Name: 원형 RT-PCR 기반 전략을 사용하여 옥수수 미토콘드리아의 기본 및 처리된 성적증명서의 차별 및 매핑 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: 배우세요 옥수수 미토콘드리아에서 원형 RT-PCR 기반 전략을 사용하여 기본 및 처리된 전사체를 차별하고 매핑하는 방법을. RNA 정규화 단계를 포함하여 불안정한 5' 삼인산의 영향을 최소화하고 전사체 분석의 정확성을 높입니다.

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이 작품은 중국 국립 자연 과학 재단 (교부금 번호 31600250, Y.Z.), 광저우 시의 과학 기술 프로젝트 (보조금 번호 201804020015, H.N.), 중국 농업 연구 시스템 (보조금 없음)에 의해 지원되었다. CARS-04-PS09, H.N.).

1. 프라이머 디자인
<ol><li>PCR 프라이머 설계 소프트웨어(표오브 머티리얼)를이용하여 역전사(RT)를 위한 유전자 특이적 프라이머를 프라이머설계(17)의일반적인 규칙에 기초한다. 참고: RT 프라이머는 표적 전사체에 매우 특이적이며, 이들은 일반적으로 5' 코딩 서열(성숙한 mRNA 및 전구체 RNA) 또는 예상된 5' 말단(18S 및 26S rRNA)의 ~500-600 nt 다운스트림에 고정된다.</li>
	<li>cRT-PCR에 의해 원형 전사체를 증폭하기 위해 서로 다른 프라이머 쌍을 설계합니다. 참고: 쌍이 짝이 된 발산 프라이머는 원형 전사체의 5'-3' 접합을 측면에 있으며, 그들의 위치는 분석된 표적 전사체들 사이에서 다양합니다(그림 S1). 일부 성적 증명서에는 긴 UTR이 있습니다. 예를 들어 nad2 -1 5' UTR 및 rps4-1 3' UTR은 각각 1,985 및 1,826/1,834 nt입니다. 두 프라이머가 코딩 영역에 고정되어 있는 경우 대상 전사체를 증폭하기가 어렵습니다. 대조적으로, 일부 UTR은 짧습니다; 예를 들어 nad2-1 및 nad4-1의3' UTR은 각각 34/35 및29-31 nt입니다. 페어링된 프라이머가 코딩 시퀀스에서 멀리 떨어져 있으면 PCR이 실패합니다. 일반적으로, 발산 프라이머의 두 쌍은 각 표적 전사체를 위해 설계되고, 여러 쌍은 성적 증명서 패턴이 복잡하고/또는 UTR이 매우 긴 사람들을 매핑하는 데 필요할 수 있습니다.</li>
	<li>수렴 프라이머 쌍을 설계하여 북부 블롯에 대한 RNA 프로브를 준비합니다. 참고: 쌍프라이머는 표적 유전자의 코딩 영역에 위치하며, PCR 생성물의 크기는 100~ 1,000 bp의 범위여야 한다. 각 순방향 프라이머는 생성된 프로브에서 벡터 서열을 최소화하기 위해 제한 효소 부위를 포함해야 한다.</li>
</ol>2. 옥수수 개발 커널에서 조잡한 미토콘드리온의 준비
<ol><li>오토클레이브로 유봉, 박격포, 유리 깔때기, 튜브 및 팁을 살균하고 오븐에서 건조시면 됩니다.</li>
	<li>4°C 또는 얼음에서 모든 절차를 수행하고 모든 용액을 미리 식힙니다.</li>
	<li>0.3 M 수크로오스, 5 mM 테트라나트륨 파이로포스페이트, 10 mM KH2PO 4,2 mM EDTA, 1% [w/v] 폴리비닐피롤리돈 40, 1% [w/v] 소 혈청 알부민, 5 mM L-se. KOH로 pH 7.3으로 조정하고 여과에 의해 살균하십시오.</li>
	<li>0.3 M 수크로오스, 1 mM EGTA 및 10 mM MOPS (3-(N-morpholino) 프로판설포닉 산으로 구성된 세척 완충제(WB)의 100 mL를 준비합니다. NaOH로 pH 7.2로 조정하고 여과에 의해 살균하십시오. 참고: DEPC 처리된 탈이온화된 H2 O를 사용하여EB 및 WB를 준비하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>수분(DAP) 후 11-20일 후에 20g의 커널을 얼음 위에 놓은 50mL 튜브에 넣고 미리 냉각된 모르타르로 커널을 옮니다. 참고: EB 100 mL에서 옥수수 커널 20g의 비율을 사용합니다.</li>
	<li>각 박격포에 10-20 mL의 얼음 차가운 EB를 추가하고 커널을 완전히 갈아냅니다.</li>
	<li>EB를 더 추가하고 두 층의 필터 천(재료표)을 통해 접지 조직을 필터링합니다.</li>
	<li>10 분 동안 8,000 x g의 여과액을 원심 분리하고 펠릿을 버립니다.</li>
	<li>상급을 새 튜브로 옮기고 원심분리기를 20,000 x g에서 10분 동안 합니다.</li>
	<li>상급체를 붓고 6 mL WB에서 펠릿을 다시 일시 중단하십시오.</li>
	<li>5 개의 1.5 mL RNase 없는 튜브에 현탁액을 알리쿼트하고 5 분 동안 14,000 x g에서 원심 분리합니다.</li>
	<li>상류액을 버리고, 미토콘드리아 펠릿을 액체 질소에 얼린 다음 -80°C에서 보관합니다.</li>
</ol>3. 미토콘드리아 RNA 추출
<ol><li>제조의 지시에 따라 상업용 시약(재료표)으로 미토콘드리아 RNA를 추출하십시오. 주의 사항: 이 시약에는 페놀과 구아니딘 이소티오차네이트가 함유되어 있습니다. 연기 후드에 함께 작업하고 실험실 코트와 장갑을 착용하십시오.</li>
	<li>DEPC 처리된 탈이온화 H2O에서 단리된미토콘드리아 RNA를 용해시키고, 분광광도계(표오브물질)로 RNA 농도 및 순도를 추정한다. 참고: 일반적으로~ ~250 μg 미토콘드리아 RNA는 15-DAP 옥수수 커널 20 g으로부터 수득된다.</li>
	<li>1x TAE 버퍼(40 mM Tris, 20 mM 아세트산, 1mM EDTA), 1.5% 아가로즈(재료표) 및 1x 핵 염색 염료(재료표)로 구성된 아가로즈 젤 1개를 준비합니다.</li>
	<li>10x 로딩 버퍼(0.5% 브로모페놀 블루, 0.5% 자일렌 시안노 FF 및 50% 글리세롤)의 적절한 부피를 추가하고 1.5% 아가로즈 겔에 미토콘드리아 RNA/로딩 버퍼 혼합물을 로드합니다.</li>
	<li>겔을 5-6 V/cm에서 20-25분 동안 1x TAE 버퍼로 실행하고, 겔 문서화 시스템(재료 표)으로 겔을 이미징하여 미토콘드리아 RNA 무결성을 평가합니다. 참고: 2개의 별개의 밴드 (~3,510 및 ~1,970 nt옥수수 미토콘드리아 26S 및 18S rRNAs에 대한)의 존재는 손상되지 않은 미토콘드리아 RNA에 대한 허용 가능한 표준이다. 가능한 분해를 배제하기 위해, RNA 무결성은 순환화된 RNA 제제의 여러 단계 동안 조사되어야 한다(그림 2).</li>
</ol>4. RNA 5' 폴리포스파타제 치료
<ol><li>RNA 5' 폴리포스파타제(표및재료) 처리(표 1)를 설정하고 37°C에서 30-60분 동안 배양한다.</li>
	<li>제조사의 지시에 따라 RNA 정제 키트(재료 표)로 5' 폴리포스파타제 처리 RNA를 회수합니다.</li>
	<li>3.3단계에서 3.5단계반복합니다.</li>
</ol>5. RNA 순환화
<ol><li>5' 폴리포스파타제 처리 및 비처리 미토콘드리아 RNA(표 2)의 동일한 양을사용하여 두 개의 원형 반응을 준비하고, 12-16시간 동안 16°C에서 두 반응을 배양한다.</li>
	<li>4.2단계에서와 동일한 키트를 사용하여 두 세트의 자가 결찰 RNA를 복구합니다. 참고: 미토콘드리아 RNA의 일부만이 자가 결찰되고, 회수된 RNA는 선형 및 순환화된 전사체의 혼합물일 것이라는 점에 유의해야 한다.</li>
	<li>3.3단계에서 3.5단계반복합니다.</li>
</ol>6. 역전사
<ol><li>동일한 양의 원형화된 5' 폴리포스파타스 처리 및 비처리 RNA(200 ng)에서 2세트의 cdNAs를 합성합니다.</li>
	<li>26S-CRT와 최대 7개의 다른 RT 프라이머의 동일한 비율을 추가하여 프라이머 혼합물을 준비합니다. 참고: 프라이머 혼합물의 최종 농도는 1 μM이어야 한다.</li>
	<li>표3에 열거된 시약을 조합하여 2개의 프리믹스를 준비하고, 65°C에서 5분 동안 배양한 다음, 2분 동안 얼음에 식힌다.</li>
	<li>두 개의 RT 반응시스템(표 4)을 조립하고 42°C에서 50분 동안 배양합니다.</li>
	<li>두 RT 반응을 70°C에서 5분 간 가열한 다음 얼음에서 식힙니다.</li>
</ol>7. 정상화
<ol><li>5' 폴리포스파타스 처리 또는 비처리 RNA로부터 유래된 템플릿 cDNA의 동일한 부피를 추가하여 두 개의 PCR 반응을 준비하였고, 5'-3' 원형26S rRNA의 접합부(즉, 26S-CF1및 -CR1) 등을 측면에 있는 발산 프라이머를 나타낸다(표 5).</li>
	<li>표6에 설명된 조건하에서 열 사이클러(재료 표)에서 두 반응을 실행합니다.</li>
	<li>1x TAE 완충제, 1.0% 아가로즈 및 1x 핵 염색 염료로 구성된 아가로즈 젤 1개를 준비합니다.</li>
	<li>2 μL 10x 로딩 버퍼(0.5% 브로모페놀 블루, 0.5% 자일렌 시안액 FF 및 50% 글리세롤)를 두 PCR 제품 각각에 넣고 젤에 로드합니다.</li>
	<li>젤을 5-6V/cm에서 30-40분 동안 1x TAE 버퍼로 실행하고 3.5단계와 동일한 젤 문서 시스템을 사용하여 이미지화합니다.</li>
	<li>컴퓨터 소프트웨어(재료표,그림 4A)를 사용하여 두 PCR 제품의 풍부도를 비교하고 필요한 경우 템플릿 cdnAs의 양을 변경하여 정규화를 최적화합니다.</li>
</ol>8. PCR 증폭
<ol><li>정규화된 cdNAs의 적절한 부피와 표적 전사체의 5'-3' 접합을 측면으로 하는 한 쌍의 발산 프라이머를 추가하여 PCR 반응 쌍을 준비한다(표 7). 참고: 표적 전사체의 PCR 증폭에 사용되는 템플릿 cDNAs의 양은 26S rRNA 정규화 결과에 의해 결정된다.</li>
	<li>표8에 기재된 프로그램에 따라 PCR 반응을 수행한다.</li>
	<li>7.3단계에서 7.5단계반복합니다.</li>
	<li>중첩된 분산 프라이머로 변경하고 8.1 단계와 8.2 단계를 반복하여 첫 번째 라운드 PCR 결과를 확인합니다.</li>
	<li>7.3단계에서 7.5단계반복합니다.</li>
	<li>겔 DNA 회수 키트(물자 표)를 이용하여 2회 PCR증폭을 반복할 수 있는 저명밴드를 회수한다.</li>
</ol>9. 성적 증명서 테르미니의 결정
<ol><li>표준 기술을 사용하여 젤 정제 된 PCR 제품을무딘 엔드 벡터 (재료 표)로 복제하십시오.</li>
	<li>콜로니 PCR을 수행하여 대상 인서트를 포함하는 포지티브 클론을 선택하고 상업적으로 시퀀싱합니다. 참고: 가변 크기의 인서트를 함유하는 포지티브 클론은 일반적으로 식물 미토콘드리아의 많은 정상 상태 전사체가 이기종 5' 및/또는 3'끝1,12를갖기 때문에 단일 회수 대역에서 검출된다.</li>
	<li>미국 국립 생명공학 정보 센터(NCBI)의 기본 로컬 정렬 검색 도구(BLAST)를 사용하여 시퀀싱 데이터를 옥수수 미토콘드리아 게놈과 정렬합니다. 유기체 "옥수수 (taxid:4577)"를 선택하고 데이터베이스 "뉴클레오티드 수집 (nr / nt)"을 검색합니다.</li>
	<li>원형 전사체의 5'-3' 접합을 찾아, 5' 및 3' 전사체 termini의 위치를 결정한다.</li>
	<li>대상 성적표의 크기를 계산합니다.</li>
</ol>10. RNA 젤 블롯 혼성화에 의한 cRT-PCR 매핑 결과 검증
참고: RNA 겔 블롯 혼성화는 디곡시게닌(DIG) 및 T7 RNA 폴리머라제, 혼성화 및 면역학적 검출을 이용한 RNA의 전사 라벨링을 위한 시약을 포함하는 상용 키트(TableofMaterials)를 이용하여 수행된다. 자세한 내용은 이 키트에 제공된 프로토콜을 참조하십시오. RNase 무료 장비만 전체 절차에 사용되었는지 확인하십시오.
<ol><li>RNA 프로브를 준비하는 데 사용되는 DNA 단편을 증폭시키고, 삽입 부위의 T7 프로모터 17 bp 상류를 포함하는 단계 9.1에서와 동일한 벡터로 복제한다.</li>
	<li>적절한 제한 효소를 사용하여 구성을 선형화하고, DNA 정제 키트(TableofMaterials)에 의해 선형화된 플라스미드를 회수하고, DEPC 처리된 탈이온화H2O에용해시켰다.</li>
	<li>제조업체의 지침에 따라 상용 키트(재료 표)에의해 DIG-11-UTP가 있는 라벨 RNA 프로브.</li>
	<li>DEPC 처리된 탈이온화 H2O.를 사용하여 10x MOPS 완충액(0.2M MOPS, 50 mM 아세테이트 및 10 mM EDTA)의 500 mL를 준비하고, NaOH에 의해 pH 7.0으로 조정하고, 여과에 의해 살균한다.</li>
	<li>단계 3.1-3.3에서 제조된 미토콘드리아 RNA에 2-3부량의 로딩 버퍼(포름아마미드 50%, 포름알데히드 6.2%, MOPS 10%, 글리세롤 10%, 브로모페놀 블루 0.1%)를 추가합니다.</li>
	<li>RNA 샘플/로딩 버퍼 혼합물을 65°C에서 10분 동안 변성한 다음 얼음에서 1분 동안 식힙니다.</li>
	<li>변성 아가로즈 겔(포름알데히드 2%, 아가로즈 1.2%, MOPS 1회)을 준비하고 RNA 샘플/로딩 버퍼 혼합물을 젤(잘 당 1-2 μg 미토콘드리아 RNA)에 로드합니다.</li>
	<li>~ 4 시간 동안 3-4 V / cm에서 1 x MOPS에서 젤을 실행합니다.</li>
	<li>20x SSC 2 L (3 M NaCl, 0.3 M 구연산나트륨, pH 7.0)을 준비합니다. 하룻밤 동안 0.1 % DEPC로 처리하고 오토 클레이브로 살균하십시오.</li>
	<li>젤을 20x SSC(매회 15분)로 2회 헹구고, 젤 RNA를 나일론 멤브레인(재료 표)으로 10-16시간 동안 20x SSC로 모세관 이송하여 옮기세요.</li>
	<li>30 분 동안 120 °C에서 베이킹하여 멤브레인에 RNA를 고정시킵니다.</li>
	<li>제조사의 지시에 따라 상용 키트(재료표)로 RNA 혼성화 및 면역학적 검출을 수행합니다.</li>
</ol>11. 1차 및 처리된 5' 종료의 차별
<ol><li>정규화된 5' 폴리포스파타제 처리 및 비처리 RNA로부터 얻어진 cRT-PCR 제품을 비교하여 1차 및 처리된 5' 말단을 구별한다. 참고: 1차 전사체에, 5' 폴리포스파타제 처리 RNA로부터의 PCR 생성물의 풍부성은 비처리대응물로부터보다 훨씬 높다(도 1, 'Gene A' 및 도 4A). 그러나, 처리된 전사체에, 유사한 수준의 PCR 생성물은 미토콘드리아 RNA의 두 세트로부터 증폭될 것이다(도1,'유전자 B').</li>
	<li>cRT-PCR 매핑 결과를 기반으로 RT-qPCR 프라이머를 설계합니다.</li>
	<li>RT-qPCR에 의한 cRT-PCR 판별 결과를 확인합니다. 참고: 5' 폴리포스파타스 처리 및 비처리 RNA로부터 유래된 2개의 cDNA 샘플은 26S 성숙한 rRNA의 RT-qPCR 제품에 의해 정규화된다.</li>
</ol>

<ol><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Major+contribution+of+transcription+initiation+to+5%27-end+formation+of+mitochondrial+steady-state+transcripts+in+maize%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Major contribution of transcription initiation to 5'-end formation of mitochondrial steady-state transcripts in maize.</a> RNA Biology. 16 (1), 104-117 (2019).</li>
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<li>Calixte, S., Bonen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmentally-specific+transcripts+from+the+ccmFN-rps1+locus+in+wheat+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">Developmentally-specific transcripts from the ccmFN-rps1 locus in wheat mitochondria.</a> Molecular Genetics and Genomics. 280 (5), 419-426 (2008).</li>
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<li>Gutmann, B., Gobert, A., Giege, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRORP+proteins+support+RNase+P+activity+in+both+organelles+and+the+nucleus+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">PRORP proteins support RNase P activity in both organelles and the nucleus in Arabidopsis.</a> Genes & Development. 26 (10), 1022-1027 (2012).</li>
<li>Stern, D. B., Goldschmidt-Clermont, M., Hanson, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloroplast+RNA+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Chloroplast RNA metabolism.</a> Annual Review of Plant Biology. 61, 125-155 (2010).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

이전 연구에서, 애기장대의 세포 현탁물 배양으로부터의 총 및 미토콘드리아 RNA는 cRT-PCR에 의해 미토콘드리아 전사체 종기를 매핑하는데 사용되었고, 유사한 결과를12로얻었다. 그러나, 농축된 미토콘드리아 RNA만이 많은 다른 연구에서 미토콘드리아 전사체 termini를 맵메이상으로 사용하였으며 1, 2,3,9. 우리는 미토콘드리아 RNA의 농축이 옥수수에서 미토콘드리아 전사체 종단의 cRT-PCR 매핑을 위한 중요한 단계라는 것을 것을을 발견했습니다. 이 농축 후, 원형화된 미토콘드리아 RNA의 비율은 0.3%에서 3.7%에서 ~30%로 극적으로 증가한다(도3 및 <strong clas...

식물 미토콘드리아에서, 많은 성숙및 전구체 RNA는 다중 이소형태로 축적되고, 정상 상태 전사체는 그들의 5' 끝에있는 차이에 기초하여 2개의 단으로 분할될 수 있습니다 1,2,3, 4. 1 차적인 전사는 전사 개시에서 파생되는 5' 삼인산염 끝이 있습니다. 대조적으로, 처리된 전사체는 전사 후 처리에 의해 생성된 5' 단인산염을 갖는다. 2가지 유형의 전사체의 차별 및 매핑은 전사 및 전사 말기 성숙의 근본적인 분자 메커니즘을 해명하는 데 중요하다.
식물 미토콘드리아에서 1 차적인 및 가공된 전사체를 구별하기 위하여는, 4개의 중요한 전략이 개발되었습니다. 첫 번째 전략은 5'삼인산염을 모노포스페이트로 변환하고 RNA 리가제에 의해 원형화될 수 있도록 담배 산 열포스파타제(TAP)로 미토콘드리아 RNA를 미리 치료하는 것입니다. TAP 처리 및 비처리 RNA 샘플의 전사체 풍부는 cDNA 말단(RACE) 또는 원형 RT-PCR(cRT-PCR)의 신속한 증폭에 의해 비교된 후 2,3,4. 두 번째 전략에서, 처리된 전사체는 먼저 터미네이터 5'-인산염 의존성 외핵항 (TEX)을 사용하여 미토콘드리아 RNA로부터 고갈되고, 1차 적인 전사체는 프라이머 확장 분석 5, 6에 의해 매핑됩니다. . 세 번째 전략은 guanylyl 트랜스퍼라제를 사용하여 1차 전사체를 미리 캡을 씌우고, 트리포스피테5'의 위치는 리보누클레아제 또는 S1 뉴클레아제 보호 분석과 함께 프라이머 확장에 의해 결정되는7,8 ,9. 5' 삼인산염의 존재/부재에 따라 다른, 네 번째 전략은 시험관 내 전사, 사이트 지시 돌연변이 발생 및 프라이머 확장 분석을 결합하여 가양성 프로모터를 특성화하고 전사를 결정합니다. 개시 사이트8,10,11. 이러한 전략을 사용 하 여, 많은 기본 및 처리 된 전사체 식물 미토 콘 드리 아에서 결정 되었습니다.
그러나, 몇몇 연구 결과는 1 차적인 전사체의 5' 삼인산염이 불안정했다는 것을 보고하고, 그(것)들은 알 수 없는 이유 2, 4,12,13를위해 monophosphate로 쉽게 변환되었다. 이 문제는 5'triphosphate의 존재/부재에 따라 기술을 사용하여 두 가지 유형의 성적 증명서의 명확한 차별을 방해하고, 공장에서 기본 및 처리 된 성적 증명서 를 체계적으로 구별하기위한 이전의 노력 미토콘드리아실패 2,12.
본 프로토콜에서, 우리는 옥수수에 안정적으로 축적된 1차 및 처리된 전사체를 체계적으로 구별하기 위해 cRT-PCR, RNA 5' 폴리포스파타제처리, RT-qPCR 및 노던 블롯을 결합한다(그림 1). cRT-PCR은 RNA 분자의 5' 및 3'사지의 동시 매핑을 허용하며, 일반적으로 식물 2,12,14,15에서전사체 termini를 매핑하도록 조정된다. RNA 5' 폴리포스파타제는 트리포스피페테5' 테르미니에서 2개의 인산염을 제거할 수 있으며, 이는 RNA 리가제에 의한 자가 결찰을 위해 1차 전사체를 사용할 수 있게 한다. 이전 연구는 옥수수에서 성숙한 26S rRNA가 5'종기를 처리했다는 것을 보여주었고, RNA 5'polyphosphatase1,16에민감하지 않았습니다. 1차 5'termini에서 불안정한 삼인산염의 영향을 최소화하기 위해, 5' 폴리포스파타스 처리 및 비처리 RNA는 성숙한 26S rRNA에 의해 정규화되고, 1차 및 처리된 전사체는 다음을 비교하여 분화됩니다. 2개의 RNA 샘플로부터 수득된 cRT-PCR 제품. cRT-PCR 매핑 및 판별 결과는 각각 노던 블롯과 RT-qPCR에 의해 검증됩니다. 마지막으로, 대체 프라이머는 cRT-PCR에 의해서가 아니라 북부 블롯에서 검출된 전사체를 증폭시키는 데 사용된다. 이 cRT-PCR 기반 전략을 사용하여, 옥수수 미토콘드리아에서 가장 꾸준한 상태 성적 증명서는 차별화되고 매핑된1.

<table><tbody><tr><td>아세트산</td><td>알라딘, 중국</td><td>A112880</td><td>1x TAE 완충액 제조</td></tr><tr><td>Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler</td><td>Thermo Fisher Scientific, 미국</td><td></td><td>4359659 PCR 증폭을 위한 열 순환기</td></tr><tr><td>Ascorbic acid</td><td>Sigma-aldrich, 미국</td><td>V900134</td><td>추출 완충액 제조</td></tr><tr><td>Biowest Agarose</td><td>Biowest, Spain</td><td>9012-36-6</td><td>PCR을 분해하려면 제품 및 RNA</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Sigma-aldrich, USA</td><td>A1933</td><td>추출 완충액 제조</td></tr> 용 <tr><td>Bromophenol blue</td><td>Sigma-aldrich, USA</td><td>B8026</td><td>아가로 젤 전기 영동 및 북부 블롯</td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Sigma-aldrich, 미국</td><td>V900882</td><td>RNase</td></tr><tr><td>DIG 북부 스타터 키트</td><td>Roche의</td> <td>비활성화12039672910</td><td>DIG-RNA 라벨링 및 북부 얼룩용. 이 키트에는 DIG 및 T7 RNA 중합효소를 사용한 RNA의 전사 라벨링, 혼성화 및 화학발광 검출을 위한 시약이 포함되어 있습니다.</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-aldrich, 미국</td><td>V900106</td><td>추출 버퍼 및 1x TAE 버퍼 EGTA</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-aldrich, 미국</td><td>E3889</td><td>세척 버퍼 준비</td></tr><tr><td>겔 문서화 시스템</td><td>Bio-Rad, 미국</td><td>Gel Doc XR+</td><td>아가로스 젤</td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>Sigma-aldrich, 미국</td><td>G5516</td><td>아가로스 젤 전기영동을 위한 로딩 버퍼 준비</td></tr><tr><td>GoldView II (5,000x)</td><td>솔라바이오,. 중국</td><td>G8142</td><td>DNA 염색</td></tr><tr><td>Hybond-N +, 나일론 멤브레인</td><td>Amersham Biosciences, 미국</td><td>RPN119</td><td>노던 블롯</td></tr><tr><td>이미지 랩</td><td>바이오 라드, 미국</td><td>이미지 랩 3.0</td><td>이미지 젤 및 PCR 제품의 풍부함을 비교합니다.</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-aldrich, 미국</td><td>V900041</td><td>추출 완충액</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Aladdin의</td> 제조를 위해 <td>중국 P112284</td><td>추출 완충액</td></tr><tr><td>L-cysteine</td>의 제조를 위해 <td>Sigma-aldrich, 미국</td><td>V900399</td><td>추출 완충액</td></tr><tr><td>Millex</td><td>Millipore의</td> 제조를 위해 <td>미국 SLHP033RB</td><td>멸균 추출 및 여과에 의한 세척 완충액</td></tr><tr><td>Miracloth</td><td>Calbiochem, 미국</td><td>475855-1R</td><td>분쇄 커널 조직 여과용</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-aldrich, 미국</td><td>V900306</td><td>Northern blot</td></tr><tr><td>NanoDrop Thermo</td><td>Fisher Scientific, USA</td><td>2000C</td><td>RNA 농도 및 순도 분석용</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-aldrich, 미국</td><td>V900797</td>용 <td> 세척 완충액</td></tr><tr><td>pEASY-Blunt 단순 클로닝 벡터</td>의 제조 <td>TransGen Biotech, 중국</td><td>CB111</td><td>젤 회수 밴드의 클로닝. 여기에는 삽입 부위의 몇 bps 상류에 T7 프로모터가 포함되어 있습니다.</td></tr><tr><td>Phanta max super-fidelity DNA polymerase</td><td>Vazyme, 중국</td> PCR 증폭을 위한 <td>P505</td><td>DNA 중합효소</td></tr><tr><td>폴리비닐피롤리돈 40</td><td>Sigma-aldrich, 미국</td><td>V900008</td><td>추출 완충액 제조용</td></tr><tr><td>Primer Premier 6.24</td><td>PREMIER Biosoft, USA</td><td>Primer Premier 6.24</td><td>역전사 및 PCR 증폭을 위한 프라이머 설계</td></tr><tr><td>PrimeScript II 역전사효소</td><td>Takara, Japan</td><td>2690</td><td>첫 번째 가닥 cDNA</td></tr><tr><td>PureLink RNA Mini kit</td><td>Thermo Fisher Scientific, 미국</td><td>12183025</td><td>RNA purificaion</td></tr><tr><td>RNA 5' 폴리포스파타제</td><td>Epicentre, 미국</td><td>RP8092H</td><td>5' 트리포스페이트를 모노포스</td></tr>페이트 <tr><td>RNase 억제제로</td> 변환 <td>New England Biolabs, UK</td><td>M0314</td><td>RNA 자가 결찰 및 5' 폴리포스파타제 치료 반응의 구성 요소로, RNase의 활성을 억제하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>아세트산 나트륨</td><td>Sigma-aldrich, 미국</td><td>V900212</td><td>북부 블롯 용 러닝 버퍼 준비</td></tr><tr>용<td>염화나트륨</td><td>Sigma-aldrich, 미국</td><td>V900058</td><td>20x SSC</td></tr><tr><td>SsoFas evaGreen supermixes</td><td>Bio-Rad, 미국</td><td>1725202</td><td>RT-qPCR</td></tr><tr><td>T4 RNA Ligase 1</td><td>New England Biolabs, UK</td><td>M0437</td><td>RNA 원형 화</td></tr><tr><td>용 Tetrasodium 피로인산</td>염 <td>시그마-알드리치, 미국</td><td>221368</td><td>추출 완충액</td></tr><tr><td>TIANgel midi 정제 키트</td>의 제조를 위해 <td>Tiangen Biotech, 중국</td><td>DP209</td> 아가로스 젤 트리스 알라딘, 중국 T110601에서 <td>DNA 단편을 정제하기 위해</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>1x TAE 완충액</td></tr><tr><td>TRIzol 시약을</td> 제조하기 위해 <td>Invitrogen, 미국</td><td>15596026</td><td>미토콘디랄 RNA를 추출하기 위해.</td></tr><tr><td>범용 DNA 정제 키트</td><td>Tiangen Biotech, 중국</td><td>DP214</td><td>제한 효소 분해 반응에서 선형화 된 플라 미드를 복구하기 위해</td></tr><tr><td>Xylene cyanol FF</td><td>Sigma-aldrich, USA</td><td>X4126</td><td>아가로 오스 젤 전기 영동을위한 로딩 버퍼 준비</td></tr></tbody></table>

원형 rt-pcr 기반 전략을 사용하여 옥수수 미토콘드리아의 기본 및 처리된 성적증명서의 차별 및 매핑

Discrimintion and Mapping of the Primary and Processed Transcripts in Maize Mitochondrion Using a Circular RT-PCR-based Strategy

식물 미토콘드리아에서, 몇몇 정상 상태 전사체는 전사 개시 (1 차 적인 전사체)에서 파생된 5' 삼인산염이 있고, 그 외는 5' 단인산염 생성 후 전사 (처리된 전사)를 포함합니다. 성적 증명서의 두 가지 유형을 구별하기 위해, 몇 가지 전략이 개발되었으며, 그들 대부분은 5 '삼인산염의 존재 / 부재에 따라 달라집니다. 그러나, 1 차 5'termini에 있는 삼인산염은 불안정하고, 녹취록의 2개의 모형의 명확한 차별을 방해합니다. 옥수수 미토콘드리아에 안정적으로 축적된 1차 및 처리된 전사체를 체계적으로 차별화하고 매핑하기 위해 cRT-PCR, RNA 5' 폴리포슈파타제 처리, 정량적 을 결합하여 원형 RT-PCR(cRT-PCR) 기반 전략을 개발했습니다. RT-PCR(RT-qPCR) 및 북부 블롯. 개선으로, 이 전략은 불안정한 5' 삼인산염의 영향을 최소화하기 위한 RNA 정규화 단계를 포함한다.
이 프로토콜에서 농축 된 미토콘드리아 RNA는 RNA 5 '폴리포스파타제에 의해 전처리되어 5'삼중산염을 모노포스페이트로 변환합니다. 순환화 및 역전사 후, 5' 폴리포스파타스 처리 및 비처리 RNA로부터 유래된 2개의 cDNA는 5' 말단을 처리하고 5' 폴리포스파타제에 민감하지 않은 옥수수 26S 성숙한 rRNA에 의해 정규화된다. 정규화 후, 1차 및 처리된 전사체는 처리된 RNA로부터 수득된 cRT-PCR 및 RT-qPCR 제품을 비교하여 차별된다. 전사체 테르미니는 cRT-PCR 제품의 클로닝 및 시퀀싱에 의해 결정된 다음, 북부 블롯에 의해 검증된다.
이 전략을 사용 하 여, 옥수수 미토 콘 드리 온에서 가장 꾸준한 상태 성적 증명서 결정 되었습니다. 일부 미토콘드리아 유전자의 복잡한 전사체 패턴으로 인해, 몇몇 정상 상태 전사체는 북부 얼룩에서 검출되었지만 분화 및/또는 매핑되지 않았습니다. 우리는 이 전략이 다른 식물 미토콘드리아또는 석고에 있는 정상 상태 전사체를 차별하고 지도로 지도하기에 적당한지 확실하지 않습니다.

미토콘드리아 RNA 원형화 효율 추정
이전 연구에서, 총 및 미토콘드리아 RNA는 모두 애기장대에서 미토콘드리아 전사체 종단의 cRT-PCR 매핑에 사용되었고(애기장대탈리아나),두 가지 유형의 RNA는 유사한 매핑 결과를12로주었다. 처음에, 우리는 또한 옥수수에 있는 미토콘드리아 전사체 termini의 cRT-PCR 매핑을 위한 총 RNA를 이용했습니다. 많은 시험 후에, 우리는 표적 성적 증명서가 검출하기 어렵다는 것을 것을을 발견했습니다. 개선으로, 우리는 옥수수 개발 커널에서 미토콘드리아 RNA를 풍부하게하고, 그것은 가능한 PCR의 한 라운드에서 원형 대상 전사체의 증폭을 했다.
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우리는 원형 RT-PCR, 정량적 RT-PCR, RNA 5' 폴리포스파타제 처리 및 북부 블롯을 결합하여 원형 RT-PCR 기반 전략을 제시합니다. 이 프로토콜은 불안정한 5' 삼인산염의 영향을 최소화하기 위한 정규화 단계를 포함하며, 옥수수 미토콘드리아에 안정적으로 축적된 1차 및 처리된 전사체를 차별하고 매핑하는 데 적합하다.

원형 RT-PCR 기반 전략을 사용하여 옥수수 미토콘드리아의 기본 및 처리된 성적증명서의 차별 및 매핑

In plant mitochondria, some steady-state transcripts have 5&#39; triphosphate derived from transcription initiation (primary transcripts), while the ...

이 프로토콜은 옥수수 미토콘드리아에서 기본 및 처리 된 성적 증명서의 매핑 및 차별에 사용됩니다. 이 기술은 RNA 정규화 단계를 포함하고 1 차및 처리된 성적증명서 사이 명확한 차별을 방해하는 불안정한 5개의 프라임 triphosphate의 영향을 최소화합니다. 옥수수 미토콘드리아 외에, 이 방법은 플라스티드 및 기타 식물 미토콘드리아에 적용 될 수있다.먼저 20그램의 커널을 얼음 위에 50밀리리터 튜브로 모으십시오. 커널을 미리 냉각된 박격포로 옮기고 10~20밀리리터의 얼음 냉기 추출 버퍼를 추가합니다. 커널을 완전히 갈고, 추출 버퍼를 더 추가하고 필터 천의 두 층을 통해 지상 조직을 필터링합니다.10 분 동안 8, 000 배 G에서 여과를 원심 분리합니다. 그런 다음 상체를 새 튜브로 옮기고 여과물을 폐기합니다. 10 분 동안 20, 000 배 G에서 튜브를 원심 분리합니다.상체를 붓고 6 밀리리터의 세척 버퍼로 펠릿을 다시 중단합니다. Aliquot는 서스펜션을 5개의 1.5 밀리리터 RNase 프리 튜브로 인용하고 5분 동안 14, 000배 G에서 원심분리합니다. 상체를 버리고 미토콘드리아 펠릿을 액체 질소로 동결하십시오.제조 업체의 지시에 따라 상용 시약을 사용하여 미토콘드리아 RNA를 추출하고 RNA 5 가지 주요 폴리 인산염 치료를 설정합니다. 이어서, RNA 정제 키트로 RNA를 회수한다. RNA 추출에 사용되는 시약은 위험합니다.항상 연기 후드에서 작업하고 항상 실험실 코트와 장갑을 착용. 처리된 5개의 주요 폴리포스파아제 및 비처리 미토콘드리아 RNA의 동일한 양을 사용하여 2개의 순환화 반응을 준비합니다. 12-16시간 동안 섭씨 16도에서 두 반응을 모두 배양한 다음 이전에 사용한 RNA 정제 키트로 자체 계합 RNA를 회수합니다.26 SCRT의 동일한 비율로 프라이머 혼합물을 준비하고 최대 7 개의 다른 역 전사 프라이머를 준비하여 시작합니다. 원고 방향에 따라 두 개의 역전사 반응 시스템을 조립하고 50 분 동안 섭씨 42도에서 배양하십시오. cDNA를 정상화하기 위해, 5개의 주요 폴리포스파타제 처리 또는 비처리 RNA에서 동일한 양의 cDNA의 2개의 PCR 반응을 준비하고 원고에 기술된 열순환 조건하에서 반응을 실행한다.26S 성숙한 rRNA에 의한 정규화는 1차 및 처리된 성적증명서를 구별하는 중요한 단계이다. 두 PCR 제품의 풍부를 비교하고 필요한 경우 템플릿 cDNA의 양을 조정하여 정규화를 최적화합니다. 정규화된 cDNA의 적절한 볼륨과 5개의 프라임에서 대상 성적증명서의 3가지 주요 접합체와 같은 이가지 프라이머 한 쌍으로 PCR 반응을 준비하고 원고 방향에 따라 PCR을 수행한다.그런 다음, 중첩 된 PCR에 의해 증폭되는 눈에 띄는 밴드를 분리하는 젤 DNA 복구 키트를 사용합니다. 표준 기술을 사용하여 젤 정제 PCR 제품을 벡터로 복제하고 콜로니 PCR을 수행하여 대상 인서트를 포함하는 양수 클론을 선택합니다. PCR 제품을 서열화하고 기본 국소 정렬 검색 도구 또는 BLAST를 사용하여 옥수수 미토콘드리아 게놈과 시퀀싱 데이터를 정렬합니다.유기체 옥수수를 선택하고 데이터베이스 뉴클레오티드 수집을 검색합니다. 원형 성적증명서의 5개의 프라임에서 3개의 프라임 접합을 찾아 5개의 프라임 및 3개의 주요 성적증명서 테르미니의 위치를 결정한다. RNA 프로브를 준비하고 T7 프로모터, 17개의 염기 쌍이 삽입 부위의 상류에 포함된 이전에 사용된 벡터로 복제하는 데 사용되는 DNA 단편을 증폭한다.RNA 프로브에 dig-11-UTP로 라벨을 지정하고 상용 키트를 사용하여 RNA 혼성화를 수행합니다. 정규화된 5가지 주요 폴리인세파아제 처리 및 비처리 RNA로부터 얻은 원형 RT-PCR 제품을 비교하여 1차 및 처리된 5개의 주요 끝을 차별한다. 그런 다음 매핑 결과를 기반으로 정량적 RT-PCR 프라이머를 설계하고 RT-PCR로 차별 결과를 확인합니다.COX-2 유전자는 원형 RT-PCR 기반 전략으로 옥수수 미토콘드리아 전사체의 매핑 및 차별을 입증하는 예로 사용되었다. 정규화된 cDNA는 PCR용 템플릿으로 사용되었으며, 그 결과 5개의 주요 폴리포스파타제 처리 샘플에서 두 개의 저명한 밴드가 증폭되었습니다. 두 밴드는 COX-2 1과 2개의 젤에서 회수되어 벡터로 복제되었습니다.콜로니 PCR 결과는 양성 클론이 가변 크기의 인서트를 포함하고 있으며, 이는 테르미니가 이질성 5개의 프라임 또는 3개의 프라임 테르미니를 가지고 있음을 의미한다. 시퀀싱 결과는 COX-2 1 과 2가 정지 코돈의 39 뉴클레오티드 하류에서 동일한 3개의 프라임 엔드를 가지고 있으며, 5개의 주요 종말은 각각 992 대 1, 030 및 1, 276 대 1, 283 뉴클레오티드 상류에 위치한 것으로 나타났다. RNA 젤 블롯 혼성화는 COX-2 1 및 2와 유사한 크기를 가진 원형 RT-PCR 매핑 결과 및 2개의 주요 대역을 검증하기 위해 수행되었다.또 다른 쌍의 이산 프라이머는 RNA 젤 블롯으로 검출된 COX-2 3 및 4개의 밴드를 증폭하도록 설계되었지만 처음 원형 RT-PCR로는 그렇지 않았습니다. 정량적 RT-PCR 결과는 COX-2 1, 2, 3 및 4가 5개의 주요 폴리포스파타제에 민감하고 5개의 주요 테르미니를 가졌다는 것을 확인했습니다. 이 프로토콜에는 포함되지 않지만 프라이머 확장 분석을 수행하여 5가지 주요 매핑 결과를 확인할 수 있습니다.

discrimintion-mapping-primary-processed-transcripts-maize

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

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