Name: 疾患関連遺伝子の発現を調べるツールとしてのタウ小細胞局在の変調 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: 学ぶ 細胞質Tauの汚染を排除して核Tauを単離する方法。SH-SY5Y細胞を用いたこの技術は、アルツハイマー病関連遺伝子の発現調節メカニズムを解明し、神経変性疾患の治療戦略開発に貢献する。

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この作品は、スクオラ・ノーマル・スペリオーレ(SNS14_B_DIPRIMIO;)からの助成金によって支えられた。SNS16_B_DIPRIMIO)。

1. 細胞培養
<ol><li>培養SH-SY5Y細胞(ヒト神経芽細胞腫細胞株、CRL-2266)を完全培地(ダルベッコの改変イーグル培地:栄養混合物F12[DMEM/F-12]10%胎児ウシ血清[FBS]、2mM L-グルタミン、100U/mLペニシリンおよび100μ細胞を37°Cおよび5%CO2でインキュベーターで維持する。10cmプレートで細胞を成長させ、コンフルエントになると分割します。</li>
</ol>2. 細胞分化
<ol><li>SH-SY5Y細胞を分化するには、めっき翌日に、10μMレチノイン酸(RA)を加えて培地を5日間完成させる。</li>
	<li>6日目は、培地を分化培地に置き換える:DMEM/F-12は50 ng/mL BDNF、2 mM Lグルタミンを添加した。FBS や抗生物質を追加しないでください。</li>
	<li>分化培地で細胞を3日間増殖させる。</li>
</ol>3. キメラコンストラクトクローニング
<ol><li>タウシーケンス0N4R(383aa)の3'末端のフレーム内の制限酵素消化によるクローニングによりタウNLSコンストラクトを生成する3xNLS(SV40NLS):5'-CCAAAAAAAAAAGGAAAAAAAAAAAAGaAGaAAAAAAGaA 注:タウの3'終端の3xNLSは、マルチクローニングサイト(MCS)にXhoIおよびBamHI制限部位を利用する哺乳動物発現のためのpCMV-タウプラスミドに複製される。</li>
	<li>タウ配列0N4R(383aa)の3'末端のフレーム内の制限酵素消化によるクローニングによりタウファネス構築物を生成する: 5'-AGTGAGCTGCAGAACTCTGAGGAGTGTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTACAAA-3'。 注:タウの3'終端のファミコンは、エコリおよびBamHI制限部位をMCSに利用する哺乳動物発現のためにpCMV-タウプラスミドにクローニングされる。</li>
	<li>DH5α大腸菌株をステップ3.1または3.2のDNA100ngで変換し、LB-寒天プレート上のプレート細胞を100mg/mLアンピシリンで変換します。37°Cで一晩栽培しましょう。</li>
	<li>単一のコロニーを選択し、アンピシリンでLBの5 mLに細胞をスパイク。細胞を一晩攪拌中に37°Cで増殖させる。</li>
	<li>DNAミニプレップ(材料テーブル)でプラスミドを抽出し、配列して構成を検証します。</li>
	<li>DH5α大腸菌株を、LB-寒天プレート上の配列検証された構造およびプレート細胞をアンピシリンで変換します。37°Cで一晩栽培しましょう。</li>
	<li>単一のコロニーを選択し、アンピシリンでLBの5 mLに細胞をスパイク。細胞を攪拌中に37°Cで2時間増殖させる。</li>
	<li>ステップ3.7の細胞をアンピシリンで200 mLのLBに入れます。37°Cで一晩栽培しましょう。</li>
	<li>細胞を3,500 x gで4°Cで10分間ペレットします。</li>
	<li>DNAマキシプレップ(材料表)でプラスミドを抽出します。</li>
</ol>4. 細胞トランスフェクション
<ol><li>ステップ1.1から種子400,000細胞を6ウェルプレートに、または8ウェルチャンバースライドで20,000細胞。プレート4サンプル:空ベクターでトランスフェクトされるコントロール細胞、タグなしタウでトランスフェクトされる細胞、タウNLSでトランスフェクトされる細胞およびタウファミコンでトランスフェクトされる細胞。</li>
	<li>製造業者の指示に従って、6ウェルプレートまたは200ngのDNAを使用して、各ウェルに対して400ngのDNAを播種した翌日。<ol>
<li>DNAとカチオン性脂質を250μL(6ウェルプレートの場合)または25μL(8ウェルチャンバースライドの場合)で、RTで5分間還元血清培地をインキュベートします。次に、それらを組み合わせてDNA脂質複合体を生成し、20分間インキュベートします。</li>
		<li>培養培地を2mL(6ウェルプレートの場合)または250°L(8ウェルチャンバースライドの場合)に交換します。細胞にDNA脂質複合体を加え、一晩で37°Cでインキュベートする。</li>
	</ol>
</li>
	<li>あるいは、カチオ系試薬ポリエチレニミン(PEI)を用したトランスフェクトDNA。<ol>
<li>2μgのDNAと6μLのPEIを完全培養培地(6ウェルプレートのウェルそれぞれに)、または100μLの完全培養培地を用いた1μgのDNAと3μLのPEIを混合します(8ウェルチャンバースライドの各ウェルに対して)、渦とRTで10分間インキュベートします。</li>
		<li>細胞にミックスを追加し、めっき量に達するために8ウェルチャンバースライドでウェルあたり6ウェルプレートまたは150°Lの完全培養培地あたり1.8 mLの完全培養培地を追加します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>トランスフェクションの翌日に培地を変更し、ステップ2.2の説明に従って分化媒体を追加します。</li>
</ol>5. 免疫蛍光
<ol><li>培養培地を取り出し、1x PBSで細胞をすすす。100%氷冷メタノールで細胞を3分間振とわずに固定します。固定液を取り外し、1x PBSで短時間洗浄します。</li>
	<li>室温(RT)で5分間1x PBSで0.1%非イオン性界面活性剤で透過する。簡単に、1x PBSで3回洗浄します。</li>
	<li>ブロッキングバッファー(PBSでは0.1%トゥイーン20および1%BSA)を有する細胞を軌道シェーカーのRTで30分間インキュベートする。</li>
	<li>適切な一次抗体(例えば、マウスモノクローナル抗タウ13抗体)でインキュベートし、眼窩シェーカー上の4°Cで一晩ブロッキング緩衝液中で1:500希釈した。抗体溶液を取り出し、1x PBSで簡単に洗浄します。</li>
	<li>フルオロフォアに共役した二次抗体(例えば、アレクサ・フルオ633に共役したヤギ抗マウス抗体)をRTで1時間ブロッキング緩衝液で希釈し、抗体溶液を1x PBSで短時間洗浄する。</li>
	<li>核を染色するには、DAPIで1:20,000を希釈して10分間ブロッキング緩衝液でインキュベートし、RTで10分間洗浄し、1x PBSで3回洗浄する。アンチフェード取り付け媒体を使用してスライドにカバースリップを取り付けます。</li>
</ol>6. ウェスタンブロット
<ol><li>ステップ4.4から細胞ペレットを回収するには、培地を取り出し、PBSで細胞を洗浄する。37°Cで4分間、500 μLのトリプシンをインキュベートします。完全なメディアと再サスペンドセルの等量を追加します。</li>
	<li>チューブ内の細胞を収集し、5分間500 x gで遠心分離機を行います。遠心分離の終わりに慎重に上清を削除します。1 mL の PBS を追加し、5 分間 500 x gで遠心分離し、上清を慎重に取り除く。細胞ペレットを氷の上に保管してすぐに使用するか、-80°Cで凍結して長期保存します。</li>
	<li>総タンパク質抽出物の場合、細胞ペレットをリシスバッファー内の氷上で30分間インキュベートし(20 mM Tris-HCl pH 8、20 mM NaCl、10%グリセロール、1%オクチルフェノキシポリ(エチレンオキシ)エタノール、分岐(材料表)、10mM EDTAを添加した。ペレットの豊富さに応じて、50 μLから100°Lのリシスバッファーを使用してください。<ol>
<li>16,000 x gで抽出物を15分間遠心分離します。20μgのタンパク質を4x Laemmli緩衝液の5μLと混合してSDS-PAGE用のタンパク質サンプルを調製し、合計20μLの総体積で100°Cで5分間沸騰させます。 注:試料は-20°Cで保存することができる。</li>
	</ol></li>
	<li>細胞内分画の場合、ステップ6.2の細胞を完全な培地で再サスペンドし、各サンプルにつき1x 106細胞を収集する。500xgで10分間遠心分離機を行い、以下の工程で細胞ペレットを得た。<ol>
<li>細胞内コンパートメントを分離するには、キット仕様に従って分画します。各画分を単離するには、ステップ6.4から細胞ペレットを対応する緩衝液でインキュベートし、遠心分離機を採取し、6.4.1.1-6.4.1.5で説明されているように次の緩衝液をペレットに添加する。細胞質抽出バッファー、膜抽出バッファー、核抽出バッファー、核抽出バッファーを5 mM CaCl2および3 U/μLマイクロコッカルヌクレアーゼおよびサイト骨格抽出バッファーで補完します。 注:すべてのバッファーは、プロテアーゼ阻害剤で補う必要があります。.セルペレットの体積に応じてバッファーの体積をスケールします。<ol>
<li>細胞質画分を単離するには、プロテアーゼ阻害剤を4°Cで補充した氷冷細胞質抽出バッファーを100μLでインキュベートし、4分間500×gで500xgで500×500gで5分間穏やかに混合し、上清を予冷チューブに移す。</li>
			<li>ステップ6.4.1.1からプロテアーゼ阻害剤を補充した100μLの氷冷膜抽出バッファーをペレットに加え、4°Cで10分間穏やかな混合でインキュベートし、4分間4分間、上清を集めます。 </li>
			<li>可溶性核分率については、ステップ6.4.1.2からペレットにプロテアーゼ阻害剤を補充した核抽出バッファーを50μL添加し、渦を加える。4°Cで30分間インキュベートし、5分間4°Cで5,000 x gで遠心分離し、上清を回収する。</li>
			<li>不溶性核分率の場合は、プロテアーゼ阻害剤を添加した核抽出バッファー50μLを、CaCl2およびマイクロコッカルヌクレアーゼをステップ6.4.1.3からペレットに添加し、ボルテックスを添加する。37°Cで5分間インキュベートし、再び渦を入れ直します。RTで16,000 x gで遠心分離し、上清を集める。</li>
			<li>細胞骨格分率については、ステップ6.4.1.4からペレットにプロテアーゼ阻害剤を補充した50μLの細胞骨格抽出バッファーを添加し、渦を踏む。RTで10分間インキュベートし、16,000 x gでチューブを5分間インキュベートし、上清を回収してペレットを廃棄します。 注:キット プロトコルに示されているように、セルの体積に応じてバッファーボリュームをスケーリングします。インキュベーションおよび遠心分離時間および温度22、23、24、25、26、27、28、29の詳細については、キットプロトコルを参照してください。あるいは、洗剤を用いて、イオン強度と遠心分離速度を上げることによって、細胞異性、膜結合、細胞骨格および核画分を分離する任意の標準的な方法30を使用する。標準的な核抽出バッファーを利用して、可溶性核分率と不溶性核分率を分離します。試料は-20°Cで保存することができる。</li>
		</ol>
</li>
		<li>SDS-PAGEの場合は、ステップ6.4.1.1-6.4.1.5から得られた細胞内分率の20°Lに4x Laemmliバッファーの7μLを追加し、5分間100°Cで沸騰させます。</li>
	</ol></li>
	<li>アクリルアミドゲルにサンプルをロードし、120Vの定電圧で電気泳動を行い、250mAで250mAでタンパク質を90分間転写します。</li>
	<li>適切なタンパク質ゲル電気泳動をチェックし、ポンソー染色溶液で膜を5分間インキュベートして、正常なブロッティングを行います。背景がきれいになるまで蒸留水で膜を洗いす。Tween 20(TBST)でトリス緩衝生理線をシェイカーで10分間洗い続けて汚れを取り除きます。</li>
	<li>シェーカーのRTで1時間、ブロッキング溶液(TBSTで5%ミルク)で膜をインキュベートします。TBSTで3回5分間洗浄します。</li>
	<li>ブロッキング溶液中の一次抗体(TBSTでは1%ミルク)で膜を4°Cで一晩ハイブリダイズする。TBSTで3回5分間洗浄します。</li>
	<li>HRP共役二次抗体をHRP共役二次抗体と共役化し、RTで1時間のブロッキング溶液を行い、TBSTで5分間3回洗浄する。</li>
	<li>化学発光を用いてタンパク質バンドを検出します。ImageJ によってウェスタン ブロット バンドの強度を定量化します。ハウスキーピング遺伝子の産物にタンパク質発現を正規化する:核可溶性および不溶性画分のためのヒストンH2B、細胞質分率および総抽出物のためのGAPDH。</li>
</ol>

<ol><li>Padmaraju, V., Indi, S. S., Rao, K. S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+evidences+on+Tau-DNA+interactions+and+relevance+to+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemistry+International%22%5BJournal%5D)">New evidences on Tau-DNA interactions and relevance to neurodegeneration.</a> Neurochemistry International. 57 (1), 51-57 (2010).</li>
<li>Rady, R. M., Zinkowski, R. P., Binder, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+tau+in+isolated+nuclei+from+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Aging%22%5BJournal%5D)">Presence of tau in isolated nuclei from human brain.</a> Neurobiology of Aging. 16 (3), 479-486 (1995).</li>
<li>Krylova, S. M., Musheev, M., Nutiu, R., Li, Y., Lee, G., Krylov, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+protein+binds+single-stranded+DNA+sequence+specifically+-+The+proof+obtained+in+vitro+with+non-equilibrium+capillary+electrophoresis+of+equilibrium+mixtures%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Tau protein binds single-stranded DNA sequence specifically - The proof obtained in vitro with non-equilibrium capillary electrophoresis of equilibrium mixtures.</a> FEBS Letters. 579 (6), 1371-1375 (2005).</li>
<li>Vasudevaraju, P., Guerrero, E., Hegde, M. L., Collen, T. B., Britton, G. B., Rao, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+evidence+on+%CE%B1-synuclein+and+Tau+binding+to+conformation+and+sequence+specific+GC%2A+rich+DNA%3A+Relevance+to+neurological+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacy+%26+Bioallied+Sciences%22%5BJournal%5D)">New evidence on α-synuclein and Tau binding to conformation and sequence specific GC* rich DNA: Relevance to neurological disorders.</a> Journal of Pharmacy & Bioallied Sciences. 4 (2), 112-117 (2012).</li>
<li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+to+the+minor+groove+of+the+double-strand%2C+Tau+protein+prevents+DNA+damage+by+peroxidation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Binding to the minor groove of the double-strand, Tau protein prevents DNA damage by peroxidation.</a> PLoS ONE. 3 (7), (2008).</li>
<li>Qi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+Magnetic+Resonance+Spectroscopy+Characterization+of+Interaction+of+Tau+with+DNA+and+Its+Regulation+by+Phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Characterization of Interaction of Tau with DNA and Its Regulation by Phosphorylation.</a> Biochemistry. 54 (7), 1525-1533 (2015).</li>
<li>Benhelli-Mokrani, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+identification+of+genic+and+intergenic+neuronal+DNA+regions+bound+by+Tau+protein+under+physiological+and+stress+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Genome-wide identification of genic and intergenic neuronal DNA regions bound by Tau protein under physiological and stress conditions.</a> Nucleic Acids Research. 1, 1-18 (2018).</li>
<li>Sotiropoulos, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atypical%2C+non-standard+functions+of+the+microtubule+associated+Tau+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Atypical, non-standard functions of the microtubule associated Tau protein.</a> Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 91(2017).</li>
<li>Lu, J., Li, T., He, R. Q., Bartlett, P. F., Götz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+microtubule-associated+protein+tau+in+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Science+China+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Visualizing the microtubule-associated protein tau in the nucleus.</a> Science China Life Sciences. 57 (4), 422-431 (2014).</li>
<li>Sultan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+Tau%2C+a+key+player+in+neuronal+DNA+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Nuclear Tau, a key player in neuronal DNA protection.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (6), 4566-4575 (2011).</li>
<li>Sjöberg, M. K., Shestakova, E., Mansuroglu, Z., Maccioni, R. B., Bonnefoy, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+protein+binds+to+pericentromeric+DNA%3A+a+putative+role+for+nuclear+tau+in+nucleolar+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cell+science%22%5BJournal%5D)">Tau protein binds to pericentromeric DNA: a putative role for nuclear tau in nucleolar organization.</a> Journal of cell science. 119 (10), 2025-2034 (2006).</li>
<li>Violet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+major+role+for+Tau+in+neuronal+DNA+and+RNA+protection+in+vivo+under+physiological+and+hyperthermic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A major role for Tau in neuronal DNA and RNA protection in vivo under physiological and hyperthermic conditions.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 1-11 (2014).</li>
<li>Hua, Q., He, R. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+could+protect+DNA+double+helix+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Proteins+and+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Tau could protect DNA double helix structure.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics. 1645 (2), 205-211 (2003).</li>
<li>Rossi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+function+of+microtubule-associated+protein+tau%3A+Involvement+in+chromosome+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">A new function of microtubule-associated protein tau: Involvement in chromosome stability.</a> Cell Cycle. 7 (12), 1788-1794 (2008).</li>
<li>Rossi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+MAPT+gene+cause+chromosome+instability+and+introduce+copy+number+variations+widely+in+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Alzheimer%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Mutations in MAPT gene cause chromosome instability and introduce copy number variations widely in the genome.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 33 (4), 969-982 (2013).</li>
<li>Rossi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+MAPT+give+rise+to+aneuploidy+in+animal+models+of+tauopathy%5BTitle%5D)+AND+%22neurogenetics%22%5BJournal%5D)">Mutations in MAPT give rise to aneuploidy in animal models of tauopathy.</a> neurogenetics. 15 (1), 31-40 (2014).</li>
<li>Sun, W., Samimi, H., Gamez, M., Zare, H., Frost, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+tau-induced+piRNA+depletion+promotes+neuronal+death+through+transposable+element+dysregulation+in+neurodegenerative+tauopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Pathogenic tau-induced piRNA depletion promotes neuronal death through transposable element dysregulation in neurodegenerative tauopathies.</a> Nature Neuroscience. 21 (8), 1038-1048 (2018).</li>
<li>Guo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+Activates+Transposable+Elements+in+Alzheimer%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Tau Activates Transposable Elements in Alzheimer's Disease.</a> Cell Reports. 23 (10), 2874-2880 (2018).</li>
<li>Maina, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+involvement+of+tau+in+nucleolar+transcription+and+the+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">The involvement of tau in nucleolar transcription and the stress response.</a> Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 70(2018).</li>
<li>Bonneau, C., Gurard-Levin, Z. A., Andre, F., Pusztai, L., Rouzier, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predictive+and+prognostic+value+of+the+Tau+protein+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Research%22%5BJournal%5D)">Predictive and prognostic value of the Tau protein in breast cancer.</a> Anticancer Research. 35 (10), 5179-5184 (2015).</li>
<li>Vanier, M. T., Neuville, P., Michalik, L., Launay, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+specific+tau+exons+in+normal+and+tumoral+pancreatic+acinar+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Expression of specific tau exons in normal and tumoral pancreatic acinar cells.</a> Journal of Cell Science. 111 (1), 1419-1432 (1998).</li>
<li>Liao, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+efficacy+of+FTY720+in+a+rat+model+of+NK-cell+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Therapeutic efficacy of FTY720 in a rat model of NK-cell leukemia.</a> Blood. 118 (10), 2793-2800 (2011).</li>
<li>Cascio, S., Zhang, L., Finn, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MUC1+protein+expression+in+tumor+cells+regulates+transcription+of+proinflammatory+cytokines+by+forming+a+complex+with+nuclear+factor-%CE%BAB+p65+and+binding+to+cytokine+promoters%3A+Importance+of+extracellular+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">MUC1 protein expression in tumor cells regulates transcription of proinflammatory cytokines by forming a complex with nuclear factor-κB p65 and binding to cytokine promoters: Importance of extracellular domain.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (49), (2011).</li>
<li>Costello, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+Term+Potentiation+Is+Impaired+in+Membrane+Glycoprotein+CD200-deficient+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Long Term Potentiation Is Impaired in Membrane Glycoprotein CD200-deficient Mice.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 34722-34732 (2011).</li>
<li>Roy, G., Placzek, E., Scanlan, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ApoB-100-containing+lipoproteins+are+major+carriers+of+3-iodothyronamine+in+circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">ApoB-100-containing lipoproteins are major carriers of 3-iodothyronamine in circulation.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (3), 1790-1800 (2012).</li>
<li>Loo, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+the+physiological+states+and+pharmacological+responses+of+differentiating+3T3-L1+preadipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in the physiological states and pharmacological responses of differentiating 3T3-L1 preadipocytes.</a> Journal of Cell Biology. 187 (3), 375-384 (2009).</li>
<li>Draker, R., Sarcinella, E., Cheung, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((USP10+deubiquitylates+the+histone+variant+H2A.Z+and+both+are+required+for+androgen+receptor-mediated+gene+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">USP10 deubiquitylates the histone variant H2A.Z and both are required for androgen receptor-mediated gene activation.</a> Nucleic Acids Research. 39 (9), 3529-3542 (2011).</li>
<li>Richard, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HSSB1+rapidly+binds+at+the+sites+of+DNA+double-strand+breaks+and+is+required+for+the+efficient+recruitment+of+the+MRN+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">HSSB1 rapidly binds at the sites of DNA double-strand breaks and is required for the efficient recruitment of the MRN complex.</a> Nucleic Acids Research. 39 (5), 1692-1702 (2011).</li>
<li>Roger, L., Jullien, L., Gire, V., Roux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gain+of+oncogenic+function+of+p53+mutants+regulates+E-cadherin+expression+uncoupled+from+cell+invasion+in+colon+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Gain of oncogenic function of p53 mutants regulates E-cadherin expression uncoupled from cell invasion in colon cancer cells.</a> Journal of Cell Science. 123 (8), (2010).</li>
<li>ten Have, S., Hodge, K., Lamond, A. I. Dynamic Proteomics: Methodologies and Analysis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aten+Have%2C+S+%22Functional+Genomics%22">Functional Genomics</a>. , Intechopen. (2012).</li>
<li>Siano, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+Modulates+VGluT1+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Tau Modulates VGluT1 Expression.</a> Journal of Molecular Biology. 431 (4), 873-884 (2019).</li>
<li>Serdar, B. S., Koçtürk, S., Akan, P., Erkmen, T., Ergür, B. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Which+Medium+and+Ingredients+Provide+Better+Morphological+Differentiation+of+SH-SY5Y+Cells%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings%22%5BJournal%5D)">Which Medium and Ingredients Provide Better Morphological Differentiation of SH-SY5Y Cells?</a> Proceedings. 2 (25), 1577(2018).</li>
<li>Forster, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+differentiated+SH-SY5Y+as+neuronal+screening+model+reveals+increased+oxidative+vulnerability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">Characterization of differentiated SH-SY5Y as neuronal screening model reveals increased oxidative vulnerability.</a> Journal of Biomolecular Screening. 21 (5), 496-509 (2016).</li>
<li>Dwane, S., Durack, E., Kiely, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimising+parameters+for+the+differentiation+of+SH-SY5Y+cells+to+study+cell+adhesion+and+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">Optimising parameters for the differentiation of SH-SY5Y cells to study cell adhesion and cell migration.</a> BMC Research Notes. 6 (1), 1(2013).</li>
<li>Encinas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+Treatment+of+SH-SY5Y+Cells+with+Retinoic+Acid+and+Brain-Derived+Neurotrophic+Factor+Gives+Rise+to+Fully+Differentiated%2C+Neurotrophic+Factor-Dependent%2C+Human+Neuron-Like+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Sequential Treatment of SH-SY5Y Cells with Retinoic Acid and Brain-Derived Neurotrophic Factor Gives Rise to Fully Differentiated, Neurotrophic Factor-Dependent, Human Neuron-Like Cells.</a> Journal of Neurochemistry. 75 (3), 991-1003 (2002).</li>
</ol>

著者たちは何も開示する必要はない。

核タウタンパク質が遺伝子発現に及ぼす影響を測定する方法について述べたい。このプロトコルを使用すると、細胞質タウの寄与は強く制限される。このプロトコルの重要なステップは、ヒト神経芽細胞腫SH-SY5Y細胞の分化、細胞内分画および核コンパートメントにおけるタウタンパク質の局在化である。
まず、代表結果セクションに示すように、RAおよびBDNFを添加することによりSH-SY5Y細胞の分化は、培養中のニューロン様細胞の良好な調製を得るために重要である。種子化された細胞の密度は、密度が低いほど細胞増殖に影響を与える可能性があるため、特に重要である。さらに、細胞分画やウェスタンブロットのような多数の細胞を必要とする実験では、BDNF分化工程が末端分化を可能にする細胞増殖をブロックし、培養中の細胞数を制限することに注意することが重要である。代替差別化プロトコルは、BDNF の代わりに RA または NGF のみを使用します。しかしながら、RA後にBDNFを添加すると、より良い形態学的分化32、33<sup class="xre...

核内のタウタンパク質の機能は、核酸1、2、3、4、5、6と密接に関連していることが示されているように、近年大きな関心を集めている。実際、最近のゲノムワイド研究では、タウが生体内7で原性およびインタージェニックDNA配列に結合することを実証した。ヌクレオラー組織における役割は、8、9、10、11が示唆されている。さらに、タウは酸化および高熱ストレス5、10、12、13からのDNA保護に関与することが提案されているのに対し、変異タウは染色体不安定性およびアヌプロイディ14、15、16に関連している。
これまで、核区画におけるタウの機能を研究する上での課題は、細胞質タウの寄与から核タウの具体的な寄与を解剖する難しさのためにほとんど未解決のままでした。さらに、核区画内のタウ分子に起因する機能は、これまで、核タウタンパク質の直接的な関与の明確な実証を欠いているため、相関に過ぎない。実際、レトロトランスポゾンの移動性またはrRNA転写またはDNA保護11、12、17、18、19におけるタウの関与は、細胞質タウの寄与または核タウに関連しない他の下流因子の影響によっても説明され得る。 
ここでは、核局在化(NLS)または核輸出信号(NES)でタグ付けされたタウコンストラクト0N4Rの使用と組み合わせて核コンパートメントを分離する古典的な手順を利用して、この問題を解決する方法を提供します。このアプローチは、細胞質コンパートメントからのタウ分子の波及による可能なアーティファクトに関連する複雑な問題を排除します。さらに、タウNLSおよびタウファミコン構築物は、それぞれ核コンパートメントからのタウ分子の濃縮または排除を誘導し、特定の機能における核タウ分子の関与に対する正および負の制御を提供する。このプロトコルは技術的に容易であり、タウ発現20、21を再活性化する癌細胞などの他の細胞型におけるタウの核機能を研究するために広く適用可能な古典的で信頼性の高い方法で構成されている。さらに、異なる区画に関連する生物学的機能を解剖するために、細胞質と核の両方に存在する他のタンパク質にも適用され得る。

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 633 ヤギ抗マウス IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A21050</td><td>IF 1:500</td></tr><tr><td>抗アクチン抗体</td><td>BETHYL LABORATORIE</td><td>A300-485A</td><td>抗ウサギ WB 1:10,000</td></tr><tr><td>抗 GAPDH 抗体</td><td>フィッツジェラルド インダストリーズ インターナショナル</td><td>10R-G109a</td><td>抗マウス WB 1:10,000</td></tr><tr><td>抗 H2B 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab1790</td><td>抗ウサギ WB 1:15,000</td></tr><tr><td>反Tau-13抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-21796</td><td>anti-mouse WB 1:1,000;IF 1:500</td></tr><tr><td>抗チューブリンα抗体</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>PA5-16891</td><td>抗マウス WB 1:5,000</td></tr><tr><td>抗 VGluT1 抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>AMAb91041</td><td>抗マウス WB 1:500</td></tr><tr><td>BCA Protein Assay Kit</td><td>Euroclone</td><td>EMPO14500</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Alomone Labs</td><td>B-250</td><td></td></tr><tr><td>ブロッティンググレードブロッカー</td><td>Biorad</td><td>1706404</td><td>無脂肪粉乳</td></tr><tr><td>BOVIN血清アルブミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503-50g</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Mini</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td>protease inhibitor</td></tr><tr><td>Criterion TGX 4-20% Stain Free, 10 well</td><td>Biorad</td><td>5678093</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62247</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>GIBCO</td><td>21331-020</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagleの 中低グルコース</td><td>ユーロクロン</td><td>ECM0060L</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>0390-100ml</td><td>pH = 8, 0.5 M</td></tr><tr><td>胎児ウシ血清</td><td>ユーロクロン</td><td>EC50182L</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>G5516-500ml</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ 抗マウス IgG-HPR</td><td>サンタクルス バイオテクノロジー</td><td>sc-2005</td><td>WB 1:1,000</td></tr><tr><td>ヤギ 抗ウサギ IgG-HPR</td><td>サンタクルス</td><td>バイオテクノロジーsc-2004</td><td>WB 1:1,000</td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8896-50ml</td><td>オクチルフェノキシポリ(エチレンオキシ)エタノール</td></tr><tr><td>Immobilon Western</td><td>MERCK</td><td>WBKLS0500</td><td></td></tr><tr><td>Lab-Techチャンバースライド8ウェルガラススライド</td><td>nunc</td><td>177402</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>ユーロクロン</td><td>ECB3000D</td><td>100X</td></tr><tr><td>リポフェクタミン 2000 トランスフェクション試薬</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>12566014</td><td>カチオン性脂質</td></tr><tr><td>メタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>322415-6X1L</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM 還元血清中剤</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>PEI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>40,872-7</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>15140122</td><td>10,000 U/mL、100 mL</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (ダルベッコ A)</td><td>OXOID</td><td>BR0014G</td><td></td></tr><tr><td>PhosStop</td><td>Roche</td><td></td><td>4906837001 ホスファターゼ阻害剤</td></tr><tr><td>QIAGEN プラスミド マキシキット</td><td>Qiagen</td><td>12163</td><td>ステップ 3.10</td></tr><tr><td>レチノイン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625-100mg</td><td></td></tr><tr><td>培養細胞用細胞内タンパク質分画キット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>78840</td><td></td></tr><tr><td>サポートニトロセルロース膜</td><td>Biorad</td><td>1620097</td><td></td></tr><tr><td>TC-Plate 6well</td><td>SARSTEDT</td><td>833,920</td><td></td></tr><tr><td>TCS SP2 レーザー走査型共焦点顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Triton x-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-500ml</td><td>非イオン性界面活性剤</td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td>15400054 0.50%</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416-100ml</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD 退色防止封入剤</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification Systems</td><td>プロメガ</td><td>A1330</td><td>ステップ3.5</td></tr></tbody></table>

疾患関連遺伝子の発現を調べるツールとしてのタウ小細胞局在の変調

Modulation of Tau Subcellular Localization as a Tool to Investigate the Expression of Disease-related Genes

タウは、ニューロンで発現される微小管結合タンパク質であり、その主な既知の機能は、細胞骨格安定性の維持に関連している。しかし、最近の証拠は、タウがDNA保護に関与する核を含む他の細胞内コンパートメントにも存在することを示し、rRNA転写において、レトロトランスポゾンの移動性および構造組織において核小体。我々は最近、核タウがVGluT1遺伝子の発現に関与していることを実証し、アルツハイマー病の初期段階におけるグルタミン酸放出の病理学的増加を説明できる分子機構を示唆している。最近まで、標的遺伝子の発現を調節する核タウの関与は、細胞質タウの寄与または他の効果の排除を妨げた技術的な制限のために比較的不確実であいまいであった核タウとは関係のない下流要因この不確実性を克服するために、核タウタンパク質によって特異的に変調された標的遺伝子の発現を研究する方法を開発しました。我々は、局在シグナルと細胞下分画の使用を結合するプロトコルを採用し、細胞質タウ分子からの干渉を排除することを可能にした。最も顕著なのは、プロトコルは簡単であり、他の細胞型および細胞状態におけるタウの核機能を研究するために広く適用可能である古典的で信頼できる方法で構成されている。

細胞質タウタンパク質の寄与を避ける遺伝子発現における核タウの影響を解剖するために用いられる戦略を図1に示した。簡単に言えば、NLSまたはNESでタグ付けされたタウタンパク質は、それぞれ核コンパートメントに蓄積されるか、または核コンパートメントから除外されます。このアンバランスの機能効果は、VGluT1遺伝子の産物として測定される遺伝子発現の変化である。
プロトコルの説明に続いて、SH-SY5Y細胞をRAで5日間処理し、次いでBDNFで3日間処理し、有糸分裂後ニューロン様細胞を得た(図2)。RAおよびBDNFがない場合、未分化SH-SY5Y細胞は、ラウンダー形態を仮定し、細胞塊を形成する。予想通り、分化プロトコルを開始し、塊が巻き戻され、細胞は神経突起を広げます。分化の終わりに、細胞は分岐した神経突起のネットワークを介して均一に分布し、...

タウは、細胞質に存在する神経タンパク質であり、そこで微小管を結合し、核の中で、アルツハイマー病関連遺伝子の変調を含む非伝統的な機能を発揮する。ここでは、細胞質タウからの干渉を排除しながら核タウの機能を調べる方法について述べる。

Tau is a microtubule binding protein expressed in neurons and its main known function is related to the maintenance of cytoskeletal stability. However, ...

この方法は、潜在的な細胞質タウ汚染を除いた一方で、核コンパートメントにおけるタウの直接的な役割に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、他の細胞型および異なる細胞条件下におけるタウの核機能に関する研究に広く適用可能である。手順を実証することは、私の研究室のポストドクターであるジャコモ・シアーノです。空のコントロールベクターにトランスフェクトされる5つのSH-SY5Yヒト神経芽細胞細胞に10回、タグなしタウでトランスフェクトされる5つの細胞に10回、タウNLSでトランスフェクトされる5つの細胞に4回10回、タウ-NESをトランスフェクトする5つの細胞に4回10回、5つの細胞に4回10を3つのウェルプレートの個々のウェルウェルにトランスフェクトする。めっきの翌日、400ナノグラムのDNAと適切な量のカチオン脂質を1つのチューブに分けて、1ウェルあたり250マイクロリットルの減少した血清をインキュベートする。室温で5分後、各ベクターを1体積のカチオン脂質と組み合わせ、室温で20分間DNA脂質複合体をインキュベートします。インキュベーションの終わりに、各ウェルの上清を2ミリリットルの新鮮な完全な培養培地に置き換え、摂氏37度で一晩インキュベーションするための適切なDNA脂質複合体溶液でそれぞれをうまくトランスフェクトする。翌日、上清を新鮮な分化培地に置き換えます。ウェスタンブロット分析では、各井戸のトランスフェクトおよび分化した細胞をPBSで洗浄し、摂氏37度で4分間、1ウェルあたり0.1%トリプシンの500マイクロリットルで細胞をインキュベートします。細胞が剥離したら、完全な培地の等量で反応を停止し、遠心分離のために各ウェルから個々のチューブに細胞懸濁液を移す。上清を慎重に除去した後、2番目の遠心分離のためにチューブあたりPBSの1ミリリットルでペレットを再懸濁し、再び上清を除去する。全タンパク質抽出物の場合、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を添加したリシスバッファーの50〜100マイクロリットルで氷上で30分間ペレットをインキュベートします。インキュベーションの終了時に、抽出物を16,000回gで15分間遠心分離し、任意の標準的な定量アッセイによってタンパク質濃度を定量する。その後、各タンパク質サンプルの20マイクログラムを4Xレムリバッファーの5マイクロリットルと混合し、合計容量20マイクロリットルにし、サンプルを摂氏100度で5分間沸騰させます。細胞内分画の場合は、カウント用の完全な培地中の細胞を再懸濁し、サンプルあたり6個の細胞に10回スピンダウンします。細胞質分画を分離するには、10分間穏やかな混合で摂氏4度のプロテアーゼ阻害剤を添加した氷冷細胞質抽出バッファーの100マイクロリットルでペレットをインキュベートする。インキュベーションの終了時に、遠心分離によってサンプルを収集し、上清を冷やされたチューブに移します。100マイクロリットルの氷冷膜抽出バッファーをペレットに加え、穏やかな混合で摂氏4度で10分間インキュベーションします。その後、ペレットを摂氏4度と3,000倍gで5分間遠心し、上清を新しいチューブに集めます。可溶性核分率を収集するには、プロテアーゼ阻害剤を添加した核抽出バッファーの50マイクロリットルを渦液でペレットに加え、サンプルを摂氏4度で30分間インキュベートします。インキュベーションの終わりに、サンプルを遠心分離し、上清を収集します。不溶性核分率を収集するには、プロテアーゼ阻害剤、塩化カルシウムおよびミクロコッカルヌクレアーゼをボルテックスでペレットに添加した核抽出バッファーの50マイクロリットルを加えます。渦と遠心分離機の前に摂氏37度で5分間サンプルをインキュベートします。その後、上清を収集します。細胞骨格分画を収集するには、50マイクロリットルの細胞骨格抽出バッファーを加え、プロテアーゼ阻害剤を添加し、渦を伴うペレットに添加します。室温で10分間のインキュベーションの後、サンプルを遠心分離し、上清を収集します。SDS-PAGE分析では、収集した細胞内分率サンプルのそれぞれ20マイクロリットルに4Xレムリバッファーの7マイクロリットルを加え、サンプルを摂氏100度で5分間沸騰させます。インキュベーションの最後に、サンプルをアクリルアミドゲルにロードし、120ボルトの一定電圧で電気泳動を行います。その後、タンパク質をニトロセルロース膜に250ミリアンペアで90分間移します。ポンソー染色液で膜を5分間インキュベートし、適切なタンパク質ゲル電気泳動とブロットが成功していることを確認します。インキュベーションの終わりに、バックグラウンドがきれいになるまで蒸留水で膜をすすい、シェイカーで10分間Tween 20を補ったトリス緩衝生理食液で連続洗浄して汚れを取り除きます。次に、トリスバッファー生理食糸と Tween 20 を洗浄ごとに 5 分間洗浄する前に、振盪で室温で 1 時間ブロック溶液で膜をインキュベートします。最後の洗浄後、摂氏4度で一晩ブロッキング溶液に関心のある一次抗体で膜をハイブリダイズし、続いてトリス緩衝生理食肉とTween 20を5分間洗浄します。最後の洗浄後、トリス緩衝生理食肉とTween 20を洗浄1回5分間3回洗浄する前に、ブロック溶液中の適切な西洋ワサビペルオキシダーゼを常温で1時間、ブロッキング溶液に組み合わせて膜をハイブリダイズします。最後の洗浄後、化学発光を用いてタンパク質バンドを検出し、ImageJでウェスタンブロットバンドの強度を定量化します。レチノイン酸および脳由来神経栄養因子がない場合、未分化SH-SY5Y細胞は、丸い形態を仮定し、細胞塊を形成する。予想通り、レチノイン酸による5日間の治療の後、塊は解き戻され、細胞は広がった。脳由来神経栄養因子による3日間の治療の後、細胞は分岐した神経突起のネットワークを介して均一に分布し、相互接続されて現れる。タウ-NLSまたはタウ-ファミコントランスフェクション後、タウ細胞内局在化は、抗タウ抗体による免疫蛍光によって検出することができる。トランスフェクションの効率に応じて、細胞はタウ-NLSトランスフェクション後のDAPIシグナルと結合する強い核染色を示すか、タウ-ファミコン後の空核で細胞質染色を行う。ウェスタンブロット分析は、細胞骨格分画内のアクチン、細胞質および細胞骨格分画内の管状管、および核画分内のH2Bの濃縮を明らかにする。ウエスタンブロット分析はまた、全抽出物中の核コンパートメントおよびベシカルグルタミン酸トランスポーター内のタグ付きおよびタグなしタウの発現を確認する。実際、可溶性核および細胞質画分におけるタウの比率は、タウ-NLSが可溶性核分率に高く富化され、タウ-NESが減少するという事実を強調している。さらに、タウ-NLSは、タウ-ファミコンが減少している間、細胞質画分に関してクロマチン結合画分で濃縮される。各サンプルの分画に使用される細胞の数を注意深くチェックし、適切な分数でハウスキーピング遺伝子の濃縮を確認してください。このビデオを見た後, 細胞コンパートメントを分離し、核のタウの機能的役割を評価することができるはずです.

modulation-tau-subcellular-localization-as-tool-to-investigate

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

このビデオでは、pH感受性蛍光標識タウ凝集体を用いてマウスミクログリアによるタウの取り込みを定量化する細胞ベースのアッセイを紹介しています。これを蛍光活性化セルソーティングで分析し、定量的評価を行っています。...

ミクログリアによるタウタンパク質の取り込みを評価するための細胞ベースのアッセイ

このビデオでは、黄色蛍光タンパク質(YFP)でタグ付けされた変異型ヒトタウタンパク質をコードするレンチウイルスをヒト神経細胞に形質導入し、タンパク質凝集を研究するプロセスを示しています。ウイルスの侵入から変異型タウの発現までのステップを概説し、ニューロンに目に見える細胞質タウ凝集体が形成されるまでのステップを概説しています。...

タウタンパク質凝集解析のためのヒトニューロンのレンチウイルス媒介形質導入

非修飾および高リン酸化タウタンパク質は、高リン酸化依存速い凝集速度論を明らかに二つのインビトロ凝集アッセイに使用した。これらのアッセイは、アルツハイマー病の進行の基礎となる原線維を形成する過リン酸化タウの性向を調節することができる化合物のための将来のスクリーンのための道を開く。...

高リン酸化タウタンパク質を用いたインビトロ凝集アッセイにおいて

タンパク質凝集体の細胞間移動、またはプロテオパシーシードは、神経変性疾患の病理進行の根底にある可能性があります。ここでは、組換えサンプルまたは生物学的サンプルからの播種活性を特異的かつ高感度に検出することを可能にする新しいFRETフローサイトメトリーアッセイについて説明します。...

FRETフローサイトメトリーでProteopathic播種活動の高感度検出

本稿では、測定、微小管と薬物治療に続く細胞内のタウのローカリゼーションのタウ結合タウ タウを測定するための標準プロトコルについて説明します。これらのプロトコルは、薬やタウ...

リン酸化と大腸癌細胞におけるタウ蛋白の局在と微小管結合の試金

In vivoマイクロダイアリシスが分子目を覚まし、自由行動下動物から脳間質液 (ISF) の現在のコレクションを有効にします。Isf 形式で比較的大きな分子を解析するために現在の記事は特にプローブを用いた膜切断高分子量マイクロダイアリシス...

生体内で高分子量カットオフと間質液を脳から大規模な細胞外タンパク質を収集するマイクロダイアリシス法プローブします。

ここより反タウ抗体の作用のメカニズムを特徴付けるため治験ツールの作成目的とミクログリアによるタウ摂取量を定量的に評価する細胞に基づく試金を記述します。...

タウの抗体を介したミクログリアによってクリアランスを勉強するセルベースのアッセイ

このプロトコルは、ヒトの神経細胞培養が変異型ヒトタウのためのコーディングをコードするレンチを用いて形質導入される手順を詳述する。形質導入培養物は、タウ凝集体および関連する病理を表示する。...

ヒトニューロンのレンチウイルス媒介性形質導入を用いたタウ凝集を研究するための in Vitro モデル

円形RNAを生成するレポーター遺伝子のクローン化と解析を行います。これらのレポーター遺伝子は、線形スプライシングを解析する構築物よりも大きく、Alu要素を含んでいます。円形RNAを調べるため、細胞にトランスフェクトされ、リニアRNAを除去した後にRT-PCRを用いてRNAを解析します。...

円形RNA解析に対する小遺伝子を含むAlu要素の使用

ここでは、初代海馬げっ歯類ニューロンのトランスフェクションと生細胞共焦点イメージングを組み合わせて、軸索輸送に対する病理学的タンパク質誘発性の影響を解析し、これらの影響を媒介する機構経路を特定する方法を示します。...

生細胞イメージングを使用して、初代海馬ニューロンの軸索輸送に対する病理学的タンパク質の影響を測定する

学ぶ 細胞質Tauの汚染を排除して核Tauを単離する方法。SH-SY5Y細胞を用いたこの技術は、アルツハイマー病関連遺伝子の発現調節メカニズムを解明し、神経変性疾患の治療戦略開発に貢献する。

疾患関連遺伝子の発現を調べるツールとしてのタウ小細胞局在の変調

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