Name: 초적혈구 멜라노가스터의생존능력을 배아에서 성인으로 평가하는 직접적이고 간단한 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 s
Description: 배우세요 Drosophila 생존능력 평가 프로토콜로 배아부터 성인까지 모든 발달 단계에서 생존율을 측정합니다. 포도 아가 플레이트와 카이제곱 분석을 활용하여 유전형별 생존율을 비교하고 발달생물학 및 유전학 연구에 활용할 수 있습니다.

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우리의 일은 CFH와 NIH PA -12-149에 NIH 1R15GM1131-01에 의해 CFH에 투자됩니다.

1. 미디어 준비
<ol><li>제조업체의 지침에 따라 포도 한천을 준비하고 (재료 표참조) 35mm 페트리 접시에 반 가득 차게 붓습니다 (그림 5).  약 1시간 동안 굳어지도록 합니다. 포도 한천이 굳어진 후 즉시 사용하거나 4 °C에서 보관하십시오.</li>
	<li>작은 플라스틱 칼 (고르지 않은 표면에 누워 같은 파리)를 사용하여 한천 접시에 걸쳐 부드럽게 상처를긁지 않고 접시의 중간을 떠나십시오 (그림 5). 소량의 효모 페이스트(신선하게 만든 것; 재료 표참조)를 접시 중앙에 놓습니다(그림 5).</li>
</ol>2. 배아 수집 미니 케이지 설정
<ol><li>효모 페이스트로 보충된 포도 한천 플레이트를 포함하는 배아 수집 케이지 내부에 두 마리의처녀 암컷과 한 명의 젊은 남성을 사용하여 십자가를 설정한다(그림 5).</li>
	<li>24 시간 후, 한천 판의 바닥을 보고 케이지를 열지 않고 누워 배아에 대한 케이지를 검사합니다.  배아가 놓인 경우, 챔버에서 한천 판을 제거하고 현미경 관찰을 위해 습한 챔버안에 놓습니다 (그림 6).  며칠 동안 누워 있는 것이 득점되면(예: 다산/장수 검사) 사육 부모를 유지하고 설명된 대로 준비된 신선한 것으로 접시를 교체합니다. 24 시간 미만의 초기 수집은 수행 할 수 있지만 처녀 여성을 사용할 때, 그들은 자신의 강아지 케이스에서 등장 한 후 48 시간까지 누워있지 않을 것이라는 점에 유의하십시오.</li>
	<li>탈수를 피하기 위해 페트리 접시 뚜껑으로 배아를 포함하는 한천 판을 덮고 습한 챔버 안에 즉시 넣습니다(그림7). 해부 현미경으로 관찰하고 부화 된 배아와 L1을 기록하십시오.  모든 배아가 부화하여 L1 애벌레로 발전할 때까지 뚜껑을 교체하고습한 챔버에서 실온에서 보관하십시오(그림 6).</li>
</ol>3. 배아와 애벌레 를 세다
<ol><li>48 시간 후, 해부 현미경의 밑에 격판을 관찰하고 음식 유리병에 한천 디스크의 전송의 앞에 마지막으로 숫자를 기록합니다.  수정 /가능한 배아는 그때까지 L1이되어야합니다.  이송 전에 더 긴 잠복기가 가능하지만 플레이트가 수분을 잃기 시작할 수 있으며 한천이식품 바이알로의 깨끗한 전달을 손상시키는 균열이 발생할 수 있다는 점에 유의하십시오(그림 7).  플레이트가 수화 상태를 유지하고 배아 생존 능력이 손상되지 않도록 하기 위해 한천 표면에 직접 구스넥 라이트를 사용하지 마십시오(그림7E는 적절한 거리를 나타남).</li>
	<li>계산 한 후, 접시를 덮고 전송 할 준비가 될 때까지 습한 챔버에 저장합니다. 결과를 기록합니다.</li>
</ol>4. 포도 한천 디스크를 식품 유리병으로 옮겨 개발 중 생존 가능성을 모니터링합니다.
<ol><li>숫자가 기록되면 (부화 배아 / L1 / L2), 조심스럽게 제조 업체의 지침에 따라 제조 Drosophila 식품 미디어를 포함하는 35mm 디스크를 수용 할 수있을만큼 큰 유리병에 포도 한천 디스크를 전송하는 주걱을 사용 (의 목록을 참조 시약). 포도 한천 디스크L1쪽을 음식에 내려놓습니다(그림 7).  애벌레와 함께 한천 디스크를 음식 바이알로 옮은 후 빈 페트리 접시에 남아있는 유충을 조심스럽게 검사합니다 (그림7E).</li>
	<li>L2/L3 유충이 바이알의 음식에 가는 것을 관찰하기 위해 매일 거의 같은 시간에 매일 음식 바이알을 검사하는 일정을 설정합니다(그림 8).</li>
	<li>번데기와 성인 초파리의 수를 기록합니다(그림 9). 더 이상 성인이 관찰되지 않을 때까지 계산을 계속하고 다음 세대를 계산하지 마십시오 (첫 번째 성인을 관찰 한 후 9 일 지난 계산하지 마십시오).</li>
	<li>결과를 관찰하고 기록한다. 사용되는 돌연변이 스톡에 따라 배아 수집, 계수 및 기록의 시간 프레임을 조절한다.</li>
	<li>카이 스퀘어 분석을 수행합니다. null 가설은 성인의 수가 원래 기록되고 음식 바이알로 옮겨진 부화 된 배아의 수와 같을 수 있도록 100 % 생존 가능성을 가정합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Hartung, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+observations+on+the+larval+growth+rate+and+viability+of+two+tumor+strains+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Some observations on the larval growth rate and viability of two tumor strains of Drosophila melanogaster.</a> Science. 107 (2777), 296-297 (1948).</li>
<li>Moree, R., King, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+Studies+on+Relative+Viability+in+Drosophila+Melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Experimental Studies on Relative Viability in Drosophila Melanogaster.</a> Genetics. 46 (12), 1732-1752 (1961).</li>
<li>Da Costa, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viability+of+F1+and+F2+generations+of+crossed+Drosophila+and+Oregon+previously+adapted+to+2+different+nutrient+media%5BTitle%5D)+AND+%22Comptes+rendus+de+l%27Acad%C3%A9mie+des+Sciences%22%5BJournal%5D)">Viability of F1 and F2 generations of crossed Drosophila and Oregon previously adapted to 2 different nutrient media.</a> Comptes rendus de l'Académie des Sciences. 242 (1), 177-180 (1956).</li>
<li>Garcia-Dorado, A., Caballero, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mutational+rate+of+Drosophila+viability+decline%3A+tinkering+with+old+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">The mutational rate of Drosophila viability decline: tinkering with old data.</a> Genome Research. 8 (2), 99-105 (2002).</li>
<li>Lence, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((m6A+modulates+neuronal+functions+and+sex+determination+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">m6A modulates neuronal functions and sex determination in Drosophila.</a> Nature. 540 (7632), 304-318 (2016).</li>
<li>Haussmann, I. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((m%286%29A+potentiates+Sxl+alternative+pre-mRNA+splicing+for+robust+Drosophila+sex+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">m(6)A potentiates Sxl alternative pre-mRNA splicing for robust Drosophila sex determination.</a> Nature. 54 (7632), 301-304 (2016).</li>
<li>Stockwer, H., Gallant, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+started%3A+An+overview+on+raising+and+handling+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Getting started: An overview on raising and handling Drosophila.</a> Methods in Molecular Biology. 420, 27-44 (2008).</li>
<li>Hales, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+on+the+Fly%3A+A+Primer+on+the+Drosophila+Model+System%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetics on the Fly: A Primer on the Drosophila Model System.</a> Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).</li>
<li>Gardner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Variation+for+Preadult+Viability+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%22%5BJournal%5D)">Genetic Variation for Preadult Viability in Drosophila melanogaster.</a> Evolution. 55 (8), 1609-1620 (2001).</li>
<li>Hongay, C. F., Orr-Weaver, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Inducer+of+MEiosis+4+%28IME4%29+is+required+for+Notch+signaling+during+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Drosophila Inducer of MEiosis 4 (IME4) is required for Notch signaling during oogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14855-14860 (2011).</li>
<li>Zhong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MTA+Is+an+Arabidopsis+Messenger+RNA+Adenosine+Methylase+and+Interacts+with+a+Homolog+of+a+Sex-Specific+Splicing+Factor%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">MTA Is an Arabidopsis Messenger RNA Adenosine Methylase and Interacts with a Homolog of a Sex-Specific Splicing Factor.</a> The Plant Cell. 5, 1278-1288 (2008).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N6-methyladenosine+modification+destabilizes+developmental+regulators+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">N6-methyladenosine modification destabilizes developmental regulators in embryonic stem cells.</a> Nature Cell Biology. 16, 191-198 (2014).</li>
<li>Hsu, P. J., Shi, H., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitranscriptomics+influence+on+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Epitranscriptomics influence on development and disease.</a> Genome Biology. 18 (197), 1-9 (2017).</li>
<li>Kan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+m6A+pathway+facilitates+sex+determination+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The m6A pathway facilitates sex determination in Drosophila.</a> Nature Communications. 8, 1-16 (2017).</li>
<li>Senkowski, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Cell+Culture-Based+Screening+Identifies+the+Anthelmintic+Drug+Nitazoxanide+as+a+Candidate+for+Treatment+of+Colorectal+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Cell Culture-Based Screening Identifies the Anthelmintic Drug Nitazoxanide as a Candidate for Treatment of Colorectal Cancer.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 14 (6), 1504-1516 (2015).</li>
<li>Ramasamy, S., Bennet, D., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+and+bioactive+molecule+screening+based+on+a+bioelectrical+impedance+cell+culture+platform%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Drug and bioactive molecule screening based on a bioelectrical impedance cell culture platform.</a> International Journal of Nanomedicine. 9, 5789-5809 (2014).</li>
<li>Weltin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture+monitoring+for+drug+screening+and+cancer+research%3A+a+transparent%2C+microfluidic%2C+multi-sensor+microsystem%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Cell culture monitoring for drug screening and cancer research: a transparent, microfluidic, multi-sensor microsystem.</a> Lab on a Chip. 14 (1), 138-146 (2014).</li>
<li>Astashkina, A., Mann, B., Grainger, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+evaluation+of+in+vitro+cell+culture+models+for+high-throughput+drug+screening+and+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">A critical evaluation of in vitro cell culture models for high-throughput drug screening and toxicity.</a> Pharmacology & Therapeutics. 134 (1), 82-106 (2012).</li>
</ol>

이해 상충이 없습니다.

요약하면,이 방법은 Drosophila에서생존가능성에 대한 정확하고 간단한 평가를 제공합니다. 전체 프로토콜을 완료하는 데 약 14일이 걸립니다. 이 절차는 전문적인 기술 기술이 필요하지 않습니다. 그러나 적절한 타이밍, 일일 관찰 일정 및 신중한 한천 이송은 정확성과 재현성을 위해 중요합니다.
식품 바이알에서 포도-한천 디스크 배아측을 아래로 배치하는 것 외에도, 절차의 또 다른 중요한 단계는 배아 수집 미니 케이지로부터 포도 한천 플레이트를 제거한 후 48시간 이상 음식 바이알로 한천 디스크를 이송하는 것입니다. 48 시간 후에 한천을 옮기는 것은 한천 디스크의 탈수로 인해 배아 및 유충 손실을 초래했습니다. L2/L3 전환을 계산하려면 플레이트가 72시간 동안 배양해야 합니다. 이 단계가 중요한 경우, 포도 한천 접시를 두껍게 부어야하고 습한 챔버는 탈수 방지를 위해 사용해야합니다. 십자가는 35mm 판을 수용하는 배아 수집 케이지에 설치되었다; 그러나, 이 절차는 60 mm 또는 100 mm 페트리 플레이트를 수용하는 것과 같은 더 큰 배아 수집 케이지를 사용하여 수행 될 수있다.  그런 다음 식품 병은 그 크기를 수용 할 수있을만큼 커야합니다.
이 프로토콜에 추가할 수 있는 단계가 있습니다. 위에서 언급했듯이 L2/L3 전환은 필요한 시간과 한천의 잠재적 탈수로 인해 플레이트에서 정량화하기가 어렵습니다. 또한, 애벌레는 한천의 표면에 매우 이동이될, 정확하게 그들을 계산하는 도전을 포즈. 30 분 동안 냉장고에 접시를 배치하거나 L2 / L3 유충을 계산하기 전에 한천의 표면에 가벼운 마취제 (리도카인 용액)의 몇 방울을 추가하면 더 정확하게 계산하기 위해 자신의 움직임을 느리게 할 수 있습니다.  이러한 수정에 주의해야 할 점은 변수(감기 민감도, 마취 감도)를 도입하고 실행 가능성 결과를 혼동할 수 있다는 것입니다.  이러한 단계 없이도, 색깔음식을 사용하여, 연구원은 pupation를 시작하기 위하여 음식 유리병의 측에 정착할 때 방황하는 L3s/prepupae를 정량화할 수 있습니다. 이 방법에 대한 제한은 배아 수집 케이지에서 십자가를 설정하기 위해 PHENOTyping을 위해 CO2로 마취되는 생존을 위해 십자가에 사용되는 성인을 필요로한다는 것입니다. Dm ime4 동형접합체 돌연변이 남성은 CO2 치료에서 깨어난 후 잘 회복되고 몇 시간 후에 죽지 않는다.  선별을 위해 성인을 고정시키는 다른 방법은 몇 분 동안 냉장고에 바이알을 넣은 다음 바이알을 분쇄된 얼음으로 옮겨 이동을 늦추고 빠르고 효율적으로 분류하는 것과 같은 방법을 탐색할 수 있습니다.
이 방법은 알릴 수 있는 강점과 생존 가능성에 미치는 영향을 비교하는 것 외에도 정의된 제약 화합물에 대한 민감도 또는 저항성을 스크리볼에 사용할 수 있습니다. 세포 배양15,16,17,18에서화합물 독성을 가리는 다른 방법과 달리이 방법은 전체 유기체를 사용하여 발달 효과를 쉽게 분석 할 수 있습니다. 요약하면, 이 프로토콜 및 그 안에 수정을 사용하여, 초경 적 생존력, 여성, 불임, 수명 및 기간에 대한 환경 요인 및 화학 화합물의 효과뿐만 아니라 알레르적 강도를 측정 할 수 있습니다. 개발 주기.

수명은 유전및 비유전적 요인에 의해 영향을 받습니다. 실온의 표준 실험실 성장 조건에서, 우리 실험실은 동일한 조건에서 재배된 다른 Dm ime4 대립구체 들 사이에서 체력과 생존율의 상당한 변화를 관찰했습니다 (그림1 및 보충수치). 생존성 연구는 인구 유전 연구에서 특정 대말류 조합 또는 성장 상태의효과를 조사하기 위해 자주 수행된다 1,2,3,4. 그러나, 돌연변이의 비 보완적인 단 내의 생존의 상세한 분석은 과학 문헌에서 찾아내기 어렵습니다. 대립계종종은 일반적으로 연구원이 균형 잡힌 주식5,6을수용하는 음식 유리병 내의 그 대립 구균에 대한 몇 가지 개인 동형접합을 발견하면 "필수적이지 않은"이라고 표시됩니다. 그러나, 정확한 카이스퀘어 분석은 이러한 동형접합체가 예상되는 멘델리안 비율에서발생하는지 여부를 평가하기 위한 5,6. 모든 Drosophila 주식에 대한 가장 허용 온도는 실온 (22-23 °C)이며, 적절한 영양소와 함께, 야생 형파리의 수명 주기는 7,8을완료하는 데 약 12 일이 걸립니다. 야생형 초파리의 각 발달단계의 지속기간이 7,8로 알려져 있기 때문에, 이 보고서에 기재된 방법은 연구 중인 초파리 균주가 각 단계에 적합한지 여부를 조사하는데 사용될 수 있다. 테스트 된 유전 적 배경에 적합한 대조군과 비교하십시오. 개발 9의 한 특정 측면에 초점을맞춘 연구와는 달리,이 프로토콜은 다른 발달 단계에서 생존가능성을 평가하는 실용적인 방법을 제공합니다.
우리의 실험실에서, 이 프로토콜은 Meiosis 4(Dm ime4)의Drosophila 유도제에 대한 결핍 주식의 생존가능성을 평가하는 데 사용됩니다. Dm ime4는 Drosophila 및 그밖 다세포 유기체에 있는 RNA 물질 대사에 있는 중요한 역할을 가진 RNA 메틸 트랜스퍼라제를 부호매이는 필수적인 유전자 10,5, 6,10, 11세 , 12세 , 13세 , 14세 . CRISPR/Cas9(보충 수치)를 통해 생성된 Dm ime4의 새로운 대립유전자를 신속하게 평가하기 위해, 균형 잡힌 주식의 바이알 내에서 생성된 성인 자손만 을 계산하는 종점 생존성 분석이 수행되었다(도1). 사용 된 주식의 일부는 이전 DM ime4 보고서5,6에설명되었다 . 동형접합체 돌연변이체는 카이스퀘어 분석(그림1 및 보충물질)에 의해 결정된 바와 같이, 아멘델리안 수준에서 나타났다. 예상보다 낮은 숫자가 누워있는 배아의 수가 적거나 부화된 배아가 적거나 L1/L2 또는 번데기의 생존 력 상실로 인한 것인지 를 평가하기 위해추적을 확장하여 각 발달 단계에 대한 카운트를 포함시켰습니다(그림 2) 그림3, 그림4, 그림5, 그림6, 그림7, 그림 8및 그림9).
여기서, 야생형(OreR) 파리를 이용한 방법을 설명한다. 경험적으로 다른 유전 적 배경이나 Drosophila 종과 함께 사용하기 위해이 방법을 테스트하려면, 우리는 참조로 OreR을 사용하고 실험 유기체에 따라 시간을 조정하는 것이 좋습니다.  프로토콜은 이형 Dm ime4 돌연변이 스톡5,6 (도 4)에서 남성과 처녀 야생형 암컷을 교차시킴으로써 생성된 자손의 생존가능성을 평가하기 위해 추가로 평가되었다.

<table><tbody><tr><td>곰팡이 방지 첨가제</td><td>Carolina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beaker</td><td>Fisher Scentific</td><td>S76100J</td><td>Beaker</td></tr><tr><td>벤치 마크 과학 디지털 핫 플레이트</td><td>The Lab Depot</td><td>H3760H</td><td>핫 플레이트</td></tr><tr><td>포도 한천 및 인스턴트 플라이 식품을 준비하기위한 브리타 여과 수돗물</td><td>모든 수돗물 여과 시스템</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 권총 또는 FlyNap</td><td>성충 파리를 분류/계수하는</td> <td>Carolina</td><td></td> 마취제</tr><tr><td>해부 현미경/입체경</td><td>Amscope</td><td>SM-1TSZ-V203</td><td>해부 현미경</td></tr><tr><td>Drosophila 배양 바이알 및 스토퍼</td><td>Carolina</td><td>173120</td><td>Drosophila</td></tr><tr><td>Embryo collection 미니 케이지</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-105</td><td>챔버 사용 배아 수집</td></tr><tr><td>삼각 플라스크</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>70980</td><td>삼각 플라스크</td></tr><tr><td>포뮬러 4-24 인스턴트 Drosophila 매체, 블루</td><td>캐롤라이나</td><td></td><td>https://www.carolina.com/drosophila-fruit-fly-genetics/formula-4-24-drosophila-medium-blue/FAM_173210.pr</td></tr><tr><td>포도 한천</td><td>Genesee Scientific</td><td>47-102</td><td>한천 플레이트에 사용되는 미디어</td></tr><tr><td>인스턴트 플라이 홍수</td><td>캐롤라이나</td><td>173210</td><td>식품 바이알</td></tr><tr>용 블루 미디어<td colspan="4">대형 페트리 접시 또는 투명한 용기는 배양 중/현미경 관찰 전후 관찰 중에 포도 한천 플레이트를 촉촉하게 유지하기 위해 젖은 종이 타월을 놓아 습한 챔버로 사용합니다</td></tr>. <tr><td>금속 주걱 (작은)</td><td>캐롤라이나</td><td></td><td></td></tr><tr><td>전자레인지</td><td>Any</td><td></td><td>포도 한천</td></tr><tr><td>페트리 접시</td>를 요리하려면 <td>Kord-Valmark</td> 포도 한천 교반 막대 용 <td>2901</td><td>페트리 접시</td></tr><tr><td></td><td>The Lab Depot</td><td>58948-981-EA</td><td>마그네틱 교반 막대</td></tr></tbody></table>

초적혈구 멜라노가스터의생존능력을 배아에서 성인으로 평가하는 직접적이고 간단한 방법

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

Drosophila melanogaster에서,생존성 시험은 특정 유전 배경의 적합성을 결정하기 위하여 이용됩니다. 말기 변형은 개발의 다른 단계에서 생존의 부분적 또는 완전한 손실을 초래할 수 있습니다. 우리의 실험실은 완전히 성숙한 성인에 태아에서 Drosophila에 있는 생존을 평가하는 방법을 개발했습니다. 이 방법은 부화 된 배아로 시작하여 개발 중에 다른 단계에서 존재하는 자손의 수를 정량화하는 데 의존합니다. 배아가 정량화된 후에는 L1/L2, 번데기 및 성숙한 성인을 포함하여 추가 단계가 계산됩니다. 모든 단계를 검토 한 후, 카이 스퀘어 테스트와 같은 통계 분석은 자손 (부화 배아)의 시작 수와 관찰 된 성인 의 수에서 절정에 이르는 후기 단계 사이에 유의한 차이가 있는지 여부를 결정하는 데 사용됩니다. 따라서 null 가설을 거부하거나 수락합니다 (부화 된 배아의 수는 개발 단계에 걸쳐 기록 된 애벌레, 번데기 및 성인의 수와 동일합니다). 이 분석의 주요 장점은 기술적 인 오류로 인한 손실을 피하기 위해 배아 헹죄가 식품 바이알로 옮길 필요가 없기 때문에 단순성과 정확성입니다. 여기에 설명된 프로토콜은 L2/L3 애벌레를 직접 검사하지는 않지만 이를 설명하기 위해 추가 단계를 추가할 수 있습니다. 부화한 배아, L1, pupae 및 성인의 수를 비교하면 추가 연구를 위해 L2/L3 단계에서 생존가능성이 손상되었는지 확인하는 데 도움이 될 수 있습니다(유충을 시각적으로 식별하는 데 도움이 되는 유충의 사용). 전반적으로, 이 방법은 Drosophila 연구원 및 교육자가 비행 수명 주기 도중 생존이 손상되는 때 결정하는 것을 도울 수 있습니다. 이 분석종을 사용하여 주식의 일상적인 평가는 본래 돌연변이가 적중에 영향을 미치는 경우에 특히, 원래 고립된 돌연변이의 표현형에 영향을 미칠 수 있는 이차 돌연변이의 축적을 방지할 수 있습니다. 이러한 이유로, 우리의 실험실은 우리의 Dm ime4 alleles의 각의 다중 사본을 유지하고 정기적으로 다른 분자 분석 이외에이 방법으로 각 주식의 순도를 확인합니다.

이 방법은 정확하고 재현할 수 있도록 한 사람이 카이 스퀘어 분석에 결합 할 때 출현 성인에 배아에서 생존력을 측정 할 수 있습니다.
초기 연구에서, 배아와 애벌레를 계산한 후, 포도 한천은 바이알의 측면에 똑바로 세워진 바이알 내부에 놓였다. 불행히도, 한천이 바이알의 측면에 놓였을 때 많은 배아와 애벌레가 성인에게 성숙하지 않았다. 이것은 포도 한천 디스크가 건조되기 때문일가능성이 있습니다 (그림 3). 이 배치는 결과를 혼동할 수 있는 환경 변수(한천 디스크의 수화)를 도입했습니다. 성인의 61%만이 나타났기 때문에 자손의 약 39%가 태아에서 성인으로 사라졌습니다. 가장 큰 손실은 L1 애벌레 (포도 한천 접시의 표면에 계산) 및 pupae 사이 발생 (음식 유리병의 벽에 계산) 카운트. 그러나, 포도 한천을 음식 표면과 직접 접촉하여 바이알 내부에 향하게 하였을 때, 자손의 6% 미만이 손실되었다(도 2). 한천은 전체 포도 한천 디스크가 바이알 내부의 인스턴트 식품의 수분과접촉하는 상태로 유지됨에 따라 수분을 유지하였다(그림 7, 도8). 이러한 결과는 유리병 내부의 한천 위치가 신뢰할 수 있는 데이터를 얻고 환경 변수의 기여를 최소화하는 데 중요하다는 것을 나타냅니다. 방법의 효과를 뒷받침하는 추가 데이터는 초기 방법 검증에 사용되는 야생형 자손을 비교하여 수집하였으며, 균형 잡힌 Dm ime4 돌연변이 스톡으로부터 처녀 야생형 암컷을 수컷으로 교차시킴으로써 생성된 자손과 초기 방법 검증에 사용되어 수집되었다. 보충 그림2, ime4Δnull/TM3sb). 자손의 약 91%가 야생형으로부터의 자손의 94%에 비해 성인기로 성숙하였다(도 4).  이러한 차이는 통계적으로 유의하지 않았다.
동형 접합부 Dm ime4 돌연변이 수컷5는 또한 방법의 추가 검증을 제공하기 위해 사용되었다. 그러나, 동형접합부 돌연변이는 배아가 증착되기 전에 재생하기에 너무 아팠고 죽었다. 그러므로, 실험의 1개의 제한은 수컷이 추적하기 위하여 시작 태아 인구를 생성하기 위하여 재생산할 수 있을 만큼 건강할 필요가 있다는 것입니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59996/59996fig1.jpg"> 그림 1 : Dm ime4 돌연변이 주식은 하위 멘델리안 수준에서 나타난다. 촉매 도메인 또는 Ado-Met 바인딩 도메인의 일부가 돌연변이된 주식이 표시됩니다(자세한 내용은 추가 도 1 참조). 일부 주식은 Ala (알라닌 스캐닝 돌연변이)로 대체 된 도메인의 일부를 가지고 있었고 다른 주식은 도메인 중 하나 또는 두 개의 도메인을 삭제했습니다. 예상 된 숫자에 대한 동형 접합체의 관찰 된 수의 비율은 백분율로 표시됩니다 (이형 형제 컨트롤과 비교하여 정렬 체계 및 카이제곱 분석에 대한 보충 그림 3을 참조하십시오). 카이 스퀘어 분석은 관찰과 예상 사이의 차이가 통계적으로 유의하고 우연만으로는 아닌지 결정하기 위해 수행되었습니다(p-값 &lt; 0.01). 오류 막대는 평균의 표준 오차를 나타냅니다(표시된 교차당 최소 3개의 예심).  모든 데이터가 있는 스프레드시트는 보충 자료에서찾을 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59996/59996fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59996/59996fig2.jpg"> 그림 2 : 바이알 내부의 한천 위치는 의도하지 않은 환경 변수를 유발할 수 있습니다. 포도 한천 디스크 배아 측에서 식품 유리병 또는 음식 유리병의 측면에 한천에서 아래로 계산 개발의 다른 단계에서 개인의 수의 히스토그램. 한천 디스크 배아측을 바이알에 내려 놓으면 성인기까지 생존한 초기 배아의 94%(SD±0.02)를 초래하였다. 한천을 음식 바이알의 측면에 놓으면 성인기에 이르는 원래 계산된 배아의 61%(SD±0.07)만 발생하였다. 모든 데이터가 있는 스프레드시트는 보충 자료에서찾을 수 있습니다. 각 단계에서 예상된 숫자는 음식 바이알로 옮기기 전에 포도 한천 디스크에 계산된 배아/L1의 초기 수로 설정됩니다(Null 가설: 부화한 배아의 100%가 발생함). 관찰된 숫자는 표시된 발달 단계에 대해 계산된 개인의 실제 수입니다. 따라서, 각 단계는 포도 한천 판상에 카운트된 부화배아의 초기 수와 비교된다. Chi square 분석은 관찰과 예상 사이의 차이가 통계적으로 유의하고 0.05의 p-값 임계값을 사용하여 우연히 만으로 인한 것이 아닌지 결정하기 위해 수행되었습니다. 그 차이는 음식 바이알의 측면에 한천으로 자란 배아에 대해 유의했지만, 디스크 배아 측에서 자란 배아에게는 중요하지 않았습니다. 오류 막대는 표준 오차를 나타냅니다(표시된 교차당 최소 3개의 예심). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59996/59996fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59996/59996fig3.jpg"> 그림 3 : 배아/L1을 운반하는 포도 한천 디스크를 음식 바이알 내부에 두는 방법을 보여주는 만화. 음식 바이알에서 한천의 위치에 기초하여 배아의 총 수와 성인 자손 사이에 유의한 차이가 있었다. 차이는 음식 바이알 내부의 디스크 배치의 차이에 의해 생성 된 환경 변수 (수화)에서 유래 : 한천 때 애벌레와 번데기 카운트에서 예상과 관찰 된 숫자 사이의 통계적으로 유의한 차이가있다 디스크는 한천 디스크가 음식과 접촉했을 때 예상 된 수치와 관찰 된 수치에서 유의한 차이가 없는 대 바이알의 측면에 배치되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59996/59996fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59996/59996fig4.jpg"> 그림 4 : Dm ime4 돌연변이 균형 주식에서 야생 형 남성 대 남성에서 개발의 다른 단계에서 개인의 수를 보여주는 히스토그램. 균형 잡힌 수컷은 2.1에 설명된 대로 처녀 야생형 암컷으로 넘어갔다.  한천은 배아측을 음식용 바이알로 옮겼다.  야생형 X형에서 포도한천디스크로 계수된 본래 배아로부터 출현하는 성인의 평균 비율은 94%, SD±0.02였으며, Dm ime4 돌연변이체/+ X 야생형에 대한 비율은 91%, SD±0.01이었다. 도 2에 대해 기재된 바와 같이 통계분석을 수행하였습니다. 두 그룹 모두 차이가 중요하지 않았습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59996/59996fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59996/59996fig5.jpg"> 그림 5 : 실험적 설정. (A) 배아 컬렉션 미니 케이지와 포도-한천 미니 페트리 요리. 플레이트는 탈수를 방지하기 위해 습한 챔버 (물로 포화 흡수 성 종이 디스크가있는 표준 페트리 접시) 내부에 배치됩니다.  소량의 효모 페이스트를 각 포도 한천 접시의 중앙에 놓았습니다.  (B) 배아 수집 플레이트 홀더 뚜껑(빨간색)을 분리하고 준비된 접시, 효모 쪽을 위로 놓습니다.  (C) 십자가를 배아 케이지로 옮기고 즉시 페트리 접시 뚜껑을 놓아 파리를 안으로 넣습니다.  (D) 덮개를 빠르게 제거하고 배아 케이지를 뒤집어 서 접촉을 접지하여 포도-한천 접시를 분리합니다.  매일 검사, 24-48 시간 동안 배양. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59996/59996fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59996/59996fig6.jpg"> 그림 6 : 포도한천 접시에 배아 개발. (a) 포도-한천 미니 페트리 접시에 증착된 야생형 배아는 해부 현미경으로 계산된다. 시각화하지 않을 때는 접시를 습한 챔버 내부에 보관하고 탈수방지를 위해 직접 빛을 피하십시오.  (B) 포도-한천 플레이트는 습한 챔버에 보관되고 부화된 야생형 배아가 기록된다.  이 사진은 A에 표시된 배아에서 개발된 3개의 야생형 L1 애벌레를 보여줍니다.  (C) 도5에 도시된 두 판에 대한 배아(1일째) 및 L1 애벌레(2일째)의 기록된 수의 예.  null 가설에 대한 "예상 수"는 식품 바이알로 이송될 때 부화하고 L1 유충이 된 배아의 수에 의해 결정된다(아래 표).  야생형 파리의 경우, 거의 모든 배아가 부화하여 L1 유충으로 발전합니다.  이것은 그밖 유전 배경에 대한 경우되지 않을 수 있고 이 방법은 생존가능성에 있는 이 다름을 결정하기 위하여 이용됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59996/59996fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59996/59996fig7.jpg"> 그림 7 : 유충 이송.  (A) L1 카운트를 기록한 후, 포도-한천 디스크는 깨끗한(에탄올 닦아낸) 주걱(B,C)을이용하여 페트리 접시에서 조심스럽게 제거하고 D에 도시된 바와 같이 L1을 옆으로 옮기고 바이알에식품을 접촉한다.  (E) 빈 페트리 접시는 신중하게 남아있는 애벌레를 감지하기 위해 검사된다.  남은 유충이 살아 있고 음식 바이알로 옮길 수 있다면, 신중하고즉시 (F).  남은 애벌레가 죽었거나 전송할 수 없는 경우 이 사실을 기록하여 후속 계산을 위해 "예상 수"를 수정합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59996/59996fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59996/59996fig8.jpg"> 그림 8 : L2 애벌레가 음식으로 들어갑니다. 포도 한천 디스크와 블루 푸드 사이의 틈새와 홈을 참조하십시오.  매일, 바람직하게는 하루 중 같은 시간에 바이알을 관찰하는 일정을 설정합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59996/59996fig8large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59996/59996fig9.jpg"> 그림 9 : 성인의 출현. (A) L3 애벌레는 음식에서 빠져 나와 강아지가 됩니다.  (B) 성인은 11일째에 등장하기 시작합니다.  매일, 바람직하게는 하루 중 같은 시간에 바이알을 관찰하고 신중하게 관찰을 기록하는 일정을 설정합니다.  모든 pupae가 나타났을 때 계산을 중지 (빈 pupae 의 경우 계산) 및 15 일에 실험을 중지하여 파리의 다음 세대를 계산하지 않도록하고 죽은 강아지를 계산 (검은 / 말린 번데).  수명 주기가 긴 돌연변이는 경험적으로 결정해야 하는 더 긴 기간이 필요할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59996/59996fig9large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
추가 수치. 이 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59996/Supplemental_Figures.zip" target="_blank">파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>  
보충 자료. 이 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59996/Supplemental_Materials.zip" target="_blank">파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 프로토콜은 배아에서 성인에 이르기까지 모든 발달 단계에서 Drosophila의 생존 가능성을 평가하기 위해 고안되었습니다. 이 방법은 상이한 유전자형 또는 성장 조건의 생존 가능성을 결정하고 비교하는 데 사용될 수 있다.

In Drosophila melanogaster, viability assays are used to determine the fitness of certain genetic backgrounds. Allelic variations can result in partial or ...

이 분석의 주요 장점은 음식 유리병으로 옮기기 위해 배아 헹이 필요 없이 기술적 오류로 인한 손실을 피하기 때문에 단순함과 정확성입니다. 이 프로토콜에는 전문적인 기술 기술이 필요하지 않습니다. 그러나 적절한 타이밍과 신중한 물 전달은 정확성과 재현성에 중요합니다.이 절차를 시연하는 것은 안토니오 록웰, 내 실험실에서 최근에 졸업 박사 과정 학생이 될 것입니다. 시술을 시작하기 전에 35mm 페트리 접시에 포도 향을 부어 반으로 가득 차서 한 시간 동안 한천을 고체할 수 있습니다. 한천이 고화되면 작은 플라스틱 칼을 사용하여 접시 바깥쪽 주변의 한천 표면을 부드럽게 긁어 내며 접시 의 중간에 긁힘이 없도록 합니다.그런 다음 소량의 갓 준비된 효모 페이스트를 접시 중앙에 놓고 접시를 배아 컬렉션 미니 케이지에 넣습니다. 배아 수집을 위해, 24 시간 동안 수집 케이지 안에 있는 2명의 처녀 Drosophila 암컷 및 1개의 젊은 남성. 다음 날, 배아를 찾기 위해 한천 판의 바닥을 검사합니다.배아가 놓인 경우, 한천판을 습한 챔버로 옮기고 탈수를 피하기 위해 뚜껑으로 접시를 덮습니다. 며칠 간의 누워서 점수를 매겨야 한다면, 새로운 한천 판을 컬렉션 케이지에 넣습니다. 현미경을 사용하여 부화배와 L1 애벌레의 수를 결정하고, 모든 배아가 부화하고 L1 애벌레로 발전할 때까지 실온에서 습한 챔버로 배아를 반환한다.48 시간 후에, 부화배와 L1 애벌레의 수를 계산하고 조심스럽게 페트리 접시에서 포도 화서의 디스크를 제거하기 위해 주걱을 사용하여 디스크를 수용 할 수있을만큼 큰 음식 유리병에 음식에 디스크 L1 측면을 배치합니다. 그런 다음 페트리 접시를 조심스럽게 검사하여 남은 애벌레를 검사합니다. L2와 L3 애벌레가 음식에 그들의 방법을 만드는 관찰될 수 있다는 것을 확인하기 위하여 매일 대략 같은 시간에 매일 음식 유리병을 감시합니다.더 이상 성인이 관찰되지 않고 후속 세대를 계산하지 않도록 계속, 강아지와 성인 Drosophila의 수를 기록합니다. 그런 다음 치 스퀘어 분석을 수행합니다. null 가설은 성인의 수가 원래 기록되고 음식 유리병으로 옮겨지는 부화 배아및 L1의 수와 같을 수 있도록 100%의 생존가능성을 가정합니다.한천이 유리병의 측면에 놓일 때, 많은 배아와 애벌레가 포도 한천 디스크 탈수로 인해 성인에게 성숙하지 않습니다. 포도 한천이 유리병 내부에 직접 접촉하여 유리병 내부에 얼굴을 아래로 두면, 한천이 유리병 내부의 인스턴트 식품의 수분과 접촉하면서 수분을 공급하기 때문에 자손의 6% 미만이 전형적으로 손실됩니다. 야생형 및 돌연변이 자손 발달을 비교하는 대표적인 실험에서, 돌연변이 자손의 약 91%가 야생형 파리의 자손의 94%에 비해 이 방법을 사용하여 성년으로 성숙하였다.식기 디스크 배아 쪽을 음식 병으로 옮은 다음 빈 페트리 접시를 확인하여 옮겨지지 않은 남은 애벌레를 확인하십시오. 또 다른 중요한 단계는 탈수방지를 위해 배아 컬렉션 미니 케이지에서 포도 한천 판을 제거한 후 48시간 이상 식품 유리병에 한 천 디스크를 옮기는 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

Drosophila의 hemocytes은 개발 배아의 전체를 통해 분산. 이 프로토콜은 찬란 표시된 hemocytes와 배아를 사용하여 이러한 마이 그 레이션을 마운트 및 이미지하는 방법을 보여줍니다.

라이브 영상 Drosophila melanogaster 배아 Hemocyte 마이 그 레이션

과학자들은 초파리 수명 프로토콜을 사용하여 다양한 실험 조건이 파리의 수명에 어떤 영향을 미치는지 측정하고 그 과정에서 생존 곡선을 생성하여 실험 결과를 정량화합니다. 샘플 프로토콜은 17-α-에티닐에스트라디올(EE2)과 같은 다양한 농도의 내분비 교란 물질 화학 물질(EDC)에 대한 노출이 수명에 미치는 영향을 연구하기 위해 적용되는 분석을 특징으로 합니다.

Drosophila melanogaster의 수명 프로토콜: 파리 수명의 차이를 식별하기 위한 생존 곡선 생성

Drosophila melanogaster는 장수 규제의 분자 기초를 탐험하기위한 강력한 모델 생물이다. 이 프로토콜은 재현, 장수뿐만 아니라 잠재적 인 함정의 인구 기반의 측정 방법과 그들을 피하기 위해를 생성하는 단계에 대해 설명합니다.

의 수명 측정<em&gt; Drosophila melanogaster</em

정자 경쟁의 능력에 대한 평가의 차이<em&gt; 초파리</em

개발 Drosophila의 배아에 작은 분자의 도입은 신규 화합물, 약물 및 독성 물질의 생물학적 활성의 특성뿐만 아니라 기본적인 발달 경로를 프로빙을위한 큰 잠재력을 제공합니다. 설명하는 방법은 여기에 초파리 배아 모델의 유틸리티를 확대,이 방법 자연 장벽을 극복 단계를 설명합니다.

의 Permeabilization의 방법<em&gt; 초파리</em작은 분자 활동의 분석 실험을위한&gt; 태아

내분비 파괴 물질 (EDC)은 유기체와 자연 환경에 심각한 문제를 나타냅니다. 드로소필라 멜라노가스터는 생체 내에서 EDC 효과를 연구하는 이상적인 모델을 나타낸다. 여기에서, 우리는 Drosophila에 있는 내분비 중단을 조사하는 방법을 제시합니다, fecundity에 EDC 효력을, 비옥, 발달 타이밍 및 비행의 수명을 해결하.

초파리 멜라노가스터에서 내분비 장애를 테스트하는 방법

혈액-뇌 장벽 무결성은 신경계 기능에 매우 중요합니다. Drosophila melanogaster에서는,혈액 두뇌 방벽은 늦은 배아 발생 도중 신경교 세포에 의해 형성됩니다. 이 프로토콜은 D. melanogaster 태아 및 제 3 instar 애벌레에 있는 혈액 두뇌 방벽 대형 및 유지보수를 위한 분석하는 방법을 기술합니다.

초파리 멜라노가스터의 혈액-뇌 장벽 무결성에 대한 분석

여기에서는 기존의 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경을 사용하여 초고해상도 이미징을 달성하기 위해 초기 초파리 배아에서 확장 현미경을 구현하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

초고해상도 이미징을 위해 확장 현미경을 사용하여 전체 마운트 초파리 배아를 물리적으로 확대

이 프로토콜은 액체 배지를 사용하여 성인 Drosophila melanogaster의 생존 가능성에 대한 화학 독성 물질의 영향을 평가하는 효율적이고 저렴한 방법을 설명합니다.

성인 Drosophila Melanogaster의 화학적 독성 평가

여기에서 우리는 모델 유기체 C. elegans를 사용하여 배아 생존력과 생산된 배아(새끼)의 총 수를 결정하는 일반적인 방법을 제시합니다.

Caenorhabditis elegans의 배아 생존력 및 무리 크기 측정

배우세요 Drosophila 생존능력 평가 프로토콜로 배아부터 성인까지 모든 발달 단계에서 생존율을 측정합니다. 포도 아가 플레이트와 카이제곱 분석을 활용하여 유전형별 생존율을 비교하고 발달생물학 및 유전학 연구에 활용할 수 있습니다.

초적혈구 멜라노가스터의생존능력을 배아에서 성인으로 평가하는 직접적이고 간단한 방법

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