Name: 디테르페노이드 천연제품의 효소 생산 및 정화를 위한 맞춤형 접근법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-04T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: 배우세요 디테르페노이드 생합성 효소를 이용한 대사체 생산 및 정화 방법을 Escherichia coli와 Nicotiana benthamiana에서 수행하는 과정입니다. 이 기술은 구조 분석 및 생물활성 연구에 활용됩니다.

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우리는 PIRS 및 pGGxZmAN2 구성을 제공한 루벤 피터스 박사(미국 아이오와 주립 대학)에게 감사드립니다. NSF 식물-생물적 상호 작용 프로그램(보조금# 1758976 to P.Z.), DOE 조기 경력 연구 프로그램(보조금# DE-SC0019178 to P.Z.), DOE 공동 게놈 연구소 커뮤니티 과학 프로그램(보조금# CSP2568 to P.Z.), NSF에 의한 이 작업에 대한 재정적 지원 대학원 연구 펠로우십 프로그램(K.M.M.)과 UC 데이비스 딘의 멘토링 어워드 펠로우십(K.M.M.)은 감사하게도 인정받고 있습니다.

저자는 그들이 경쟁 적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

디테르페노이드 천연 제품의 광범위한 조사 및 적용은 원하는 화합물의 충분한 양을 합성하고 정화하기 위해 간단하고 저렴한 프로토콜을 필요로합니다. 광범위한 종에서 사용 가능한 디테르페노이드 대사 효소의 수가 급격히 증가함에 따라 미생물 및 식물 기반 숙주 시스템을 사용하여 디테르페노이드의 효소 생산을 위한 광범위한 재고를 제공합니다. 또한, 많은 디테르페노이드 경로의 모듈식 아키텍처는 '플러그 앤 플레이' 조합 엔지니어링 접근법에서 동일하거나 다른 종의 효소를 사용하여 자연적이고 새로운 자연과 같은 디테르페노이드 천연의 배열을 생성할 수 있게 합니다. 제품2,14,26,35.
대장균은 견고성, 확장성 용이성, 부산물 오염 감소를 위한 제한된 화학적 복잡성, DNA 조립 및 발현을 위한 사용 가능한 다양한 도구로 인해 천연물 생합성에 선호되는 미생물 숙주입니다. 최적화. 우리의 경험에서, 여기에 설명 된 플랫폼은 여기에 제안 된 것을 포함하여 많은 다운 스트림 응용 프로그램에 적합한 디테르펜 올레핀과 알코올의 수백 mg의 제품 수율을 생산하는 데 적합합니다. 산업 규모를 충족하지 는 않지만, 여기에 설명된 생산 플랫폼은 taxadiene 및 sclareol 33과 같은 관련 디테르페노이드에 대해 성공적으로 입증된 바와 같이 추가 경로, 호스트 및 발효 최적화를 위한 토대가 될 수 있습니다. ,34. 속도 제한 MVA 또는 MEP 통로 유전자의 과발현은 불충분한 전구체 공급 및 전구체 플럭스와 같은 디테르페노이드 생합성을 위한 수율 제한 인자를 경쟁 경로로 의한 수율 제한 인자를 극복하기 위해 성공적으로 확립되었다13, 32,33,39. 여러 연구에서 성공으로 입증되었지만, 테르페노이드 대사 진핵 P450s 및 대장균의 다른 막 결합 효소의 발현 및 촉매 활성이 좋지 않은 것은33,39의 제한 인자일 가능성이 높다. ,48,49,50,51,52. 코돈 에 최적화 된 서열 및 단백질 변형의 사용, 예를 들어 소포체 신호 펩티드의 제거 또는 석고 신호 펩티드의 도입과 같은, 수용성 P450 발현 을 증가하는 데 유용 입증14,38 ,49,50,53. 이러한 변형은 또한 본 연구에서 예로 사용되는 옥수수 CYP71Z1839의 미생물 공동 발현을 위해 사용되었다. 기재된 프로토콜은 구성당 하나 또는 두 개의 유전자를 운반하는 플라스미드의 사용에 기초하며, 모두 동일한 유도성 프로모터 하에 있다. 대규모 유전자 조합이 필요한 경우, 다중 플라스미드 및 항생제(13)의 사용으로 인한 변형 효율 및 배양 성장 감소를 완화하기 위해 다양한 다중 유전자 카세트 또는 유전자 스태킹 시스템을 사용하는 것이좋습니다. .
유전학 및 유전체학 자원의 광범위한 가용성으로 식물 숙주 시스템은 천연 물 제조에 점점 더 적합해지고 있습니다. 장점은 광합성에 의해 구동되는 필요한 천연 전구체를 생산하는 식물의 능력을 포함, 따라서 전구체 분자를 보충 할 필요없이 제품 형성을 가능하게54,55. N. 벤타미아니는 이미 생체 내 기능성 특성화 및 테르페노이드 및 기타 천연 제품 경로14,35,36,40의 조합발현에 널리 사용되고 있다. . N. benthamiana를 숙주 시스템으로 사용하는 주목할만한 장점은 디테르페노이드 전구체의 내인성 생산, 기본 유전자 서열의 사용, 진핵 P450s의 단순화 된 발현, 결합 유전자 변형의 용이성 ( 별도의 항생제는 일시적인 공동 변환을 위해 필요하지 않으며 잎 재료에서 대상 제품을 간단하게 추출할 수 있습니다. 필요한 경우, 디테르페노이드 생산은 전구체 공급을 증가시키기 위해 주요 MEP 경로 유전자의 공동 발현을 통해 향상될 수 있다36,41. N. benthamiana에서 확장 가능한 디테르페노이드 생산을 위한 제약은 충분한 식물 바이오매스를 생성해야 하기 때문에 액체 미생물 배양에 비해 더 복잡하며, 화학적으로 복잡한 제품 정제를 보다 많이 생산해야 합니다. 식물 조직, 및 내인성 효소에 의한 산화, 글리코실화 또는 탈인산 등을 통해 표적 제품의 바람직하지 않은 대사가 가능,36,43,44,45 ,46,47. 그러나, 이 절차는 아그로인여과(56)에 사용되는 식물의 수를 증가시킴으로써mg 제품 수량까지 확대될 수 있다.
여기에 설명된 제품 추출 및 정제 프로토콜은 대장균 및 N. 벤타미아나뿐만아니라 S. cerevisiae 및 기타 식물 또는 미생물 숙주 시스템과 호환되며, 비용 효율적인 접근 방식을 제공합니다. 생물학 및 화학 실험실모두에 설치되며 고가의 정화 장비가 필요하지 않습니다. 분리 깔때기를 이용한 대사산물 추출은 크로마토그래피 정제 전에 효율적인 추출 및 상 분리에 적합합니다. 깔때기 크기를 쉽게 조정하여 더 큰 배양량을 허용하고 대규모 배양물에서 추출하는 데 필요한 실험 시간을 줄일 수 있습니다. 우리는 헥산/에틸 아세테이트 그라데이션의 사용이 탄화수소 및 산소 화합물을 모두 포함하는 돌라브랄렉신 군을 위해 여기에서 입증된 바와 같이 상이한 극성의 디테르페노이드를 추출하는 데 이상적이라는 것을 발견하였다(그림3). 표적 제품의 특성에 따라, 다른 용매 혼합물이 유리할 수 있다. 그러나, 용매는 분리 깔때기 기술을 사용하여 성공적인 추출 및 상 분리를 보장하기 위해 물과 함께 오타해서는 안됩니다. 또한, 증발을 통한 제품 손실은 낮은 분자량 모노 및 세스키 테르페노이드 및 기타 VOC와 같은 휘발성 유기 화합물(VOC)을 생산하기 위해 이 접근법을 사용할 때 고려해야 합니다. 더 큰 규모 (~2 L) 실리카 컬럼을 사용하여 산소화의 다른 수준의 디테르페노이드의 크로마토그래피 분리는 향상된 제품 분리를 제공하고 반복적 정제의 필요성을 최소화하기 때문에 우리의 경험에 유리했습니다. 작은 열 볼륨을 사용할 때 단계를 수행합니다. 원하는 배양 량과 천연 물의 종류에 따라 열 부피와 행렬을 필요에 따라 조정할 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용하여 달성될 수 있는 표적 제품의 순도는 생체 활성 분석과 같은 많은 다운스트림 응용 분야 또는 효소 활성 분석에 사용하기에 적합합니다. 그러나 NMR을 통한 구조 분석과 같이 더 높은 순도 수준이 필요한 경우(semi)-예비 HPLC를 사용하여 추가 정제를 통해 제품 순도를 효율적으로 향상시킬 수 있습니다.
여기서 설명된 이 프로토콜은 디테르페노이드 천연 제품의 생산에 최적화되어 있지만, 원하는 효소를 생성하여 관련 모노, 세스키 및 트라이 테르펜노이드뿐만 아니라 다른 천연 물류 등급에 쉽게 맞춤화 할 수 있습니다. 조합식14,57. 그러나, 제품 추출 및 정제절차의 수정은 모노-세스키-테르페노이드와 같이 휘발성이 높은 화합물, 또는 예시된 바와 같이 더 높은 극성 및 기능적 변형을 고려해야 한다. 많은 트리테르페노이드, 페닐프로판노이드 및 기타 천연 제품 등급의 당화.
천연물 제조를 위한 산업용 규모의 플랫폼을 사용할 수 있지만 여기에 설명된 프로토콜은 대부분의 실험실에서 쉽게 설정할 수 있는 저렴하고 사용자 정의 가능한 도구를 제공합니다. 옥수수 dolabralexins의 생산에 의해 입증 된 바와 같이 여기 및 다른 곳에서39,이 방법을 사용하여 달성 될 수있는 제품 수량과 순도는 일반적으로 다양한 다운 스트림 분석 및 사용을 용이하게하기에 충분하다, 포함,하지만, 제한, 다양 한 생물 활동 연구, 유기 체 간의 상호 작용의 분석, 효소 기질 또는 반 합성 접근을 위한 시작 재료로 사용 하기 위해.

디테르페노이드는 많은 유기체에서 중요한 역할을 하는 12,000개 이상의 다환 20탄소 천연물의 화학적으로 다양한 군을 포함한다1. 곰팡이와 식물은 디테르페노이드의 가장 큰 다양성을 생산하지만, 박테리아는 또한 생리 활성 디테르 페노이드를 형성하는 것으로 나타났다 (리뷰참조2,3,4,5). 그들의 광대 한 구조적 다양성에 뿌리를 두고, 디테르 페 노이드는 생물학적 기능의 무리를 제공합니다. 몇 가지 디테르 페 노이드, gibberellin 성장 호르몬 등, 개발 과정에서 필수적인 기능을 가지고5. 그러나, 디테르페노이드의 대다수는 화학 방어 및 유기간 상호 작용의 중재자 역할을 합니다. 이 중,옥수수(Zea mays)및쌀(Oryza sativa)과같은 주요 식품 작물에서 항균 디터페노이드의 해충 및 병원균 방어 및 종별 블렌드에서 디테르펜 수지산이 가장 광범위하게 발생되어 왔다. 공부 6,7. 이러한 생체 활동은 상업적 응용을 위한 풍부한 화학 저장소를 제공하며, 일부 디테르페노이드는 일상 생활의 중요한 의약품, 식품 첨가물, 접착제 및 기타 바이오 제품으로 사용되며8,9 ,10. 디테르페노이드의 자연적 다양성과 생물학적 기능에 대한 연구를 진전시키고 궁극적으로 광범위한 상업적 응용을 촉진하기 위해서는 순수 화합물의 비용 효율적인 준비를 위한 도구가 필요합니다. 펄프 및 제지 산업의 부산물로 생산되는 디테르펜 수지산과 같은 몇 가지 디테르페노이드 바이오 제품에 대해 식물 재료로부터의 대규모 절연이 확립되었다8. 그러나, 특정 조직에만 디테르페노이드의 축적과 환경 자극에 의한 엄격한 규제 하에서 종종 천연 생산자로부터 충분한 생성물의 분리를제한한다 2. 또한, 디터 페노이드의 구조적 복잡성은 화학 합성을 통해 생산을 방해하지만 이러한 접근법은 여러 경우11,12에서성공적이었다. 고급 게놈 및 생화학 기술의 가용성으로, 효소 생산 플랫폼은 디테르페노이드 화합물의 범위를 생산하기위한 증가 관심을 얻고있다 (리뷰13,14, 15,16,17,18).
디테르페노이드를 포함한 모든 테르페노이드는 2개의 이소민 이소프레노이드 전구체, 이소펜테닐 이산염(IPP) 및 디메틸리알 이인산염(DMAPP)19에서 유래되어, 차례로 메발로네이트(MVA) 또는 메틸레리트리톨-5-인산염(MEP) 통로. 테르페노이드 생합성은 박테리아의 MEP 경로와 곰팡이의 MVA 경로를 통해 진행되는 반면, 식물은 세포질 MVA 및 석고 MEP 경로를 가지고 있으며, 후자는 디테르페노이드 형성을 향한 1 차적인 경로인20. Prenyl 트랜스퍼라제에 의한 IPP 및 DMAPP의 응축은 모든 디테르페노이드, 제라닐게라닐 디포스페이트(GGPP)20에중앙 20-탄소 전구체를 산출한다. GGPP 형성의 하류, 2개의 효소 군, 테르펜 신타제(TPSs) 및 시토크롬 P450 단산소나제(P450s)는 주로 테르페노이드 대사의 광대한 화학적 다양성의 형성을 제어한다21,22. 디터펜 신타제(diTPSs)는 GGPP의 커밋된 카보케이션 구동 순환화 및 재배열을 촉매하여 다양한 입체별 이중, 폴리- 또는 매크로-주기적 디터펜 스캐폴드1,3,23, 24. 이들 스캐폴드의 산소화 및 추가기능적 장식은 P450 효소에 의해 촉진되고 다른 효소패밀리(22,25)를선택한다. TPS와 P450s는 일반적으로 모듈형 생합성 네트워크를 형성할 수 있는 종특이적 다중 유전자 군으로 존재하며, 공통청사진을 따라 다양한 효소 모듈을 결합하면 광범위한 화합물2, 26. 최근 몇 년 동안 모듈 형 테르 페노이드 경로에서 작동하는 기능적으로 구별되는 효소의 급속한 발견은 부분적 또는 완전한 경로의 대사 공학을위한 다목적 부품 목록으로 사용하기위한 기회를 확대제공했습니다. 미생물 및 식물 기반 생산 플랫폼 모두. 예를 들어,효모(Saccharomyces cerevisiae)는항말라리아제 인 아르테미신(27), 세스키트르페노이드 바이오연료와 같은테르페노이드 바이오제품의 제조를 위한 다효소 경로를 설계하는 데 성공적으로 적용되었다. 비사볼렌과 파르네센28,또한 디테르페노이드29,30,31을선택한다. 마찬가지로, 산업 규모의 제조를 위한 엔지니어링된 대장균 플랫폼은 항암 약물로 사용되는 탁솔 전구체 taxadiene및 디테르펜 알콜, sclareol을 포함하여 몇몇 디테르페노이드 대사산물을 위해 설치되었습니다. , 향수 산업13,32,33,34에사용됩니다. 유전 공학 및 변환 기술의 발전은 또한 식물 천연 제품9,14,35,36을생산하기위한 식물 호스트 시스템을 점점 더 실용적으로 만들었습니다. 특히, 가까운 담배 상대인 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana)는여러 유전자 조합의 아그로박테리움-매개형질전환의 용이성으로 인해 테르페노이드 경로 분석 및 엔지니어링을 위해 널리 사용되고 있다. , 내인성 전구체의 효율적인 생합성, 높은 바이오 매스14,35,36.
테르페노이드 생합성을 위한 이러한 확립된 플랫폼에 그림을 그리면서, 디테르페노이드의 효소 생산과 단일 화합물의 정제를 위한 사용하기 쉽고 비용 효율적인 방법을 설명합니다. 제시된 프로토콜은 향상된 디테르페노이드 전구체 생합성을 위해 설계된 대장균 및 N. 벤타미아나 플랫폼이 어떻게 다른 diTPS 및 P450 효소의 조합 발현을 위해 사용될 수 있는지를 보여줍니다. 원하는 디테르페노이드 화합물. 구조적으로 다른 디테르페노이드를 생산하고 정화하는 이 프로토콜의 적용은 옥수수(Zea mays),돌라브랄렉신(dolabralexins)에서 전문화된 디테르페노이드의 예에 의해 도시되며, 그 중 2개의 diTPS와 1개의 P450을 모집하는 내인성 생합성 효소. 올레핀에서 산소화 된 유도체에 이르기까지 다양한 돌라브 랄렉신의 정제는 대규모 실리카 컬럼 크로마토그래피 및 준비적 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC)와 분리 깔때기 추출을 결합하여 달성됩니다. 설명된 프로토콜은 디테르페노이드 생산에 최적화되어 있지만 관련 테르페노이드 클래스뿐만 아니라 효소 자원을 사용할 수있는 다른 천연 제품에 쉽게 적응 할 수 있습니다. 이 접근법을 사용하여 생산된 화합물은 핵 자기 공명(NMR) 분석을 통한 구조적 특성화, 효소 기능 연구를 위한 기판으로 사용, 및 다양한 다운스트림 애플리케이션에 적합하며, 이에 국한되지 않습니다. 생체 활동 검시.

<table><tbody><tr><td>1020 트레이</td><td>온실 메가 스토어</td><td>CN-FLHD</td><td></td></tr><tr><td>2- (N- 모르 폴리노) 에탄 술폰산</td><td>시그마</td><td>M8250-500g</td><td>MES</td></tr><tr><td>4 "테크 스퀘어 포트</td><td>맥콩키 도매 재배자 공급</td><td>JMCTS4</td><td></td></tr><tr><td>5977 추출기 XL MS</td><td></td> Agilent-7890B <td></td><td></td></tr><tr><td>GC</td><td></td> Agilent-Acetonitrile <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>시그마</td><td>271004</td><td></td></tr><tr><td>한천</td><td>피셔</td><td>BP1423-2</td><td></td></tr><tr><td>박테리아 효모 추출물</td><td>피셔</td><td>BP9727-2</td><td></td></tr><tr><td>비커</td><td>CTechGlass</td><td>BK-2001-015B</td><td></td></tr><tr><td>캡, 9mm 파란색 나사, PFTE</td><td>애질런트</td><td>5185-5820</td><td>GC 바이알 캡</td></tr><tr><td>Carbenicillin</td><td>Genesee</td><td>25-532</td><td>Carb</td></tr><tr><td>클로람페니콜</td><td>피셔</td><td>50247423</td><td>클로르</td></tr><tr><td>크로마토그래피 컬럼</td><td>CTechGlass</td><td>CL-0015-022</td><td></td></tr><tr><td>투명 습도 돔</td><td>온실 메가스토어</td><td>CN-DOME</td><td></td></tr><tr><td>ColiRollers 도금 비즈</td><td>시그마</td><td>71013</td><td>유리 구슬</td></tr><tr><td>CoorsTek 도자기 모르타르</td><td>피셔</td><td>12-961A</td><td>모르타르</td></tr><tr><td>CoorsTek 도자기 유봉</td><td>피셔</td><td>12-961-5A</td><td>유봉</td></tr><tr><td>델타-아미노레불린산 염산염</td><td>시그마</td><td>50981039</td><td>아미놀레볼린산</td></tr><tr><td>에탄올</td><td>피셔</td><td>A962-4</td><td>EtOH</td></tr><tr><td>에틸 아세테이트</td><td>피셔</td><td>E1454</td><td></td></tr><tr><td>팔콘 50mL 원추형 원심분리기 튜브</td><td>Fisher</td><td>14-432-22</td><td>팔콘 튜브</td></tr><tr><td>Fisherbrand 일회용 큐벳</td><td>Fisher</td><td>14-955-127</td><td>큐벳</td></tr><tr><td>Fisherbrand 페트리 접시(투명 뚜껑 포함)</td><td>Fisher</td><td>FB0875713</td><td>페트리 접시</td></tr><tr><td>Fisherbrand 폴리프로필렌 마이크로튜브 보관 랙</td><td>Fisher</td><td>05-541</td><td>마이크로튜브 랙</td></tr><tr><td>포도당</td><td>시그마</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>Fisher</td><td>G33-500</td><td></td></tr><tr><td>헥산</td><td>피셔</td><td>H292-4 (CS)</td><td></td></tr><tr><td>HP-5MS</td><td>Agilent</td><td>19091S-433</td><td>GC 컬럼</td></tr><tr><td>입구 어댑터</td><td>CTechGlass</td><td>AD-0006-003</td><td>유리 입구 어댑터</td></tr><tr><td>이소프로필 &beta;-D-1-thiogalactopyranoside</td><td>Fisher</td><td>BP1755-100</td><td>IPTG</td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Fisher</td><td>BP9065</td><td>Kan</td></tr><tr><td>KIM-KAP 캡, 일회용, 폴리프로필렌, Kimble Chase</td><td>VWR</td><td>60825-798</td><td>통기성 시험관 뚜껑</td></tr><tr><td>염화마그네슘</td><td>아크로스</td><td>223210010</td><td>MgCl2</td></tr><tr><td>황산마그네슘</td><td>시그마</td><td>M7506-500g</td><td>MgSO4</td></tr><tr><td>Miracle-Gro 수용성 다목적 식물 식품</td><td>Miracle-Gro</td><td>2756810</td><td></td></tr><tr><td>믹서 밀 MM 200</td><td>Retsch</td><td>20.746.0001</td><td>조직 mill</td></tr><tr><td>Nalgene Fernbach 배양 플라스크</td><td>Sigma</td><td>Z360236</td><td>2.8 L 플라스크</td></tr><tr><td>New Brunswick I26</td><td>Eppendorf</td><td>M1324-0000</td><td>쉐이킹 인큐베이터</td></tr><tr><td>Nicotiana benthamiana seed</td><td>USDA 생식질 저장소</td><td>등록 TW16</td><td>N. benthamiana</td></tr><tr><td>OverExpress C41(DE3) 화학적 역량 세포</td><td>Lucigen</td><td>60442</td><td>C41-DE3 세포</td></tr><tr><td>Parafilm M 랩핑 필름</td><td>Fisher</td><td>S37440</td><td>Parafilm</td></tr><tr><td>염화칼륨</td><td>Sigma</td><td>P-9541</td><td>KCl</td></tr><tr><td>인산칼륨 이염기성 무수</td><td>Fisher</td><td>P288-3</td><td>인산이칼</td></tr><tr><td>륨 인산칼륨 인산염 일염기</td><td></td><td></td>성 <td>인산일칼륨</td></tr><tr><td>Pyrex 일회용 배양관, 무테</td><td>시그마</td><td>CLS9944516</td><td>시험관</td></tr><tr><td>피루브산 나트륨 소금</td><td>피셔</td><td>501368477</td><td>나트륨 피루브산</td></tr><tr><td>레토르트 링 스탠드</td><td>CTechGlass</td><td>ST00</td><td>링 스탠드</td></tr><tr><td>리보플라빈</td><td>Amresco</td><td>0744-250g</td><td></td></tr><tr><td>리팜피신</td><td>시그마</td><td>R7382</td><td>Rif</td></tr><tr><td>Rotovap</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sand, 50-70 메쉬 입자 크기</td><td>시그마</td><td>274739-1KG</td><td></td></tr><tr><td>실리카</td><td>피셔</td><td>AC241660010</td><td>실리카 겔</td></tr> 염화<tr><td>나트륨</td><td>Fisher</td><td>5271-3</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>수산화 나트륨</td><td>Fisher</td><td>SS266-1</td><td></td></tr><tr><td></td><td>501368607</td><td></td><td>NaOH 스펙</td></tr> 스펙 <tr><td>스퀴브 분리 깔때기</td><td>CTechGlass</td><td>FN-1060-006</td><td>분리 깔때기</td></tr><tr><td>선샤인 믹스 # 1</td><td>Sungro 원예</td><td></td><td>화분 토양</td></tr><tr><td>Thermo Scientific 스냅 캡 저잔류 미세 원심 분리기 튜브</td><td>Fisher</td><td>21-402-902</td><td>마이크로 튜브</td></tr><tr><td>삼각형 깔때기</td><td>CTechGlass</td><td>FN-0035</td><td>깔때기</td></tr><tr><td>트립톤</td><td>Fisher</td><td>BP14212</td><td></td></tr><tr><td>바이알, 나사, 2mL, 호박색, WrtOn</td><td>Agilent</td><td>5182-0716</td><td>GC 바이알</td></tr><tr><td>가시 분광 광도계, V-1200</td><td>VWR</td><td>634-6000P</td><td>분광 광도계</td></tr><tr><td>ZORBAX Eclipse XDB-C18</td><td>Agilent</td><td>990967-202</td><td>HPLC 컬럼</td></tr><tr><td>ZORBAX Eclipse XDB-CN</td><td>Agilent</td><td>990967-905</td><td>HPLC 컬럼</td></tr></tbody></table>

디테르페노이드 천연제품의 효소 생산 및 정화를 위한 맞춤형 접근법

A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

디테르페노이드는 삶의 왕국에 널리 분포되어 있으며 발달 과정, 유기간 상호 작용 및 환경 적응에 중요한 생물학적 기능을 가지고 있는 다양한 종류의 소분자 천연 제품을 형성합니다. 이러한 다양한 생체 활동으로 인해 많은 디테르페노이드는 의약품, 식품 첨가물, 바이오 연료 및 기타 바이오 제품과 같은 경제적 중요성도 있습니다. 고급 유전체학 및 생화학적 접근법은 디테르페노이드 대사 유전자, 효소 및 경로에 대한 지식의 급속한 증가를 가능하게 했습니다. 그러나 디터페노이드의 구조적 복잡성과 개별 화합물의 좁은 분류학적 분포는 종종 단일 종에 불과하며 효율적인 생산을 위한 제약 요인으로 남아 있습니다. 신진 대사 효소의 넓은 범위의 가용성은 지금 이 중요한 대사 산물 단의 더 깊은 조사를 촉진하기 위하여 충분한 역가 및 순도에 있는 디테르페노이드를 생성하기위한 자원을 제공합니다. 미생물 및 식물 기반 효소 공동 발현을 위한 확립된 도구를 활용하여, 대장균 또는 니코티아나 벤타미아나에서디테르페노이드의 효소 생산을 위한 쉽게 작동하고 사용자 정의 가능한 프로토콜을 제시하고, 실리카 크로마토그래피 및 반준비 HPLC를 통해 원하는 제품의 정제. 옥수수(Zea mays)돌라브랄렉신 디테르페노이드의 군을 예로 들자면, 디테르펜 신타제(diTPS)와 시토크롬 P450 모노옥시다제(P450) 효소의 모듈식 조합이 어떻게 다른 디테르페노이드 스캐폴드를 생성하는데 사용될 수 있는지 강조한다. 정제된 화합물은 대사 산물 구조 분석, 효소 구조 기능 연구, 시험관 내 및 질라 생체 활성 실험과 같은 다양한 다운스트림 응용 분야에서 사용될 수 있습니다.

대장균을 이용한 디테르페노이드 생산을 위한 회로도 워크플로우 도 1은 디테르페노이드 생산을 위한 설명된 워크플로우를 도시한다. 여기에 설명된 프로토콜은 실리카를 통해 원하는 디테르페노이드 제품의 대량 배양 및 정제를 위해 디테르페노이드 생합성13,32에 대해 앞에서 설명한 대장균 플랫폼에서 채택되었습니다. 크로마토그래피. 이 프로토콜의 사용을 입증하기 위해, 우리는 두 개의 diTPSs를 포함하는 옥수수에서 최근에 확인 된 돌라브렉신 경로를 사용, ZmAN2 (Zm00001d029648) 및 ZmKSL4 (Zm00001d032858), 다기능 P450 (CYP71Z18, Zm00001d014134) 및 시토크롬 P450 (ZmCPR2, Zm00001d026483)(그림 2). 간단히 말해서, 대장균 BL21DE3-C41 유능한 세포는 pCDFDuet:IRS 및 pACYC-듀엣:GGPPS/ZmAN2 플라스미드13,32로미리 변형하였다. pCDFDuet:IRS플라스미드는 디터페노이드 전구체 생산을 위한 주요 효소를 함유하고있으며, 여기에는 1-데옥시-D-자일루로스-5-인산염 신타제(dxs), 1-디옥시-D-자일루로스-5-인산염 환원효소(dxr), 및 이소펜테닐 디포스페이트 이소머라아제(idi)는대장균(13)에서 디테르페노이드 형성을 증가시키는 것으로 나타났다. pACYC-Duet:GGPPS/ZmAN2 플라스미드에는 옥수수 엔트-코팔릴디포스페이트 신디사이저 ZmAN2와 에비스 그랜디스의GGPP 신디사이저가 포함되어 있다. 돌라브랄렉신 생합성에서 커밋된 반응을 촉매하는 효소는 플라스미드 pET28b:ZmKSL4 및 pETDUET:ZmCPR2/ZmCYP71Z18로 공동 변형하였다. 시퀀스 및 플라스미드 구문에 대한 자세한 내용은 Mafu 등 201839를참조하십시오.
추출된 효소 제품의 GC-MS 크로마토그램은 그림 3A에나타내며, 돌라브라디아인(1.2±0.25 mg/L 배양), 에폭시돌라브렌(0.65±0.2 mg/L 배양), 에폭시돌라브란올(11.4)의 형성을 도시하고 있다. ±1.1 mg/L 배양체)는 디테르페노이드 슬레톨을 이용하여 표준 곡선에 기초하여 정량화하였다. Sclareol 은 돌라브랄렉신과 비교하여 유사한 구조와 화학적 특성으로 인해 기준 표준으로 사용되었습니다. 전형적으로 관찰된 경미한 부산물은 클로람페니콜, 인돌 유도체 옥신돌 및 인돌-5-알데히드, 및 전구체 제라닐게라닐 이인산염(GGPP)을포함한다(그림 3). Indole은 일반적으로 1차 부산물을 나타내지만 GC-MS 계측기의 무결성을 유지하기 위해 설정된 용매 지연보다 7분의 짧은 보존 시간으로 인해 여기에 표시되지 않습니다.
N. 벤타미아나를 이용한 디테르페노이드 생산의 회로도 워크플로우 그림 4는 N. 벤타미아나에서돌라브랄렉신 통로의 발현에 대한 개요를 도시한다. 여기에 설명된 제품의 경우, 다음 구성은 A. tumefaciens 균주 GV3101: pLife33:p19(p19 유전자 침묵 억제 단백질 발현), pLife33:ZmCYP71Z18, pLife33:ZmAN2, pLife33:ZmKSL4로 별도로 변형되었다. 옥수수 돌라브랄렉신 통로 유전자의 전체 길이 네이티브 서열은 대장균 및 A. 투메파시엔에서전파를 위한 카나마이신 저항성을 가진 이진 T-DNA 벡터 pLife3341에 사용되었다. 상류 테르페노이드 통로 유전자의 공동 발현은 선택적, 전구체 geranylgeranyl 이인산염은 N. 벤타미아나에서 내인성 형성되기 때문에. 그러나, 몇몇 연구 결과는 성공적으로 N. benthamiana14,36,41에있는 디테르페노이드 대형을 증가시키기 위하여 그 같은 접근을 채택했습니다. 도 3에도시된 바와 같이, 공동 발현은 성공적으로 돌라브라디아엔 및 15,16-에폭시돌라브렌을 생산했다. 대장균에서의효소 병용 발현과는 달리, 15,16-에폭시돌라브라란올은 대사산물 추출물에서 검출되지 않았다.
잎 추출물에 15,16-에폭시돌라브렌의 존재는 N. 벤타미아나에서CYP71Z18의 활성을 입증하였다. 15,16-에폭시돌라브라란올은 미생물 배양물로부터 추출한 후 안정한 것으로 나타났으며(그림3)뿐만 아니라 이전 연구에서 옥수수 뿌리 조직에서 분리된 후39,하이드록시살화된 생성물이 글리코실화되는 그럴듯한 것으로 나타났다. 내인성 글리코실트랜스퍼라제에 의해 액포에 이의를 제기한 후, 추출을 위해 여기에 사용되는 유기 용매 혼합물로 추출에 접근할 수 없게 되는36,43,44,45 ,46. N. benthamiana에 있는 통로 공학의 맥락에서 유사한 바람직하지 않은 제품 수정은 이전 연구 결과47에서보고되었습니다. 대장균의공동 발현에 대해 도시된 바와 같이, N. benthamiana의 과도 발현은 참조 질량 스펙트럼 데이터베이스와 비교하여 서로 다른 사슬 길이의 선형 알칸을 포함한 여러 부산물을 추출하는 결과를 초래한다. 잎 재료로부터 추출된 화합물 적시하는 g 건성 잎 조직 당 평균 2.4 +/- 0.5 mg의 돌라브라디엔 및 0.9 +/- 0.3 mg 15,16-에폭시돌라브렌인 것으로 나타났다. 이러한 적계자는 상이한 실험 적 설정이 주어진 대장균 공동 발현 시스템과 직접 비교될 수 없다.
디테르페노이드 정제 디테르페노이드 정제는 실리카 컬럼 크로마토그래피 및 후속 반준비 HPLC를 사용하여 달성되었다. 풀화된 대장균 배양물 12L로부터의 대사산물 추출물을 실리카 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 3개의 국소 돌라브랄렉신 화합물을 분리하여 정제하였다(도3A). 실리카 크로마토그래피는 디테르펜 올레핀과 산소화된 유도체를 간단하게 분리할 수 있고, 실리카 매트릭스에 유지되는 주요 오염물질인 옥신돌이를 쉽게 제거하기 때문에 표적 화합물의 고순도를 달성하는 데 이상적입니다. 그림 3A).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59992/59992fig1.jpg"> 그림 1: 액체 세균 배양으로부터 대장균 및 대사산물 정제에서 디테르페노이드 생산을 위한 워크플로우. 파선 상자는 추가 정제가 필요한 선택적 단계를 묘사합니다. (A)분리깔때기를 이용하여 추출된 대장균 배양의 대표적인 이미지. (B)실리카 크로마토그래피를 이용한 대사산물 정제의 대표적인 이미지.   <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59992/59992fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59992/59992fig2v2.jpg"> 도 2: 이 연구에서 사용된 돌라브랄렉신 생합성 통로 및 유전자 구성. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59992/59992fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59992/59992fig3v2.jpg"> 그림 3: GC-MS 결과. 대표적인 GC-MS 크로마토그램은(A) 대장균 및(B) 벤타미아나에서효소 공동 발현 법을 사용하여 얻어진 정제된 디테르페노이드 제품의 크로마토그램이다. 제품 식별은 국립 표준 기술 연구소(NIST) 질량 스펙트럼 라이브러리의 정품 표준 및 기준 질량 스펙트럼과 의 비교를 기반으로 합니다. 1, 옥신돌; 2, 인돌-5-알데히드; 3, 피롤로[1,2-a]피라진-1,4-디온, 헥사하이드로-3-(2-메틸프로필);; 4, 6-O-아세틸-1-[[4-브로모페닐]티오]-a-d-글루코사이드 S, S-이산화; 5, 돌라브라디엔; 6, 15,16-에폭시돌라브렌; 7, 피롤로[1,2-a]피라진-1,4-디온, 헥사하이드로-3-(페닐메틸);; 8, 15,16-에폭시돌라브라란골; 9 및 12, 알 수 없음; 10, 클로람페니콜; 11, 3,7,11,15-테트라메틸-2-헥사데켄-1-올; 13-16, 알칸. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59992/59992fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59992/59992fig4.jpg"> 그림 4: N. 벤타미아나에서 디테르페노이드 생산. (A) N. 벤타미아나에서 디테르페노이드 생산의 워크플로우 및 잎재료로부터의 대사산물정제. (B) N. 벤타미아나 식물의 대표적인 이미지는 침윤 실험을 위해 준비된, 가지치기 전에. (C)가지 치기 후 N. 벤타미아나 식물의 대표적인 이미지. (D)주사기에 침투 한 잎의 이미지. 어두운 지역이 침투했습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59992/59992fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

여기서 우리는 대장균 또는 니코티아나 벤타미아나에서생합성 효소의 합성 발현을 통해 디테르페노이드 대사산물을 생산하고 정화하기 위한 프로토콜을 쉽게 사용하고 크로마토그라피 생성물을 제시합니다. 정화. 생성된 대사산물은 분자 구조 특성화, 효소 기능성 연구 및 생체 활성 검정을 포함한 다양한 연구에 적합합니다.

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...

이 프로토콜은 다른 다운스트림 분석에 사용할 수 있으며 다양한 대사 산물 표적에 맞게 사용자 정의 할 수있는 정제 된 디테페노이드를 생산하는 데 적합합니다. 이 방법의 주요 장점은 전문 대사 산물의 밀리그램 양을 생산하는 간단하고 저렴한 방법입니다. 공동 발현에 사용되는 유전자와 효소를 교환함으로써, 이 방법은 모노테르페노이드 및 세스테커페노이드뿐만 아니라 플라보노이드와 같은 다른 대사산물 클래스를 포함한 다른 테르페노이드를 생산하도록 변형될 수 있다.디테페노이드 대사 생산 및 변환을 위해, 얼음에 화학적으로 유능한 대장균 세포를 온난화로 시작합니다. 배양이 해동되면, 냉각된 1.5 밀리리터 마이크로튜브에 25마이크로리터의 유능한 세포를 추가하고 공동 발현에 사용되는 각 구조의 마이크로리터 용액당 100 나노그램의 마이크로리터를 추가한다. 마이크로튜브 랙을 가로질러 튜브를 긁어내고 10분마다 부드럽게 혼합하여 얼음에 혼합물을 30분 간 배양합니다.인큐베이션이 끝나면 세포 혼합물을 섭씨 42도에서 1분 동안 충격한 후 세포를 얼음에 다시 2분 이상 다시 놓습니다. 다음으로, 튜브에 섭씨 37도 SOC 배지의 200 마이크로리터를 추가합니다. 그리고 1시간 동안 섭씨 37도, 분당 200회 회전으로 문화를 배양합니다.인큐베이션이 끝나면 약 10개의 오토클레이브 유리 구슬과 100마이크로리터의 세포가 37도에 적절한 항생제로 따뜻한 리조제니 국물 식도 판을 첨가한다. 그리고 뚜껑을 제자리에 놓고 접시를 수평으로 흔들어 세포를 고르게 분배합니다. 그런 다음 유리 구슬을 폐기물 용기에 부드럽게 두드리고 밤새 섭씨 37도에서 플레이트를 배양하고 표면 측면을 아래로 코팅합니다.다음 날 인큐베이터에서 플레이트를 제거합니다. 계획된 1리터 배양당 플라스틱 통기성 캡이 있는 15밀리리터 멸균 유리 튜브에 적절한 항생제를 장착한 갓 준비된 리소제니 국물 배지 5밀리리터를 추가하고, 파이펫 팁을 사용하여 한천 플레이트에서 개별 변형된 대장균을 선택합니다. 준비된 15밀리리터 튜브에 수확한 콜로니 1개를 추가하고 각 튜브에 통기성 이 가능한 플라스틱 캡을 장착합니다.그런 다음, 12~24시간 동안 37도의 섭씨에 캡된 대장균 의 작은 문화를 배치합니다. 다음 날 100 밀리리터100 밀리리터를 900 밀리리터에 적절한 항생제로 작은 배양당 1리터 플라스크에 넣습니다. 그리고 플라스크를 섭씨 37도, 분당 140회전으로 약 30분간 놓습니다.훌륭한 국물은 따뜻할 때 각 접종 문화의 전체 5 밀리리터 양을 문화당 1리터 문화 플라스크에 추가합니다. 그리고 약 3 시간 동안 분당 140 회전에 흔들리는 인큐베이터에 플라스크를 배치합니다. 600 나노미터의 광학 밀도가 0.6에 도달하면 인큐베이터의 온도를 섭씨 16도로 줄입니다.인큐베이터가 냉각되면, 1개의 어금음 IPTG 1밀리리터, 리터 리보플라빈 당 4그램, 각 배양에 리터 아미노레프룰린산 당 150그램을 신선하게 준비한 밀리리터 1밀리리터를 첨가하십시오. 디테페노이드 생산을 위해, 충분한 전구체 형성을 보장하기 위해 각 배양에 1개의 어금음 나트륨 피루바테의 25 밀리리터를 추가하십시오. 그런 다음 72시간 동안 섭씨 16도, 분당 140회 회전으로 배양하여 매일 25밀리리터의 플루루바테 나트륨을 적절한 문화에 추가합니다.대사 산물 분리 및 정화를 위해 연기 후드의 링 스탠드에 분리 깔때기를 고정하십시오. 그리고 깔때기 아래에 폐기물 용기를 놓습니다. 에틸 아세테이트와 헥산 50/50 용액의 500 밀리리터를 세파라토리 깔때기에 붓습니다.그리고 유입경로에 관심의 변형된 E.coli 공동 발현 문화의 500 밀리리터를 추가합니다. 깔때기에 유리 스토퍼를 놓고 유입기를 5~10회 흔들어 추출 용매와 문화를 혼합하고, 깔때기가 거꾸로 되어 있는 동안 자주 첨탑을 열고 퍼널을 가스 후드로 가리키며 깔때기를 탈착시합니다. 방금 시연된 대로 두 번째 흔들림과 탈가스를 한 후, 깔때기를 링 스탠드에 똑바로 세워 약 1분간 놓습니다.상부 용매 층이 수성 배양층과 분리되면 스토퍼를 제거하고 E.coli 층을 폐기물 비커로 배출하여 깔때기 내에서 용매 층을 유지합니다. 이어서, 추출된 대사산물을 함유한 용매를 깨끗한 플라스크로 배출하기 전에, 제1 추출에 사용되는 용매의 동일한 500 밀리리터를 사용하여 배양의 나머지 500 밀리리터를 사용하여 추출을 반복한다. 여기서, 대표적인 가스 크로마토그래피-질량 분광법 크로마토그램의 대표적인 추출 효소 제품이 나타난다.일반적으로 관찰되는 경미한 부산물은 클로람페니콜과 인돌 유도체 옥신돌 및 인돌 피발알데히드를 포함한다. 실리카 컬 크로마토그래피를 통한 디테페노이드 정제 후, 디테페노이드 스클레어롤을 사용하여 표준 곡선에 따라 정량화된 3개의 돌라브랄렉신 화합물을 얻을 수 있다. 실리카 크로마토그래피는 표적 화합물의 고순도를 달성하는 데 이상적입니다.디테르펜 올레핀과 산소화된 유도체의 간단한 제조를 가능하게 하고 실리카 매트릭스에 유지되는 주요 오염 된 옥신돌을 쉽게 제거합니다. 또한, 테르페노이드 경로 유전자의 공동 발현은 N.벤타미안에서 디테페노이드를 생성하는 데 사용될 수 있으며, 그 결과 돌라브라디엔과 15, 16 에폭시돌라브렌의 생산이 초래된다. 추출 중에 사용되는 용매는 관심있는 대사 산물의 물리적 화학적 특성에 최적화되어야하며 두 개의 뚜렷한 층을 유지하기 위해 물과 혼합할 수 없어야합니다.이 절차에 따라 정제 된 대사 산물은 구조 분석 및 항생제 산을 포함한 다운 스트림 분석에 사용할 수 있습니다. 이 기술은 새로운 diterpenoids의 발견을 가능하게 했습니다, 여기에 표시된 것을 포함하여, 이 대사 산물은 그들의 화학 구조 및 새로운 biactivies를 위해 분석될 수 있도록. 분리 깔때기에서 유기 용매를 사용할 때 예방 조치를 취하십시오.항상 실험실 안전 기준에 따라 생물학적 폐기물을 폐기해야 합니다.

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