Name: 인간과 마우스 심근 표본에서 대식세포 하위 세트 및 기질 세포의 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: 학습하세요 효소 소화법을 이용해 인간과 마우스 심근에서 대식세포 및 기질 세포를 분리하는 방법을. 3시간 내에 단일 세포 현탁액을 준비하여 심장 면역 세포 이질성과 심혈관 질환 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 프로젝트는 워싱턴 대학의 아동 발견 연구소와 세인트 루이스 아동 병원 (CH-II-2015-462, CH-II-2017-628), 반스 유대인 병원 재단 (8038-88), NHLBI (R01)에서 제공하는 기금으로 가능했습니다. HL138466, R01 HL139714). K.J.L.은 NIH K08 HL123519 및 버로우스 웰컴 펀드(1014782)의 지원을 받고 있습니다.

제시된 프로토콜은 세인트 루이스 기관 검토 위원회 (#201305086)에있는 워싱턴 대학에 의해 승인되었습니다. 모든 피험자는 샘플 수집 전에 정보에 입각한 동의를 제공하고 실험은 승인된 연구 프로토콜에 따라 수행됩니다. 제시된 프로토콜은 워싱턴 대학 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인으로 수행되며 실험실 동물의 관리 및 사용을 위한 NIH 가이드에 설명된 지침을 따릅니다.
1. 인간 심장 조직 표본의 준비
<ol><li>왼쪽 및 오른쪽 관상 동맥 오스티아를 캐뉼로 심은 심장을 씻어 내고 200 mL의 차가운 식염수로 주입하십시오.</li>
	<li>LVAD 에피카디얼 용기를 캐뉼링하여 LVAD 정점 코어티를 세척하고 50 mL의 차가운 식염수를 주입합니다.</li>
	<li>멸균 가위를 사용하여 차가운 식염수 또는 HBSS에서 좌심실의 상피 또는 측면 벽으로부터 조직 시편을 해부합니다.</li>
	<li>조심스럽게 미세 가위를 사용하여 표본에서 후두 지방과 chordae tendineae을 해부.</li>
	<li>멸균 블레이드 또는 가위를 도움으로 약 200mg의 무게로 조직 덩어리를 해부하십시오.</li>
</ol>2. 마우스 심장의 준비
<ol><li>CO2 질식 또는 자궁 경부 탈구에 의해 마우스를 안락사.</li>
	<li>날카로운 가위의 도움으로 가슴 구멍을 엽니 다. 무딘 지혈을 사용하여 심장을 위쪽으로 들어 올립니다. 5 mL 주사기에 부착 된 25 G 바늘을 사용하여 차가운 PBS로 심장을 침전시하십시오. 심장이 희미해 진 것 까지 만드십.</li>
	<li>심장을 제거하고 얼음에 멸균 페트리 접시에 놓습니다.</li>
</ol>3. 단세포 현탁액의 준비
<ol><li>인간의 심장 조직 덩어리 (~200 mg) 또는 무린 심장을 멸균 페트리 접시에 놓습니다. 멸균 블레이드 나 가위를 사용하여 조직을 잘게 다듬습니다.</li>
	<li>소화 설정:<ol>
<li>인간의 심장 조직 덩어리 당 3 mL의 최종 소화 볼륨을 사용 하 여 (200 mg) 또는 1 murine 심장 당. 최종 효소 농도는 다음과 같습니다: 콜라게나제1 (450 U/mL), DNase1 (60 U/mL), 히알루로니다제 (60 U/mL).</li>
		<li>각 소화 반응에 대해 DMEM과 모든 효소를 15 mL 원엽 튜브에 추가합니다. 깨끗한 집게의 도움으로, 각 반응 튜브에 미세하게 다진 조직을 배치합니다. 부드러운 소용돌이로 잘 섞어보시다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>37°C에서 1시간 동안 소화하여 낮은 또는 중간 교반 속도로 설정된 교반기에서.</li>
	<li>소화 1 시간 후, 인큐베이터에서 튜브를 꺼내 얼음위에 놓습니다. 상단에 40 μm 세포 스트레이너와 50 mL 원점 튜브를 설정합니다. 효소 비활성화 (ED) 완충액2 mL로 필터를 적시다.</li>
	<li>각 소화 관에 ED 버퍼 8 mL를 추가 하 여 소화 효소를 비활성화 합니다. 이어서 생성된 13 mL 총 혼합물을 40 μm 세포 스트레이너를 통해 50 mL 원점 튜브에 부어 넣는다. 샘플을 신선한 15 mL 원추형 튜브로 다시 옮김. 이것은 최적 세포 펠릿을 가능하게 하고 원심분리 도중 세포 손실을 극소화합니다.</li>
	<li>샘플을 400 x g에서 6분 동안 회전시다(4°C로 설정된 원심분리기). 0.5 mL의 미디어를 남기는 상급체를 폐기하십시오. 부드러운 파이펫팅으로 세포 펠릿을 다시 중단하고 ACK 라시스 버퍼 1 mL을 추가합니다. 튜브를 부드럽게 소용돌이시키고 실온에서 5 분 동안 배양하여 적혈구 (RBC) 용해를 수행합니다.</li>
	<li>ACK 버퍼에서 5분 후에 9mL의 DMEM을 샘플에 추가합니다. 뚜껑을 다시 튜브에 다시 놓고 튜브를 부드럽게 뒤집어 혼합하고 40 μm 셀 스트레이너를 통해 필터링합니다. 15 mL 원엽 튜브에서 여과액을 수집합니다.</li>
	<li>튜브를 400 x g에서 6 분 동안 원심 분리하고 상한체를 버립니다.</li>
	<li>FACS 버퍼 1mL를 추가하고 펠릿을 다시 일시 중단합니다. 이어서 FACS 버퍼에서 세포를 1.5 mL 마이크로원지소지 튜브로 옮김을 전달한다. 원심분리기는 다시 400 x g에서 5분 간. 상급체를 버리고 FACS 버퍼의 100 μL에서 펠릿을 다시 놓습니다. 단일 세포 현탁액은 이제 항체 염색을 위한 준비되었습니다.</li>
</ol>4. 항체 염색
<ol><li>일반적인 인간 항체 패널은 다음과 같은 항체로 구성됩니다: CD45-PercpCy5.5, CD14-PE, CD64-FITC, HLA-DR-APC/Cy7, CCR2-APC. 표 1을참조하십시오. 모든 항체를 1:50 희석시에 심장 시료에 첨가하고 어둠 속에서 4°C에서 ~30-40분 동안 배양한다. 아래 4.4 단계로 진행하십시오.</li>
	<li>기질 세포 (내피 세포, 섬유 아세포, 평활근 세포)의 경우 DRAQ5 (최종 농도 1 μM) 및 CD45-percpCy5.5를 추가하십시오. 표 1을참조하십시오. 어둠 속에서 4 °C에서 30 분 동안 배양하십시오. 아래 4.4 단계로 진행하십시오.</li>
	<li>뮤린 심장 대식세포의 경우 CD45-PercpCy5.5, CD64-APC, MHCII-APC/Cy7, CCR2-BV421 및 Ly6G-FITC와 같은 항체를 추가합니다. 표 2를참조하십시오. 모든 항체를 1:100 희석에서 심장 샘플에 추가하고 어둠 속에서 4 °C에서 ~ 30-40 분 동안 배양합니다. 아래 4.4 단계로 진행하십시오.</li>
	<li>FACS 버퍼에서 샘플을 두 번 세척합니다. 각 세척시, FACS 버퍼 1 mL을 추가하고, 부드럽게 소용돌이, 원심분리기를 5분 동안 400 x g에 넣고, FACS 버퍼 350 μL로 다시 중단하고 DAPI(1 μM, 최종 농도)를 추가합니다. 이제 샘플이 FACS 분석/정렬에 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>

<ol><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+abundant+tissue+macrophage+population+in+the+adult+murine+heart+with+a+distinct+alternatively-activated+macrophage+profile%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An abundant tissue macrophage population in the adult murine heart with a distinct alternatively-activated macrophage profile.</a> PLoS One. 7 (5), e36814(2012).</li>
<li>Hulsmans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+facilitate+electrical+conduction+in+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Macrophages facilitate electrical conduction in the heart.</a> Cell. 169 (3), 510-522 (2017).</li>
<li>Hulsmans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+macrophages+promote+diastolic+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cardiac macrophages promote diastolic dysfunction.</a> Journal of Experimental Medicine. 215 (2), 423-440 (2018).</li>
<li>Aurora, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+are+required+for+neonatal+heart+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Macrophages are required for neonatal heart regeneration.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1382-1392 (2014).</li>
<li>Lavine, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+macrophage+lineages+contribute+to+disparate+patterns+of+cardiac+recovery+and+remodeling+in+the+neonatal+and+adult+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16029-16034 (2014).</li>
<li>Epelman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+and+adult-derived+resident+cardiac+macrophages+are+maintained+through+distinct+mechanisms+at+steady+state+and+during+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation.</a> Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).</li>
<li>Leid, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primitive+embryonic+macrophages+are+required+for+coronary+development+and+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Primitive embryonic macrophages are required for coronary development and maturation.</a> Circulation Research. 118 (10), 1498-1511 (2016).</li>
<li>Bajpai, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+heart+contains+distinct+macrophage+subsets+with+divergent+origins+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">The human heart contains distinct macrophage subsets with divergent origins and functions.</a> Nature Medicine. 24 (8), 1234-1245 (2018).</li>
<li>Dick, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-renewing+resident+cardiac+macrophages+limit+adverse+remodeling+following+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Self-renewing resident cardiac macrophages limit adverse remodeling following myocardial infarction.</a> Nature Immunology. 20, 29-39 (2019).</li>
<li>Nahrendorf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+healing+myocardium+sequentially+mobilizes+two+monocyte+subsets+with+divergent+and+complementary+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions.</a> Journal of Experimental Medicine. 204 (12), 3037-3047 (2007).</li>
</ol>

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이 프로토콜은 인간 심근으로부터 다양한 대식세포 서브세트를 추출할 수 있게 한다. 이 프로토콜은 간단하며 FACS 분석을 위해 준비된 단일 셀 현탁액을 준비하는 데 3~4시간이 걸립니다. 프로토콜은 수행하기가 비교적 간단하지만 가변성을 최소화할 수 있는 특정 기술적 측면을 고려해야 합니다. 첫째, 최적의 세포 생존을 위해 인간 조직과 적시에 작업하는 것이 필요합니다. 세포 사멸을 최소화하기 위해 조직을 차가운 식염수/HBSS에 보관하는 것이 중요합니다. 또한 심근 시편에서 상피 지방 및 기타 결합 조직을 제거해야합니다. 일관된 조직 다듬기 및 소화 시간은 샘플 변이에 대한 샘플을 감소시게 됩니다.
조직 소화 및 후속 세포 수율에 있는 intra 분석 및 교차 분석 가변성이 둘 다 있습니다. 이것은 조직에서 단 하나 세포 현탁액을 준비에 있는 제한의 한개입니다. 이를 최소화하는 가장 중요한 방법은 효소가 비교적 새롭고 적절하게 aliquoted되고 -80 °C에 저장되도록하는 것입...

대식세포는 심장에서 가장 풍부한 면역세포 유형을 나타내며, 심장 손상1,2,3,4에이어 강력한 염증 및 회복 반응을 생성하는 데 중요한 역할을 한다. 이전에, 우리 그룹은 뚜렷한 발달 기원5,6에서파생된 뮤린 심혼에 있는 대식세포의 2개의 중요한 부세트를 확인했습니다. 광범위하게, 조직 상주 심장 대식세포 서브세트의 뚜렷한 집단은 CCR2의 세포 표면 발현에 기초하여 확인될 수 있다(C-C 모티프 케모카인 수용체 2). CCR2- 대식세포(세포 표면 발현: CCR2- MHCII낮고 CCR2- MHCII높음)는배아 기원(원시및 적혈구 계보)이며, 자가 갱신할 수 있고, 동압 조건 하에서 지배적인 집단을 나타낸다. 상주 CCR2+ 대식세포는 확실한 조혈 기원이며, 순환 단핵구로부터의 모집을 통해 유지되며, 항상성 조건하에서 소집단을 나타낸다. 기능적으로, CCR2- 대식세포는 최소한의 염증을 생성하고 관상 동맥 발달 신생아 심장 재생에 중요하다5,7. 대조적으로, CCR2+ 대식세포는 심장 모욕에 따라 강력한 염증 반응을 개시하고 부수적인 심근세포 손상, 좌심실의 불리한 리모델링 및 심부전진행에 기여한다8,9.
최근, 우리는 인간 심근이 또한 CCR2- 또는 CCR2+8로유사하게 확인된 대식세포의 2개의 별개의 부집합을 포함한다는 것을 보여주었습니다. 유전자 발현 및 기능적 분석은 인간 CCR2- 및 CCR2+ 대식세포가 기능적으로 서로 다른 서브세트를 나타내며, 마우스 심장에서 발견되는 CCR2 + 대식세포와 기능적으로 유사하다는 것을 밝혀냈습니다. 인간CCR2- 대식세포는 IGF1, PDGF, Cyr61 및 HB-EGF를 포함한 강력한 수준의 성장 인자를 표현합니다. CCR2+ 대식세포는 IL-1b, IL-6, CCL-2, CCL-7 및 TNF-a와 같은 염증을 촉진하는 케모카인 및 사이토카인에서 풍부하게 함유된다. 자극된 CCR2+ 대식세포는 배양에서 염증성 사이토카인 인터류킨-1β(IL-1β)의 현저하게 높은 수준을 분비한다. 이 분부 집합이 어떻게 달리 조직 수선에 기여하고 심장 상해의 맥락에서 좌심실 (LV) 개조는 적극적인 연구의 지역 남아 있습니다.
마우스와 인간의 심장에서 대식세포 이질성의 흐름 세포 분석 기반 분석은 심장 조직을 소화하고 단일 세포 현탁액을 생성하고 대량 RNA 시퀀싱/단일 세포 RNA 시퀀싱 또는 기능성 분석과 같은 추가 하류 프로세스에 대한 세포 선별을 생성해야 합니다. 뮤린 하트에서 단일 세포 현탁액을 만들기위한 원래 프로토콜은 Nahrendorf 외. 200710에서Nahrendorf 그룹에 의해 처음 보고되었다. 우리의 실험실은 인간의 심근에서 대식세포를 추출하기 위해 프로토콜을 조정하고 수정했습니다. 동일한 프로토콜을 사용하지만 염색 및 게이팅 방식에서 약간의 변형으로,CD45-인간 심근으로부터의 기질 세포도 수확될 수 있다. 여기에 제시된 텍스트 및 비디오에서, 인간 심근으로부터 대식세포 또는 기질의 추출을 위해 일상적으로 수행되는 프로토콜이다.
심장 조직 견본은 확장된 심근병증 (DCM: 특발성 또는 가족) 또는 허혈성 심근병증 (ICM)을 겪고 있는 좌심실 보조 장치 (LVAD) 이식 또는 심장 이식을 가진 성인 환자에게서 얻어진다. 심이식 심질 또는 LVAD 코어는 소화 절차를 시작하기 전에 차가운 식염수와 함께 혈관이 심어져 있습니다. 흉터 또는 지방 조직 침투의 정도에서 결정 된 조직 표본의 "품질"은 대식세포의 수율에 크게 영향을 미칠 수 있음을 유의하는 것이 중요합니다. 흉터의 넓은 지역을 가진 심혼 견본은 훨씬 더 낮은 세포 수율을 가질 것이고 원하는 다운스트림 분석 방법 체외 세포 배양을 요구할 때 심각한 기술적 한계를 제기할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>15 mL 코노칼 튜브</td><td>Thermo Fisher</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>40 &마이크로; m 세포 여과기</td><td>Thermo Fisher</td><td>50-828-736</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 원뿔형 튜브</td><td>Thermo Fisher</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>ACK 용해 버퍼</td><td>Gibco</td><td>A10492-01</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>시그마</td><td>A2058</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소 1</td><td>시그마</td><td>C0130-1G</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>써모 피셔</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 1x</td><td>Gibco</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>DNAse 1</td><td>Sigma</td><td>D4527-20KU</td><td></td></tr><tr><td>DRAQ5</td><td>Thermo Fisher</td><td>62251</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0.5 M pH 8</td><td>Corning</td><td>46-034-CI</td><td></td></tr><tr><td>효소 비활성화 완충액</td><td></td><td></td><td>490 mL HBSS, 10 mL FBS, 1 g BSA</td></tr><tr><td>FACS 완충액</td><td></td><td></td><td>976 mL PBS, 20 mL FBS, 4 mL EDTA (0.5 M)</td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td><td>Gibco</td><td>A3840201</td><td></td></tr><tr><td>집게</td><td>VWR</td><td>82027-406</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 1x</td><td>Gibco</td><td>14175-079</td><td></td></tr><tr><td>지혈제</td><td>VWR</td><td>63042-052</td><td></td></tr><tr><td>히알루로니다아제 타입 1-s</td><td>시그마</td><td>H3506-500MG</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>Gibco</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td>172931</tr><tr><td>면도날</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>가위</td><td>VWR</td><td>82027-578</td><td></td></tr></tbody></table>

인간과 마우스 심근 표본에서 대식세포 하위 세트 및 기질 세포의 분리

Isolation of Macrophage Subsets and Stromal Cells from Human and Mouse Myocardial Specimens

대식세포는 심장에서 가장 이질적이고 풍부한 면역 세포 집단을 나타내며 심장 손상 후 염증 및 회복 반응을 유도하는 데 핵심적입니다. 어떻게 대식 세포의 다양 한 하위 집합 심장 부상 후 면역 반응을 조율 연구의 활성 영역. 여기에 제시된 간단한 프로토콜은 우리 실험실이 건강하고 병들인 개인에게서 얻은 마우스와 인간 심근 표본에서 대식세포의 추출을 위해 일상적으로 수행하는 간단한 프로토콜입니다. 간략하게, 이 프로토콜은 항체 염색, 및 유세포 측정에 선행된 단 하나 세포 현탁액을 생성하기 위하여 심장 조직의 효소 소화를 관련시킵니다. 이 기술은 대량 및 단세포 RNA 시퀀싱뿐만 아니라 정렬된 세포에서 수행되는 기능성 분석법에 적합합니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 단순성, 최소한의 일일 변동 및 다양한 마우스 모델 및 인간 질병 개체에 대한 대식세포 이질성에 대한 조사를 허용하는 광범위한 적용성입니다.

기재된 프로토콜은 마우스와 인간 심근으로부터 대식세포의 분리를 허용한다. 동일한 프로토콜을 사용하지만, 다른 염색 및 게이팅 전략을 사용하여, 기질 세포는 또한 인간 심근으로부터 수확될 수 있다. 여기에 제시된 FACS 결과는 BD LSRII 또는 BD FACS ARIA III 플랫폼에서 획득되었습니다. 보정 제어는 스테인드 비장 세포에서 단일 색상 제어 샘플에서 생성되었다. 도 1은 처리되지 않은 인간 LVAD 코어를 나타낸다. 도 2는 CCR2-및 CCR2+인간 대식세포의 유동 선별을 위한 게이팅 방식을 나타낸다. 도3A는 CD45-인간 심근으로부터의 기질 세포및 도 3</strong...

여기서 제시된 프로토콜은 효소 소화를 통해 단일 세포 현탁액을 준비시킴으로써 인간 및 마우스 심근으로부터 대식세포 및 기타 비면역 세포의 다양한 서브세트를 분리하는 프로토콜이다. 유세포분석 기반 식별 및 절연 대식세포의 특성화를 위한 게이팅 방식도 제시된다.

Macrophages represent the most heterogeneous and abundant immune cell populations in the heart and are central in driving inflammation and reparative ...

심혼은 심장 염증과 수리에 있는 중요한 역할을 하는 면역 세포의 이기질 인구를 포함합니다. 면역 세포의 이질성을 이해하고 기능에 대한 추가 통찰력을 얻기 위해서는 심장에서 이러한 세포의 회복을 허용하는 방법이 있는 것이 중요합니다. 이 기술은 건강하거나 병에 걸린 심혼에 있는 면역성 세포 다양성뿐만 아니라 면역성 세포 다양성을 밝히는 것을 도울 수 있습니다.이 기술에는 세 가지 주요 장점이 있습니다. 첫째, 3시간 이내에 다양한 셀 유형의 단일 셀 서스펜션 생성을 이끄는 간단한 단일 워크플로우입니다. 둘째, 그것은 실행 가능한 면역 및 비 면역 세포 집단의 높은 회복으로 이끌어 냅니다.셋째, 매우 다재다능한 방법이며 다른 종의 심장 조직에도 적용할 수 있습니다. 단일 소화 반응에 사용되는 조직의 양에주의를 기울이는 것이 중요합니다. 멸균 가위를 사용 하 여, 차가운 식염수 또는 HBSS에서 왼쪽 심실의 정액 또는 측면 벽에서 해부 조직 표본.시편에서 정성 지방과 코르자인 건음을 조심스럽게 해부합니다. 멸균 블레이드 나 가위의 도움으로, 약 200 밀리그램의 무게 조각으로 조직 덩어리를 해부. 마우스를 안락사한 후 날카로운 가위의 도움으로 가슴 구멍을 엽니다.무딘 헤모스타츠를 사용하여 심장을 위쪽으로 들어올립니다. 5 밀리리터 주사기에 부착 된 25 게이지 바늘을 사용하여 차가운 PBS로 심장을 퍼퓨즈하십시오. 심장이 희미해 나타날 때까지 퍼퓨즈.심장을 제거하고 멸균 페트리 접시에 얼음에 놓습니다. 멸균 페트리 접시에 인간의 심장 조직 덩어리 또는 뮤린 심장 200 밀리그램을 놓습니다. 멸균 블레이드 나 가위를 사용하여 조직을 미세하게 다진다.소화를 설정하려면 15 밀리리터 원추형 튜브에서 모든 인간 심장 조직 덩어리 또는 효소 콜라게나제 I, DNase I 및 hyaluronidase를 밀리리터 당 450, 60 및 60 단위의 농도로 모든 인간 심장 조직 덩어리 또는 한 개의 뮤린 심장에 대한 3 밀리리터의 최종 소화 볼륨을 준비합니다. 튜브에 DMEM2.5 밀리리터를 추가합니다. 깨끗한 집게의 도움으로, 각 반응 튜브에 미세하게 다진 조직을 배치합니다.부드러운 소용돌이로 잘 섞으세요. 흔들리는 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 1시간 동안 소화하여 낮은 중간 교반 속도로 설정합니다. 소화 한 시간 후, 인큐베이터에서 튜브를 꺼내 얼음에 놓습니다.위에 40 미크로넨 세포 여과기를 가진 50 밀리리터 원원형 튜브를 설치합니다. 두 밀리리터의 효소 비활성화 버퍼로 필터를 적시다. 다음으로, 각 소화 관에 완충제 비활성화 효소의 8 밀리리터를 추가하여 소화 효소를 비활성화합니다.그런 다음 40 마이크로론 세포 여과기를 통해 총 혼합물의 결과 13 밀리리터를 50 밀리리터 원내 튜브에 붓습니다. 여과된 샘플을 신선한 15 밀리리터 원추형 튜브로 다시 전달합니다. 샘플을 섭씨 4도에서 6분간 400배 g로 회전합니다.미디어의 0.5 밀리리터를 떠나 상수 폐기. 부드러운 파이펫팅으로 셀 펠릿을 다시 중단하고 ACK 리시스 버퍼 1밀리리터를 추가합니다. 튜브를 부드럽게 소용돌이치며 실온에서 5분 동안 배양하여 적혈구 용액을 수행합니다.ACK 버퍼에서 5분 후 샘플에 9밀리리터의 DMEM을 추가합니다. 뚜껑을 튜브에 다시 넣고 튜브를 부드럽게 반전하여 혼합합니다. 40 미크론 세포 여과기를 통해 필터링하고 15 밀리리터 원내 튜브에서 여과를 수집합니다.튜브를 400배 g에서 6분간 원심분리하고 상체를 폐기합니다. FACS 버퍼 1밀리리터를 추가하고 펠릿을 다시 놓습니다. 그런 다음 1.5 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브로 옮김합니다.원심 분리기는 5 분 동안 400 배 g에서 다시 합니다. 상체를 버리고 FACS 버퍼의 100 마이크로 리터에서 펠릿을 다시 중단하십시오. 단일 세포 현탁액은 이제 항체 염색을 위한 준비가 되었습니다.1~50개의 희석시 심장 샘플에 전형적인 인체 항체 패널을 추가합니다. 기질 세포와 뮤린 심장 대식세포에 다른 항체를 사용하십시오. 어둠 속에서 섭씨 4도에서 30~40분 동안 배양하세요.FACS 버퍼 1밀리리터, 부드럽게 소용돌이, 원심분리기를 400배 g에서 5분간 추가합니다. 이 세탁 단계를 두 번째로 반복하십시오. 그런 다음 FACS 버퍼의 350 마이크로 리터에서 샘플을 다시 중단하고 하나의 마이크로 몰러의 최종 농도에 도달하기 위해 DAPI를 추가합니다.이제 샘플은 FACS 분석을 위한 준비가 되었습니다. 이 프로토콜에서는 마우스와 인간 심근으로부터 대식세포의 분리가 이루어졌다. 이 그림은 처리되지 않고 처리된 인간 LVAD 코어를 보여줍니다.인간 심근병증으로부터의 CD45 음성 기질 세포뿐만 아니라 인간 심근증으로부터의 CCR2 음성 및 CCR2 양성 인간 대식세포의 유량 분류를 위한 게이팅 방식이 제시되었다. 라이트 스테인드 FACS의 이미지는 CD45 양성 및 CD45 음성 세포를 정렬생존가능성을 나타내는 그대로 세포막을 보여줍니다. 마우스 심장에서 대식세포를 정렬하는 게이팅 계획도 성공적이었습니다.효소 반응에 사용되는 조직의 무게는 효율적인 소화에 매우 중요합니다. 프로토콜에 표시된 효소 농도에 대해 200 밀리그램 이하의 조직을 사용하지 않습니다. 이 방법에 따라, 세포는 시험관 내 자극 암시를 위해 배양될 수 있다.세포는 벌크 RNA 염기서열 분석 또는 단하나 세포 염기서열분석용으로 분류될 수 있다. 이 방법은 건강하거나 병에 걸린 인간의 심장에 존재하는 이전에 인식할 수 없는 대식세포 이질성을 발견하는 데 귀중한 기술역할을 해 왔습니다. 단일 세포 시퀀싱 다음에이 방법을 사용 하 여, 다양 한 면역 및 비 면역 세포 는 어떻게 다양 한 면역 및 비 면역 세포 건강 한 심장 대 질병 심장에서 다양 한 발견 하기 위해 진행.

isolation-macrophage-subsets-stromal-cells-from-human-mouse

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

우리는 인간 대 식세포의 세대를위한 간단하고 효율적인 프로토콜을 제시한다. 버피 코트는 이중 밀도 구배 원심 분리에 의해 처리되고 격리 된 단핵구는 테프론 코팅 된 세포 배양 가방에서 대 식세포로 분화된다. 이 대 식세포의 수율을 극대화하고 다음 실험을 위해 세포 수확을 용이하게한다.

인간의 두 그라데이션 원심 분리하여 단핵구와 테프론 코팅 세포 배양 가방에서 대 식세포로 분화의 분리

우리는 근섬유아세포 표현형을 가진 쥐와 인간 식도 기질 세포의 1차 배양을 생성하는 프로토콜을 제시합니다. 배양된 세포는 방추체 모양의 형태를 가지고 있으며 α-SMA 및 비멘틴을 발현하며 상피, 조혈 및 내피 세포 표면 마커가 없습니다. 특성화된 기질 세포는 상피-기질 상호 작용의 기능적 연구에 사용할 수 있습니다.

마우스 및 인간의 식도에서 근섬유 아세포의 분리

인간의 심장 조직 심근 재생에 적합 할 수있는 다 능성 혈관 주위 전구체 세포 집단을 항구. 주연 세포와 CD34 + CD146 - - 외막 세포, 인간 심근에서 여기에 설명 된 기술은 원시 혈관, 즉 CD34 + CD146와 연관된 두 능성 간질 세포 집단의 동시 분리 및 정제를 허용한다.

인간의 심장 조직에서 혈관 주위 능성 전구체 세포 집단의 분리

이 프로토콜 수 있습니다 격리 하 고 특성화 연구원 조직 상주 다양 한 세포 특징 염증된 조직 변화 무질서의 다이어트 유발 모델에서 추출.

절연, 특성화 및 비만 관련 염증에 의해 영향을 받는 조직에서 세포의 정화

이 문서에서는, endomyocardial bioptic 샘플의 arrhythmogenic 심장 근육 병 증 환자에서 심장 mesenchymal stromal 세포를 분리 하는 방법을 제공 됩니다. 그들의 특성 및 그들의 adipogenic 차별화를 강화 하는 프로토콜을 설명 합니다.

절연 및 Endomyocardial Bioptic 샘플의 Arrhythmogenic 심장 근육 병 증 환자에서 심장 중간 엽 기질 세포의 특성

이 통신 격리와 인간에서 치경 대 식 세포의 문화에 대 한 방법론 및 실험적인 목적을 위한 murine 모델에 설명합니다.

고립과 Murine 인간과 치경 대 식 세포의 생체 외에서 문화

이 프로토콜 격리, 식별 하 고 안정 된 상태 또는 염증 동안 쥐의 심근에 있는 면역 세포를 계량 하는 간단 하 고 효율적인 방법을 제공 합니다. 프로토콜은 cytometry에 의해 더 분석 될 수 있는 단일 세포 현 탁 액의 세대에 대 한 효소 및 기계적 소화를 결합 합니다.

절연 및 심장의 Extravascular 면역 세포의 식별

우리는 그들의 생물학 과 치료 잠재력의 기본적인 연구 그리고 조사를 위한 뮤린 심장 pericytes를 격리하고 정화하는 프로토콜을 설치했습니다.

뮤린 심장 pericytes의 격리 및 정화

단일 성인 마우스 심장의 심실과 심실 모두에서 심근세포 및 비근구의 동시 절연을 위한 방법이 설명된다. 이 프로토콜은 매우 실행 가능한 심장 심근세포 및 비 근구세포의 일관된 수율을 초래하고 페노티핑 및 체외 분석을 위한 최적의 세포 별 배양 조건을 자세히 설명합니다.

성인용 마우스 심장에서 심방 심근 세포, 심실 심근 세포 및 비근구의 동시 격리 및 문화

이 프로토콜은 유세포 분석을 위한 여러 막 결합 마커의 염색을 통해 지방 세포에서 고품질 RNA를 얻는 방법론과 SVF-대식세포의 표현형을 포함하여 단일 공정에서 인간 내장 지방에서 생존 가능한 지방 세포 및 기질 혈관 분획-SVF 세포를 분리하기 위한 효율적인 콜라겐분해효소 분해 방법을 제공합니다.

RNA 분석 및 대식세포 표현형에 적합한 인간 내장 지방 조직에서 생존 가능한 지방 세포 및 기질 혈관 분획 분리

여기에 제시된 프로토콜은 마우스 심장의 동방 결절 (SAN) 및 방실 결절 (AVN) 영역으로부터 심장 상주 대 식세포를 분리하기위한 단계별 접근법을 제공한다.

쥐 동방과 방실 결절에서 상주 심장 대 식세포의 분리 및 배양

학습하세요 효소 소화법을 이용해 인간과 마우스 심근에서 대식세포 및 기질 세포를 분리하는 방법을. 3시간 내에 단일 세포 현탁액을 준비하여 심장 면역 세포 이질성과 심혈관 질환 연구에 활용할 수 있습니다.

인간과 마우스 심근 표본에서 대식세포 하위 세트 및 기질 세포의 분리

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