Name: CRISPR-Cas9를 사용하여 꿀벌 뇌 섹션에서 항 RDL 및 안티 mGlutR1 수용체 항체 테스트 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: 배우세요 CRISPR-Cas9 유전자 편집을 이용하여 성체 꿀벌 뇌에서 GABAA와 mGlutR1 수용체 발현을 조절하고 학습 및 기억에 관여하는 단백질 기능을 연구하는 방법입니다. 이 기술은 항체 특이성 검증에도 활용됩니다.

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이 작품은 BHS에 다음과 같은 상에 의해 지원되었다: 인간 국경 과학 프로그램; NIH NIGMS (R01 GM113967); NSF 아이디어 랩 (1556337). DmGluRA에 대한 펩티드 및 항체는 DR. Serge Birman (마르세유, 루미니, 프랑스) 연구소에서 설계되었다 때 IS는 프로그램 d'Urgence FRM / Postdocs UFP20060306548 에 의해 지원되었다 라 Recherche 의료를 부어. 우리는 RDL 가이드와 qPCR 드롭 오프 어세의 설계에 대한 도움을 통합 DNA 기술 (IDT)에서 다니엘라 Junqueira 마로시와 알렉스 한터에 감사드립니다.

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저자는 공개 할 것이 없다.

안티 RDL 및 안티 mGlutR1의 특성화 첫째, 우리는 고정 된 꿀벌 뇌의 조각에 면역 블롯 및 사전 흡착에 의한 항 RDL 및 항 mGlutR1 항체를 특징으로합니다. 각 항체는 모든 알려진 이소폼을 인식하도록 만들어졌으며, 서양 분석은 예측된 분자량에 해당하는 밴드를 인식한다는 것을 보여줍니다. 다음으로, 두 항체는 꿀벌 뇌 섹션에서 생산된 공액 펩티드에 의해 차단되었다.
우리의 연구 결과에 있는 첫번째 목표의 한개는 특정 공액 펩티드에 대하여 생성된 항체가 고정된 두뇌 조직에 있는 그것의 단백질에 특정하다는 것을 설치하는 것이었습니다. 이를 위해 CRISPR-Cas9 시스템을 활용했습니다. 우리는 꿀벌 RDL 및 mGlutR1에 대한 특정 가이드를 설계하고 형광 프로브 ATTO550로 라벨CRISPR-Cas9를 만들기 위해 각각을 사용했다. 각 수용체에 대해, 우리는 우리가 디자인한 Cas9 시스템을 취한 세포에 있는 대응하는 유전자를 제거해서 성숙한 꿀벌 두뇌에 있는 표적으로 한 단백질의 양을 감소시키기 위하여 오셀리에 있는 3개의 다른 CRISPR-Cas9 리보뉴클레오 단백질의 혼합물을 주입했습니다. 우리의 연구에서, 우리는이 단계를 달성.
이러한 실험의 성공을 위한 첫 번째 중요한 단계 중 하나는 적절한 가이드 RNA를 설계하는 것입니다. 유전자 서열의 시작, 중간 및 끝에 위치한 최대 5개의 가이드 RNA를 설계하는 것이 좋습니다. 우리의 예비 작업에서, 우리는 3 ~ 5 마리의 꿀벌에 다양한 조합으로 테스트했습니다. 우리는 또한 주사의 다른 농도 시도, 뿐만 아니라 주사 후 시간, 그리고 주사에 RNP의 다양 한 혼합물. 우리는 두뇌를 해부하고 반대로 RDL 및 반대로 mGlutR1 항체를 사용하여 가공했습니다. 이러한 초기 테스트에서, 우리는 적절 한 조합을 설립, 주입 후 시간, 농도 및 주입에 대 한 CRISPR-Cas9의 양 뿐만 아니라. 이러한 초기 테스트는 여기에서 자세히 설명한 실험을 설정하기 위한 기초가 되었습니다.
목표는 두 배였다: 1) 우리의 항체 염색은 CRISPR-Cas9 및 2) 행동 연구를위한 최상의 실험 조건을 통해 작동하도록 치료 후 감소 된 꿀벌에서 입증. 따라서, 많은 세포 핵이 주사 후 CRISPR-Cas9 48 h를 함유하는 경우, 안티-RDL 및 안티-mGlutR1 염색의 감소가 중요하다는 것을 보여준다. 추가적으로, 시험된 항체가 꿀벌 두뇌 준비에 있는 mGlut1 그리고 RDL 단백질을 구체적으로 인식하고 꿀벌 두뇌에 있는 현지화 연구 결과에서 사용될 수 있다는 것을 보여줍니다.
행동 연구를 위한 실험 설정 CRISPR-Cas9 다음으로, 우리는 CRISPR-Cas9가 행동 연구에 사용될 수 있도록 실험을 설정했습니다. 8개 또는 9마리의 꿀벌을 대조군 및 실험적 치료를 위해 수집하였다. 그(것)들은 주입 전후에 행동으로 시험되고, 그 후에 그들의 두뇌는 표적 단백질의 감소를 보인 두뇌 지구를 결정하기 위하여 ATTO550 및/또는 면역세포화학을 위해 가공되었습니다. 여기서 한 세트의 실험에 대해 취한 꿀벌의 수는 대조군 및 실험 조건에 대해 8-9 개 이하의 꿀벌로 제한되었다는 점에 유의해야합니다. 이 방법으로 두 조건을 같은 날에 테스트할 수 있습니다. 또한, 일단 우리가 주사에 대 한 CRISPR-Cas9 혼합물을 준비, 우리는 결코 그들을 동결. CRISPR-Cas9 혼합물은 3일 연속으로 사용했을 때 효능이 변하지 않았고 4-8°C에서 보관하였다. 그러나, 우리는 3 일 후에 그것을 시험하지 않았습니다.
실험 주사의 두 세트와 두 항체 모두에 대한 결과 섹션에서 설명했듯이, 테스트된 16개 꿀벌 중 3개만이 버섯 체체, 프로토세레브룸 및 안테나 로브에서 큰 분포ATTO550을 보였다. 다른 모든 꿀벌에서, CRISPR-Cas9의 분포는 버섯 몸, 중앙 복합체 및/또는 후방 프로토세레브럼으로 제한되었습니다. 이 주입 방법을 사용 하 여 대상 단백질의 감소 꿀벌의 대부분에 버섯 시체에만 제한 됩니다 어떤 행동 연구에 대 한 이해 하는 것이 필수적이다. 그것은 안테나 로브 또는 식도 신경절로 확장되지 않습니다. 따라서, 우리가 사용하는 주입 기술은 행동 실험에서 버섯 체내 및 중앙 복합체의 수용체 감소의 효과를 연구하는 데 적합하며, CRISPR-Cas9를 도입하는 다른 방법은 다른 뇌 영역을 연구하는 데 더 적합할 것입니다.
결론적으로, 우리의 연구는 뇌의 항체 염색을 위한 대조군으로 CRISPR-Cas9의 성공적인 적용을 입증했습니다. 항체(anti-RDL 및 anti-mGlutR1)의 경우, mGlutR1-CRISPR-Cas9 또는 RDL-CRISPR-Cas9의 섭취가 성공했을 때, 상응하는 항체 염색의 수준도 현저히 감소되었다. 또한, 오켈리에 주입 균질 하지 않은 뇌에서 CRISPR-Cas9의 분포를 주도 하는 주의 하는 것이 필수적이다. 분포는 오켈리와 버섯 몸을 둘러싼 최소한의 영역에서 전체 뇌의 많은 세포에 다양. 세포에 의한 mGlutR1-또는 RDL-CRISPR-Cas9 의 가변성은 주사의 변화에 기인할 가능성이 높았다. 우리의 데이터는 CRISPR-Cas9 시스템이 꿀벌에서 작동한다는 것을 보여줍니다, 그러나 주입의 방법은 개별 꿀벌 두뇌에 걸쳐 CRISPR-Cas9 섭취량의 가변성을 감소시키기 위하여 향상될 필요가 있습니다. 이러한 제한 내에서, 행동 실험을 위한 성인 꿀벌에 있는 유전자를 조작하기 위하여 이 기술을 채택하는 것이 지금 가능합니다.

최근에 발견된 CRISPR/Cas9 시스템은 다양한 모델 시스템과 유기체에서 게놈 DNA를 변경하는 데 사용된 강력한 도구입니다. 그것은 이전 방법 보다 더 효율적이 고 강력한 게놈 수정을 함으로써 생물 의학 연구 및 주요 기술 돌파구를 가속화했다 1. S. pyogenes 박테리아가 원산지인 이 시스템은 Cas9 엔도뉴렐라제에 의존하며, 그 활성은 DNA에서 이중 가닥 휴식(DSBs)을 초래하고, Cas9 단백질을 특정 서열 의존적 위치로 지시하는 가이드 RNA(gRNA)에 의존합니다2. CRISPR/Cas9에 의해 생성된 이중 가닥 브레이크는 비상동성 최종 결합(NHEJ)을 통해 복구할 수 있으며, 이는 프레임 이동으로 이어질 수 있는 오류가 발생하기 쉬운 프로세스또는 기증자 템플릿이 있을 때 상동성 직접 수리로 이어질 수 있습니다. gRNA 자체는 표적 특이적 CRISPR RNA(crRNA)와 리보뉴클레오단백질 복합체(RNP)2,3으로서정제된 Cas9 뉴클레아제와 함께 화학적으로 합성및 전달될 수 있는 보편적 트랜스-활성화 crRNA(tracrRNA)로 구성된다. gRNA 또는 Cas9 뉴클레아제의 형광 표지는 형광 현미경 검사법을 통해 분자 성분의 검출 및 세포내 시각화를 허용할 수있습니다 4.
현재 의 작품에서, 우리는 성인 꿀벌 두뇌의 단백질 수준을 줄이기 위해 CRISPR-Cas9 시스템을 활용합니다. 우리는 대사성 글루타메이트 수용체 (mGluR) 및 항 mGlutR1 수용체 항체 및 GABAA 수용체 소단위 RDL 및 항 RDL 항체를 연구했습니다. 우리는 성인 꿀벌의 두뇌에 있는 단백질의 양을 감소시키는 간단한 방법을 개발하고 대응하는 단백질에 대하여 개발된 항체의 추가 시험을 몰기 위하여 그것을 이용했습니다. CRISPR-Cas9의 형광을 모니터링하여 단백질 감소에 관여하는 영역과 세포를 추정할 수 있었습니다.
이 방법을 사용하여, 우리는 또한 공액 펩티드에 대하여 토끼에서 만들어진 항 mGlutR1 항체를 특징으로 하였다. 꿀벌 게놈은 고도로 보존된 AmGluRA (NCBI 명명선에 따라 명명된 mGlutR1) 메타보트로픽 글루타메이트 수용체5를인코딩합니다. 꿀벌 mGlutR1 유전자는 NCBI 데이터베이스에 따라 4개의 예측된 스플라이스 변이체를 가지고 있습니다. 그것은 pupal 및 성인 꿀벌 단계 둘 다의 중추 신경계 (CNS)에서 표현되고 장기 기억 형성에 관여한다는 것을 보고되었습니다5. mGlutR1에 대해 개발된 항체는 꿀벌의 학습 및 기억 과정에서 글루타마테르기 시스템을 연구하는 데 필수적인 도구가 될 수 있습니다.
우리의 연구에서, 우리는 또한 아피스 mellifera RDL 수용체 소단위에서 공액 펩티드로 면역 토끼에서 개발 된 항 RDL 항체를 특징으로. 꿀벌 Rdl 유전자, AmRdl (XM_006565102.3, NCBI 데이터베이스), 14 예측 스플라이스 변이체가 있습니다. 부분적으로 복제된 조각은 NCBI 데이터베이스 AF094822.1에 보고되었습니다. RDL 수용체 기능 및 그 생리학은꿀벌9,10,11을포함하여 곤충6,7,8에서잘 연구된다. 항 RDL에 대하여 개발된 항체는 꿀벌에 있는 학습 그리고 기억 프로세스에 있는 GABAergic 시스템을 공부하기 위한 필수적인 공구일 수 있습니다.
옥토파민과 티라민 수용체의 역할에 대한 이전 연구는 서양 얼룩12,13에의한 단백질의 양을 후속 테스트로 뇌에 주입 RNAi를 사용했다. 그러나 RNAi에는 몇 가지 중요한 제한이 있습니다. 단백질의 감소가 발생하는 RNAi 주입 후 짧은 시간 창이있다 13. CRISPR-Cas9는 최근 꿀벌 배아에서 전체 동물14,15,16에서유전자를 삭제 또는 수정하는 데 사용되었다. 우리는 성인 꿀벌에 있는 단백질의 양을 감소시키기 위하여 CRISPR-Cas9의 사용을 보고했습니다. 우리는 통제된 실험실 조건 하에서 학습과 기억의 행동 연구 결과에 그것을 결합하는 기능 때문에 꿀벌을 위한 이 접근을개발했습니다 17.
본 작품에서, 우리는 2개의 수용체에 대하여 항체를 개발하고 단백질이 CRISPR-Cas9 주입에 의해 감소된 후에 성숙한 꿀벌 두뇌 단면도에 그(것)들을 시험했습니다. 동시에, 우리는 행동 실험에 대한 방법을 사용할 수있는 실험 디자인을 설립했다.

<table><tbody><tr><td>아세트산</td><td>시그마-알드리치</td><td>A6283_100 mL</td><td>웨스턴 블로팅</td></tr><tr><td>아크릴아미드-비스 아크릴아미드</td><td>바이오 라드</td><td>500 mL</td><td>1610156 웨스턴 블로팅</td></tr><tr><td>아가로스</td><td>시그마-알드리치</td><td>A0169-250g</td><td>꿀벌 뇌를 블록으로 고정하기 위해 증류수와 함께 사용</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment 당나귀 안티 토끼 IgG (H+L)</td><td>Jackson Research Laboratories</td><td>711-546-152</td><td>2차 항체는 토끼</td></tr><tr><td>Alt-R CRISPR-cas9 tracrRNA-5'ATTO</td><td>IDT</td><td>1075934</td>에서 1차 항체를 밝히기 위해 <td>설계된 가이드 RNA와 함께 CRISPR</td></tr><tr><td>시스템용 리보핵단백질을 만드는 데 사용되는</td>gRNA<td>Alt-R S.p. Cas9 nuclease V3</td><td>IDT</td><td>1081058</td> 효소</tr>를 생성합니다.<tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-mGlutR1 항체</td><td>Covalab (FRANCE)/21st Century Biochemical</td><td>본 논문의 저자에 의해 특성</td>화 <td>꿀벌에서 mGlut 1의 1차 배양에 사용됨</td></tr><tr><td>Anti-RDL 항체</td><td>본 논문의 저자에 의해 특성화된</td><td>21세기 생화학</td> 꿀<td>벌에서 RDL의 1차 배양에 사용됨</td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0001154</td><td>프로테아제 억제제</td></tr><tr><td>Barraquer 홍채 가위 7mm 블레이드 날카로운 점</td><td>World Precision Instruments</td><td>14128-G</td><td>해부에 사용 꿀벌 뇌</td></tr><tr><td>Benzamidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12072</td><td>프로테아제 억제제</td></tr><tr><td>블레이드 홀더용 블레이드(파손 가능)</td><td>Fine Science Tool</td><td>10050-00</td><td>해부 웨스턴 블로팅용</td></tr><tr><td>블레이드 홀더 및 차단기</td><td>Fine Science Tool</td><td>15309</td><td>해부 웨스턴 블로팅용</td></tr><tr><td>붕규산 유리 모세관</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100 F</td><td>주입 절차용</td></tr><tr><td>화학발광 웨스턴 블롯 검출 기판</td><td>Bio-Rad</td><td>1705062</td><td>웨스턴 블로팅</td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472476-50mL</td><td>RNA 분리</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Bio-Rad</td><td>1610611</td><td>웨스턴 블로팅</td></tr><tr><td>DNA easy kit</td><td>QIAGEN</td><td>69504</td><td>DNA 추출uj</td></tr><tr><td>DNA-free 키트</td><td>INVITROGEN</td><td>AM1907</td><td>DNA 제거에 사용</td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus 피펫, 3팩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z683884</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 24 Well Polystyrene Multiwell</td><td>Falcon</td><td>351147</td><td></td></tr><tr><td>Multiwell Flat Bottom Embedding Capsules, Polyethylene</td><td>Electron Microscopy Science</td><td>70021</td><td>뇌 절편용 바구니</td></tr><tr><td>겸자 Dumont #5 (쌍)</td><td>꿀벌의 뇌 해부용</td> <td>Fine Science Tool</td><td>11254-20</td> 머리에서 꿀벌 뇌</tr> 집<tr><td>게 Dumont #5S(쌍)</td><td>기관으로부터 뇌를 청소하기 위한</td> <td>Fine Science Tool</td><td>11252-00</td> 해부</tr><tr><td>전 유전자 발현 마스터 믹스</td><td>통합 DNA 기술</td><td>1055770</td><td>qPCR 드롭 오프 분석</td></tr><tr><td>글루 타르 알데히드</td><td>EMS</td><td>16220</td>, <td>peabsorption 조절을위한 펩타이드 접합체 제조에 사용</td></tr>, <tr><td>글리세롤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516-500 mL</td>, <td>웨스턴 블로팅, 매립 매체</td></tr>, <tr><td>글리신</td>, <td>Bio-Rad</td>, <td>1610718</td><td>웨스턴 블로팅</td></tr>, <tr><td>소수성 여과 나일론, Spectrum</td><td>Labs</td><td>145910</td>, <td>뇌 단면 용 바구니 하단</td></tr><tr><td>: 이소 프로필 알코올</td><td>: 시그마 Aldrich</td><td>I9030-50mL</td><td>RNA 분리</td></tr><tr><td>열쇠 구멍 limpet 헤모시아닌</td><td>시그마 - Aldrich</td><td>H7017</td><td>제어</td></tr><tr><td>LSM800 공 초점 현미경</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mGlu_Guide 1</td><td>IDT</td><td></td><td>설계 가이드 RNA CRISPR-Cas 9. </td></tr><tr><td></td><td></td> CRISPR-Cas 9를 위한 2개의 IDT <td></td><td>설계 가이드 RNA mGlu_Guide mGlutR1 게놈 염기서열을 표적으로 합니다. CRISPR</td>을 위한 3 IDT 설계 가이드 RNA mGlu_Guide mGlutR1 게놈 염기서열을 표적으로 합니다</tr><tr><td></td><td></td>.<td></td><td> 표적 mGlutR1 게놈 염기서열</td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td>웨스턴 블로팅</td></tr><tr><td>96웰 PCR 마이크로플레이트</td><td>, 적용된 바이오시스템</td><td>4346907</td><td>qPCR 드롭 오프 분석 및 qRT-PCR</td></tr><tr><td>384웰 PCR 마이크로플레이트</td><td>, 시그마-알드리치</td><td>Z374911</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>미네랄 오일</td>, <td>주사 절차용</td><td>M5904_500mL</td><td></td></tr><tr><td>모델 p87 불타는 갈색 마이크로 피펫 풀러</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td>모세관 제제</td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81381</td><td>임베딩 용액</td></tr><tr><td>나노 리터 2000</td><td>세계 정밀 기기 나노 리터</td><td></td><td>주입 장치</td></tr><tr><td>일반 당나귀 혈</td>청 <td>잭슨 연구소</td><td></td> 면역 <td>세포 화학을위한 AB_2337258 차단제</td></tr><tr><td>비 면역 염소 혈청</td><td>Invitrogen</td><td>50-062Z 100 mL</td><td>면역 블로팅을 위한 차단제</td></tr><tr><td>뉴클레아제가 없는 완충액</td><td>IDT</td><td>1072570</td><td>CRISPR-Cas9 주입의 준비에 사용되는</td></tr><tr><td>뉴클레아제가 없는 완충액</td><td>CRISPR-Cas 9 시스템의 제조에 사용되는 뉴클레아제가</td>없는 물 <td>IDT</td><td>AM9337</td> 뉴클레아제가 없는 물</tr><tr><td>OrbitalShaker Mp4</td><td>유전자 파라포</td><td></td><td></td></tr><tr><td>름알데히드</td><td>시그마-알드리치</td><td>158127-500 g</td><td>꿀벌 뇌에 고정제를 만들기 위해 PBS와 함께 사용</td></tr><tr><td>페닐 메틸 설포닐 플루오 라이드 (PMSF)</td> <td>시그마 - 알드리치</td><td>P7626-250 mg</td><td>프로테아제 억제제</td></tr><tr><td>인산염 완충제</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>P4417-100TAB</td><td>파라 포름 알데히드와 함께 고정 제로 사용; 항체 완충제</td></tr></tbody></table>

crispr-cas9를 사용하여 꿀벌 뇌 섹션에서 항 rdl 및 안티 mglutr1 수용체 항체 테스트

Anti-RDL and Anti-mGlutR1 Receptors Antibody Testing in Honeybee Brain Sections using CRISPR-Cas9

클러스터 정기적으로 간격이 짧은 Palindromic 반복 (CRISPR)/CRISPR 관련 단백질 9 (Cas9)는 유전자 기능의 연구에서 널리 사용되는 유전자 편집 기술이다. 우리는 곤충 GABAA 수용체 소단위 저항디엘드린 (RDL) 및 대사성 글루타메이트 수용체 mGlutR1 (mGluRA)에 대하여 개발된 항체의 특이성을 확인하기 위하여 이 연구 결과에서 이 방법을 이용합니다. 항체는 열매파리(Drosophila melanogaster)뿐만아니라꿀벌(Apis mellifera)에특이적인 공액 펩티드에 대하여 토끼에서 발생하였다. 우리는 꿀벌 두뇌에 있는 수용체의 분포를 공부하기 위하여 꿀벌 두뇌 단면도에 있는 이 항체를 이용했습니다. 상기 항체는 펩티드에 대해 화결하고 면역블로팅 및 펩타이드 접합체를 이용한 퍼즈소어레이션의 고전적 방법으로 시험하여 항체가 제기된 해당 펩티드 접합체에 특이적임을 보여주었다. 여기에서 우리는 상응하는 수용체를 위해 디자인된 가이드 RNA를 가진 CRISPR-Cas9 주입 후에 두뇌에 있는 단백질 표적의 감소를 시험하기 위하여 CRISPR-Cas9 기술을 개발했습니다. CRISPR-Cas9 방법은 또한 하나 또는 다중 유전자가 수정될 필요가 있을 때 성인 꿀벌에 있는 행동 분석에서 이용될 수 있습니다.

안티 RDL 항체 테스트 항체는 도 1A에도시된 바와 같이 RDL 펩티드 접합체에 대하여 제조되었다. 항-RDL 항체를 특성화하는 첫 번째 단계는 항 RDL 항체및 HRP 표지염소 표지 된 IgG 이차 항체를 이용한 웨스턴 블롯을 사용하여 꿀벌 뇌로부터 추출된 단백질의 균질계를 확인하는것이다(도 1A,삽입). 두 항-RDL 항체는 RDL 소단위 이소포름 단백질의 추정 중량에 상응하는 ~50-60 kD(화살표)에 위치한 밴드를 인식했다. 항RDL 항체가 뇌 슬라이스에서 펩티드를 인식한다는 것을 입증하기 위해, 우리는 preadsorption 제어(그림 1B,C)를사용했다. 항체가 공액 펩티드로 미리 포인되었을 때, 섹션의 염색은 없었다. 이는 항-RDL 항체가 제기된 컨쥬게이트 펩티드를 인식한다는 것을 입증했다. 항 RDL 항체가 고정 된 뇌 조직에서 단백질을 인식한다는 것을 입증하기 위해 CRISPR-Cas9를 사용하여 세포에서 RDL 단백질을 생성하는 RDL 유전자를 제거했습니다. 도 1D1-3은,반RDL 항체로 표지된 대조군 전두엽 꿀벌 뇌 절편을 나타낸다. 이 꿀벌은 RDL-CRISPR-Cas9 RNP를 주입하지 않았다. 그림 1D1에서,반대로 RDL은 꿀벌 두뇌의 정면 단면도에 있는 neuropils를 표시합니다. 도 1D2의 동일한 정면 섹션은 RDL-CRISPR-Cas9 복합체가 주입되지 않았기 때문에 ATTO550에서 형광의 부재를 나타낸다.
도 1E1-E3는 RDL-CRISPR-Cas 9로 주입된 꿀벌로부터의 뇌 섹션을 도시하고 도 1D1-D3에서대조뇌와 동일한 양의 항체로 처리한다. 반RDL 염색은 주사 후 48시간 전체뇌에서 현저히 감소하였고, ATTO550의 분포는 뇌에서염색(도 1E2)은꿀벌 중간 오펠리에서 RDL-CRISPR-Cas 9 주사의 성공을 나타낸다. 뇌의 여러 산란 세포는 ATTO550을 전시합니다. RDL-CRISPR-Cas 9의 성공적인 주사는 대조군과 비교하여 단백질 발현을 감소하였다(도1E1-3). 8개의 면역염색된 꿀벌 뇌에서, 오직 한 뇌만이 버섯 체체, 프로토세레브럼 및 안테나 로브의 세포에서 RDL-CRISPR-Cas9의 높은 분포를 보였으며, 다른 뇌는 버섯 체내 꽃받침, 중앙 복합체, 안테나 로브에서 ATTO550으로 세포 염색을 했다. 이 꿀벌에서, 감소 반대로 RDL 면역 염색은 그림 1E1에도시된 두뇌에서 와 같이 극적이지 않았다는 것을 주의하는 것이 중요합니다.
다음으로, RDL-CRISPR-Cas9 주입 후 꿀벌48시간에서 수정된 RDL gDNA의 수준을 추정하기 위해, 우리는 드롭오프 프로브가 RDL gRNA 중 하나의 영역과 일치하도록 설계된 qPCR 드롭오프 테스트를 수행했습니다. 이러한 실험에서, RDL-CRISPR-Cas 9를 주입한 꿀벌 뇌에서, 형광의 상대적 감소는 샘플에서 변형된 gDNA의 수에 대응하였다. 본 시험에서 RDL-CRISPR-Cas9를 주입한 12마리의 꿀벌에서 gDNA에 이 가이드에 해당하는 영역은 비주입 된 꿀벌의 gDNA와 비교하여 64 % ± (평균 ± 30 % SD)이었다(그림 3A).
다음으로, 주사 후 48시간 동안 꿀벌에서 RDL RNA의 수준을 추정하기 위해, 우리는 별도의 꿀벌 군에서 qRT-PCR을 수행하였다(도3B). 우리는 RDL-CRISPR-Cas 9의 RDL RNA 수준을 주입되지 않은 꿀벌의 RNA 수준과 (n = 19) 주입되지 않은 꿀벌의 RNA 수준과 비교했습니다 (n = 12). 이들 실험에서, mRNA RDL의 상대적 감소는 비주입 된 꿀벌에서 RNA의 수준과 비교하여 59 % ± (평균 ± 15 % SE)이었다. 각 꿀벌의 RDL RNA 수준을 개별적으로 조사했을 때, 19개의 꿀벌 중 오직 13개의 꿀벌만이 RNA의 현저한 감소를 보였다. 이 데이터는 오셀리를 통해 RDL-CRISPR-Cas9의 주입이 항상 많은 수의 뇌 세포에 도달하지 않을 수 있음을 나타내며, 이는 RDL 면역 염색 RDL-CRISPR-Cas9 주입 꿀벌로 데이터를 확인합니다. 이러한 제제에서, 8개 중 1개의 꿀벌만이 다른 꿀벌 뇌와 비교하여 많은 뇌 세포(버섯 체, 프로토세레브룸 및 안테나 로브)에서 RDL CRISP-Cas9를 가졌으며, 여기서 RDL-CRISPR-Cas9의 분포는 프로토세레브룸(버섯 체꽃 체액 및 중앙 복합체)에 있는 세포에 집중되었지만 안테나 로브는 없었다(도4).
항 mGlutR1 항체 테스트 우리는 드로소필라 멜라노가스터에 특이적인 공액 펩티드에 대하여 토끼에서 생성된 항mGlutR1 항체를 사용하였다(도2A). 이러한 펩티드의 서열은 꿀벌 펩티드(CLSDKTRFDYFARTVPPD)를 가진 94% 동일정체성을 나타낸다. 첫째, 우리는 면역 블로팅을 사용하여 꿀벌 뇌 단백질에 대한 항체를 확인했습니다. 꿀벌 뇌 균질화는 10% SDS-PAGE로 분리하고 전기 영동을 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 옮기고 안티-mGlutR1로 염색하였다. 그림2A의 삽입은 2개의 이소폼에 해당하는 예상 가중치(103 및 83 kD)를 가진 두 개의 밴드를 나타낸다. 우리가 꿀벌 두뇌에 이 항체를 시험할 때, 우리는 그림 2B,D에도시된 것과 같이 꿀벌 두뇌 단면도에 있는 neuropilar 단면도 및 세포를 레이블을 붙이는 것을 것을을 발견했습니다. 공액-mGlutR1 펩티드로 항-mGlutR1 항체의 퍼즈소어링 후, 꿀벌 뇌 슬라이스에서 특이적 염색이사라졌다(도 2C). 이는 항-mGlutR1 항체가 펩티드를 인식한다는 것을 확인한다(도2C). 다음으로, 우리는 중앙 오켈리에 mGlutR1-CRISPR-Cas9의 혼합을 주입하고 대조군 noguideRNA를 사용했습니다. 대조군 꿀벌(n=7)에서, ATTO550으로부터의 형광은 세포에 집중되지 않았다. 일부 뇌는 ATTO550 라벨을 산란했다. 따라서, 도 2D1-3의 대조군 제제는 ATTO550 형광이 아닌 뇌에서 안티-mGlutR1 염색을 나타낸다. mGlutR1-CRISPR-Cas9가 오셀리에 주입되고 많은 세포에 의해 채택되었을 때, 이차 항체의 형광 수준은 기능성 mGlutR1RNP를 취하는 영역에서 현저히 감소하였다(도2E1-3). 꿀벌은 48시간 동안 모니터링되었고, 각 실험 조건에서 벌 한 마리가 죽은 채로 발견되었습니다. 따라서, 이 실험에서는 7개의 대조군 꿀벌과 8마리의 CRISPR-Cas9 꿀벌을 확인했습니다. CRISPR-Cas9로 주입된 모든 꿀벌은 mGlutR1-CRISPR-Cas9에 세포를 주입하였다. 이 세포의 대부분은 버섯 바디 꽃받침에 있었다, 중앙 복합체, 및 후방 protocerebrum. 7개 중 2마리의 꿀벌만이 버섯 체체, 중앙 복합체 및 안테나 로브의 많은 세포에서 ATTO550 라벨링을 보였습니다. 이러한 꿀벌 중 하나의 예는 그림 2E에도시되어 있습니다. 이러한 제제에서 mGlutR1 염색의 수준이 감소하는 것은 유의했다. 다른 5마리의 꿀벌은 버섯 체체 및 후방 프로토세레브럼에서 mGlutR1 CRISPR-Cas9의 성공적인 전달에 상응하는 ATTO550 라벨링을 가지고 있지만 안테나 로브에는 없습니다.
다음으로, 주사 후 48시간 동안 꿀벌에서 수정된 mGlutR1 gDNA의 수준을 추정하기 위해, 우리는 qPCR 기반 드롭오프 테스트를 수행하였고, 여기서 드롭오프 프로브는 mGlutR1 가이드 근처 의 영역에 있도록 설계되었습니다. 이러한 실험에서, mGlutR1-CRISPR-Cas 9를 주입한 꿀벌 뇌에서, 12마리의 꿀벌에서 gDNA의 상대적 변형은 59% ±(평균 ± 33%SD)였고, 비주사된 꿀벌의 gDNA와 비교하였다(도3A).
이러한 결과는 또한 꿀벌의 다른 그룹에서 qRT-PCR 테스트에 의해 확인되었으며, 여기서 우리는 RNPmGlutR1mix로 주사 한 후 48 시간 동안 꿀벌에서 qRT-PCR을 사용하여 mGlutR1 RNA 수준을 추정했습니다(그림 3B). 우리는 mGlutR1-CRISPR-Cas9의 mGlutR1 RNA 수준을 주입되지 않은 꿀벌의 RNA 수준과 꿀벌 (n = 6)을 비교했습니다 (n = 6). 이러한 실험에서, 주입된 꿀벌에서 mRNA mGlutR1의 상대적 감소는 53% ±(평균 ±18% SE)였고, 무주사 된 꿀벌과 비교하였다(도3B).
버섯체의 케년 세포에서 RNP RDL-CRISPR-Cas9를 발현한 4개의 상이한 꿀벌의 절편은 도 4A-D에나타내고 있다. 버섯 체내에 ATTO550 형광과 안테나 로브를 가진 예는 도 4E,F에도시되어 있다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>가이드</td>
			<td>시퀀스</td>
			<td>gRNA</td>
			<td>RNP</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>[가이드RNA:트라크르RNA]</td>
			<td>[gRNA:Cas9 뉴클레아제]</td>
		</tr>
<tr>
<td>RDL_Guide1</td>
			<td>ACCGTACGACCCCCGCT</td>
			<td>GRDL1</td>
			<td>RRDL1</td>
		</tr>
<tr>
<td>RDL_Guide2</td>
			<td>아크GTCGATCGTGACGT</td>
			<td>GRDL2</td>
			<td>RRDL2</td>
		</tr>
<tr>
<td>RDL_Guide3</td>
			<td>CCATGACGAAACACGCCC</td>
			<td>GRDL3</td>
			<td>RRDL3</td>
		</tr>
<tr>
<td>mGlu_Guide 1</td>
			<td>CGAAGATCTGACGGT</td>
			<td>GMGL1</td>
			<td>RMGL1</td>
		</tr>
<tr>
<td>mGlu_Guide 2</td>
			<td>TTCAACGAGAGCAAGTTCAT</td>
			<td>GMGL2</td>
			<td>RMGL2</td>
		</tr>
<tr>
<td>mGlu_Guide 3</td>
			<td>GCAAACGTCGGTAGGAGGGA</td>
			<td>GMGL3</td>
			<td>RMGL3</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: RDL 및 mGlutR1용으로설계된 가이드의 뉴클레오티드 서열.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59993/59993fig1a.jpg"> 그림 1: 항 RDL 항체의 특성화. (A)RDL 소단위의 회로도는, 분홍색 원이 C-종단에서 N-종단 및 펩티드 1(세포내 CVRFKVVVKKKHSKGGL-amide)에서 펩티드 2(세포외 CVNEQSYFHIATSNEINI-amide)의 국소화를 나타낸다. A에 삽입된 것은 상응하는 항 RDL 항체(항 RDL 펩1 및 항 RDL 펩2)로 처리된 꿀벌 뇌 추출물의 서쪽 얼룩에 있는 밴드를 나타낸다. 각 면역블롯은 RDL 소단위의 다양한 이소폼의 추정 중량에 상응하는 단백질 ~50-60 kD의 명백한 크기를 나타낸다. (B, C) 공액 펩티드 1을 가진 반대로 RDL 항체의 preadsorption. C의 이미지는 항체가 공액 펩티드 1로 미리 인양되었을 때 섹션의 염색 감소를 나타낸다. 부채형 몸체(Fb)와 타원체(eb)는 뇌의 중앙 복합 구조입니다. M = 버섯 몸체의 내측 엽. (D1-3) 대조군, 48시간 후 무주사 된 꿀벌 뇌 섹션의 안티 RDL 염색. (D2) 이 꿀벌은 주입되지 않았으며 ATTO550 형광을 포함하지 않습니다. (D3) D1 및 D3에서 이미지를 병합 . (E1-3) RDL-CRISPR-Cas9의 주입은 세포 핵에서 48 시간(E2)ATTO550 형광 후 항 RDL 염색을 감소시키는 성공적인 RDL-CRISPR-Cas9 전달을 나타냈다. (E3) RDL(녹색)과 ATTO550(빨간색)의 병합된 이미지입니다. 배율 막대 = 100 μm (B-E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59993/59993fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59993/59993fig2a.jpg"> 그림 2: 항 mGlutR1 항체의 특성화. (A)면역에 사용되는 드로필라 멜라노가스터 펩티드를 보여주는 GCPR mGluR의 회로도. 비교를 위해, 아피스 멜라이프라 펩티드는 아래와 같이 나타낸다. 원은 mGlutR1 수용체 세포외 도메인의 N-말기에서 펩티드의 국소화를 나타낸다. A에 삽입된 항-mGlutR1 항체는 알려진 이소폼의 추정 중량에 해당하는 꿀벌 뇌 ~103 kD 및 ~83 kD의 서쪽 블롯에서 두 개의 밴드를 인식한다는 것을 보여준다. (B, C) 안테나 로브 사구체의 연속2부에서 항mGlutR1 항체의 퍼디저프 제어. C의 안테나 사구체 섹션에서 항-mGlutR1 의 이미지는 항-mGlutR1 항체를 가진 항-mGlutR1 펩티드의 사전 인큐베이션의 결과로서 염색의 감소를 나타낸다. 이 절차는 항체가 B (예양에서 펩티드의 부재)와 비교하여 염색을 폐지하는 용액에서 침전시킵니다. (D1)중간 오셀루스에서 대조군 주사 후 꿀벌 뇌 슬라이스에서 항-mGlutR1의 염색을 나타낸다. 이 주사는 CRISPR-Cas9에 의한 mGlutR1 수용체의 노크를 가능하게 하는 mGlutR1 gRNA가 부족하여, 따라서 항-mGlutR1 항체의 염색이 감소되지 않았다(녹색). (D2) ATTO550 형광의 부재는 뇌에서 기능적 CRISPR-Cas9의 부재를 나타냅니다. (D3) 안티 mGlutR1 및 ATTO550의 병합 된 이미지. (E1-E3)는mGlutR1이 중앙 오셀루스에서 mGlutR1-CRISPR-Cas 9를 주사한 후 48시간 동안 영구적으로 쓰러진 뇌 섹션에서 안티-mGlutR1의 염색을 보여준다. 따라서, 많은 세포에서 mGlutR1의 성공적인 녹아웃으로 인해이 뇌의 얼룩이 크게 감소된다. (E2) 꿀벌 뇌의 많은 세포 핵에서 ATTO550 염색은 mGlut1-CRISPR-Cas 9의 주입이 성공적이었음을 나타냅니다. (E3) ATTO550 (빨간색) 및 안티 mGlutR1 (녹색)의 병합 된 이미지. 배율 막대 = 10 μm (B,C); 100 μm (D,E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59993/59993fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59993/59993fig3.jpg"> 도 3: 상응하는 RPN CRISPR-Cas9의 345 nL로 주사 후 48시간 동안 꿀벌 뇌에서 RDL 및 mGLUTR1 mRNA의 변형된 gDNA 및 mRNA의 발현을 평가한다. (a)수정 면적을 가진 gDNA의 양을 평가하기 위한 qPCR 기반 드롭오프 분석 시험을2-ΔΔCt 방법을 사용하여 계산하고, 주입되지 않은 뇌의 제어에 대해 정규화하였다. 데이터는 평균 + SD로 표현된다.(B)TheqRT-PCR 시험은 CRISPR-Cas9주입 및 무주입 꿀벌에서 mRNA의 양을 평가하는데 사용되었다. 암액틴은 기준 유전자로서 사용하였다. 상대유전자 발현은2-ΔΔCt 방법을 사용하여 계산하고, 주입되지 않은 뇌의 제어에 대해 정규화하였다. 데이터는 평균 + SE로 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59993/59993fig3large.jpg" target="_blank">표현됩니다.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59993/59993fig4a.jpg"> 그림 4: ATTO550 형광을 통해 꿀벌 뇌에서 RNP CRISPR-Cas9의 분포의 예. (A-D) 버섯 몸의 케년 세포에서 RNP RDL-CRISPR-Cas9를 발현한 4개의 다른 꿀벌의 뇌 섹션. (E, F) RNPmGlutR1 CRISPR-Cas9로 주사 한 후 두 개의 뇌 48 시간의 예. 배율 막대 = 150 μm (A-F). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59993/59993fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

여기서 제시된 프로토콜은 항체 특이성을 시험하기 위해 성인 꿀벌 뇌에서 단백질의 생산을 감소시키기 위한 CRISPR-Cas9 시스템을 사용하는 프로토콜이다.

CRISPR-Cas9를 사용하여 꿀벌 뇌 섹션에서 항 RDL 및 안티 mGlutR1 수용체 항체 테스트

Cluster Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) is a gene editing technique widely used in studies of ...

처음으로 우리는 성인 꿀벌 두뇌에 있는 뉴런의 하위 집합에 있는 ionotropic GABAA 및 대사위편 글루타민산체 수용체를 위해 코딩된 유전자의 수정을 설치했습니다. CRISPR-Cas9 유전자 편집은 통제된 실험실 조건하에서 학습및 기억에 있는 그들의 역할을 탐구하기 위하여 성인 꿀벌 두뇌에 있는 하나 또는 다중 유전자를 수정하기 위하여 이용될 수 있습니다. 이 방법은 성인 꿀벌에서 특정 단백질의 기능을 연구하고 해당 단백질에 대한 항체의 특이성을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다.이리나 시나케비치와 함께 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 온 레프 커츠만과 최현이 될 것이다. CRISPR-Cas9 주입 후 면역 세포화학 적 분석에 의한 RDL 및 mGlutR1의 발현을 테스트하려면 먼저 온라인 CRISPR-Cas9 도구를 사용하여 가이드 DNA 서열을 사용하여 가이드를 설계합니다. 각 가이드 RNA에 대한 RNA 복합 형성안내를 준비하고, 각 가이드 RNA의 이름으로 각 가이드에 대해 하나의 시험관을 라벨을 붙이고, 뉴클레오티드 프리 버퍼 92마이크로리터, 100개의 마이크로몰라 플루오로포어4개소리터, CRISPR RNA 를 표지된 4개의 마이크로리터, 각 튜브에 적합한 가이드 RNA 용액의 4마이크로리터를 추가한다.모든 재료가 추가되면 솔루션을 부드럽게 혼합하고 튜브 내용을 벤치 상단 원심분리기에서 5초 간 회전하여 용액을 퇴적시합니다. 그런 다음, 가이드 RNA 복합체를 만들고 실온에서 10 분 냉각을 만들기 위해 5 분 동안 섭씨 95도까지 용액을 유지하십시오. 리보뉴클레오단백질 복합체 형성을 준비하기 위해 각 가이드 RNA 용액의 6마이크로리터와 마이크로리터 SP-Cas9 뉴클레아아제 V3당 0.5 마이크로리터를 적절히 표지된 튜브에 첨가한다.부드러운 혼합 후, 10 분 동안 37섭씨37도에서 용액을 배양하여 주입을 위한 RNP 리보뉴클레오단백질 혼합물을 만들고, 배양의 끝에 각 리보뉴클레오단백질의 4개의 마이크로리터를 적절한 RDL에 첨가한다. 제어를 만들기 위해, 노 가이드 RNA 용액은 92 마이크로 리터의 완충제와 4 개의 마이크로 리터의 물과 트레이서 RNA의 4 마이크로 리터를 혼합합니다. 물을 첨가한 후, 용액을 섭씨 95도에서 5분간 유지하고 실온에 도달할 때까지 혼합물을 식히도록 합니다.그런 다음, 마이크로리터 Cas9 nuclease V3당 0.5 마이크로그램의 6개의 마이크로리터와 노가이드 RNA 용액의 6개의 마이크로리터를 혼합한다. 리보뉴클레오단백질 혼합물 주입의 경우, 캡에 작은 구멍이 있는 바이알에서 개별 꿀벌을 포획한 후, 얼음에 3분 이상 꿀벌을 고정시키고 각 꿀벌을 덕트 테이프로 이전에 준비된 금속 홀더에 고정시킵니다. 뒤쪽 흉부, 날개와 머리가 노출되어 있습니다. 5 밀리리터 주사기를 사용하여 더 이상 배가 고프지 않을 때까지 한 마리의 어금니 자당 용액으로 꿀벌을 먹이고, 습기를 위해 젖은 종이 타월이있는 상자에 고정 된 꿀벌을 놓습니다.다음으로, 35밀리리터 페트리 접시 두 개가 있는 뚜껑 안쪽에 왁스를 놓고 접시의 바닥을 왁스 위에 놓습니다. 각 접시의 커버와 바닥 사이에 어금니 자당 한 개를 주입하고, 한 잔의 유리 슬라이드와 흰색 상자에 먹이 페트리 접시 를 넣고 하나의 유리 슬라이드와 블랙 박스에 배치합니다. 그런 다음, 각 상자에 작은 빗을 놓고 RDL CRISPR-Cas9 혼합물로 미세 주입 시스템을로드합니다.RDL CRISPR-Cas9 주사의 경우, 리보뉴클레오프로틴 RDL 믹스의 345 나노리터와 함께 8마리의 꿀벌의 중앙값 오젤리를 주입한 다음, 꿀벌을 흑색 실험 상자에 방출하기 전에 하나의 어금니 자당으로 먹이를 넣습니다. 주사없이 컨트롤로 여덟 꿀벌의 두 번째 세트를 공급하고 흰색 제어 상자에 해제. 그런 다음 두 상자를 젖은 종이가 있는 폴리스티렌 용기에 넣고, 하루에 두 번 벌을 관찰하여 충분한 음식과 습도가 있는지 확인합니다.주입 후 48시간 후, 꿀벌을 얼음위에 30초 동안 고정시키고 가위를 사용하여 각 곤충을 참수합니다. 연기 후드에 해부 현미경 아래 PBS에서 4 %의 파라 포름알데히드에 머리를 배치하고, 신중하지만 신속하게 안테나, 화합물 눈, 상단 외골격을 제거하기 위해 바라커 홍채 가위를 사용합니다. 머리와 나머지 기관에서 엑소 스켈레톤의 나머지 부분을 제거하기 전에 머리가 10 분 동안 고정 솔루션에 앉을 수 있도록하십시오.그런 다음 각 뇌를 섭씨 4~8도에서 하룻밤 사이에 4%의 파라포름알데히드를 함유한 1.5밀리리터 미세센심분리기 튜브에 배치합니다. 다음 날 아침, 3.8 그램의 아르그로즈를 erlenmeyer 플라스크에 50 밀리리터의 증류수에 넣고 아르그로즈가 액화될 때까지 용액을 전자 레인지에 넣습니다. 3~4개의 고정 꿀벌 두뇌를 새로운 35mm 페트리 접시에 옮기고 티슈 페이퍼를 사용하여 과도한 고정을 제거합니다.조심스럽게 뇌에 액체 아르그로즈를 붓고 안테나 로브가 향하고 있도록 아르그로즈 내의 샘플을 방향을 지정합니다. 아르그로가 고화된 후, 메스를 사용하여 단일 뇌를 함유한 개별 적인 아르그로즈 블록을 잘라내고 소수성 메쉬 바닥과 600 마이크로리터의 PBS가 있는 바구니 1개가 담긴 24웰 플레이트의 각 웰을 채웁니다. 그런 다음, 각 아르그로즈 블록으로부터 뇌 조직의 70 마이크로미터 단면을 획득하기 위해 진동을 사용한다.단일 뇌의 섹션을 획득하는 것과 동일한 바구니의 메시에 배치합니다. 형광소로 섹션을 부착 한 후 공수 항체, 표준 프로토콜에 따르면, 장착 매체의 방울을 사용하여 단일 뇌의 섹션으로 각 슬라이드를 포함하고 형광 현미경 검사법에 의해 샘플을 시각화. 안티 RDL 야생 유형의 정면 섹션에서 신경 필 레이블, 하지만 CRISPR-Cas9 RDL 녹아웃 꿀벌 두뇌.항-mGlutR1 항체에 대해 유사한 특이성을 관찰했다. 이러한 대표적인, 정량적 PCR은 RDL CRIPSR-Cas9로 주입된 꿀벌 뇌의 시험을 중단하며, 형광의 상대적 감소는 샘플내의 수정된 가이드 DNA의 수에 대응하였다. mGlutR1 CRISPR-Cas9 주사 후, 가이드 DNA의 상대적 수정은 비 주입 꿀벌의 뇌에서 관찰 된 가이드 DNA에 비해 주입 된 꿀벌의 뇌에서 약 59 %였다.이러한 정량적 RT-PCR ina 별도 군에서 메신저 RNA RDL의 상대적 감소는 비주입 꿀벌의 RNA 수준에 비해 약 59%였으며, 주입된 꿀벌에서 메신저 mGlutR1 RNA의 상대적 감소는 약 53%였으며, 특히, 오셀리를 통한 RDL CRISPR-Cas9의 주사는 항상 많은 수의 뇌 세포에 도달하지 못할 수도 있다. 예를 들어, 이러한 제제에서는 8개 중 단 1개만 다른 꿀벌 뇌에 비해 많은 수의 뇌 세포에서 RDL CRISPR-Cas9를 가졌다. RDL CRISPR-Cas9는 프로토세레브럼의 세포 내에 집중되어 있지만 안테나 로브는 아닙니다.냉동 및 재냉동 RNA를 피하십시오. 꿀벌을 과도하게 식히지 않도록 주의하십시오. 바이알에서 움직이지 않는 중지가 되면 즉시 활용하십시오.이 기술은 버섯 본체및 꿀벌 행동에 중앙 복합체에 있는 억제 이오노로픽 및 대사위피 수용체의 감소의 효력을 연구하기 위하여 이용될 수 있습니다.

anti-rdl-anti-mglutr1-receptors-antibody-testing-honeybee-brain

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 프로토콜에서는, 우리는 동시에 꿀벌 두 개의 유전자 (더블 유전자 최저를) 억제 두 가지 전략에 대해 설명합니다. 그럼 우리는 꿀벌 미각 지각을 두 번 유전자 최저의 효과를 연구하는 코 확장 응답 (PER) 분석을 사용하는 방법을 제시한다.

꿀벌의 RNAi를 매개로 두 유전자 넉다운과 미각 지각 측정 (<em&gt; 아피스 mellifera</em&gt;)

최근 몇 년 동안, 살아있는 세포 기반 분석은 표면과 형태 적 항원에 대한 항체를 검출하기 위해 성공적으로 사용되어왔다. 여기서, 우리는 많은 환자 코호트의 분석을 가능 계측법 높은 처리량의 흐름을 사용하는 방법을 설명한다. 새로운 항체의 검출은 면역 매개 질환의 진단과 치료를 향상시킬 것입니다.

인간 혈청에있는 N-메틸-D-아스파 라진 산염 수용체 또는 도파민 2 수용체에 대한 항체를 검출하는 높은 처리량 유동 세포 계측법 세포 기반 분석

RNA in situ hybridization (ISH)는 세포와 조직에서 RNA를 시각화할 수 있습니다. 여기에서는 RNAscope ISH와 면역조직화학 또는 조직학적 염료의 조합을 사용하여 마우스와 인간 뇌 섹션에서 축삭돌기에 국한된 mRNA를 검출하는 방법을 보여줍니다.

고해상도를 사용하여 뇌 섹션에서 Axonally 지역화 된 mRNA를 검출<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드

CRISPR / Cas9 시스템은 과학계를 대상으로 게놈 편집에 액세스하고 저렴한 만들 수있는 가능성을 제공합니다. 이 프로토콜은 CRISPR / Cas9 시스템을 사용하여 관심의 유전자를 녹아웃 한 다음 성인 마우스 뇌에 stereotaxically을 주입합니다 바이러스를 만드는 방법을 설명하기위한 것입니다.

디자인, 포장, 높은 역가 CRISPR 레트로와 렌티 배달 정위 주입을 통해

이 원고는 자유 비행 꿀벌에 대한 간단한 비 침습적 방법뿐만 아니라 억제 꿀벌의 정확한 지역화 된 처리 수 있도록 더 많은 침략 변종을 포함, 꿀벌에 약리 에이전트를 관리하기위한 여러 프로토콜을 설명합니다.

절제된 자유 비행 꿀 꿀벌의 Neuropharmacological 조작,<em&gt; API를 mellifera이</em

이 논문은 digoxigenin (DIG) 표지 또는 바이오틴 표지 프로브를 사용하는 곤충 안테나에서 특히 낮은 수준으로 발현 된 Odorant Receptor (OR) 유전자 및 기타 유전자에 대해 상세하고 매우 효과적인 RNA in situ hybridization 프로토콜을 설명합니다.

RNA에 의한 Locust Antenna 내의 악취 수용체 유전자의 국산화<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드 화

꿀벌 두뇌의 다른 지역에서 phospholipase C (PLC)에 pharmacologic 에이전트의 억제 효과 테스트 하려면 우리는 그 지역에서 PLC 활동을 측정 하는 생 화 확 적인 분석 결과 제시. 이 분석 결과 PLC 활동 조직 들 뿐만 아니라 다른 행동을 전시 하는 꿀벌 들을 비교 하는 데 유용 수 있습니다.

꿀벌에서 두뇌 Homogenate에서 Phospholipase C 활동의 탐지

곤충 우사회성의 많은 특성은 식민지 내 의사 소통과 노동 분업에 의존합니다. 미세 주입 및 CRISPR 매개 돌연변이 유발을 통한 개미 배아의 주요 조절 유전자의 유전자 조작은 진사회적 곤충의 이타적 행동의 본질에 대한 통찰력을 제공합니다.

개미 하르페냐토스 염기 에서 CRISPR 매개 돌연변이 유발을 위한 배아 주사

여기에 제시 헬 리코파 armigera 의 프로토콜입니다 (Hübner) 태아 미세 주입 및 CRISPR / Cas9 게놈 편집에 의해 생성 된 녹아웃 돌연변이 식별. 돌연변이 곤충은 생체 내의 다른 유전자 들 사이에서 유전자 기능 및 상호 작용의 추가 연구를 가능하게 합니다.

CRISPR/Cas9 게놈 편집 헬리코파 아르미게라 의 배아 미세 주입 및 녹아웃 돌연변이 식별 (휘브너)

우리는 쥐 맥락막신경총에서 인슐린 수용체 이성질체 IR-A 및 IR-B를 매핑하기 위해 Duplex in situ hybridization assay를 구축하여 기존 방법의 한계를 극복했습니다. 이 고해상도 접근법은 동형(isoform) 특이적 발현을 밝혀 뇌 인슐린 신호전달에 대한 새로운 통찰력과 신경 장애에 대한 잠재적인 동형(isoform) 표적 치료에 대한 새로운 통찰력을 제공합니다.

RNA In Situ Hybridization Assay를 사용한 쥐 뇌의 인슐린 수용체 A 및 B의 정확한 시각화

여기에서는 증폭 준비 세포 용해, 재조합효소 중합효소 증폭 및 CRISPR/Cas12a 분석을 사용하여 Lotmaria passim 및 Nosema ceranae 와 같은 꿀벌 병원체에서 DNA를 검출하는 간단하고 빠른 절차를 설명합니다.

RPA/CRISPR/Cas12a 시스템과 결합된 알칼리 용해를 통한 트리파노소마티드 기생충 및 노세마 세라네 의 현장 DNA 검출

배우세요 CRISPR-Cas9 유전자 편집을 이용하여 성체 꿀벌 뇌에서 GABAA와 mGlutR1 수용체 발현을 조절하고 학습 및 기억에 관여하는 단백질 기능을 연구하는 방법입니다. 이 기술은 항체 특이성 검증에도 활용됩니다.

CRISPR-Cas9를 사용하여 꿀벌 뇌 섹션에서 항 RDL 및 안티 mGlutR1 수용체 항체 테스트

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