Name: 전자 현미경 검사법을 검사하기위한 배아, 달걀 껍질 및 곰팡이 배양 처리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: 배우세요 전자현미경 검사를 위한 거북이 배아, 달걀 껍질 및 곰팡이 배양의 표준화된 샘플 준비 프로토콜입니다. HMDS 화학 건조, 공기 건조 및 임계점 건조 방법을 통해 섬세한 조직 구조를 보존하고 가공 인공물과 원본 구조를 구분할 수 있습니다.

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저자는 다니엘 발다사르 박사에게 감사드리고 싶습니다, SUNY 오스웨고 는 원고에 대한 유용한 토론과 의견에 대한. 이 연구는 라이스 크릭 준회원 보조금에 의해 지원되었다, 오스웨고; 도전 은 PGL과 JG에 SUNY 오스웨고와 국립 과학 재단 (NSF) 작은 보조금을 부여합니다.

참고 : 이 연구에 사용되는 페인트 거북이(Chrysemys picta)계란은 뉴욕 주 환경부로부터 얻은 허가를 받아 2015-16 년 5 월부터 6 월까지 뉴욕 주 라이스 크릭 필드 스테이션에서 수집되었습니다. 보존 (12 월).
1. SEM용 배아를 처리하는 화학 건조 방법
<ol><li>둥지 시즌 동안 필드 사이트에서 거북이 계란을 수집합니다. 뚜껑 (L x W x H) 6.7 cm x 25.4 cm x 10.2 cm버미와 토탄 모스 (1 :1 비율)의 촉촉한 혼합물로 준비 침구 매체로 채워진 플라스틱 상자로 만든 미리 배양 챔버를 준비합니다. 상자의 측면과 뚜껑을 따라 약 0.25cm의 4-6 구멍을 만들어 폭기를 허용합니다.</li>
	<li>둥지에서 토양을 부드럽게 제거하여 알을 발견하십시오. 배양 중에 미생물 오염을 제어하기 위해 희석 된 요오드 팅크 (1:25,000)로 거북이 계란의 표면을 닦으십시오. 클러치는 서로 분리놓고, 그려진 거북이의 클러치 크기는 5~9개의 달걀과 상자당 최대 8~9개의 달걀을 놓는다. 참고 : 수집, 닦기, 라벨 링 및 상자 내부에 배치하는 동안 계란을 조심스럽게 처리하십시오. 계란의 위치 및 정렬은 누워 있던 것과 동일해야 하며, 어떤 운동도 배아 발달을 억제합니다.</li>
	<li>계란을 침구에 반으로 직접 묻고, 30°C로 설정된 인큐베이터 내부에 상자를 덮고 놓습니다. 이 연구에서 각각 사용되는 배아 단계 12, 13 및 18을 얻기 위해 10-17일 동안 난자를 배양하였다. 증류수를 첨가하여 매일 침구 매체를 부분적으로 적시고 탈수를 방지하고 배아의 정상적인 발달을 위해 수분 수준을 유지합니다. 참고: 배양 및 발판 배아는39이전 간행된 완전한 발달 표에 따라 입니다.</li>
	<li>뾰족한 가위를 사용하여 등쪽 달걀 껍질과 노른자 멤브레인의 한쪽에 첫 번째 컷을 만들어 긴 축으로 수직으로 고정시킵니다. 배아 디스크를 절단하지 않도록 조심스럽게 노른자에 가위를 삽입합니다. 이제 긴 축을 따라 계란의 측면을 잘라 다음 짧은 축을 따라 계란의 다른 쪽을 잘라.</li>
	<li>껍질을 벗기고 배아 측을 위로 밀어 내어 적당히 열어 보냅니다. 달걀 껍질의 다른 측면을 잘라 내고 절제 된 조각을 인산염 완충 식염수 (7.4의 pH에서 PBS)에 넣습니다. 참고 : 거북이 달걀은 점성이 높은 달걀 노른자로 채워지고 배아의 등쪽은 달걀 껍질 막에 부착됩니다. 배아 근처의 달걀 껍질 막은 반투명 한 흰색에서 불투명한 백악질 흰색으로 배양으로 바뀝습니다. 이를 통해 긴 축의 중심에 배아를 찾아내고외부(40,41)로부터어두운 석회화된 반점으로 볼 수 있다.</li>
	<li>입체 현미경을 사용하여 집게를 사용하여 달걀 껍질에서 껍질을 벗겨 노른자 막과 함께 배아를 분리하십시오. 집게와 마이크로 가위를 사용하여 배아 외 막을 제거하십시오. 배아 숟가락을 사용하여 배아를 페트리 접시에 신선한 PBS로 옮겨 혈액이나 노른자를 씻으시다.</li>
	<li>명확한 12 웰 플레이트를 사용하여 4 °C또는 PBS에서 2-3 % 글루타랄데히드에서 PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드에서 밤새 배아를 고정하십시오. 배아의 크기에 따라 각 우물에 1~3개의 배아를 놓습니다. 2-3 일 동안 고정 시간을 연장하여 오래된 배아에 대한 완전한 침투 (샘플이 흰색으로 나타납니다)를 확인하십시오. 신선한 PBS로 배아를 3x 5분 동안 헹구고 헹구어 보시고 자합니다. 참고: 폴리에스테르 메쉬 하의가 있는 폴리스티렌 인서트를 사용하여 12웰 플레이트에 폴리스티렌 인서트를 사용하여 한 용매에서 다른 용매로 시편을 옮기십시오.</li>
	<li>증류수에서 일련의 에탄올 농도를 사용하여 샘플을 탈수: 30%, 50%, 70%, 80%, 95%, 및 100% 각 탈수 용액에서 1시간 동안 샘플을 치료한다. 완전한 탈수성을 보장하기 위해 100% 에탄올로 단계를 두 번 반복합니다. 즉시 사용하지 않을 경우 샘플을 -20°C에서 70% 에탄올로 장기간 보관하십시오.</li>
	<li>일련의 hexamethyldisilazana (HMDS)를 사용하여 건조 배아를 100% 에탄올 농도: 1:2, 2:1 및 100%. 샘플을 각 용액에 20 분 동안 두고 페트리 접시를 부분적으로 덮어 둡니다. 참고: HMDS는 독성이 매우 높기 때문에 필요한 개인 보호 장비를 갖춘 연기 후드에 HMDS와 관련된 모든 단계를 수행하십시오.</li>
	<li>배아를 최종 100% HMDS 용액에 완전히 또는 부분적으로 덮은 후 하룻밤 동안 HMDS 증발을 돕고 샘플을 장착 및 스퍼터 코팅에 사용할 준비가 남겨 둡니다. 샘플을 통해 먼지가 침전을 제거하기 위해 접시를 덮습니다. 참고 : 조직은 완전한 건조 후 흰색으로 나타나고 부분적으로 건조 된 샘플은 노란색으로 보이며, 이 조직을 연기 후드에 더 오랜 시간 동안 둡니다.</li>
	<li>분석된 샘플크기당 알루미늄 스텁 및 탄소 접착제 테이프의 크기를 선택합니다. 이중 스틱 탄소 전도성 테이프(12mm)를 사용하여 말린 샘플을 표준 알루미늄 핀 스텁(12.7mm x 8mm)에 조심스럽게 장착합니다.</li>
	<li>스퍼터 코터의 챔버에 장착 된 샘플을 도입하여 전하 효과를 제거하기 위해 매우 얇은 금 막으로 시편을 코팅하십시오. 금 판 은 35 mA 스퍼터에서 60-120 s의 표본을 플레이트.</li>
	<li>세트 나사를 단단히 고정하여 스텁을 해당 모공 플레이트에 장착합니다. 샘플 교환 도구를 사용하여 샘플 홀더를 SEM의 샘플 챔버 로 또는 밖으로 이송합니다. 10kV의 가속 빔 전압과 방출 전류 10 μA로 고진공 모드에서 샘플을 이미지화합니다. 참고: 시료, 시료 홀더, 마운팅 스텁 및 이송 도구를 취급하는 동안 항상 장갑을 착용하여 손에서 SEM 시스템으로의 그리스 오염을 방지하십시오.</li>
	<li>위의 절차에서 얻은 표본의 분해능을 비교하기 위해 아래에 나열된 대체 기술을 테스트합니다.<ol>
<li>1.7단계 후 실온에서 1% 오스뮴 테트옥사이드를 함유한 후 고정을 포함합니다.</li>
		<li>HMDS의 빠른 신속한 증발을 위해 1.10단계에서 HMDS를 부분적으로 또는 완전히 제거합니다.</li>
		<li>3.3-3.4단계까지 임계점 건조(CPD)를 이용하여 1.8단계 후 배아를 처리한다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 공기 건조 방법을 사용하여 SEM용 달걀 껍질 준비
<ol><li>1.1-1.7단계에 명시된 대로 배아를 고치기 위해 그려진거북이(Chrysemys picta)알을 수집하고 배양한다.</li>
	<li>2.1단계에서 배아 고정 후 증류수에 달걀 껍질을 저장합니다. 노른자와 알부민 오염을 제거하기 위해 적어도 1 시간 동안 증류수에 담가 달걀 껍질을 철저히 청소하십시오.</li>
	<li>밤새 연기 후드에 섬세한 정전기 방지 물티슈를 씻은 후 공기 건조 계란 껍질. 말린 달걀 껍질을 번호와 단계로 표시된 깨끗한 표본 병에 보관하십시오.</li>
	<li>1.11-1.13 단계에 명시된 단계에 따라 시편을 장착, 스퍼터 코팅 및 이미지화합니다.</li>
</ol>3. SEM을 위한 곰팡이 배양준비를 위한 임계점 건조방법
<ol><li>슬라이드 문화대 설정<ol>
<li>곰팡이 배양을 위한 감자 덱스트로스 한천(PDA) 배지 준비: 에를렌마이어 플라스크에 증류수 1L에 PDA 전력 39g을 추가합니다. 플라스크를 소용돌이치며 30분 동안 121°C에서 매체를 오토클레이브합니다. 참고 : 살균 후, 한천 용액은 뜨거워야하며 곧 굳어지지 않을 것입니다. 항생제를 비활성화하지 않도록 충분히 식힙니다.</li>
		<li>소용돌이로 섞어서 접시(각 10cm 페트리 접시마다 약 10-12 mL의 용지)를 붓고 조심스럽게 쌓아 고체화시워 주세요.</li>
		<li>멸균 메스 블레이드를 사용하여 한천의 작은 블록을 1/2에서 3/4 인치 정도 잘라냅니다. 한천 블록을 제거하고 깨끗한 유리 현미경 슬라이드에 놓습니다.</li>
		<li>슬라이드를 깨끗한 페트리 접시에 놓아 오염을 방지하고 배양 중에 수분을 보존합니다.</li>
		<li>멸균 이쑤시개를 사용하여 페트리 접시 의 바닥에서 슬라이드를 들어 올려 플레이트와 슬라이드 사이의 표면 장력을 만들어 배양 후 섬세한 성장을 방해하지 않고 유리 슬라이드를 제거합니다.</li>
		<li>멸균 루프 또는 바늘을 사용하여 시편 접종에서 슬라이드의 한천 블록의 네 면 각각으로 곰팡이의 일부를 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김을 사용한다.</li>
		<li>접종 후 한천 블록의 표면에 깨끗한 커버 슬립을 놓습니다. 슬라이드 주변의 페트리 접시에 멸균 증류수 몇 방울을 떨어뜨려 성장하는 곰팡이의 수분을 보장합니다.</li>
		<li>파라핀 필름을 사용하여 플레이트를 부분적으로 밀봉하고 적절한 시간 동안 플레이트를 30 °C에서 배양하십시오 (푸사리움 종은 36 ~ 48 h동안 배양하십시오).</li>
		<li>페트리 접시에서 슬라이드를 제거하고 멸균 집게를 사용하여 한천 블록에서 단단히 부착 된 커버 슬립을 분리합니다. 한천 블록을 PBS에서 3% 글루타랄데히드에서 밤새 4°C에서 고정한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>에탄올 계열을 통과하여 샘플을 탈수: 10%, 25%, 50%, 75% 및 90% 변화당 15분. 100% 에탄올에서 각각 30분 간 지속되는 두 가지 변화로 최종 탈수시 시료를 처리하여 완전한 포화를 보장합니다.</li>
	<li>임계 점 건조: 탈수된 샘플을 CPD 장치의 챔버에 놓습니다. 액체 CO2가 챔버를완전히 채울 때까지 밸브를 열고 액체 CO2를 배출하고 에탄올을 배출하도록 밀봉하여 챔버를 냉각시웁니다.<ol>
<li>챔버 압력이 1000 psi를 초과하고 온도가 31 °C를 초과할 때 임계 점을 달성하기 위해 챔버를 천천히 밀봉하고 가열하며, CO2의 액체 및 기체 상은 평형상태입니다. 표면 장력의 영향을 피하기 위해 챔버와 샘플을 가스로 서서히배출합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1.11-1.13 단계에 명시된 다음 단계로 시편을 장착, 금 도금 및 이미징을 수행합니다.</li>
	<li>1.9-1.13 단계까지 HMDS를 사용하여 3.2 단계에서 시편을 화학적으로 건조하여 비교 분석을 수행합니다.</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없다

우리의 연구에서, 다른 고정 에이전트, 탈수 및 건조 방법은 SEM 화상 진찰을 위한 3개의 다른 섬세한 생물학 견본을 준비하기 위하여 시험되었습니다: 배아, 계란 껍질 및 곰팡이 배양. SEM은 일반적으로 표면 해석에 사용되므로 고정 관통은 덜 중요하지만 내부 구조가 잘못 고정되면 내부 수축 또는/축소된 표면 구조가 발생할 수 있음을 이해해야 합니다. 연장된 고정 시간은 또한 더 큰 조직 견본을 위해 고려되어야 합니다, 고정 기간에 따라서 고정식 해결책을 몇 번 대체하. 고정식과 조직 사이의 활발한 상호 작용으로 인해 세포의 삼투 특성이 상당히 변할 것입니다. 조직 유체는 고정제를 희석시킬 것이고 따라서 전반적인 삼투에 기여하는 알데히드 효과는 세포 부피에 대한 영향이 우려되는 한 무시될 수 있다. 또한, 포름알데히드는 조직에 더 빨리 침투하고 글루타랄데히드에 비해 크로스 링커로 더 효과적입니다. 완충된 포름알데히드-글루타랄데히드 혼합물은 또한 다양한 조직을 고정하기 위해 보고되었지만, 단층 및 세포 현탁액의 희석 된 용액은<...

주사 전자 현미경 (SEM) 초구조 분석 및 세포 내 이미징 은 원핵 생물, 식물 및 동물의 3 차원 프로파일링을위한 광 현미경 검사법을 보완합니다. SEM의 높은 공간 해상도는 나노미터에서 마이크로미터 척도까지 시편의 미세 구조적 특성을 검사하는 데 사용할 수 있는 가장 다재다능하고 강력한 기술 중 하나입니다. 건조 된 표본은 기능적 관계에 대한 유효한 결론을 개발하기위한 기초를 제공하는 강렬한 세부 사항으로 조성및 지형 구조로 해결1,2,3 , 4개 , 5개 , 6개 , 7명 , 8개 , 9. 생물학적 표본의 SEM 이미지를 해석 할 때, 그것은 네이티브 구조와 처리 중에 생성 된 유물을 구별하는 큰 도전이다. SEM은 일반적으로 샘플10,11로부터방출되는 1차, 이차 또는 역산 전자 빔에 영향을 미치는 가스 분자로부터의 어떠한 간섭을 피하기 위해 매우 높은 진공에서 작동한다. 또한 생물학적 물질은 가난하거나 비전도성 특성으로 인해 방사선 손상에 취약합니다. SEM에 적재된 시편은 고진공환경(10,11)에서발생하는 모든 배출을 제거하기 위해 모든 유기 오염물질이 완전히 건조되고 프리되어야 한다. 생물학적 표본은 대부분 물로 구성되어 있기 때문에, 네이티브 구조물이 유지되도록 하기 위해 추가적인 준비 기술이 필요합니다.
얻어진 해상도는 시편 유형 및 활용된 기악 파라미터에 특정한 준비 방법을 최적화하는 데 기반을 두고 있습니다. 따라서 모든 조직 유형에 대해 일반화 된 처리 단계를 사용하지 않아도됩니다. 일부 생물학적 표본은 구조를 보존하기 위해 덜 엄격한 처리가 필요하며 수축 및 붕괴와 같은 건조 아티팩트의 도입을 피하기 위해 섬세한 유형의 시료에 더 많은 시간과 주의가 필요할 수 있습니다. 시료 전처리는 SEM 이미징에서 중요한 단계입니다. 형태측정 연구의 결과는 표본 준비 절차12,13에의해 현저하게 영향을 받습니다. 많은 생물학적 시료에 대한 일반적인 준비 단계는 금, 백금 또는 팔라듐과 같은 금속으로 고정, 탈수 및 코팅을 통해 표면을 SEM 분석을 위한 전도성으로 변환합니다. 사용된 단계의 성질 및 조합은 조직의 유형 및 연구의 특정 목표에 따라 달라질 것이다. 전하 축적, 진공 및 전자 빔 손상에 대한 민감성은 부드러운 섬세한 생물학적 샘플을 처리할 때 문제를 야기하며, 물체의 기본 구조를 유지하기 위한 추가 처리 단계가 필요합니다. 오스뮴 테트옥사이드 고정, 탈수 등의 종래의 방법을 사용하여 14,15,16,17의섬세한 조직의 수축 및 붕괴를 야기한다. 이 연구의 목적은 초기 연구의 아이디어를 준비하고 이미지화하기 위한 수정과 결합하여 파생된 우아한 방법론을 확립하는 것입니다(예: 파충류 배아, 페인트거북이의 달걀 껍질, 곰팡이 문화).
적합한 고정 방법의 선택은 생물학적 표본의 현미경 분석을위한 첫 번째 가장 중요한 단계입니다. 유기체로부터 분리 된 직후 조직을 고정하는 것은 분해로 인한 형태 변경을 방지하는 데 필수적입니다. 효과적인 고정식은 세포에 신속하게 침투하여 세포 과정을 종료하고 SEM17하에서 후속 처리 단계 및 검사를 모두 견딜 수 있도록 시료의 구조를 안정화시키는 효과를 비가역적으로 유지해야 합니다. , 18. 여러 화학 적 및 물리적 고정 방법이 알려져 있지만, 화학 적 고정은 자동 용해, 부패 및 건조 효과로 인한 세포 변화를 피하기 위해 생물학적 표본에 더 일반적으로 사용됩니다. 문학17,19,20,21,22,23,변성 및 생물학적 거대 분자를 응고하고, 공유적으로 가교하는 거대 분자에 의해 고쳐진 분자. 알코올은 매우 가난하게 초구조를 보존하는 변성 고정제로 사용되며 주로 가벼운 현미경 검사법에 사용되며 전자 현미경 분석에는 권장되지 않습니다. 포름알데히드, 글루타랄데히드 및 오스뮴 테트옥사이드와 같은 가교 고정제는 조직 내의 거대 분자 간에 분자 간 및 분자 간 가교를 생성하여 초구조체11의 우수한 보존을 제공합니다. ,24,25,26. 생물학적 샘플은 온도에 민감합니다. 고정의 시작 부분에 온도는 막 단백질의 측면 이동성을 감소시키고, 세포 간 분자의 확산을 늦추고, 고정 속도(11)를느리게 하기 위해 4°C로 하는 것이 좋습니다. 조직 을 고정하는 데 필요한 시간은 주로 시료의 크기와 고정이 시편의 구성 요소와 반응하는 속도에 달려 있습니다. 4°C에서 PBS에서 4% 파라포름알데히드 또는 3% 글루타랄데히드의 하룻밤 고정은 더 작은 섬세한 샘플을 처리 할 수 있도록 순차적 침투 특성에 대해본 연구에 사용되는 표본의 SEM 분석을위한 바람직한 방법입니다17 , 18세 , 19세 , 20개 , 27. 오스뮴 테트옥사이드를 이용한 사후 고정 단계는 독성 특성으로 인해 제거될 뿐만 아니라 본 연구에서 분석된 샘플의 이미지 품질을 향상시키는 추가적인 이점을 구현하지 못하는 것으로 나타났다.
생물학적 샘플에는 SEM 작동을 방해하는 유체가 포함되어 있습니다. 따라서 샘플을 SEM 샘플 챔버에 삽입하기 전에 건조해야 합니다. 탈수가 보장되면 표면 장력/건조로 인해 시편에 아티팩트를 만들지 않고 조직에서 용매를 제거해야 합니다. 세 가지 다른 건조 방법은 SEM 이미징을위한 조직을 처리하는 동안 일반적으로 사용되었다 : 공기 건조, 임계 점 건조, 및 동결 건조 샘플28,29,30,31. 동물 조직 샘플28,29,30,31과동일한 결과를 생성하는 세 가지 건조 방법 모두를 보고하는 연구는 거의 없습니다. 더 작은 견본을 위해 이용되는 일반적인 방법은 알콜과 hexamethyldisilazane (HMDS)의 상승 농도 시리즈에 의하여 화학적 탈수입니다, 그러나 더 큰 견본은 임계 점 건조 (CPD) 계기32를사용하여 건조됩니다. 건조 과정에서, 액체/기체 계면에 의해 시편을 통과하는 작은 공동에서 형성된 상당한 힘; 이것은 심지어 중공 구조(33)의완전한 붕괴로 이어질 수 있습니다. 처리로 인해 발생하는 모든 변형은 시편의 기본 구조 적 특징으로 오인 될 수 있습니다. 따라서, 처리를 위한 일반화현상은 제거되어야 하고 섬세한 조직 견본이 분석될 때 특히 조직의 각 모형을 위한 유일한 건조 프로세스가 표준화되어야 합니다.
위에서 언급한 모든 프로세스의 다양한 조합을 사용하여 수행된 여러 시험에서 파충류 배아, 페인트 거북이의 달걀 껍질 및 곰팡이 배양이라는 세 가지 섬세한 조직의 SEM 분석에 사용할 수 있는 방법을 표준화했습니다. 발달 생물학자와 형태학자는 대표적인 척추동물에서 배아 발달 중에 정상적이고 비정상적인 형태 형성을 설명합니다. 유전자 신호 통로에 대한 조사는 새로운 구조의 형태학적 설명에 달려 있습니다. SEM 분석 도중 척추동물 배아 구조에 있는 어떤 급격한 변경든지 피하기 위하여는, 우리는 탈수다음 화학건조를 추천합니다. HMDS를 이용한 화학건조는 비교적 최신의 건조 방법이며 상대적 민첩성, 사용 편의성, 비용손실, 필요한 제한된 전문 지식 및 장비 9. CPD는 특정 온도 및 압력에서 시편에 걸쳐 CO2를 통과하는 것을 사용하여 일반적으로 사용되는 건조 기술입니다. 우리는 HMDS가 연약한 섬세한 조직을 건조시키기에 적합하고 배아 조직에 광대한 변형을 일으킨 임계 점 건조에 비해 더 큰 샘플을 가공할 수 있다는 것을 확인했습니다. 몇몇 방법은 균류34의형태학적 특성을 공부하기 위하여 SEM 화상 진찰을 위한 견본을 준비하기 위하여 이용되었습니다. 곰팡이 시편은 일반적으로 오스뮴 테트옥사이드에 고정된 후 에탄올 탈수 및 임계 점 건조가 뒤따르며, 이는 오스뮴 테트옥사이드6,7,35의 독성 효과가 있지만 만족스러운 결과를 제공할 수 있습니다. 처리 하는 동안 솔루션을 변경 하는 동안 곰 팡이 재료를 잃고 단점이 발음 된다. 고정없이 공기 건조를 이용한 시료 전처리 기술도36개 시행되었으나 수축 및 붕괴된 구조물을 초래하며, 이러한 시편의 관찰은 종을 특성화하면서 쉽게 잘못 해석될 수 있다. 곰팡이 하이pha는 액체와 접촉하는 무결성을 잃고 심지어 건조는 구조를 복원하기 위해 달성되지 않을 수 있습니다. 이 효과 로 인해, 동결 건조는 일반적으로 곰 팡이 균 사 체와 같은 연약한 조직을 건조에 사용 됩니다. 동결 건조는 깨끗한 재료에 적합하지만 염이나 분비물의 존재는 SEM 보기 단계에서만 식별되는 표면 세부 사항을 모호하게 합니다. 우리는 글루타랄데히드 고정 및 임계 점 건조와 슬라이드 배양 방법을 결합하여 손상되지 않은 곰팡이 하이페 및 포자의 구조적 세부 사항을 산출합니다. CPD 건조는 배아의 수축을 일으켰지만, 글루타랄알데히드 고정과 결합될 때 잘 보존된 균사 구조가 발생했습니다. 달걀 껍질은 보호 커버링 역할을 할뿐만 아니라 기계적 안정성, 가스와 물에 대한 투과성 및 개발 배아를위한 칼슘 예비를 제공함으로써 oviparous 동물의 배아에 1 차적으로 중요합니다. 민물 거북 달걀 껍질은 구조에 따라 "경직된"으로 분류되며, 그가용성으로 인해 생물학자 1, 2,3,4에서 상당한 관심을 받고 있습니다. , 5개 , 6개 , 7명 , 37세 , 38.
우리는 어떤 단단한 계란 껍질 종에 적용 할 수있는 페인트 거북이의 계란 껍질과 껍질 막의 쉬운 검사를위한 간단한 방법을 자세히 설명합니다. 준비 방법론은 결과이미지 품질과 감소된 잠재적 아티팩트를 기반으로 평가되었습니다.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Fischer 슬라이드</td><td>배양을 위한</td>과학적 <td>S25127A</td></tr><tr><td>알루미늄 핀 스텁</td><td>Tedpella</td><td>16111</td><td>12.7 mm x 8 mm</td></tr><tr><td>BD Difco 탈수 배양 배지: 감자 포도당 한천</td><td>BD 213400</td><td>DF0013-17-6</td><td>곰팡이, 효모 및 곰팡이의 분리 및 배양을 위한 배지</td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Fischer BioReagents</td><td>BP904-100</td><td>배지용 항생제</td></tr><tr><td>굵은 질석</td><td>온실 메가 스토어</td><td>SO-VER-12</td><td>침구 매체</td></tr><tr><td>투명 12 웰 플레이트</td><td>코닝</td><td>07-201-589</td><td>배아 고정</td></tr><tr><td>용 커버 슬립</td><td>피셔 과학</td><td>슬라이드 배양</td><td>용 S17525B</td></tr><tr><td>임계 점 건조기</td><td>정족수 CPD</td><td>EMS850</td><td>임계 점 건조</td></tr><tr><td>배양 접시</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>08 747B</td><td>DISH PETRI 100X10MM 12/PK</td></tr><tr><td>에탄올</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>A406P 4</td><td>탈수제</td></tr><tr><td>겸자- 물병자리 핀셋</td><td>Tedpella</td><td>5804</td><td>스타일 4, 길이 108mm, 너비 x 두께 0.017 x 0.17 mm</td></tr><tr><td>글루타르알데히드</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>G151-1</td><td></td></tr><tr><td>스퍼터 코팅기용 고정 골드 타겟</td><td>DENTON VACUUM</td><td>TAR001-0158</td><td>골드 타겟, 2.375&프라임; D x .002&프라임;</td></tr><tr><td>Hexamethyldisilazana</td><td>Fischer Scientific</td><td>C19479-5000</td><td>화학 건조제</td></tr><tr><td>Kim 닦음</td><td>Kimtech</td><td>S-8115</td><td>청소</td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>Thermo Scientific</td><td>67-762-16</td><td>슬라이드 배양</td></tr><tr><td>현미경 가위</td><td>Tedpella</td><td>1327</td><td>더블 포인티드, 스테인리스 스틸, 100mm L (3-5/8").</td></tr><tr><td>마이크로 가위</td><td>Tedpella</td><td>1346</td><td>Vannas 유형, 직선, 80mm L</td></tr><tr><td>Moria 천공 배아 스푼</td><td>미세 과학 도구</td><td>10370-17</td><td>길이 14.5 cm, 팁 직경 20 mm, 숟가락 깊이 5 mm</td></tr><tr><td>Netwell 인서트</td><td>Corning</td><td>0330B09</td><td>15 mm 인서트 74 &micro; m 메쉬 크기 폴리 에스테르 멤브레인은 다양한 용매로 표본을 처리하는 동안 편리한 캐리어 역할</td></tr>을합니다 <tr><td>파라 포름 알데히드</td><td>Fischer Scientific</td><td>T353-500</td><td>고정 피트</td></tr><tr><td>이끼</td><td>월마트-미라클 그로</td><td>551705263</td><td>침구 매체</td></tr><tr><td>PELCO 탭 더블 스틱 탄소 전도성 테이프</td><td>Tedpella</td><td>5000</td><td>12mm OD</td></tr><tr><td>스퍼터 코터</td><td>DENTON VACUUM</td><td>DESK V</td><td>얇은 금속 코팅</td></tr><tr><td>SEM</td><td>JEOL USA</td><td>JEOL JSM 6610LV 주사 전자 범위</td><td>전자 현미경</td></tr></tbody></table>

전자 현미경 검사법을 검사하기위한 배아, 달걀 껍질 및 곰팡이 배양 처리

Processing Embryo, Eggshell, and Fungal Culture for Scanning Electron Microscopy

주사 전자 현미경 검사법 (SEM)은 다양한 생물학적 및 비 생물학적 샘플의 초구조 적 분석에 널리 사용되고 있지만, 다른 생물학적 샘플 처리에 관련된 방법은 독특한 관행을 포함한다. 샘플 처리를 위한 문헌에 설명된 모든 기존 관행은 여전히 유용한 응용 프로그램을 찾을 수 있지만 샘플 준비의 미묘한 변화는 이미지 품질을 변경하고 아티팩트를 도입할 수 있습니다. 따라서, 분석된 조직의 종류에 특이적인 독특한 시료 제제 기술을 사용하여 초구조적 분해능으로 양질의 이미지를 얻을 필요가 있다. 이 연구의 초점은 SEM을 사용하여 화상 진찰 배아, 단단한 계란 껍질 및 곰팡이 문화를 위한 최적 견본 준비 프로토콜을 제공하기 위한 것입니다. 연구된 세 가지 섬세한 생물학적 샘플에 대해 좋은 결과를 얻으려면 다음 최적화가 권장되었습니다. 4% 파라포름알데히드 또는 3% 글루타랄데히드와 같은 더 온화한 고정식을 사용하고 에탄올 시리즈를 사용한 탈수증이 필수적입니다. 슬라이드 배양에 의해 얻어진 한천 블록에 곰팡이 균사체는 한천 플레이트에서 직접 가져온 배양에 비해 더 나은 초구조적 무결성을 산출합니다. HMDS를 사용하여 배아의 화학적 건조는 임계 점 건조에 비해 표면 장력 아티팩트를 도입하지 않고 건조를 제공합니다. HMDS는 시료가 건조 중에 덜 부서지기 때문에 수축으로 인한 균열을 방지합니다. 그러나 곰팡이 배양의 경우, 임계 점 건조는 화학 적 건조에 비해 허용 가능한 이미지 품질을 제공합니다. 달걀 껍질은 장착 전에 철저한 세척 및 공기 건조를 제외하고는 특별한 준비 단계없이 이미지화 할 수 있습니다. 준비 방법론은 각 시험에서 얻은 허용 가능한 이미지 품질에 기초하여 표준화되었다.

도 1은 도장된거북이(Chrysemys picta) 배아의 주사 전자 현미경 분석을 보여준다. 도색된 거북이 알을 침구 배지상에 채취하고 배양하고, 화학건조 후 알루미늄 스텁에 장착하여 SEM 이미징에 사용하였다(도1A-E). 단계 12 배아의 측면보기는 두개안면 구조물을 보여줍니다; 상악 가루는 하악을 넘어 확장하고 잘 표시된 비강 구덩이 내측을 제한; 5개의 인두 아치도 관찰되었다(그림1F). 배아의 후방 꼬리 부위에 새로 형성된 소미트는 분절된 몸소미에 비해 쉽게 계산할 수 있다. 앞다리 싹은 뒷다리 싹에 비해 더 이상 나타나고 통풍구보다 더 많은 포인트. 갑피 능선의 잘 정의된 아웃성장은 단계 15 배아의 전체 사지 측면 영역을 따라 보입니다(도1</...

여기에서, 우리는 주사 전자 현미경 검사법 (SEM)를 사용하여 섬세한 조직 견본을 화상 진찰을 위한 상세한 처리 프로토콜을 제시합니다. 세 가지 다른 처리 방법, 즉, hexamethyl disilazana (HMDS) 화학 건조, 간단한 공기 건조 및 임계 점 건조는 각각 경질 계란 껍질, 초기 발달 단계에서 배아 및 곰팡이 배양을 준비하기 위해 설명됩니다.

Although scanning electron microscopy (SEM) is being widely used for the ultra-structural analysis of various biological and non-biological samples, ...

우리는 스캐닝 전자 현미경 을 사용하여 그려진 거북이 배아, 단단한 계란 껍질 및 곰팡이 배양을 이미징하기위한 샘플 준비 프로토콜을 표준화했습니다. 이러한 포괄적인 방법은 알려진 프로토콜에 대한 미묘한 변경을 사용하여 원래 구조와 아티팩트 처리 사이의 분화를 허용하는 세 가지 섬세한 조직을 처리합니다. 나와 함께 절차를 시연하는 것은 제시카 기븐스, 내 실험실에서 대학원생이 될 것입니다.둥지 시즌 동안 필드 사이트에서 거북이 알을 수집하기 전에 플라스틱 상자의 측면을 따라 4 ~ 6 0.25 센티미터 구멍을 만들고 뚜껑에 식기를 허용하십시오. 버미쿨라이트와 토탄 이끼 침구 혼합물을 1 대 1 비율로 촉촉하게 혼합하여 상자를 채우기 전에. 둥지 부위에서는 토양을 부드럽게 제거하여 알을 발견하고 각 거북이 알의 표면을 희석된 요오드 팅크로 닦아 인큐베이션 중 미생물 오염으로부터 보호합니다.상자당 최대 8~9개의 알을 배치한 것과 동일한 방향과 정렬에 배치하여 개별 클러치를 서로 분리합니다. 모든 계란이 수집되면 침구에 계란 반을 수동으로 묻고 10~17일 동안 30도 의 섭씨 인큐베이터 안에 뚜껑을 두어 배아 단계 12, 13 및 18 개의 배아를 얻습니다. 탈수를 방지하고 정상적인 배아 발달을 위해 수분 수준을 유지하기 위해 매일 침구 매체를 부분적으로 적시고 증류수를 첨가합니다.적절한 개발 단계에서 뾰족한 가위를 사용하여 등쪽 달걀 껍질과 노른자 막의 한쪽에 잘라 내어 달걀의 긴 축으로 수직으로 자른다. 다음으로, 짧은 축을 따라 계란의 반대편을 자르고, 집게를 사용하여 배아 쪽을 위로 열어 껍질을 벗깁니다. 달걀 껍질의 다른 측면을 잘라 PBS에 껍질의 절제 된 조각을 배치합니다.스테레오현미경과 집게를 사용하여 달걀 껍질에서 배아와 노른자 막을 껍질을 벗깁니다. 집게와 마이크로 가위를 사용하여 여분의 배아 막을 제거하고 배아 숟가락을 사용하여 배아를 신선한 PBS의 페트리 접시로 옮킵니다. 혈액과 노른자를 씻은 후, 12웰 플레이트당 최대 3개의 배아를 두어 2~3일 동안 섭씨 4도에 파라포름알데히드를 함유합니다.샘플이 흰색으로 나타나면 폴리에스테르 메쉬 하의가 있는 폴리스티렌 인서트를 사용하여 세척당 신선한 PBS에서 35분 세척으로 배아를 헹구십시오. 마지막 세척 후, 농도 당 1 시간 동안 상승 에탄올 시리즈에서 탈수 샘플. 두 번째 에탄올 침수 후, 부분적으로 덮여 페트리 접시와 침지 당 20 분 동안 에탄올 농도에 HMDS의 시리즈에서 배아를 건조.그런 다음 마지막 100% HMDS 용액에 배아를 배치하여 밤새 연기 후드로 완전히 또는 부분적으로 덮입니다. HDMS의 농도를 에탄올로 점진적으로 증가시킴으로써 건조를 늦추는 것은 배아내 우수한 표면 구조를 드러내는 데 중요하다. 다음 날 아침, 이중 스틱 탄소 전도성 테이프를 사용하여 완전히 건조된 샘플을 표준 알루미늄 핀 스텁에 조심스럽게 장착하십시오.모든 시료가 장착된 경우, 샘플을 스퍼터 코팅 챔버에 도입하여 35mm 스퍼터에서 60~120초 동안 매우 얇은 금필름으로 시편을 코팅합니다. 그런 다음 세트 나사를 단단히 고정하여 해당 붓는 접시에 스텁을 장착합니다. 샘플 교환 도구를 사용하여 이미징을 위해 샘플 홀더를 스캐닝 전자 현미경의 샘플 챔버로 전송합니다.전자 현미경 검사용 달걀 껍질을 준비하기 위해 배아 수확 후 적어도 1 시간 동안 증류수에 달걀 껍질을 놓아 노른자 또는 알부민 오염을 제거하십시오. 다음으로, 공기는 밤새 연기 후드에 섬세한 정전기 방지 물티슈에 청소 된 달걀 껍질을 건조. 말린 달걀 껍질을 깨끗한 표본 병에 보관하고 숫자와 배아 단계로 표시합니다.그런 다음, 배아에 대해 입증된 바와 같이 달걀 껍질 표본을 마운트, 스퍼터 코트 및 이미지화합니다. 슬라이드 곰팡이 문화를 확립하려면 멸균 메스를 사용하여 고체 감자 덱스트로스 천의 절반에서 3 분기 인치 블록을 자르고 개별 유리 현미경 슬라이드에 블록을 놓습니다. 깨끗한 페트리 접시 바닥에 멸균 이쑤시개를 놓아 슬라이드를 들어 올려 플레이트와 슬라이드 사이의 표면 장력을 만듭니다.페트리 접시에 각 슬라이드를 이쑤시개위에 놓습니다. 다음으로, 멸균 루프를 사용하여 시편 접종에서 한천 블록의 4개의 측면으로 곰팡이를 전달합니다. 슬라이드 주변의 페트리 접시에 멸균 증류수 몇 방울을 추가하여 성장하는 곰팡이의 수분을 보장합니다.부분적으로 파라핀 필름으로 접시를 밀봉하고 곰팡이 종에 대한 적절한 잠복기 30도 에 접시를 배치합니다. 인큐베이션이 끝나면 페트리 접시에서 슬라이드를 제거하고 멸균 집게를 사용하여 단단히 부착된 한천 블록을 슬라이드에서 3%의 글루타랄데히드 용기로 옮겨 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 아침, 농도 당 15 분 동안 오름차순 에탄올 시리즈에서 샘플을 탈수.90%침수 후, 100%에탄올에서 2개의 30분 변화와 함께 최종 탈수시 샘플을 처리하여 임계점 건조 장치의 챔버에 탈수된 샘플을 배치하기 전에 완전한 채도를 보장한다. 챔버를 밀봉하고 액체 이산화탄소가 배출될 수 있도록 밸브를 열고 액체 이산화탄소가 챔버를 완전히 채울 때까지 에탄올이 배출되도록 합니다. 다음으로, 챔버 압력이 평방 인치 당 1, 000 파운드의 압력을 초과하고 온도가 섭씨 31도를 초과하고 이산화탄소의 액체 및 가스 공간이 평형에있을 때 챔버를 밀봉하고 천천히 가열하여 임계 점을 달성합니다.그런 다음 챔버와 시료를 가스로 천천히 배출하여 시료에 표면 장력의 영향을 피하고, 입증된 곰팡이 표본을 마운트, 플레이트 및 이미지화한다. 12단계 거북이 배아의 측면 스캐닝 전자 현미경 보기는 상악이 하악을 넘어 어떻게 확장되는지, 그리고 내측으로 잘 표시된 비강 구덩이를 제한하는 방법을 보여줍니다. 5개의 인두 아치도 관찰할 수 있습니다.단계 15 배아에서, 새로 형성된 소미트는 배아의 후방 꼬리 부위에서 볼 수 있으며, 앞다리 싹은 통풍구보다 더 cortally 포인트. 갑피 능선의 잘 정의된 아웃스컬은 또한 배아의 전체 사지 측면 영역을 따라 시각화될 수 있다. 18단계에서는 부리의 중앙 노치에 맞는 터미널 후크가 있는 약간 뒤집힌 하부 부리를 장착하여 짧은 투영 주부가 형성되었습니다.위턱은 노치 된 모양을 나타내며, 작은 계란 치아는 위턱의 끝에서 형성되는 것을 볼 수 있습니다. 전자 현미경 검사를 스캔하여 크리세미 피타 달걀 껍질과 조개 막의 초구조적 분석은 내부 필라멘에 단단히 부착 된 외부 칼칼리누스 달걀 껍질 층을 보여줍니다. 달걀 껍질의 외부 표면은 다양한 크기의 작은 둥근 우울증이나 기공의 농도와 함께, 그룹 및 인접한 쉘 단위 사이에 배치 구형 구형 결절로 만든 잘 구별 미네랄 쉘 단위로 구성되어 있습니다.일반적인 방법론은 SEM을 사용하여 괜찮은 이미지 품질을 달성하기 위해 모든 생물학적 표본에 대해 일반화 될 수 없습니다. 화학 및 공기 건조 방법은 다른 유기 샘플에도 사용될 수 있으며, 커플링 슬라이드 배양 기술은 모든 부드럽고 견고한 미생물 배양에 사용될 수 있습니다.

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전자 현미경 검사법을 검사하기위한 배아, 달걀 껍질 및 곰팡이 배양 처리

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