 차 항체와 멤브레인을 혼성화하십시오. TBST로 3회 5회 세척합니다.</li>
	<li>RT에서 1 시간 동안 차단 용액에서 HRP 컨쥬게이트 이차 항체로 멤브레인을 혼성화하십시오.</li>
	<li>화학 발광을 사용하여 단백질 밴드를 검출합니다. ImageJ에 의해 웨스턴 블롯 밴드의 강도를 정량화합니다. 하우스키핑 유전자의 생성물상단백질 발현을 정상화합니다: 핵용해 및 용해성 분획을 위한 히스톤 H2B, 세포질 분획및 총 추출물에 대한 GAPDH.</li>
</ol>

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저자는 공개 할 것이 없다.

우리는 유전자 발현에 핵 타우 단백질의 영향을 측정하는 방법을 기술한다. 이 프로토콜을 사용하면 세포질 타우의 기여가 강력하게 제한됩니다. 이 프로토콜의 중요한 단계는 다음과 같습니다: 인간 신경 아세포종 SH-SY5Y 세포의 분화, 핵 구획에서 타우 단백질의 세포 분열 및 국소화.
먼저, 대표적인 결과 섹션에 나타난 바와 같이, RA 및 BDNF를 첨가하여 SH-SY5Y 세포의 분화는 배양에서 뉴런 유사 세포의 양호한 제제를 얻는 데 매우 중요하다. 더 낮은 조밀도가 세포 증식에 영향을 미칠 수 있기 때문에 종자 된 세포의 밀도는 특히 중요합니다. 더욱이, 세포 분획 및 웨스턴 블롯과 같은 많은 수의 세포를 필요로 하는 실험의 경우, BDNF 분화 단계는 말단 분화를 허용하도록 세포 증식을 차단하여 배양내의 세포 수를 제한한다는 점에 유의하는 것이 중요하다. 대체 분화 프로토콜은 BDNF 대신 RA 또는 NGF만 사용합니다. 그러나, RA 후 BDNF를 첨가하면 더 나은 형태학...

핵에서 타우 단백질의 기능은 핵산1,2,3,4,5,6과밀접하게 연관되어 있는 것으로 나타났기 때문에 최근 몇 년 동안 상당한 관심을 얻고 있다. 실제로, 최근 게놈 전체 연구는 타우가 생체 내에서 genic 및 intergenic DNA 서열을 결합한다는 것을 보여주었습니다7. 뉴클레올라 조직에서의 역할은8,9,10,11로제안되었다. 더욱이, 타우는 산화 및 고열 스트레스5,10,12,13,돌연변이 타우가 염색체 불안정성 및 이수성 및 이수성14,15,16에연결되는 반면, 산성 및 고열 스트레스로부터 DNA 보호에 관여하는 것으로 제안되었다.
지금까지 핵구획에서 타우의 기능을 연구하는 과제는 세포질 타우의 기여에서 핵타우의 구체적인 기여를 해부하는 어려움으로 인해 거의 해결되지 않았다. 더욱이, 핵 구획에 있는 타우 분자에 기인하는 기능은, 지금까지, 핵 타우 단백질의 직접적인 관여의 명백한 데모가 결여되기 때문에, 단지 상관관계가 있습니다. 실제로, 타우가 레트로트랜스포손의 이동성 또는 rRNA 전사 또는 DNA 보호에 11,12,17,18,19의 관여는 또한 세포질 타우의 기여 또는 핵 타우와 관련이 없는 다른 다운스트림 요인의 효과에 의해 설명될 수 있다.
여기서, 우리는 핵국극화(NLS) 또는 핵수출신호(NES)로 태그된 타우컨스0N4R의 사용과 결합된 핵구획을 분리하는 고전적인 절차를 이용하여 이 문제를 해결할 수 있는 방법을 제공한다. 이 접근법은 세포질 구획에서 타우 분자의 유출로 인해 가능한 유물과 관련된 복잡한 문제를 제거합니다. 더욱이, 타우-NLS 및 타우-NES 구성은 핵 구획에서 타우 분자의 농축 또는 배제를 유도하고, 특정 기능에서 핵 타우 분자의 개입에 대한 긍정적 및 음성 적 제어를 제공한다. 이 프로토콜은 기술적으로 용이하고 타우발현(20,21)을재활성화시키는 암세포와 같은 다른 세포 유형에서 타우의 핵기능을 연구하기 위해 광범위하게 적용가능한 고전적이고 신뢰할 수 있는 방법으로 구성된다. 더욱이, 그것은 다른 구획에 관련되었던 생물학 기능을 해부하기 위하여 세포질 및 핵 둘 다에 존재하는 그밖 단백질에도 적용될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 633 염소 안티 마우스 IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A21050</td><td>IF 1:500</td></tr><tr><td>안티 액틴 항체</td><td>BETHYL LABORATORIE</td><td>A300-485A</td><td>안티 토끼 WB 1:10,000</td></tr><tr><td>안티 GAPDH 항체</td><td>Fitzgerald Industries International</td><td>10R-G109a</td><td>안티 마우스 WB 1:10,000</td></tr><tr><td>안티 H2B 항체</td><td>Abcam</td><td>ab1790</td><td>안티 토끼 WB 1:15,000</td></tr><tr><td>안티 Tau-13 항체</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-21796</td><td>안티 마우스 WB 1:1,000; IF 1:500</td></tr><tr><td>안티 튜불린 알파 항체</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PA5-16891</td><td>안티 마우스 WB 1:5,000</td></tr><tr><td>안티 VGluT1 항체</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>AMAb91041</td><td>안티 마우스 WB 1:500</td></tr><tr><td>BCA 단백질 분석 키트</td><td>Euroclone</td><td>EMPO14500</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Alomone Labs</td><td>B-250</td><td></td></tr><tr><td>블로팅 등급 차단제</td><td>Biorad</td><td>1706404</td><td>무지방 분유</td></tr><tr><td>보빈 혈청 알부민</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503-50g</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Mini</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td>프로테아제 억제제</td></tr><tr><td>Criterion TGX 4-20% 무스테인, 10</td>웰 <td>Biorad</td><td>5678093</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62247</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>GIBCO</td><td>21331-020</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle의 중간 저당</td><td>유로 클론</td><td>ECM0060L</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>0390-100ml</td><td>pH = 8, 0.5 M</td></tr><tr><td>태아 혈청</td><td>유로 클론</td><td>EC50182L</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>G5516-500ml</td><td></td></tr><tr><td>염소 안티 마우스 IgG - HPR</td><td>산타 크루즈 생명 공학</td><td>sc-2005</td><td>WB 1:1,000</td></tr><tr><td>염소 안티 토끼 IgG - HPR</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2004</td><td>WB 1:1,000</td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8896-50ml</td><td>Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol</td></tr><tr><td>Immobilon Western</td><td>MERCK</td><td>WBKLS0500</td><td></td></tr><tr><td>Lab-Tech Chamber slide 8 well glass</td><td>slide nunc</td><td>177402</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Euroclone</td><td>ECB3000D</td><td>100X</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 형질주입 시약</td><td>, Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>12566014 양이온성 지질</td></tr><tr>,<td>메탄올</td><td>, Sigma-Aldrich</td><td>, 322415-6X1L</td><td></td></tr>, <tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td>, <td>M8266-100G</td><td></td></tr><tr>,<td>NaCl</td>, <td>Sigma-Aldrich,</td><td>S3014-1kg</td><td></td></tr><tr><td>, Opti-MEM, 저혈청, 배지</td>, <td>Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>PEI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>40,872-7</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>10,000 U/mL, 100 mL</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(Dulbecco A)</td><td>OXOID</td><td>BR0014G</td><td></td></tr><tr><td>PhosStop</td><td>Roche</td><td>4906837001</td><td>phosphatase inhibitor</td></tr><tr><td>QIAGEN Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12163</td><td>Step 3.10</td></tr><tr><td>배양 세포용 레티노산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625-100mg</td><td></td></tr><tr><td>세포 이하 단백질 분획 키트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>78840</td><td></td></tr><tr><td>지원 니트로셀룰로오스 멤브레인</td><td>Biorad</td><td>1620097</td><td></td></tr><tr><td>TC-Plate 6well</td><td>SARSTEDT</td><td>833,920</td><td></td></tr><tr><td>TCS SP2 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Triton x-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-500ml</td><td>비이온 계면활성제</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15400054</td><td>0.50%</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416-100ml</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD 안티페이드 마운팅 매체</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Plus SV Minipreps DNA 정제 시스템</td><td>프로메가</td><td>A1330</td><td>3.5</td></tr></tbody></table>단계

질병 관련 유전자의 발현을 조사하는 도구로 타우 세포 국소화의 변조

Modulation of Tau Subcellular Localization as a Tool to Investigate the Expression of Disease-related Genes

타우는 뉴런에서 발현되는 미세소관 결합 단백질이며, 그 주요 알려진 기능은 세포골격 안정성의 유지와 관련이 있다. 그러나, 최근의 증거는 타우가 DNA 보호, rRNA 전사, 레트로 트랜스포손의 이동성 및 구조 적 조직에 연루된 핵을 포함한 다른 세포 외 구획에도 존재한다는 것을 나타냈다. 핵균. 우리는 최근에 핵 타우가 VGluT1 유전자의 발현에 관여한다는 것을 보여주었습니다, 알츠하이머 병의 초기 단계에서 조미료 방출의 병리학적 증가를 설명할 수 있는 분자 기계장치를 건의하. 최근까지, 표적 유전자의 발현을 조절하는 핵타우의 개입은 세포질 타우의 기여의 배제 또는 다른 그 효과의 배제를 방지하는 기술적 한계로 인해 상대적으로 불확실하고 모호하게 되어 왔다. 핵 타우와 관련이없는 다운 스트림 요인. 이러한 불확실성을 극복하기 위해, 우리는 핵타우 단백질에 의해 특이적인 변조된 표적 유전자의 발현을 연구하는 방법을 개발하였다. 우리는 세포화 신호와 세포분열의 사용을 결합하는 프로토콜을 채택하여 세포질 타우 분자로부터의 간섭을 배제할 수 있게 했습니다. 가장 주목할 만한, 프로토콜은 쉽고 다른 세포 유형 및 세포 조건에서 Tau의 핵 기능을 연구하기 위해 광범위하게 적용 가능한 고전적이고 신뢰할 수있는 방법으로 구성됩니다.

세포질 타우 단백질의 기여를 피하는 유전자 발현에서 핵타우의 영향을 해부하는 데 사용되는 전략은 도 1에도시되어 있다. 간단히, NLS 또는 NES로 태그된 타우 단백질은 각각 핵 구획에서 축적되거나 배제된다. 이러한 불균형의 기능적 효과는 VGluT1 유전자의 생성물로 측정된 유전자 발현의 변화이다.
프로토콜 설명에 따라, SH-SY5Y 세포를 MIToTIC 후 신경유사 세포를 얻기 위해 5일 동안 RA로 처리한 다음 BDNF로 3일 동안 처리하였다(도2). RA 및 BDNF의 부재에서, 미분화 된 SH-SY5Y 세포는 둥근 형태를 가정하고 세포 덩어리를 형성한다. 예상대로, 분화 프로토콜을 시작, 덩어리가 풀고 세포는 신경구를 확산; 분화의 끝에서, 세포...

타우는 세포질과 미세관을 결합하는 핵에 모두 존재하는 신경 단백질로 알츠하이머 병 관련 유전자의 변조를 포함한 틀에 얽매이지 않는 기능을 발휘합니다. 여기서, 우리는 세포질 타우에서 오는 간섭을 배제하면서 핵타우의 기능을 조사하는 방법을 설명한다.

Tau is a microtubule binding protein expressed in neurons and its main known function is related to the maintenance of cytoskeletal stability. However, ...

이 방법은 잠재적인 세포질 타우 오염을 제외하면서 핵 구획에서 타우의 직접적인 역할에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 다른 세포 유형과 다른 세포 조건하에서 타우의 핵 기능에 대한 연구에 광범위하게 적용 가능하다는 것입니다. 절차를 시연하는 것은 지아코모 시아노, 내 실험실에서 포스트 닥터가 될 것입니다.빈 대조군 벡터로 전염되는 5개의 SH-SY5Y 인간 신경아세포종 세포세포를 4회 10회 도금하여 시작하여, 태그가 없는 타우로 전염되는 5개의 세포에 4회 10회, 타우-NLS로 전염되는 5개의 세포에 4회 10회, 타우-NES에 4회 10회, 타우-NES에 잘 감염되는 5개의 세포에 4회 10회 를 감염한다. 도금 다음 날, 별도로 400 나노그램의 DNA와 양이온 지질의 적절한 양을 우물 당 250 마이크로리터의 1개의 튜브로 배양합니다. 실온에서 5분 후 각 벡터를 1부의 양이온 지질과 결합하고 실온에서 20분 동안 DNA 지질 복합체를 배양합니다.인큐베이션의 끝에서, 37섭씨에서 하룻밤 배양을 위한 적절한 DNA 지질 복합 용액과 함께 각각 2밀리리터의 신선한 완전한 배양 배지와 트랜스펙트의 2밀리리터로 각각 의 수퍼네티츠를 대체한다. 다음 날, 슈퍼네티츠를 신선한 분화 매체로 대체하십시오. 웨스턴 블롯 분석을 위해, PBS와 각각 잘 각 우물에서 전염 및 분화 세포를 세척하고 섭씨 37도에서 4 분 동안 잘 당 0.1 %의 500 마이크로 리터로 세포를 배양한다.세포가 분리되면, 완전한 매체의 동등한 부피로 반응을 멈추고 각 우물에서 각 우물에서 원심분리를 위한 개별 튜브로 세포 현탁액을 전달한다. 수퍼네이션을 조심스럽게 제거한 후, 두 번째 원심분리를 위해 튜브당 PBS의 1밀리리터로 펠릿을 다시 중단하고 슈퍼네티츠를 다시 제거한다. 총 단백질 추출물의 경우, 프로테아제와 인산염 억제제로 보충된 용해 완충제의 50~100마이크로리터에서 30분 동안 펠릿을 얼음에 배양합니다.인큐베이션의 끝에서, 원심분리기 추출물을 16, 000배 g에서 15분간, 임의의 표준 정량화 분석으로 단백질 농도를 정량화한다. 그런 다음 각 단백질 샘플 20 마이크로그램을 4X Laemmli 버퍼 5개마이크로리터와 총 20마이크로리터에 혼합하고 샘플을 섭씨 100도에서 5분간 끓입니다. 세포 전분획의 경우, 계산을 위해 전체 배지에서 세포를 다시 중단하고 샘플당 6개의 세포로 10번 아래로 회전합니다.세포균 분획을 격리하려면 펠릿을 100 마이크로리터의 얼음 차가운 세포질 추출 버퍼에 10분 동안 부드러운 혼합으로 섭씨 4도의 프로테아제 억제제로 보충합니다. 인큐베이션의 끝에서, 원심분리에 의해 샘플을 수집하고 미리 차가운 튜브로 슈퍼 네이션을 전송합니다. 프로테아제 억제제로 보충된 100마이크로리터의 얼음 냉막 추출 버퍼를 펠릿에 넣고 4°C에서 부드러운 믹싱을 10분간 배양합니다.그런 다음 4섭씨 에서 5분 동안 펠릿을 원심분리하고 3, 000배 g로 펠릿을 수집하고 수퍼네티츠를 새로운 튜브로 수집합니다. 수용성 핵 분획을 수집하려면 프로테아제 억제제로 보충된 50마이크로리터를 펠릿에 넣고 30분 동안 섭씨 4도에서 샘플을 배양합니다. 인큐베이션의 끝에서 샘플을 원심 분리하고 초월제를 수집합니다.불용성 핵 분획을 수집하려면 프로테아제 억제제, 염화칼슘 및 미세 코칼 뉴클레아제로 보충된 50개의 핵 추출 버퍼를 소용돌이가 있는 펠릿에 추가합니다. 피질 및 원심분리 전에 섭씨 37도에서 5분간 샘플을 배양합니다. 그런 다음 초월체를 수집합니다.사이토셀레탈 분획을 수집하려면, 피질이 있는 펠릿에 프로테아제 억제제로 보충된 시토스켈레탈 추출 버퍼 50마이크로리터를 추가합니다. 실온에서 10 분 잠복 후 샘플을 원심 분리하고 초월제를 수집합니다. SDS-PAGE 분석을 위해, 수집된 각 세포극 분수 샘플의 20 마이크로리터에 4X Laemmli 버퍼의 7개의 마이크로리터를 추가하고 5분 동안 섭씨 100도에서 샘플을 끓입니다.인큐베이션이 끝나면 샘플을 아크릴아미드 젤에 적재하고 120볼트의 일정한 전압으로 전기포전을 수행합니다. 그런 다음 단백질을 니트로셀룰로오스 막으로 90분 동안 250밀리암페어로 옮킵니다. Ponceau 염색 용액에서 5분 동안 멤브레인을 배양하여 적절한 단백질 젤 전기포고증과 성공적인 블로팅을 확인합니다.인큐베이션이 끝나면, 백그라운드가 깨끗할 때까지 증류수로 멤브레인을 헹구고 셰이커에서 10분 동안 Tween 20으로 보충된 트리스 버퍼링 식염수로 연속 세척하여 얼룩을 제거합니다. 다음으로, 트리스 버퍼식식염수와 트위엔 20을 세척당 5분간 세 번 세척하기 전에 실온에서 1시간 동안 블로킹 용액을 차단하여 멤브레인을 배양합니다. 마지막 세척 후, 4섭씨에서 밤새 차단용에 대한 관심의 1차 항체와 멤브레인을 혼성화하고 트리스 버퍼식식염수와 Tween 20을 5분 동안 3개의 세척으로 한다.마지막 세척 후, 적절한 고추냉이 과록시다제 공액으로 멤브레인을 실온에서 1 시간 동안 차단한 이차 항체로 혼합한 후 트리스 버퍼식식염수와 Tween 20을 세척당 5분 동안 3회 세척합니다. 마지막 세척 후, 화학 발광을 사용하여 단백질 밴드를 감지하고 ImageJ에 의해 웨스턴 블롯 밴드의 강도를 정량화. 망막산과 뇌 유래 신경영양인이 없는 경우, 미분화 된 SH-SY5Y 세포는 둥근 형태학을 가정하고 세포 덩어리를 형성한다.예상대로, 망막산으로 5 일 치료 후, 덩어리가 풀림과 세포가 확산. 뇌 유래 신경 영양인을 가진 처리의 3 추가 일 후에, 세포는 분지 중성염의 네트워크를 통해 균일하게 분포되고 상호 연결된 나타납니다. 타우-NLS 또는 타우-NES 경질 후, 타우 아세포 지역화는 항타우 항체를 가진 면역 형광에 의해 검출될 수 있다.배혈의 효율에 따라, 세포는 타우-NLS 트랜스페션 후 DAPI 신호와 병합되는 강력한 핵 염색 또는 타우-NES 후 빈 핵과 세포질 얼룩을 표시한다. 웨스턴 블롯 분석은 세포골격 분획 내의 액틴의 농축, 세포질 및 세포골격 분획 내의 튜룰린, 핵 분획 내의 H2B를 보여줍니다. 웨스턴 블롯 분석은 또한 총 추출물에서 핵 구획 및 vesicular 조미료 수송기 1발 내에서 태그가 지정되고 태그되지 않은 타우의 발현을 확인합니다.실제로 용해성 핵과 세포질 분획에서 타우의 비율은 타우-NES가 감소하는 동안 수용성 핵 분획에서 타우-NLS가 매우 풍부하다는 사실을 강조합니다. 또한 타우-NLS는 세포질 분획에 대하여 크로마틴 결합 분획이 풍부해지며 타우-NES는 감소한다. 각 샘플의 분획에 사용되는 세포의 수를 주의 깊게 확인하고 적절한 분획에서 하우스 키핑 유전자의 농축을 확인해야합니다.이 비디오를 시청한 후 셀룰러 구획을 분리하고 핵에서 타우의 기능적 역할을 평가할 수 있어야 합니다.

modulation-tau-subcellular-localization-as-tool-to-investigate

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연구

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Genetics

유전학

이 동영상은 pH 민감성 형광 표지 타우 응집체를 사용하여 쥐 미세아교세포의 Tau 흡수를 정량화하는 세포 기반 분석을 보여주며, 정량적 평가를 위해 형광 활성화 세포 분류를 통해 분석됩니다.

미세아교세포에 의한 타우 단백질 흡수를 평가하기 위한 세포 기반 분석

이 비디오는 단백질 응집을 연구하기 위해 노란색 형광 단백질(YFP)로 태그된 돌연변이 인간 타우 단백질을 인코딩하는 렌티바이러스로 인간 신경 세포를 transduction하는 과정을 보여줍니다. 이는 바이러스 진입에서 돌연변이 타우 발현까지의 단계를 간략하게 설명하며, 뉴런에서 눈에 보이는 세포질 타우 응집체의 형성으로 절정에 이릅니다.

타우 단백질 응집 분석을 위한 인간 뉴런의 렌티바이러스 매개 형질도입

수정되지 hyperphosphorylated 타우 단백질 과인산 화 - 의존성 응집 빠른 반응 속도를 나타 내기 위해 두 응집 시험 관내 어 세이에 사용 하였다. 상기 분석 방법은 알츠하이머 질환의 진행의 기초를 형성하는 피 브릴 hyperphosphorylated 타우 성향을 변조 할 화합물에 대한 미래의 화면에 대해 방법을 포장.

생체 외 분석에서 집계 Hyperphosphorylated 타우 단백질을 사용하여

단백질 응집체 또는 단백질 요법 씨앗의 세포 간 이동은 신경 퇴행성 질환에서 병리학의 진행의 기초가 될 수 있습니다. 여기에서는 재조합 또는 생물학적 샘플에서 시딩 활성을 특이적이고 민감하게 검출할 수 있는 새로운 FRET 유세포 분석 분석에 대해 설명합니다.

FRET 유동 세포 계측법과 Proteopathic의 시드 활동의 민감한 검출

이 원고는 타우 hyperphosphorylation, 타우에 바인딩 microtubules, 및 약물 치료에 따라 세포내의 지역화를 측정을 측정 하기 위한 표준 프로토콜을 설명 합니다. 이러한 프로토콜은 약물 또는 다른 화합물 타우 hyperphosphorylation 또는 microtubule 바인딩 대상 심사에 대 한 반복적으로 사용할 수 있습니다.

인 산화 및 대 장 암 세포에 타우 단백질의 지역화 함께 Microtubule 바인딩 분석 결과

Vivo에서 microdialysis는 깨어, 자유롭게 행동 하는 동물에서 뇌 중간 유체 (ISF)에 존재 하는 분자의 컬렉션을 사용할 수 있습니다. ISF에 상대적으로 큰 분자를 분석 하기 위해 현재 문서 막 잘라 높은 분자 무게를 가진 프로브를 사용 하 여 microdialysis 프로토콜에 특히 초점을.

Vivo에서 Microdialysis 메서드를 잘라 높은 분자 무게와 뇌 간 질 성 액체에서 큰 Extracellular 단백질을 수집 조사

여기 타우 이해 더 나은 안티 타우 항 체의 행동의 메커니즘을 특성화 하는 조사 가능한 도구를 만들기의 목표와 microglia 양적 평가를 세포 기반 분석 결과 설명 합니다.

Microglia에 의해 항 체 중재 타우 정리 공부 세포 기반 분석 결과

이 프로토콜은 인간 신경 배양이 돌연변이 인간 타우를 코딩 하는 렌 티 바이러스 컨스트 럭 트와 형질 도입 하는 절차를 자세히 설명 합니다. 형질 도입 배양은 타우 응집 체 및 관련 병 리를 표시 합니다.

인간 뉴런의 렌 티 바이러스 매개 된 형질 도입을 이용한 타우 응집 연구를 위한 시험관 내 모델

우리는 원형 RNA를 생성하는 리포터 유전자를 복제하고 분석합니다. 이러한 리포터 유전자는 선형 접합을 분석하고 Alu 요소를 포함하는 구성물보다 큽합니다. 원형 RNA를 조사하기 위하여는, 구조물은 세포로 형질 감염되고 결과 RNA는 선형 RNA의 제거 후에 RT-PCR를 사용하여 분석됩니다.

원형 RNA를 분석하기 위해 미니유전자를 포함하는 Alu 요소 사용

여기에서는 1차 해마 설치류 뉴런의 transfection과 live-cell confocal imaging을 결합하여 축삭 수송에 대한 병리학적 단백질 유도 효과를 분석하고 이러한 효과를 매개하는 기계론적 경로를 식별하는 방법을 보여줍니다.

일차 해마 뉴런의 축삭 수송에 대한 병리학적 단백질의 효과를 측정하기 위해 Live-Cell Imaging 사용

배우세요 핵 타우 단백질의 세포질 오염 없이 분리하는 방법을 SH-SY5Y 신경모세포종 세포에서. 이 기술은 알츠하이머병 관련 유전자 발현 연구에 활용됩니다.

질병 관련 유전자의 발현을 조사하는 도구로 타우 세포 국소화의 변조

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