Name: 세포 부착의 역학 을 검사 하 고 산화 스트레스 동안 Fibronectin에 상피 세포의 확산 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: 학습하세요 산화 스트레스 조건에서 fibronectin에 상피 세포의 부착 및 확산 역학을 정량화하는 방법을. 이 기법은 세포골격 역학 연구에 활용 가능하며 암 전이 메커니즘 이해에 기여합니다.

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저자들은 스콧 R. 허튼 박사와 메건 S. 블랙레지 박사가 원고에 대한 비판적 검토에 감사를 표한다. 이 작품은 하이 포인트 대학의 연구 및 후원 프로그램에 의해 투자되었다 (MCS) 노스 캐롤라이나 주립 대학에서 생명 공학 프로그램 (MCS).

1. 준비
참고: 아래에 설명된 프로토콜은 REF52 세포 및 ATM+/+ 또는ATM-/- 인간 섬유아세포와 함께 사용하기 위해 최적화되었습니다. 다른 세포 유형은 아래 노트 및 문제 해결 섹션에 설명된 대로 추가 최적화가 필요할 수 있습니다.
<ol><li>REF52 세포에 대한 완전한 세포 배양 배지의 500 mL를 만드십시오. Dulbecco의 수정 된 독수리 배지 (DMEM)를 포함하는 고혈당 500 mL에 10 % FBS, 2 mM L-글루타민 및 100 단위 / mL 페니실린 스트렙 토마이신을 추가합니다.</li>
	<li>멸균 1x 인산완충 식염수(PBS), pH 7.4의 12 mL에 1 mg/mL FN 용액 300 μL을 추가하여 피브로넥틴(FN)의 25 μg/mL 용액을 준비합니다. 잘 섞으세요.</li>
	<li>혈청 프리 DMEM 세포 배양 배지에서 0.5% (w/v) 탈립(즉, 지방산 불포함) 소 혈청 알부민(dlBSA) 용액을 준비한다. 0.5 g의 dlBSA를 100 mL의 혈청 프리 DMEM 배지에 추가합니다. 용액을 잘 섞지 만 소용돌이를하지 마십시오. 사용하기 전에 0.22 μM 주사기 필터를 사용하여 용액을 새로운 멸균 용기에 걸링합니다. 4 °C에서 보관하십시오.</li>
	<li>1x PBS의 100 mL에 파라포름 알데히드 3.7 g을 용해시킴으로써 3.7 % 파라 포름 알데히드 용액을 만듭니다. 부드러운 열과 교반을 사용하여 파라포름알데히드를 용액으로 넣습니다. 참고: 파라포름 알데히드 용액은 빛에 민감하며 빛으로부터 보호되어야 합니다. 4 °C에서 보관하면 최대 1 주일 동안 좋습니다. 주의: 파라포름알데히드는 독성, 인화성, 부식성 및 건강상의 위험이 있습니다. 사용하기 전에 파라포름알데히드에 대한 재료 안전 데이터 시트를 검토하십시오. 아이 쉴드, 페이스 쉴드, 전면 입자 호흡보호구, 장갑 및 실험실 코트를 포함하여 취급할 때 적절한 개인 보호 장비를 사용하십시오.</li>
	<li>1x PBS (v /v)에서 0.2 % 비 이온 계면 활성제를 함유하는 투과 솔루션을준비하십시오. 100 mL의 경우, 교반하면서 트리톤 X-100 ~ 100 mL의 0.2 mL를 천천히 추가합니다.</li>
	<li>1x PBS 용액에 용해된 2.5% BSA, 5% 염소 혈청 및 0.05% 비이온 계면활성제(w/v/v)를 함유하는 면역형 광차단 완충제를 만든다. 100 mL의 경우, 교반하면서 염소 세럼 5 mL, BSA 2.5 g, 트리톤 X-100 0.05 mL을 95 mL 1x PBS에 넣습니다.</li>
	<li>37°C 및 5%CO2에서세포 배양 인큐베이터에서 10cm2(또는 임의의 다른 용기 크기) 세포 배양 플레이트에서 DMEM 완전 배양 배지에서 REF52 세포를 성장시다.</li>
</ol>2. 세포 외 매트릭스 단백질 피브로넥틴으로 세포 배양 판을 코팅
참고: BSL-2 인증 층류 후드에서 무균 기술과 멸균 시약을 사용하여 이 섹션을 수행합니다. 시작하기 전에 주요 단계에 대한 개요는 그림 1A를 참조하십시오.
<ol><li>조직 배양 인증 24웰 플레이트를 사용하여, 각 우물에 유리 커버슬립 1개(12-Cir-1)를 놓습니다. 그림 1B에따라 플레이트에 라벨을 붙입니다.</li>
	<li>25 μg/mL FN 용액의 피펫 500 μL을 24웰 플레이트의 각 웰에.</li>
	<li>코팅과 완전한 침수를 보장하기 위해 각 커버에 용액을 몇 번 슬립합니다. 뚜껑을 접시에 다시 놓습니다.</li>
	<li>플레이트를 37°C 및 5%CO2에서 1시간 동안 세포 배양 인큐베이터에서 배양한다. 참고: 또는 4°C에서 밤새 배양하십시오.</li>
	<li>1 시간 후, 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 우물에서 FN 용액을 흡인한다.</li>
	<li>1x PBS의 500 μL로 우물을 세 번 씻으소서. 1x PBS의 최종 세척을 흡인합니다.</li>
	<li>37°C 및 5%CO2에서최소 15분 동안 0.5% dlBSA 용액의 500 μL로 웰을 차단합니다.</li>
	<li>아래 3단계에서 도금 전지를 하기 전에 dlBSA 용액을 흡인한다. 참고: 플레이트를 보관하는 경우 dlBSA 용액을 포위한 후 각 커버슬립에 500 μL의 1x PBS를 추가하십시오. 플레이트는 최대 1주일 동안 4°C에서 보관할 수 있습니다.</li>
</ol>3. 부착 분석에 대한 앵커리지 의존적 세포 준비
참고: BSL-2 인증 층류 후드에서 무균 기술과 멸균 시약을 사용하여 이 섹션을 수행합니다.
<ol><li>셀 도금 전에 적어도 30 분, 다음 솔루션을 미리 따뜻하게 : DMEM 완전한 매체, dlBSA 용액, 1 x PBS, 0.5 % 트립신 - EDTA 솔루션, 37 ° C 수조에서 트립신 중화 혈청 (TNS).</li>
	<li>10cm2 접시에 REF52 세포의 결합 단층으로 시작하여 따뜻한 1x PBS 6 mL로 세포를 두 번 씻으하십시오. 혈청은 37°C 및 5%CO2에서6 mL의 따뜻한 dlBSA 용액에서 적어도 1 시간 동안 (세포 유형에 따라 다름) 세포를 굶어.</li>
	<li>6 mL의 따뜻하게 한 1x PBS로 세포를 세척하고 PBS를 흡인하고 따뜻한 0.5 % 트립신 -EDTA 용액 1.5 mL을 추가하십시오.</li>
	<li>세포를 37°C및 5%CO2에서 ~2분 동안 세포 배양 인큐베이터에 놓는다.</li>
	<li>가벼운 현미경으로 세포를 관찰하여 분리가 완료되었는지 확인합니다. 세포가 벤치 상판에 플레이트를 두드린 후에도 여전히 부착되어 있는 경우, 37°C 인큐베이터로 되돌려 추가로 2분 간. 필요에 따라 적은 시간 동안 세포를 트립시니화한다.</li>
	<li>파이펫 1.5 mL의 따뜻한 트립신 중화 용액 (TNS)을 접시에 트립시니화를 중지하고 분리 된 세포를 수집합니다. 용액을 플레이트 바닥상에서 여러 번 파이펫하여 남은 모든 부착 셀을 제거합니다. 세포가 덩어리로 나타나면 접시 뒤쪽에서 부드럽게 위아래로 파이펫팅하여 셀 현탁액을 삼각화하십시오.</li>
	<li>경현미경으로 트립판 블루 배제 및 혈세포계를 사용하여 세포를 카운트합니다. 또는 자동화된 셀 카운터를 사용합니다.</li>
	<li>15 mL 원엽 튜브에서 dlBSA의 5 mL에서 1.0 - 3.0 x 104 세포 /mL 세포 현탁액을 생성하기 위해 적절한 양의 세포를 제거합니다.</li>
	<li>~ 300 x g에서 5 분 동안 테이블 탑 원심 분리기에서 고정 각도 로터를 사용하여 원심 분리기 세포.</li>
	<li>세포 펠릿으로부터 상월체를 흡인하고, 총 7 mL의 따뜻한 dlBSA 용액에서 세포를 재중단시켰다. 커버슬립 도금 시 세포가 지나치게 동조되는 것을 허용하지 말고, 서로 접촉하는 세포가 거의 없는 균등하게 분포한다.</li>
	<li>세포 현탁액을 2개의 15 mL 원뿔형 튜브로 균등하게 나누고, 하나는 비히클 단독 제어(DMSO)와 Ku55933(ATM 키나제 억제제, 산화제)에 대해 하나5. 각 튜브에 3.5 mL의 셀 현탁액이 포함되어 있는지 확인하십시오.</li>
	<li>튜브 회전기를 사용하여, 세포 배양 인큐베이터에서 90-120분 동안 37°C에서 튜브를 회전한다.</li>
	<li>도금 30분 전에 각 튜브에 10 μM Ku55933 및 DMSO(1:1,000)의 최종 농도를 추가합니다. 셀 서스펜션을 남은 시간 동안 회전자 위에 다시 놓습니다.</li>
	<li>세포를 도금하기 직전에, 인큐베이터로부터 24웰 플레이트를 회수하고 dlBSA 용액을 흡인한다.</li>
	<li>세포 현탁액을 90-120분 동안 회전한 후, 각 처리군으로부터 500 μL의 세포 현탁액을 제거하고 24-웰 플레이트에서 1개의 FN 코팅 커버슬립을 2단계로부터 첨가하였다(도1B). 플레이트를 37°C 및 5%CO2 세포 배양 인큐베이터로 되돌리고 세포 현탁액을 다시 회전한다.</li>
	<li>FN 커버슬립상에 셀 현탁액을 도금한 후, 세포가 원하는 시간(예를 들어, 10분, 15분, 20분, 30분)동안 부착되도록 한 다음 즉시 4단계로 진행한다.</li>
</ol>4. 면역 형광을 위한 세포 고정 및 항체 염색
참고: 다음 단계는 달리 명시되지 않는 한 비멸균 조건 및 실온에서 수행됩니다.
<ol><li>접착이 필요한 시간이 경과한 후, 플레이트의 각 커버슬립에서 셀 용액을 흡인한다.</li>
	<li>우물의 측면을 사용하여 각 커버 슬립에 3.7 % 파라 포름 알데히드 용액 500 μL을 부드럽게 분배하고 10-15 분 기다립니다.</li>
	<li>파라포름알데히드 용액을 제거하고 각 커버슬립을 500 μL의 1x PBS로 총 2회 세척합니다. 참고: 기관의 환경 보건 및 안전 계획에 따라 파라포름 알데히드 폐기물을 책임감 있게 폐기하십시오.</li>
	<li>PBS를 흡인하고, 실온에서 10-15분 동안 1x PBS(v/v)에서 0.2% 트리톤 X-100의 500 μL로 각 커버슬립에 세포를 투과시한다.</li>
	<li>각 커버슬립을 1x PBS의 500 μL로 3회 세척합니다.</li>
	<li>5% 염소 혈청, 2.5% BSA 및 0.05% 트리톤 X-100을 함유하는 면역형광 차단 완충액500 μL로 각 커버슬립상의 세포를 1 x PBS 용액에 30-60분 동안 용해시블한다.</li>
	<li>차단 완충제에서 1차 항팍실린 항체(1:250)를 희석한다. 잘 섞어서 각 커버슬립에 항체 용액200 μL을 추가합니다. 적어도 1 시간 동안 실온에서 배양하십시오. 참고: 대안적으로, 1차 항체 용액은 4°C에서 하룻밤 동안 배양될 수 있다. 염색 복합체 및 후속 FA 분석에 사용될 수 있는 많은 일반적인 초점 접착 마커가 있습니다. 이들은 인테그린 소단위 (β1, α5, 또는 αV), 탈린, 또는 vinculin2:다음 단백질에 대하여 항체를 포함합니다.</li>
	<li>항체 용액을 흡인하고, 각 커버슬립을 1x PBS의 500 μL로 각각 10분 동안 3회 세척한다. 이 지점에서 앞으로 빛으로부터 샘플을 보호하십시오.</li>
	<li>동일한 차단 완충액에서 적색 형광 알렉사 594 염료(1:1000) 및 염소 항 마우스 488형광이차 항체(1:400)에 공액화된 팔로이드 F-액틴 프로브를 희석한다. 잘 섞어서 각 커버슬립에 200 μL의 항체 용액을 30분 동안 넣습니다. 참고: 다른 종으로부터형광성으로 공액된 이차 항체도 사용될 수 있다. 그러나, 다른 종으로부터항체의 사용은 차단 완충제 혈청의 변형을 요구할 것이다.</li>
	<li>항체 용액을 흡인하고, 각 커버슬립을 1x PBS의 500 μL로 각각 10분 동안 3회 세척한다.</li>
	<li>1x PBS를 흡인하고 dIH2O의 500 μL로 한 번 헹구는다.</li>
	<li>DAPI를 포함하는 안티 페이드 장착 매체를 사용하여 현미경 슬라이드에 전표를 장착합니다.</li>
	<li>현미경 슬라이드를 두고 실온에서 어둠 속에서 하룻밤 을 설정합니다.</li>
	<li>현미경 슬라이드를 4 °C에서 어두운 환경에서 저장하여 장기간 보관하고 이미징이 끝날 때까지 보관하십시오. 참고 : 표준 면역 형광 기술을 사용하여 이미지. 고출력 오일 침지 60배 대물 렌즈를 사용하여 셀 가장자리의 초점 접착력과 주변 주름을 기록할 수 있는 충분한 해상도를 확보하는 것이 좋습니다. 각 치료 조건 및 시간에 따라 각 커버슬립에 대해 여러 시야에서 20-30개의 셀 이미지를 수집합니다. 결합된 복제본에서 통계 분석을 수행하려면 최소 60개의 셀을 생성해야 합니다. 형광 이미지를 로 저장하고 내보내기. 최소 300dpi 해상도의 TIFF 파일.</li>
</ol>5. 응력 섬유, 세포 순환 및 초점 접착 형성 정량화
참고 : 다음 이미지 분석은 (http://fiji.sc/) 무료로 다운로드 할 수있는 피지 그냥 이미지 J (피지)의 최신 버전을 사용하여 수행됩니다.
<ol><li>일반 이미지 처리 참고: 모든 이미지는 아래 5.1.1-5.1.5 단계를 수행하여 계산 분석을 위해 준비해야합니다(그림 2). 그 후, 모든 후속 정량화 절차를 선택할 수 있다.<ol>
<li>을 엽니다. 피지를 사용 하 여 TIFF 형광 이미지입니다. 이미지가 8비트 및 그레이스케일인지 확인합니다.</li>
		<li>이미지 조정 창/레벨을 선택하고 자동(그림 2A)을선택합니다.</li>
		<li>배경 형광을 빼려면 프로세스 빼기 배경을 선택합니다. 포물선 슬라이딩을 선택하고 롤링 볼 반지름 50픽셀(그림2B)의옵션을 선택합니다. 참고: 롤링 볼 반지름에 적합한 크기를 확인하려면 선 도구를 선택하고 이미지에서 가장 큰 접착력에 반지름을 그립니다. 측정을 선택하여 그려진 선의 길이를 확인합니다. 반지름 값이 너무 크면 이미지에서 접착을 포함한 피쳐가 손실됩니다. 반지름이 너무 작으면 배경 잡음으로 인해 처리된 이미지에서 아티팩트가 발생합니다.</li>
		<li>이미지 조정- 밝기/대비를 선택하여 배경에 접착강도를 확인합니다. 필요한 경우 조정합니다. 참고: 밝기 / 콘트라스트를 최적화하고 신호를 포화하지 않으려면 이미지의 조회 도구를 사용하여 히스토그램을 검사하여 밝기 / 대비를 조정하십시오.</li>
		<li>분석-세트 측정:면적, 평균 회색 값, 모양 설명자 및 통합 밀도에서 다음 매개변수를 선택합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>응력 섬유 형성 분석 참고: 응력 섬유는 표현형에 따라 여러 가지 방법으로 정량화될 수 있습니다.<ol>
<li>총 셀 수에 대한 백분율로 응력 섬유가 있는 셀 수를 계산합니다. 이 분석은 서로 다른 실험 조건 하에서 형성된 응력 섬유의 수에 시각적 차이가 있는 경우에 가장 좋습니다.</li>
		<li>셀을 가로대하는 응력 섬유의 수를 계산합니다. 이 분석은 세포 당 형성된 응력 섬유의 수를 비교하는 것을 허용합니다.</li>
		<li>세포 당 염색된 플라할로이드(예를 들어, F-액틴)에 의해 주어진 총 형광 강도를측정한다 17,18. 이 방법은 F-액틴 염색으로 인한 형광 강도의 급격한 증가/감소를 강조합니다.<ol>
<li>위의 5.1.5단계에서 측정 파라미터를 설정합니다.</li>
			<li>피지 도구 모음에서 자유형 도구를 선택하고 관심 있는 셀을 수동으로 추적합니다. 분석 측정을선택합니다. 선택한 측정 매개 변수를 보여주는 새 창이 나타납니다.</li>
			<li>피지 도구 모음에서 자유형 도구를 선택하고 셀이 없는 빈 공간을 수동으로 추적합니다. 분석 측정을선택합니다. 이 측정은 배경 형광으로 작용합니다.</li>
			<li>아래 방정식을 사용하여 세포당 총 F-액틴 형광을 결정합니다. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59989/59989equ01.jpg"> 참고: 생성된 측정은 세포당 F-액틴 형광을 주기 위해 다른 세포와 비교하여 정규화될 수 있습니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>세포 순환성 분석 참고 : 세포 영역에 대한 정보 (시간이 지남에 따라 퍼지는 셀의 지표) 뿐만 아니라 원형도 기록 할 수 있습니다. 이 측정은 각각 둥글게 길쭉한 셀을 정량화하는 방법으로 0에서 1 사이의 비율로 제공됩니다.<ol>
<li>피지 도구 모음에서 자유형 도구를 선택하고 개별 셀을 추적합니다. 이미지 측정을 선택하고 각 셀의 셀 면적 및 둘레 측정값을 기록합니다. 각 셀에 대해 이 절차를 반복합니다. 참고: 설정 측정 기능에서 원형은 모양 설명자 측정(5.1.5 단계)으로 제공됩니다.</li>
		<li>그림 3 및 그림 4에 설명된 대로 셀당 액틴이 풍부한 주름 또는 돌출부를 수동으로 계산합니다. </li>
	</ol></li>
	<li>초점 접착 분석 참고 : 초점 접착 분석을 수행하기 전에, 피지의 최신 버전에 멕시코 모자 필터 플러그인을 설치합니다. 다음 프로토콜은 이전 연구19,20,21에서수정되었습니다.<ol>
<li>블록 크기 19, 히스토그램 저장소 256, 최대 경사 6을 사용하여 마스크없이 빠르지 않은 최대 경사를 사용하여 프로세스 향상 로컬 대비(Clahe)를 선택합니다. (그림2C)</li>
		<li>프로세스 필터- 시그마(반지름)가 2.0인 가우시안 블러를 선택하여 이미지를 필터링합니다(그림2D).</li>
		<li>반경이 2.0인 플러그인-멕시코 모자 필터(Mhf)를 선택합니다(그림2E).</li>
		<li>임계값을 실행하고 황 또는 Isodata를 임계값 방법으로 사용하여 어두운 배경 및 오버/언더를 선택합니다. 자동 임계값을선택합니다. 참고: 이 단계를 수행하면 유착이 강조 표시되고 서로 구별됩니다.</li>
		<li>다음 매개변수를 선택한 파티클 분석(크기=20, 픽셀 무한대 및 원형=0.00-0.99)을 선택합니다. 윤곽선을 확인하여 초점 접착을 적절히 감지하고 분리합니다. 참고: 이러한 결과는 개별 초점 접착의 수, 면적 및 모양 설명을 생성합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

저자는 그들이 경쟁 적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

여기서 설명된 프로토콜은 세포 확산 동안 동적 세포골격 리모델링을 위한 다수의 앵커리지 의존성 세포 유형을 신속하게 스크리닝하는 다목적및 경제적인 방법입니다. 특히, 이 방법은 세포가 FN에 부착될 때 산화 스트레스 동안 응력 섬유 및 국소 접착 형성을 정량적으로 검사한다(도1A). 더욱이, 이들 세포 표현형은 세포 부착 및 확산15,16,22동안 역할을 문서화했기 때문에 작은 GTPases의 Rho 가족의 구성원에 대한 규제 역할을 제안할 수 있다. 그러나, 추가적인 생화학 기술은 GTP 결합, 활성 Rho 가족 단백질의 가능한 관여를 확인하기 위하여 요구될 것이다.
제시된 프로토콜은 F-액틴과 팍실린의 면역형광 검출을 활용하여 ATM 키나아제 억제에 의해 유...

세포 매트릭스 접착 (즉, 초점 접착)은 세포 접착 및 확산을 중재하는 크고 역동적 인 다분자 단백질 복합체입니다. 이러한 프로세스는 조직 개발에 대 한 중요 한, 유지 보수, 그리고 생리 기능. 국소 유착은 세포외 기질 (ECM)에 세포골격 액틴을 연결하는 스캐폴딩 단백질뿐만 아니라 인테그린과 같은 막 결합 수용체로 구성된다1. 이러한 복합체는 다양한 신호 전달 경로의 활성화를 통해 세포 외 환경에 존재하는 물리 화학 적 단서에 반응 할 수있다. 이와 같이, 초점 유착은 지시된 이동, 세포 주기 규칙, 분화 및생존을포함하는 다수의 세포 과정으로 세포 외 기계적 단서를 전파하는 신호 센터로서 역할을 한다1,2. 초점 유착을 조절하고 상호 작용하는 신호 분자의 한 그룹은 작은 GTPases의 Rho 가족의 구성원을 포함합니다. Rho GTPases는 그들의 특정 spatiotemporal 활성화3를 통해 세포 이동 및접착 역학을 통제하는 중요한 단백질입니다. 당연히, Rho 단백질 기능의 dysregulation는 전이, 혈관 신생 및 그 외와 같은 인간적인 병리의 수에서 연루되었습니다. 특히, 세포 산화 상태는 세포 이동 및 접착의 변조에 지배적 인 역할을한다. 반응성 산소 종(ROS)의 증가와 같은 레독스 항상성의 변화는 다수의 세포 유형 및 인간 질병에서 로단백질 활성뿐만 아니라 유착을 조절하는 것으로 입증되었다4,5,6 ,7,8. 예를 들어, DNA 손상 수리 세린/트레오닌 키나아제 A-T 돌연변이(ATM)의 돌연변이에 의해 야기되는 신경장애 운동실조-말실증(A-T)을 앓고 있는 개인은 전이성 암의 위험이 증가합니다9. 10. 이러한 환자와 세포주에서 ATM 키나아제 활성의 손실은 유전적 돌연변이 또는 화학적 억제를 통해, 펜토스 인산통로의 기능 장애로 인한 높은 수준의 산화 스트레스를 초래한다7,11, 12. 더욱이, 실험실에서 최근 연구는 시험관에서 Rho 가족 GTPases를 활성화의 직접적인 결과로 세포골격 역학 (즉, 접착 및 확산)을 변경하여 A-T에서 ROS에 대한 병리생리학적 역할을 강조했다5. 궁극적으로, 로가족 활성화에 의한 세포골격역학의 이러한 변화는 A-T 환자5,13에서언급한 전이성 암의 위험 증가로 이어질 수 있다. 따라서 산화 스트레스 동안 세포 매트릭스 상호 작용 간의 상호 작용을 이해하면 접착 및 확산 의 조절에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 이러한 연구는 또한 이러한 신호 프로세스에서 Rho 가족 GTPases에 대 한 가능한 역할에 대 한 추가 조사를 위한 무대를 설정할 수 있습니다.
본원에 기재된 프로토콜은 ATM 키나아제 활성의 억제에 의해 야기된 산화 스트레스 동안 유착 어셈블리 및 확산의 초기 세포 역학을 연구하는 프로토콜이다. 이러한 분석은 ECM 단백질 피브로넥틴(FN)에 대한 앵커리지 의존성 세포의 잘 특성화된 기전을 기반으로 한다. 현탁액에서 유지되는 세포가 FN 상에 도금되면, 몇몇 Rho GTPases는 액틴 시토스켈레탈 리모델링3,14의제어를 조정한다. 형태학적 변화는 세포가 원형과 원형의 원형에서 평평해지고 팽창하는 것으로 이동함에 따라 관찰됩니다. 이러한 관찰과 수반되는 것은 ECM과 수많은 매트릭스 유착의 개발이다. 이러한 변화는 세포가 15,16을부착하고 확산함에 따라 첫 번째 시간 동안 Rac1을 가진 RhoA의 양면 활성화에 기인합니다.
세포 확산뿐만 아니라 접착 형태및 역학을 검사하기 위해 다양한 방법이 활용되었습니다. 그러나, 이 방법은 정교한 장기, 살아있는 화상 진찰 총 내부 반사 형광 (TIRF) 또는 공초점 현미경 검사법에 의존합니다. 따라서 사용자는 특수 장비 및 소프트웨어에 액세스할 수 있어야 합니다. 또한, 이러한 바이오 이미징 시스템에 필요한 설정 시간은 특히 여러 억제제 또는 치료 조건을 동시에 테스트할 때 초기 접착 이벤트를 포착하는 데 어려움을 겪고 있습니다.
본 명세서에서 상세한 방법은, 접착 어셈블리및 시험관 내 확산을 제어하는 파라미터를 평가하는 간단하고 경제적이면서도 정량적인 방법을 제공한다. 프로토콜은 상피 현미경 및 CCD 카메라와 같은 일반적으로 이용 가능한 실험실 장비를 사용하여 수행됩니다. 이 분석법은 ATM 키나아제 활성의 화학적 억제에 의한 산화 스트레스의 기간 후에 FN 코팅 된 표면에 앵커리지 의존 세포를 적용하는 것을 포함하며, 이는 이전에 입증된5. 도금 후, 셀은 지정된 시간 동안 부착및 부착할 수 있습니다. 부착되지 않은 세포는 부착된 세포가 부착의 마커(예를 들어, paxillin) 및 확산(예를 들어, F-액틴)에 형광계 항체로 고정및 표지되는 동안2,5. 이 단백질은 그 때 epifluorescence 현미경을 사용하여 구상되고 기록됩니다. 후속 데이터 분석은 자유롭게 사용할 수있는 피지 소프트웨어를 사용하여 수행됩니다. 더욱이, 이 방법은 다양한 ECM 단백질, 다양한 산화제/세포 배양 조건 또는 다양한 앵커리지 의존성 세포주를 포함하는 광범위한 조건 하에서 접착 역학을 검사하는 데 적용될 수 있다. 생물학적 질문.

<table><tbody><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA (1x)</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>25300-054</td><td>세포 해리</td></tr><tr><td>10cm2 접시</td><td>Cell Treat</td><td>229620</td><td>멸균, 조직 배양 처리</td></tr><tr><td>15mL 원뿔형 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-5</td><td>멸균</td></tr><tr><td>1X 인산염 완충 식염수</td><td>Corning Cellgro</td><td>21-031-CV</td><td>PBS, 멸균, Mg2+ 및 Ca2+ 없음</td></tr><tr><td>24웰 세포 배양 처리된 플레이트</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-740</td><td>멸균, 조직 배양 처리</td></tr><tr><td>4°C; C 냉장고</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse IgG anti-paxillin primary antibody (clone 165)</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>610620</td><td>marker of focal adhesions</td></tr><tr><td>Aspirator Argos</td><td></td><td>EV310</td><td></td></tr><tr><td>Biosafety cabinet</td><td>Nuair</td><td>NU-477-400</td><td>Class II, Type A, series 5</td></tr><tr><td>Delipidated Bovine Serum Albumin (Fatty Acid Free) Powder</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9704-100</td><td>dlBSA</td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231-100</td><td>유기 용매 용해 Ku55933</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Media, High Glucose</td><td>Fisher Scientific</td><td>11965092</td><td>REF52 염기 세포 배양 배지</td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Fisher Scientific</td><td>16000044</td><td>인증, 세포 배양 배지</td></tr><tr><td>보충제 피지</td><td>미국 국립보건원(National Institutes of Health)</td><td>http://fiji.sc/</td> <td>이미지 분석 프로그램</td></tr><tr><td>, 필터 주사기</td>, <td>Fisher Scientific</td><td>, 6900-2502</td>, <td>0.2 &마이크로; M, 멸균</td></tr><tr><td>유리 커버 슬립 (12-Cir-1.5)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>12-545-81</td><td>염소</td></tr><tr><td>안티 마우스 IgG 2 차 항체 Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td>형광 2 차 항체, Life Technologies의 감광성</td></tr><tr><td>염소 혈청</td><td>Gibco</td><td>16210-064</td><td>면역 형광 혈구 분석기 용 차단 용액 구성 요소</td></tr><tr><td></td> 세포 <td>계수를 위한</td> <td>Fisher Scientific</td><td>22-600-107</td></tr><tr><td></td><td>Life Technologies</td><td>33016-015</td><td>FN</td></tr><tr><td>IX73 형광 도립 현미경</td> 형<td>광, 세포 형태, 계수 및 해리를 시각화하기 위한</td><td>Olympus</td><td></td> 현미경</tr><tr><td>Ku55933</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML1109-25MG</td><td>ATM 키나아제 억제제, 반응성 산소 유도제 종</td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>Fisher Scientific</td><td>25-030-081</td><td>세포 배양 배지 보충제</td></tr><tr><td>흑백 CMOS 16비트 카메라</td><td>Optimos</td><td></td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148-500G</td><td>PFA, 면역형광</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td> 고정제 <td>Fisher Scientific</td><td>15-140-122</td><td>P/S, 배양 배지용 항생제 용액</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 phalloidin(F-actin 프로브)</td><td>Invitrogen</td><td>A12381</td><td>F-actin 마커, DAPI가 포함된 광에 민감한</td></tr><tr><td>ProLong Gold 퇴색 방지 시약</td> 핵 <td>염료 DAPI를</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> 포함한 Invitrogen P36941 커버 슬립 마운팅 미디어, <td>Graham, D.M. et. al. Journal of Cell Biology 2018</td></tr>, <tr><td>열 제어 기능이 있는 교반 플레이트</td>, <td>Corning Incorporated</td><td>PC-420D</td><td></td></tr><tr><td>주사기</td><td>BD Biosciences</td><td>309653</td><td>60 mL 주사기</td></tr><tr><td>조직 배양 인큐베이터</td><td>Nuair</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td> 세포<td>막 투과에 사용되는</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td> 세제</tr><tr><td>Trypan Blue Solution</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-250-061</td><td>세포 계수용</td></tr><tr><td>Trypsin 중화 용액 (1x)</td> Life Technologies <td>R-002-100</td> TNS<td>의 Gibco</td><td>, 소 태아 혈청관 회전기 대신 트립신 중화</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>11-676-341</td><td></td></tr><tr><td>수조</td><td>Fisher Scientific</td><td>FSGPD02</td><td></td></tr></tbody></table>

세포 부착의 역학 을 검사 하 고 산화 스트레스 동안 fibronectin에 상피 세포의 확산

Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress

세포 외 매트릭스 (ECM)에 세포의 접착 그리고 퍼짐은 유기체 발달 도중 및 성인 조직의 항상성에 대한 필수적인 세포 과정입니다. 흥미롭게도, 산화 스트레스는 이러한 과정을 변경할 수 있습니다., 따라서 전이성 암 같은 질병의 병 리 생리학에 기여. 따라서, 세포가 산화되는 동안 ECM에 부착되고 퍼지는 방법의 메커니즘을 이해하면 정상 및 질병 상태에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 아래에 기재된 단계별 프로토콜은 면역형광계 분석기를 사용하여 시험관내 섬유넥틴(FN)에 불멸의 섬유아세포 세포의 세포 부착 및 확산을 구체적으로 정량화하는 것이다. 간략하게, 앵커리지 의존성 세포는 산성 스트레스를 유도하기 위해 ATM 키나제 억제제 Ku55933에 노출되고 현탁액에 보유된다. 세포는 FN 코팅 된 표면에 도금되고 소정의 기간 동안 부착 할 수 있습니다. 부착된 상태로 남아 있는 세포는 부착(예를 들어, paxillin) 및 확산(예를 들어, F-액틴)의 형광 계 항체 마커로 고정및 표지된다. 데이터 수집 및 분석은 epifluorescence 현미경 및 자유롭게 사용할 수 있는 피지 소프트웨어를 포함하여 일반적으로 이용 가능한 실험실 장비를 사용하여 수행됩니다. 이 절차는 매우 다재다능하고 다양한 세포주, ECM 단백질, 또는 억제제에 대해 광범위한 생물학적 질문을 검사하기 위해 변형될 수 있다.

실험 설정의 일반적인 스키마
도 1은 REF52 세포의 혈청 결치로 시작하여 후천형광이미지의 전산분석으로 끝나는 세포 부착 및 확산 프로토콜에 대한 일반적인 스키마를 나타낸다. 프로토콜의 주요 단계는 타임라인에 나와 있습니다. 참고로, 프로토콜의 2단계는 FN 코팅 커버슬립의 제조를 기술하며, 이는 3단계와 동시에 수행되어야 한다: 혈청 을 분주하게 하는 REF52 세포는 현탁액에 배치하기 전에(도 1A). 형광 현미경 검사법에 대한 샘플의 고정 전에 치료 군 및 세포 접착 기간을 나타내는 모의 표지 24 웰 플레이트의 예(도 1B).
국소 접착 정량화를 위한 면역형광 이미지 처리
REF52 세포는 90분 동안 현탁액으로 유지되었...

이 방법은 세포 부착의 초기 역학을 정량화하고 앵커리지 의존적 세포를 섬유넥틴상으로 확산시키는 데 유용하다. 더욱이, 이 분석은 세포 확산 및/또는 세포 부착 관련 세포 내 신호 경로에 변경된 산화배 항상성의 효력을 조사하기 위하여 이용될 수 있습니다.

세포 부착의 역학 을 검사 하 고 산화 스트레스 동안 Fibronectin에 상피 세포의 확산

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the ...

이 방법은 연구원이 산화 스트레스 도중 세포 외 매트릭스 단백질 섬유네신에 세포 접착 및 앵커리지 의존성 세포의 초기 역학을 정량화할 수 있게 합니다. 이 기술은 다재다능하며 광범위한 조건에서 사이토스켈레탈 역학을 검사하도록 조정할 수 있습니다. 또한 공통 실험실 장비와 자유롭게 사용할 수 있는 소프트웨어를 사용하여 데이터 수집 및 분석을 수행합니다.세포가 백변성 상태의 변경 중에 ECM에 부착하고 퍼지는 방법에 대한 메커니즘을 이해하면 전이성 암과 같은 정상 및 질병 상태에 대한 귀중한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 이 방법은 상이한 세포 배양 조건, 앵커리지 의존세포주 및/산화제 하에서 세포 확산 및 접착력을 검사하여 광범위한 생물학적 질문에 답하는 데 사용할 수 있다. 이 기술을 수행하는 데 필요한 수많은 시약이 있습니다.따라서 모든 솔루션이 시작하기 전에 사전에 만들어지는 것이 필수적입니다. BSL-II 인증 라미나르 플로우 후드에서 조직 배양 인증 24웰 플레이트를 설정. 유리 커버슬립 1개를 각 웰에 넣습니다.텍스트 프로토콜의 그림 1B에 따라 플레이트에 레이블을 지정합니다. 다음으로, 각 우물에 섬유네틴 용액의 파이펫 500 마이크로리터. 각 커버 위에 용액을 피펫하면 균일한 코팅과 완전한 침수를 보장하기 위해 몇 번 미끄러짐.뚜껑으로 접시를 덮습니다. 1시간 동안 이산화탄소 5%를 37도에서 배양합니다. 그런 다음 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 우물에서 섬유네틴 용액을 흡인시합니다.세척당 1X PBS 500 마이크로리터를 사용하여 우물을 세 번 씻으시면 됩니다. 1X PBS의 최종 세척을 흡수하고, 최소 15분 동안 5%의 이산화탄소를 37도에서 0.5%의 BSA 용액500마이크로리터로 차단합니다. 먼저, 섭씨 37도에서 수조에 필요한 솔루션을 미리 데워보겠습니다.BSL-II 인증 라미나르 플로우 후드에서 REF52 세포의 컨물루블 한 단층으로 시작하여 10 평방 센티미터 의 접시에 담아 따뜻한 1X PBS6 밀리리터로 셀을 두 번 씻으시다. 세럼은 따뜻한 디리피들 BSA 용액의 6 밀리리터에서 적어도 한 시간 동안 세포를 굶어 버티고 있습니다. 다음으로, 따뜻하게 1X PBS의 6 밀리리터로 세포를 씻는다.PBS를 흡인하고 따뜻한 0.5 % 트립신 -EDTA 솔루션의 1.5 밀리리터를 추가합니다. 약 2 분 동안 5 %의 이산화탄소와 섭씨 37도에서 세포를 배양. 분리가 완료되었는지 확인하

examining-dynamics-cellular-adhesion-spreading-epithelial-cells-on

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

이 동영상은 기질 강성에 따른 변형을 이해하기 위해 원발성 인간 대장암 세포의 세포골격 및 국소 접착을 연구하는 기술을 설명합니다. 연질 및 경질 기질에서 암세포를 배양하면 암 예후를 위한 다양한 다운스트림 생물물리학적 측정이 가능합니다.

Cytoskeleton and Focal Adhesion Organization Assay: 기질의 세포 접착 및 확산을 연구하기 위한 면역형광 기반 방법

이 비디오는 배양된 오가노이드에서 산화 스트레스를 시각화하는 기술에 대해 설명합니다. 이 연구는 서로 다른 ROS 조절제로 처리한 후 오가노이드에 존재하는 다양한 세포 유형에서 ROS 축적으로 인한 산화 스트레스 수준을 이해하는 데 도움이 됩니다.

형광 프로브 이미징 분석: 반응성 산소종 유도 처리로 처리된 배양된 장 오가노이드 세포의 산화 스트레스를 시각화하는 기술

출처: Alluri, H., et al. 혈액-뇌 장벽 기능 장애 연구를 위한 체외 허혈-재관류 손상 모델로서의 산소-포도당 결핍 및 재산소화. J. Vis. Exp. (2015). 이 비디오는 쥐의 뇌 미세혈관 내피 세포(RBMEC)에서 밀접 접합 단백질과 스트레스 섬유의 형광 국소화를 보여줍니다. 스트레스 단층에서는 형광 표지된 항체를 사용하여 밀착 접합 단백질을 표지하고, 형광단 표지된 팔로이딘은 응력 섬유를 표지합니다. 그런 다음 표지된 분자는 컨포칼 현미경을 통해 시각화됩니다.

내피 세포에서 밀접한 접합 단백질과 스트레스 섬유의 형광 국소화(Fluorescence Localization of tight junction proteins and stress fibers in endothelial cells)

여기서, 우리는 지속적으로 셀 기판 임피던스와 생균 영상 분석에 의해 비 침습성 방식으로 높은 시간 해상도를 가진 세포 부착 및 디 - 접착 공정을 정량화하는 프로토콜을 제시한다. 이러한 접근은 매트릭스 수정 및 접착 의존성 시그널링 이벤트들이 시간적인 관계에 의해 트리거 세포 접착 / 디 접착 공정의 역학을 보여준다.

매트릭스 수정에 의해 유도 된 세포 접착 및 탈 부착의 실시간 변화를 측정 셀 기판 임피던스와 라이브 세포 이미징을 사용하여

살아있는 세포의 기계적 변형률에 대한 실시간 반응을 측정할 수 있도록 맞춤형 모터 구동 기계식 액추에이터를 사용하여 새로운 이미징 프로토콜이 개발되었습니다. 기계생물학과 관련된 이 시스템은 컨포칼 또는 원자력 현미경으로 거의 실시간 이미징을 허용하면서 최대 20%까지 균주를 적용할 수 있습니다.

기계 스트레치 동안 라이브 세포 이미징

이 플로우 접착 분석은 T 세포 상피 세포 상호 작용의 간단한 고 충격 모델을 제공한다. 주사기 펌프는 전단 응력을 생성하기 위해 사용하고, 공 초점 현미경 정량 이미지를 캡처한다. 이 연구의 목적은 효과적으로 유동 조건을 이용하여 T 세포 유착을 정량화하는 것이다.

T 림프구 - 접착 분자 상호 작용의 연구에 대한 접착에서 전단 응력의 분석

이들은 기계적 장력 송신 조직 항상성 및 개발에 관여하는 신호 전달 경로를 시작으로 세포 표면 유착은 mechanotransduction 중앙이다. 여기서는 리간드 피복 된 자성 마이크로 비드 접착 수용체 포스 응용 프로그램을 사용하여, 인장에 응답하여 활성화되는 생화학 적 경로를 해부위한 프로토콜을 제시한다.

자석 구슬을 사용하여 기계 인장에 대한 응답으로 세포 표면 접착 리모델링 분석

이 원고 xenobiotic 유발 산화 스트레스의 시험에 대 한 유전자 인코딩된 fluorogenic 기자 라이브 셀 이미징 응용 프로그램에서 사용을 설명합니다. 이 실험 방법은 많은 독성 산화 스트레스의 검색에 사용 되는 기존 방법의 단점을 피하는 동안 탁월한 spatiotemporal 해상도, 감도 및 특이성을 제공 합니다.

유전자로 인코딩된 Fluorogenic 센서를 사용 하 여 독성 산화 스트레스의 평가에 접근을 이미징

여기, 선물이 포스터 공명의 동시 사용에 대 한 프로토콜 에너지 전송 기반 긴장 센서 측정 단백질 역학 힘 민감한 측정을 사용 하는 photobleaching 후 단백질 부하 및 형광 복구를 측정 하 살아있는 세포 내 단백질 역학입니다.

살아있는 세포 형광 기술의 조합을 사용 하 여 힘에 민감한 단백질 역학의 측정

이 프로토콜은 확산 세포의 가장자리에서 돌출부의 동적 매개 변수 (돌출부, 수축, 주름)를 측정하는 것을 목표로합니다.

라이브 셀 현미경을 사용하여 확산 중 셀 에지 돌출 역학 측정

여기서는 내피세포를 동기화된 진동성 고혈당과 맥동성 전단 스트레스에 노출시키는 마이크로유체 시스템을 제작하고 작동시키는 프로토콜을 제시합니다. 이 접근법은 당뇨병 내피 기능 장애 연구를 위한 생리학적으로 적합한 시험관 내 모델을 제공합니다. 이 프로토콜은 산화 스트레스와 내피 세포 반응의 정량적 측정을 가능하게 합니다.

생리적 맥박성 전단 응력과 진동성 고혈당 하에서 내피 기능 장애를 모델링하는 마이크로플루이딕 시스템

학습하세요 산화 스트레스 조건에서 fibronectin에 상피 세포의 부착 및 확산 역학을 정량화하는 방법을. 이 기법은 세포골격 역학 연구에 활용 가능하며 암 전이 메커니즘 이해에 기여합니다.

세포 부착의 역학 을 검사 하 고 산화 스트레스 동안 Fibronectin에 상피 세포의 확산

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