Name: 클릭 가능한 케이지 화합물의 설계, 합성 및 광화학적 특성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: 학습하세요 클릭 가능한 케이지 화합물의 설계 및 합성 방법을 광화학적 특성 분석과 함께. 이 기술은 신경과학 연구에서 세포 표적화와 광 활성화 실험에 활용됩니다.

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이 작품은 JSPS KAKENHI 교부금 번호 JP16H01282 (TF), 혁신적인 영역에 대한 과학 연구를위한 보조금 "메모리 역동성", JP19H05778 (TF), "MolMovies"에 의해 지원되었습니다.

1. 클릭 가능한 케이지 화합물을 위한 모듈식 케이지 paBhc 그룹의 합성28,41
<ol><li>
제제 (6-브로모-7-하이드록시쿠마린-4-yl)메틸 클로라이드 (Bhc-CH2Cl)
	<ol>
<li>교반기가 장착된 100 mL 라운드 바닥 플라스크에 4-브로모어소르시놀(9.742 g, 51.5 mmol)을 놓습니다.</li>
		<li>H2 SO4(98%, 30 mL)를 플라스크에 넣고 혼합물을 저어 녹입니다.</li>
		<li>에틸 4-클로로아세테이트(10 mL, 74 mmol)를 드롭와이즈에 넣으세요.</li>
		<li>혼합물을 주변 온도에서 5일 동안 계속 저어줍니다.</li>
		<li>별도로 으깬 얼음 조각(~200 mL)을 500 mL 에를렌마이어 플라스크에 넣습니다.</li>
		<li>반응 혼합물을 얼음에 붓고 미세하게 가루침이 얻을 때까지 30 분 동안 힘차게 저어줍니다.</li>
		<li>진공 여과를 통해 침전물을 수집합니다. 밝은 갈색 침전물을 물로 5 번 씻으소서.</li>
		<li>밤새 진공 하에서 침전물을 건조하여 bhcCH2Cl을 연갈색 분말(13.57 g, 46.9 mmol)으로 산출한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
메탄올 (6-브로모-7-하이드록시쿠마린-4-yl)의 제조 (BhcCH2OH)
	<ol>
<li>준비된 BhcCH2Cl(1.1440 g, 3.95 mmol)과 1M HCl(300 mL)을 딤로스 콘덴서가 장착된 둥근 바닥 플라스크 1L에 놓습니다. 혼합물을 140°C에서 5일간 저어줍니다. 이 시간 후, 주위 온도에 혼합물을 냉각.</li>
		<li>진공 하에서 회전 증발에 의한 반응으로부터 물을 제거하여bhcCH2OH(1)를 연갈색 분말(1.0359 g, 3.82 mmol, 97% 수율)으로 산출한다. 참고: bhcCH2Cl 1g당 1M HCl의 250mL를 사용하면 만족스러운 결과를 제공합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
만니치 반응을 통한 paBhcCH2OH (2)의 제조
	<ol>
<li>파라포름알데히드(446.4 mg, 14.9 mmol)를 50 mL 의 둥근 바닥 플라스크에 놓습니다. 플라스크에 무수 에탄올(5 mL)과 N-메틸프로파르가밀(1.25 mL, 14.8 mmol)을 첨가합니다.</li>
		<li>혼합물을 주변 온도에서 1시간 동안 저어줍니다.</li>
		<li>플라스크에 bhcCH2OH(1)(1.367 g, 5.04 mmol)를 추가합니다. 혼합물을 블록 히터 장치로 80°C로 가열하고, Ar 분위기 하에서 2시간 동안 80°C에서 혼합물을 계속 교반한다.</li>
		<li>블록 히터를 중지하고 실온으로 반응 혼합물을 냉각.</li>
		<li>진공 여과에 의해 생성 된 밝은 갈색 - 노란색 침전물을 수집합니다. 소량의 무수 에탄올 (매번 1 mL)으로 침전제를 두 번 씻으하십시오.</li>
		<li>진공 하에서 여분의 에탄올을 제거하여 paBhcCH2OH(2)(1.393 g, 3.96 mmol)를 산출한다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 클릭 가능한 케이지 화합물의 준비
참고: 다음 절차는 하이드록실, 아미노 및 카르복실레이트 작용기를 함유한 다른 클릭 가능한 케이지 화합물의 제조에 적용될 수 있습니다.
<ol><li>
일반 절차 1 : 클릭 할 수있는 케이지 아민의 준비
	<ol>
<li>paBhcCH2OH(2)(709.6 mg, 2.02 mmol) 및 N,N'-카본 디이미다졸 (CDI, 397.6 mg, 2.45 mmol)을 30 mL 의 둥근 바닥 플라스크에 놓습니다. 건조한CH2Cl2(6mL)를 넣고 주변 온도에서 1시간 동안 저어줍니다.</li>
		<li>4-디메틸아미노피리딘(4-DMAP, 324.8 mg, 2.66 mmol)과 테르트-부틸(6-아미노헥실)카르바메이트(533.1 mg, 2.46 mmol)를 첨가합니다. 용액을 주변 온도에서 3시간 동안 저어줍니다.</li>
		<li>진공 하에서 회전 식 증발기로 용매 및 기타 휘발성 물질을 제거하십시오. 실리카 젤 플래시 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 잔류물을 직접 정화합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
일반 절차 2 : 클릭 할 수있는 케이지 알코올의 준비
	<ol>
<li>파클리탁셀(PTX, 48.7 mg, 0.057 mmol)을 30mL 의 둥근 바닥 플라스크에 3방향 스톱콕과 Ar 풍선이 장착된 곳에 놓습니다. 건조CH2Cl2 (1 mL), 4-DMAP (17.1 mg, 0.14 mmol), 및 4-니트로페닐 클로로포메이트 (26.0 mg, 0.13 mmol)를 추가하십시오.</li>
		<li>주위 온도에서 2.5시간 동안 Ar 대기하에서 용액을 저어줍니다.</li>
		<li>용액에 4-DMAP(15.7 mg, 0.13 mmol) 및 paBhcCH2OH(2)(39.1 mg, 0.111 mmol)를 첨가합니다. 혼합물을 주변 온도에서 17 시간 동안 계속 저어줍니다.</li>
		<li>CHCl3(10 mL) 및 15% 수성 NaHCO3(5 mL)을 혼합물에 첨가합니다. 약 3분 간 혼합물을 힘차게 저어줍니다.</li>
		<li>유기층을 함유한 플라스크에 0.5M 구연산(5 mL)을 첨가합니다. 혼합물을 저어 서 위와 같이 수성 층을 제거합니다.</li>
		<li>위상 분리 컬럼을 사용하여 유기층을 분리합니다. 진공 하에서 회전 식 증발기로 용매를 제거하십시오. 표준 실리카 젤 플래시 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 제품을 정화합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
일반 절차 3 : 클릭 할 수있는 케이지 카복실산의 준비
	<ol>
<li>아라키돈산(33.0 μL, 0.100 mmol), paBhcCH2OH(2)(39.6 mg, 0.112 mmol) 및 4-DMAP(14.1 mg, 0.115 mmol)을 드라이CH2Cl2(2 mL)에 용해시. N, N.isopropylcarbodiimide (DIPC, 17.0 μL, 0.110 mmol)를 추가하고 140 분 동안 주변 온도에서 용액을 저어줍니다.</li>
		<li>진공 상태의 용매를 제거합니다. 실리카 젤 플래시 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 잔류물을 직접 정화합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 클릭 가능한 케이지 화합물에 기능 단위 설치
<ol><li>구리(II) 황산 펜타하이드레이트(249 mg)를 이온 교환수(IEW, 10 mL)에 용해하여 0.1 M CuSO4 용액을 부여한다.</li>
	<li>용해 2시-paBhcmoc-PTX (8.0 mg, 6.5 μmol), 트리스 (3-하이드록시프로필리아졸메틸)아민(THPTA, 17.5 mg, 40.3 μmol), 나트륨 L-아스코르브산나트륨 (162.4 mg, 0.825 mmol), 및 15-클로로-3,6,9-trioxapentadecyl 아지드 (3.1 mg, 11 μmol) 0.1 M 인산염의 혼합 용매에 버퍼 (2.5 mL, pH 7.2) 및 디메틸 설폭사이드 (DMSO, 0.5 mL).</li>
	<li>반응 혼합물에 0.1 M CuSO4 용액(81.2 μL, 8.1 μmol)을 첨가한다. 혼합물을 주변 온도에서 80 분 동안 저어 줍니다. 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 사용하여 반응의 진행 상황을 모니터링하십시오.</li>
	<li>75% 아세토니트릴/물 용액(3.5 mL)을 추가하여 침전물을 용해시더드합니다. 생성된 용액을 반준비 HPLC 시스템에 직접 적용하여 원하는 제품을 정화합니다. 참고 : 테르트-부탄올을 첨가하여 반응 혼합물의 용용화는 반응의 진행을 가속화 할 수 있습니다.</li>
</ol>4. 케이지 화합물의 광내성 무분열 반응
<ol><li>재고 솔루션 준비
	<ol>
<li>원하는 케이지 화합물(5 μmol)을 DMSO(500 μL)에 용해하여 10 mM 스톡 용액을 준비한다. 각 용액(10 μL)의 알리쿼트(aliquot)를 1.5mL 미세원원지 튜브에 분배하고 사용하기 직전까지 냉동고(−20°C)에 보관하십시오.</li>
		<li>6 mM K3[Fe(C2O4)3] (100 mL): 80 mL의 물에 재결정 된 폴리옥살산염 (0.295 g, 0.675 mmol)을 용해하십시오. 0.5 M H2SO 4(10mL)와 적당량의 IEW를 추가하여 부피를 100mL로 구성합니다. 참고 : 칼륨 페리 옥살산은 뜨거운 물에서 재결정화를 통해 정제하고 어둠 속에서 저장해야합니다. 재결정된 칼륨 페리옥살레이트는 트리하이드레이트로서 수득된다; 따라서, 그 수식은K3[Fe(C2 O4)3]··3H2O및491.24의 분유 중량을 고려하여 재고용액의 제조시에 고려되어야 한다. 510 nm에서 흡수를 측정하여 6 mM 용액의 순도를 확인하십시오. 흡광도가 <0.02인 경우, 실험에 사용하기에 적합하다.</li>
		<li>0.1% 버퍼 펜 (30 mL): 용해 NaOAc·3H2O (7.35 g), 1,10-페난트랄린 (페난트린)· H2O(30 mg) 및 IEW(20 mL)에서H2SO 4(0.9 mL)를 conc. H. IEW를 추가하여 볼륨을 30mL로 구성합니다. 참고 : 용액은 1.8 M NaOAc, 0.54 M H2SO4및 0.1 % 1,10 페난트린을 포함합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>페리옥살레이트 작용법을 이용한 광자 수 측정
	<ol>
<li>석영 큐벳에 6mM K3[Fe(C2 O4)3](V1 L)을 놓습니다. 5s에 대한 350 nm 빛으로 용액을 조사하십시오.</li>
		<li>조사된 용액을 l[cm] 경로 길이의 파이렉스 큐벳으로 옮긴다.</li>
		<li>조사된 샘플 용액에 0.1% 버퍼-phen(V2 L)을 추가하고 파이펫팅을 통해 잘 섞습니다. 510 nm에서 샘플의 흡광도를 측정합니다. 단위 시간당 평균 흡수 변화를 계산합니다(ΔA510 [s-1]).</li>
		<li>다음 방정식에 따라 단위 시간당 생성된 Fe2+ 이온의 두더지 수를 계산합니다. nFe2+ [몰s-1]= (((((V1 + V2)[L] × ΔA510 [s-1])//(l[cm] × θ510 [L 몰-1 cm-1]), 여기서(V1 +V2)는흡수 측정을 위한 시료의 부피이고, l은 큐벳의 광학 경로 길이이고, θ510은 Fe2+의어금니 흡수성이다- 510 nm에서 펜 복합체. 참고: 일반적인 실험 조건에서 V1 = 2.0 × 10-3 L, V2 = 0.33 × 10-3 L, l = 1.0 cm, θ510 = 1.1 × 104 L mol-1 cm-1을 사용했습니다.</li>
		<li>다음 수식을 사용하여샘플(I0)에도달하는 광자의 두더지 수를 계산합니다. I0 [아인슈타인 cm-2 s-1]= nFe2+ /Φ350 Φ 350은 350 nm에서 페리옥살산염의 광감소의 양자 효율이다. 참고: 350 nm에서 의 칼륨 페리옥살산염 액티노미터의 양자 효율은 보고되지 않았지만, 358 nm에서 1.2542의 보고값이 사용되었다.</li>
	</ol></li>
	<li>350 nm에서 양자 효율 측정
	<ol>
<li>시료 스톡 용액(DMSO, 10 μL)을 K-MOPS 버퍼(pH 7.2, 10 mL)로 희석하여 0.1% DMSO를 함유하는 K-MOPS에서 10 μM 용액을 부여하였다. 참고: K-MOPS 완충액은 100 mM KCl 및10 mM 3-(N-morpholino) 프로판설포닉산(Mops)으로 구성되었으며, KOH를 사용하여 pH 7.2로 적정화되었다.</li>
		<li>화학 작용계의 광반응에 사용된 동일한 큐벳에용액(V1 L)의 aliquot를 전송합니다. 4.2.1단계에서 설명한 것과 동일한 설정을 사용하여 샘플 용액을 조사합니다.</li>
		<li>조사된 용액으로부터 aliquot(50 μL)를 주기적으로 제거하고 HPLC를 사용하여 분석합니다.</li>
		<li>시작 물질의 90%가 반응하는 조사시간(t90%)을결정하여 시작 물질의 시간 의존적 실종의 플롯을 피팅한다. 참고: 방사선의 내부 여과가 무시될 수 있도록 조사된 샘플의 흡광도는 <0.1로 유지되어야 합니다. 원조 물질의 광분석 소비량은 단일 지수 붕괴에 의해 근사화될 수 있으므로 광용해 과정을 방해하는 바람직하지 않은 보조 효과가 없는 것이 바람직합니다.</li>
		<li>다음 수학식28을사용하여실종(Φdis)의양자 수율을 계산합니다. Φ디스 = 1/(t90% × I0 × σ350) 여기서 t90% [s]는 시작 물질의 90%가 소비된 조사 시간이며, I0[아인슈타인cm-2 s-1]은광자의 두더지 수, σ 350[cm]입니다. 2 mol-1]은350 nm에서 샘플의 데카딕 소멸 계수입니다. 참고 : σ350 [cm2 몰-1] = 103θ350 [M-1cm -1].</li>
	</ol></li>
</ol>5. HaloTag 리간드가 있는 클릭 가능한 케이지 화합물 타겟팅
참고: 사용하기 전에, 10% 항생제(스트렙토마이신 황산염, 페니실린 G, 암포테리신)를 함유한 10% 태아 소 혈청(FBS)으로 보충된 덜베코의 변형된 이글 배지(DMEM, 저당, 피루바트, L-글루타민)에서 HeLa 세포를 유지하십시오. 37 °C 및 5%CO2.
<ol><li>배지를 제거하고 트립신-에틸렌디아미네테트라아세트산(EDTA, 1 mL)을 37°C에서 1분간 1분간 처리하여 세포를 트립시니화시키고, 세포에 DMEM(4 mL)을 추가하고 부드럽게 피펫팅하여 세포를 다시 현탁시한다. DMEM (2 mL) 24 시간 전에 35mm 유리 바닥 접시에 접시 당 약 5 × 105 세포를 씨앗.</li>
	<li>4개의 접시에 대해, 1.5 mL 마이크로원심분리튜브에서, 감소된 혈청 배지(700 μL)에서 플라스미드 DNA(pcDNA3-Halo-EGFR, 14 μg)를 희석한다. 별도로, 감소된 혈청 배지(150 μL)에서 지방 흡입 시약(5 μL)을 각각 4개의 튜브에 희석하고 주위 온도에서 5분 동안 방치합니다.</li>
	<li>희석된 플라스미드 DNA(150 μL)의 일부를 각각의 희석된 지방흡입 시약 샘플에 첨가한다. 주변 온도에서 5분 동안 배양합니다.</li>
	<li>세포를 37°C 및 24시간 동안 5%CO2에서 유지한 후, DMEM을 흡인하고 인산완충식염수(PBS, 2 mL)로 세포를 헹구었다. 감소된 혈청 배지(1.5 mL)를 추가합니다.</li>
	<li>각 접시에 플라스미드-리포페션 시약(150 μL) 복합제를 첨가합니다. 세포를 37°C 및 5%CO2에서 48시간 동안 유지한다.</li>
	<li>배지를 흡인하고, 2 μM paBhc-HEX-FITC/Halo를 함유하는 갓 제조된 DMEM(1 mL)의 일부를 첨가하고, 37°C및 5%CO2에서 30분 동안 세포를 배양한다.</li>
	<li>케이지된 화합물을 함유하는 배지를 흡인하고 PBS+(린스당 1 mL)로 세포를 두 번 헹구어 언바운드 화합물을 제거한다. 환원된 혈청 배지(500 μL)를 첨가하고 세포를 37°C 및 5%CO2에서 30분 동안 배양하여 세포에 들어간 화합물을 제거하였다. 참고 : PBS +는 인산염 버퍼링 식염수 2 mM CaCl2 및 1 mM MgCl2로보충되었습니다.</li>
	<li>배지를 제거하고 PBS+(1mL)로 세포를 두 번 헹구십시오. 페놀 레드를 포함하지 않는 배지(1 mL)의 일부를 추가합니다. 레이저 스캐닝 공초점 형광 현미경검사법에 의해 형광 이미지를 기록합니다.</li>
</ol>6. 클릭 가능한 케이지 화합물을 사용하여 키나아제 현지화의 광중재 변조
참고: 사용하기 전에 Ham's F-12 배지에 CHO-K1 세포를 37°C및 5%CO2에서10% FBS로 보충하여 유지하십시오.
<ol><li>DMSO에서 paBhc-AA(5)의 100배작업 용액(1mM)을 준비합니다. 참고: 화합물의 10 mM 스톡 용액을 냉동고(-20°C)에 제조 및 저장한다.</li>
	<li>DMEM (2 mL) 24 시간 전에 35mm 유리 바닥 접시에 접시 당 약 5 × 105 세포를 씨앗.</li>
	<li>GFP-DGKγ 48시간 전에 플라스미드 코딩을 가진 조-K1 세포를 무분별한 실험전에 트랜스펙트. 참고: 형질감염은 5.2-5.5 단계에 따라 수행됩니다.</li>
	<li>배지를 감소된 혈청 배지(2mL)로 교체합니다. 100× paBhc-AA 작업 용액 (20 μL)을 추가하고 5 분에서 1 시간 사이에 37 °C 및 5 %CO2에서 세포를 배양하십시오. 참고: 로딩 시간은 사용되는 화합물에 따라 다릅니다.</li>
	<li>이중 광원 형광 조명기가 장착된 반전형광 현미경의 객관적인 단계에 세포를 놓습니다.</li>
	<li>10초마다 형광 영상을 찍습니다. 또는 유연한 석영 섬유를 통해 Xe 램프를 사용하여 405 nm 빛으로 셀을 조사합니다.</li>
	<li>형광 등 이미지를 10분 동안 계속 기록합니다.</li>
</ol>

우리는 공개 할 것이 없습니다.

이전에는 다양한 생물학적 활성 분자의 bhc 케이지 화합물을 개발하여 높은 광내성 효율을 나타내는28,45,46,47. bhc 케이징 그룹의 레퍼토리를 확대하기 위해 다양한 기능 단위32,40,41의도입으로 쉽게 수정할 수 있는 모듈형 케이지 화합물의 플랫폼도 보고했습니다. 따라서 본 프로토콜은 구리(I)-촉매 후이젠 순환화를 통해 변형될 수 있는 bhc 케이징 기의 클릭 가능한 전구체의 합성방법을 나타낸다. 클릭 가능한 전구체, paBhcCH2OH(2)의합성은 시판되는 4-브로모어소르시놀(도1A)으로부터시작하여 4단계 반응 서열을 통해 달성되었다. 본 프로토콜의 장점은 힘든 정제 단계(예를 들어, 컬럼 크로마토그래피 분리)가 필요하지 않다는 것이다.
클릭 가능한 전구체 paBhcCH2 OH(2)는다양한 작용기를 마스크하는데 사용될 수 있으며, 아민, 알코올 및 카르복실산의 클릭 가능한 케이지 화합물은 2를 전구체로서 사용하여 합성하였다(도1B). 아민은 카바메이트로 수정되었고 알코올은 탄산염으로 수정되었습니다. 일반적인 절차 1 및 2에서, CDI는 클릭 가능한 카르바메이트의 제조에 사용되었고, 4-니트로페닐 클로로포르메이트는 탄산염의 제조에 사용되었다. 반응 메커니즘에 의해 지시된 바와 같이, 두 시약 모두 카르바메이트 및 탄산염의 제조에 사용될 수 있다. 또한 원하는 케이지 화합물의 수율은 케이지되는 분자의 화학 적 구조에 달려 있음을 주목해야한다. 다른 예는 우리의 이전 보고서28,30,33,48에서볼 수 있습니다.
클릭 수정은 보고된절차(49)의약간의 수정을 사용하여 수행되었다. 트리스(triazolylmethyl)아민계 리간드의 첨가는 높은 수율에 양호한 양호한 원하는 제품을 얻기 위해 필요하다. 다양한 아지데스는 상업적 소스와 문헌 절차모두에서 쉽게 구할 수 있기 때문에, 우리는 수용성 및 세포 표적화 능력과 같은 추가 특성을 가진 다양한 모듈식 케이지 화합물을 준비할 수있다(그림 2).
광리해의 양자 수율은 보고된 절차28,50에따라 측정되었다. 도 3은 2-glc-paBhcmoc-PTX의 광용량 소비량과 PTX의 방출이 각각 단일 지수 붕괴 및 상승에 의해 근사화되었다는 것을 보여 주며, 이는 방사선또는 원치 않는 이차 효과의 내부 여과가 없음을 시사한다. 개선된 광용해 양자수율(Φ)과 광용해효율(θΦ)은이전에 보고된 Bhc 케이지 화합물에 비해 클릭 가능한 paBhc 케이지 화합물에 대해 관찰되었다(표1)41, 41, 43. bhc 케이지 화합물의 광용해 효율(θΦ)이2 니트로 벤질 형 케이지 화합물(48)보다100 배 이상 높기 때문에 paBhc 케이지 그룹의 존재로 인한 현저한 개선은 명확하게 이 시스템의 장점입니다.
개념 증명 실험으로서, 친수성 모이티가 2-paBhcmoc-PTX(4)로도입되었고, 세포 표적리간드가 화합물3(도 2)으로도입되었다. 2°C-glc-paBhcmoc-PTX의 용해도는 모PTX(표1)보다650배 높았다. 선택적 세포 표적화는 태그-프로브 시스템을 사용하여 달성되었고, paBhcmoc-hex-FITC/Halo(8)할로태그 리간드를 베어링하는 것은 HaloTag/EGFR 융합 단백질을 발현하는 배양 포유류 세포의 세포막을 성공적으로 표적으로 하였다. 그림 4). 키나아제의 세포외 국소화의 사진 매개 변조도 클릭 가능한 케이지 화합물5(도 5)를사용하여 달성되었다. 
결론적으로, 우리는 성공적으로 수용성 및 세포와 같은 추가 특성으로 쉽게 수정 할 수있는 생물학적으로 흥미로운 분자의 사진 케이지 화합물에 대한 클릭 가능한 플랫폼의 제조 방법을 입증했습니다. 타겟팅 능력. paBhc 케이징 그룹은 수정 가능한 작용기를 가진 임의의 분자를 준비하는데 사용될 수 있기 때문에, 본 프로토콜의 적용은 본원에 기재된 분자에 한정되지 않는다. 모듈형 플랫폼, 즉 paBhc 케이지 그룹을 사용하여 원하는 케이지 화합물을 쉽게 제조할 수 있으며 클릭 수정을 통해 물리적 및 화학적 특성을 조절할 수 있습니다.

케이지드 화합물은 원래 의 기능을 공유적으로 부착 된 사진 이동식 보호 그룹에 의해 시간적으로 가려진 합성 분자로 설계되었습니다. 흥미롭게도, 생물학적으로 관련된 분자의 케이지 화합물은 세포 생리학1,2,3,4,5의 시공간적 조절을 위한 필수 방법을 제공한다. ,6. 1977년, 엥겔스와 슐라에거는 cAMP 7의 막 투과성 및 포토래블 유도체로서cAMP의2-니트로벤질 에스테르를 보고했다. 다음 해, 카플란은 ATP (NPE-ATP)의 1-(2-nitrophenyl)에 에틸 에스테르를 보고하고이 화합물을 "케이지"ATP8로명명했습니다. 그 이후, 2-니트로벤질, p-하이드록시페나실9, 2-(2-니트로페닐)에틸10,11,7-니트로인돌린-1-yls12와같은 광화학적으로 이동식 보호기의범위, 도 13,(쿠마린-4-yl) 메틸스14,15,16은 케이지 화합물의 제조에 사용되어 왔다.
막 투과성, 수용성 및 세포 표적화 능력과 같은 바람직한 추가 특성을 가진 케이지화합물의 합성은 세포 생물학적 응용을 용이하게 할 것으로 기대된다. 이러한 분자의 물리적 및 광화학적 특성은 주로 광화학적으로 이동식 보호 기의 화학적 구조에 의존하기 때문에 이를 준비하는 데 사용되는 광세이징 그룹의 다양한 레퍼토리가 필요합니다. 그러나, 높은 광용해 효율성을 나타내는 현재 이용 가능한 세이징 그룹의 구조적 다양성은 제한적입니다. 이것은 케이지 화합물의 사용을 증가에 장애물이 될 수 있습니다.
이 문제를 해결하기 위해 기존 광분리형 보호군의 화학적 변형이나 뛰어난 광물리적 및 광화학적 특성을 가진 새로운 광연성 크로모포어의 설계를 통해 광지보호군의 레퍼토리가 확장되었습니다. 예로는 니트로디벤조푸란(NDBF)17,[3-(4-4,5-디메톡시-2-니트로페닐)-2-부틸] (DMNPB)18,19,칼슘에 민감한 2-니트로벤질 광케이지20,대체 쿠마리닐메틸(DEAC45021) , DEAdcCM22,7-아제티디닐-4-메틸쿠마린23,및 스티릴 쿠마린24,시안 유도체(CyEt-pan)25,및 BODIPY 유도체26,27.
또한, 이전에는 (6-브로모-7-하이드록시코마린-4-yl) 메틸(Bhc) 그룹을 개발하고 신경전달물질28,제2 메신저29,30,및 다양한 케이지 화합물을 성공적으로 합성하였다. 올리고뉴클레오티드31,32,33은 큰 1광자 및 2광자 여기 단면을 나타낸다. 추가 속성은 감광성을 손상시키지 않고 케이징 그룹에 쉽게 설치할 수 있다면, 케이지 화합물의 레퍼토리는34,35,36, 37,38,39. 따라서 우리는 세 부분으로 구성된 모듈 형 케이지 화합물, 즉 Bhc 그룹을 사진 반응 코어로, 추가 기능 설치를위한 화학 적 손잡이 및 마스크 될 분자40을 설계했습니다. 41.
따라서, 본 문서는 생물학적으로 관련된 분자의 케이지화합물의 제조를 위한 실용적인 방법을 제공한다. 본 프로토콜은 사진 케이지 그룹을 위한 클릭 가능한 플랫폼의 준비 방법, 케이지 화합물의 레퍼토리를 확장하기 위한 추가 기능의 도입, 물리적 및 광화학적 측정에 대해 설명합니다. 추가 셀룰러 애플리케이션을 위한 클릭 가능한 케이지 화합물의 세포 유형 선택적 타겟팅.

<table><tbody><tr><td>아세토 니트릴, EP</td><td>Nacalai</td><td>00404-75</td><td></td></tr><tr><td>아세토 니트릴, 슈퍼 탈수</td><td>후지 필름 Wako</td><td>010-22905</td><td></td></tr><tr><td>항생제 - 항진균제, 100X</td><td>Thermo Fisher</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>4- 브로 모레 소르 시놀</td><td>TCI 화학 물질</td><td>B0654</td><td></td></tr><tr><td>N, N'- 카르 보닐 디 미다 졸</td><td>후지 필름 Wako</td><td>034-10491</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>Kanto</td><td>07278-71</td><td></td></tr><tr><td>구리(II) 황산염 5수화물, 99.9%</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>032-12511</td><td></td></tr><tr><td>디클로로메탄, 탈수</td><td>Kanto</td><td>11338-05</td><td></td></tr><tr><td>N,N'-디이소프로필카르보디이미드(DIPC)</td><td>TCI 화학</td><td>D0254</td><td></td></tr><tr><td>4-디메틸아미노피리딘</td><td>TCI 화학</td><td>D1450</td><td></td></tr><tr><td>디메틸설폭사이드, 탈수 -</td><td>super-Kanto</td><td>10380-05</td><td></td></tr><tr><td>DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Sigma</td><td>D6046-500ML</td><td></td></tr><tr><td>이중 광원 형광 조명기, IX2-RFAW</td><td>올림푸스</td><td></td><td></td></tr><tr><td>에탄올(99.5)</td><td>후지필름 Wako</td><td>054-07225</td><td></td></tr><tr><td>에틸 4-클로로아세토아세테이트</td><td>TCI 화학 물질</td><td>C0911</td><td></td></tr><tr><td>햄 F-12 L-글루타민/페놀 레드</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>087-08335</td><td></td></tr><tr><td>염산</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>087-01076</td><td></td></tr><tr><td>도립 형광 현미경 IX-71</td><td>올림푸스</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ISOLUTE 상 분리기 15mL</td><td>Biotage</td><td>120-1906-D</td><td></td></tr><tr><td>L-(+) ● 아스코르빈산 나트륨 염</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>196-01252</td><td></td></tr><tr><td>레이저 스캐닝 형광 컨포칼 현미경, FLUOVIEW FV1200/IX-81</td>, <td>올림푸</td><td></td><td></td></tr>스 <tr><td>리포펙타민 2000, 형질주입 시약</td><td>, Thermo Fisher</td><td>11668027</td><td>lipofection 시약</td></tr><tr><td>3-(N-모르폴리노)프로판설폰산</td><td>, 도진도</td><td>345-01804</td>, <td>걸레,</td></tr><tr><td>4-니트로페닐클로로포르메이트(4-NPC)</td><td>, TCI 화학 물질</td><td>C1400</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I 환원 혈청 매체, 페놀 레드 없음</td><td>Thermo Fisher</td><td>11058021</td><td>환원 혈청 배지에는 페놀이 레드가 포함되어 있지 않습니다</td></tr><tr><td>1,10- 페난트롤린 일수화물</td><td>Nacalai</td><td>26707-02</td><td></td></tr><tr><td>RPR 350 nm 램프가있는 광화학 반응기</td><td>Rayonet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Potassium Trioxalatoferrate (III) trihydrate</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>W01SRM19-5000</td><td></td></tr><tr><td>아세트산 나트륨 Trihydrate</td><td>Nacalai</td><td>31115-05</td><td></td></tr><tr><td>중탄산나트륨</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>199-05985</td><td></td></tr><tr><td>황산, 96-98%</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>190-04675</td><td></td></tr><tr><td>Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine (THPTA)</td><td>ALDRICH</td><td>762342-100MG</td><td></td></tr><tr><td>tri-Sodium Citrate Dihydrate</td><td>Nacalai</td><td>31404-15</td><td></td></tr><tr><td>크세논 라이트 소스, MAX-303</td><td>아사히 스펙트라</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

클릭 가능한 케이지 화합물의 설계, 합성 및 광화학적 특성

Design, Synthesis, and Photochemical Properties of Clickable Caged Compounds

케이지된 화합물은 높은 시공간적 분해능으로 세포 생리학의 사진 매개 조작을 가능하게 합니다. 그러나, 현재 사용 가능한 케이지 그룹의 제한된 구조적 다양성과 광용해 효율을 희생하지 않고 합성 변형의 어려움은 살아있는 세포에 대한 케이지 화합물의 레퍼토리를 확장하는 데 걸림돌이 됩니다. 응용 프로그램. 쿠마린 형 광케이지 그룹의 화학적 변형은 다양한 물리적 및 화학적 특성을 가진 케이지 화합물의 제조를위한 유망한 접근법이기 때문에, 우리는 변형 될 수있는 클릭 가능한 케이지 화합물의 합성 방법을보고합니다. 구리(I)-촉매 Huisgen 순환화를 통해 다양한 기능 단위로 쉽게. 모듈형 플랫폼 분자는 광세이징 기로서 메틸(6-브로모-7-하이드록시코마린-4-yl) 그룹을 포함하며, 이는 종래의 2-니트로벤질에 비해 높은 광용해 효율을 나타낸다. 아민, 알코올 및 카르복실레이트 (carboxylates)를 포함하는 클릭 가능한 케이지 화합물의 제조를위한 일반적인 절차가 제시됩니다. 수용성 및 세포 표적화 능력과 같은 추가 특성은 클릭 가능한 케이지 화합물에 쉽게 통합될 수 있다. 더욱이, 광리해 양자 수율을 포함한 물리적 및 광화학적 특성은 측정되었고 상응하는 Bhc 케이지 화합물보다 우수한 것으로 나타났다. 따라서 기재된 프로토콜은 사용 가능한 케이지 화합물에서 구조적 다양성의 부족에 대한 잠재적인 해결책으로 간주될 수 있다.

아라키돈산 및 파클리탁셀을 포함하는 일부 생물학적으로 흥미로운 분자의 클릭 가능한 케이지 화합물은 성공적으로 합성되었다(도1)28,41. 수용성 및 세포 표적화 능력과 같은 추가적인 특성은 구리(I)-촉매 후이젠 사이클화("클릭" 반응)를 통해 paBhcmoc-PTX내로 도입되었다(그림2). 이러한 클릭 가능한 케이지 PTX는 350 nm(그림3)에서조사시 부모 PTX를 생성하기 위해 포토즐로이징되었고, 클릭 가능한 케이지 화합물의 물리적 및 광화학적 특성은 표 1에 요약되어 있다. 클릭 가능한 케이지 화합물 2θ-glc-paBhcmoc-PTX(Φdis 0.14) 및 paBhc-AA(Φ디스 0.083)의 양자 수율은 기존의 Bhc 케이지 화합물 2θ-Bhcmoc-PTX(Φdis)의 2배 이상이었습니다. 0.040) 및 Bhc-AA(Φ디스 0.038)43. 또한, 글루코스 무에티를 함유하는 2°C-glc-paBhcmoc-PTX에 대해 향상된 수용성이 관찰되었다.
살아있는 세포 실험에서, HaloTag 단백질 및 표피 성장 인자 수용체(EGFR)의 융합 단백질을 일시적으로 발현하는 배양포유류 세포에 paBhc-hex-FITC/Halo를 표적화하는 것이 성공적으로 달성되었다. 파브헥스-FITC/Halo의 플루오레세인 모에티의 녹색 형광은 세포막상에서 관찰되었다(도4). 키나아제의 세포외 국소화의 광 매개 변조는 paBhc 케이지 화합물을 사용하여 달성되었다. 디아실글리세롤 키나아제 γ(DGKγ)의 전좌는아라키돈산(AA)(AA)(44)의존재 로부터 활성화되는 것으로 보고되었다. GFP-DGKγ를 일시적으로 발현하는 CHO-K1 세포를 AA 또는 paBhc-AA(5)로 처리하였다. AA의 첨가는 DGKγ의 세포외 국소화의 변조를일으켰다(그림 5A,B). UV 광에 노출된 후 paBhc-AA 처리 된 세포에 대해 DGKγ의 국소화에서 유사한 변화가 관찰되었다(도 5C,D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60021/60021fig01.jpg"> 그림 1: 클릭 가능한 케이지 화합물의 제조. (A)시약 및 조건: a. 에틸 4-클로로아세토아세테이트/conc. H2SO4/rt/7일/91% 수율, b. 1 M HCl/역류/3일/97% 수율. c. N-메틸 프로 파르 가일 라민 / HCHO / EtOH, 다음(1)를추가하고 17 h / 79 % 수율에 대한 역류에서 가열. (B)클릭 가능한 케이지 아민, PTX 및 아라키돈산의 합성. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60021/60021fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60021/60021fig02.jpg"> 그림 2: 클릭 가능한 케이지 화합물에 기능 단위를 설치합니다. (a)구리(I)를 통한 수용성 케이지 PTX의 합성-촉매 후이젠 순환화. (B)세포 타겟팅을 위한 HaloTag 리간드를 포함하는 클릭 가능한 케이지 화합물의 구조. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60021/60021fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60021/60021fig03.jpg"> 그림 3: 2의 광리화-glc-paBhcmoc-PTX (6). K-MOPS 용액(pH 7.2)에서 샘플(10 μM)을 350 nm에서 조사하였다. (A) 6의 광용해 (254 nm에서 측정)에 대한 전형적인 HPLC 추적. 샘플을 지정된 조사 시간에 분석하였다. (B) 6의사진 용광을위한 시간 코스 . 파란색 원은 6의소비를 보여줍니다. 실선은 6에대한 간단한 감쇠 지수에 대한 최소 사각형 곡선 맞춤을 보여줍니다. 빨간색 사각형은 PTX의 수율을 보여줍니다. 오류 막대는 표준 편차(±SD)를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60021/60021fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60021/60021fig04.jpg"> 도 4: paBhc-hex-FITC/Halo(8)로 배양된 배양 포유류 세포의 형광 이미지. pcDNA3-Halo-EGFR로 형질감염된 세포를 37°C에서 화합물 8의 2 μM 용액으로 30분 동안 배양하였다. 이미지는 PBS+로 반복 세척한 후에 얻어졌습니다. 모의 처리 HEK293T 세포(A: 차동 간섭 대비 (DIC) 이미지와 D: 형광 이미지.) HEK293T세포(B 및 E)및 HeLa세포(C 및 F)는Halo-EGFR(B 및 C: DIC 이미지 및 E 및 F:형광 이미지)을 일시적으로 발현한다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60021/60021fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60021/60021fig05.jpg"> 도 5: BHC 케이지 아라키돈산으로 배양된 CHO-K1 세포의 UV 조사 후형광 이미지. CHO-K1 세포를 융합 단백질 DGKγ-EGFP로 형질감염하였다. (A)형질감염된 세포의 형광 이미지. (B)아라키돈산의 10 μM 용액을 첨가한 후 100s. (C)세포는 37°C에서 paBhc-AA(5)의10 μM 용액을 5분 동안 배양하였다.(D)100s 후 20-s UV 조사(330-385 nm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60021/60021fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>화합물</td>
			<td>λ 최대(nm) 
</td>
			<td>θ최대 (M-1cm -1)b
</td>
			<td>φ디스c
</td>
			<td>θφ디스d
</td>
			<td>용해도(μM)e
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ptx</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>2'-Bhcmoc-PTX</td>
			<td>340</td>
			<td>10500</td>
			<td>0.040</td>
			<td>400</td>
			<td>55</td>
		</tr>
<tr>
<td>2'-pabhcmoc-PTX</td>
			<td>359</td>
			<td>9300</td>
			<td>0.059</td>
			<td>670</td>
			<td>8.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>2'-글록-Bhcmoc-PTX</td>
			<td>373</td>
			<td>12300</td>
			<td>0.14</td>
			<td>1280</td>
			<td>650</td>
		</tr>
<tr>
<td>bhc-AA</td>
			<td>341</td>
			<td>10800</td>
			<td>0.038</td>
			<td>390</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>paBhc-AA</td>
			<td>366</td>
			<td>10300</td>
			<td>0.083</td>
			<td>750</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 클릭 가능한 케이지 화합물의 물리적 및 광화학적 특성. a. 흡수 최대 (nm), b. λ최대에서 몰 흡수율(M-1 cm-1),c. 350 nm, d에서 시작 물질의 실종의 양자 수율. 어금니 흡수율및 350 nm에서의 양자 수율의 생성물, e. K-MOPS(pH 7.2)에서 포화 용액의 농도(μgmL-1).

클릭 가능한 moieties를 가진 모듈식 케이지 화합물의 광화학적 특성의 합성 및 측정을 위한 프로토콜이 제시된다.

Caged compounds enable the photo-mediated manipulation of the cell physiology with high spatiotemporal resolution. However, the limited structural ...

이 절차의 전반적인 목표는 수용성 또는 세포 표적화 능력과 같은 추가 특성을 가진 광케이지 화합물의 제조를 위한 실용적인 방법을 제공하는 것입니다. 간단한 합성 절차를 사용하여,이 기술은 케이지 화합물을 통해 실험실을 확장하고 자신의 감광성을 손상시키지 않고 추가 특성으로 케이지 화합물을 만드는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 합성은 우리의 클릭 가능한 케이지 화합물이 디클로로메탄 또는 디메틸 설프리산화물과 같은 비뉴클레오필유기 용매에 용해될 때 사진 조사에 안정적이기 때문에 표준 실험실에서 수행될 수 있다.사사키 히로나와 함께 절차를 시연하는 것은 실험실에서 졸업생인 아오키 하나미와 와타히키 레이노부 스즈키 아키노부입니다. 709.6 밀리그램의 paBhc 메탄올과 397.6 밀리그램의 n-carbonyldiimidazole을 30 밀리리터 라운드 바닥 플라스크에 첨가하여 시작하십시오. 플라스크에 건조 6 밀리리터디클로로메탄을 넣고 1시간 동안 주변 온도에서 용액을 저어줍니다.인큐베이션이 끝나면 342.8 밀리그램의 4-디메틸아미노피리딘과 552마이크로리터의 테르부틸 6-아미노 헥실 카바메이트를 넣고 3시간 동안 주변 온도에서 용액을 저어줍니다. 그런 다음 진공 하에서 회전 증발기를 사용하여 용매 및 기타 휘발성 물질을 제거하고 실리카 젤 플래시 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 잔류물을 직접 정화합니다. 딸깍 잘 수 있는 케이지 화합물에 기능성 장치를 설치하려면 구리 2개의 황산펜타하이드레이트 249밀리그램을 이온 교환 수의 10밀리리터에 녹여 0.1 어금니 구리 황산염 용액을 제공합니다.두 개의 프라임 paBhc 모의 파클리 탁셀의 8 밀리 그램을 용해, 트리의 7.5 밀리그램 (3-하이드록시 프로필트리아졸리아졸리멜메틸)amine, 162.4 밀리그램의 나트륨-l-아스코르바테, 15-클로로-3, 6, 9-트리옥시펜틸데실 아지드의 혼합 용매에서 0.1 어금강 완충제 및 0.5 밀리리터의 디메틸 산화물. 다음으로, 반응 혼합물에 0.1 개의 어금니 구리 황산염 용액의 81.2 마이크로 리터를 추가하고 HPLC와의 반응의 진행 상황을 모니터링하면서 80 분 동안 주변 온도에서 혼합물을 저어줍니다. 반응의 끝에서, 75%의 아세틸 니트리에 수액의 3.5 밀리리터로 침전물을 해결하고 원하는 제품을 정화하기 위해 반 전가HPLC 시스템에 직접 결과 용액을 적용한다.양자 효율 측정을 위해 UV 광 차단 필터로 덮인 형광 램프 아래에서 10 밀리리터의 KMOPS 버퍼로 디메틸 설산화물 10 마이크로리터로 샘플 스톡 솔루션을 희석하십시오. 화학 작용계의 사진 반응에 사용되는 동일한 시험관으로 용액의 알리쿼트전달. 350나노미터 광을 5초 동안 350나노미터 광으로 시료 용액을 조사하여 HPLC의 분석을 위해 주기적으로 조사된 용액에서 50개의 마이크로리터 알리쿼트를 제거합니다.그런 다음 시작 재료의 90 %가 시작 재료의 시간 의존적 실종의 피팅 플롯에 의해 반응되는 초에서 조사 시간을 결정합니다. 할로택 리간드의 경우, 적절한 세포 해리 시약으로 관심있는 대상 세포 집단을 수확하고 DMEM 농도의 밀리리터 당 5 세포당 2.5 배 10에서 세포를 다시 중단하십시오. 그런 다음 접시 당 5 세포당 약 10에서 35 밀리리터 유리 바닥 접시에 넣고 섭씨 37도및 이산화탄소 5%에서 하룻밤 동안 배양합니다.다음 날 아침, PC DNA 3개의 후광 표피 성장 인자 수용체 혈장 DNA의 14 마이크로그램을 감소혈청 배지 700마이크로리터를 포함하는 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 희석시켰다. 다음으로, 4개의 튜브각각에 감소된 혈청 배지의 150 마이크로리터에 리포페션 시약의 5마이크로리터를 추가하고 튜브가 5분 동안 주변 온도에서 서있을 수 있도록 합니다. 인큐베이션의 끝에서, 희석 된 리포션 시약 샘플 각각에 희석 된 플라즈마 DNA 150 마이크로 리터를 추가하고 추가 5 분 동안 주변 온도에서 샘플을 배양한다.인큐베이션이 끝나면 접시당 PBS 2밀리리터로 세포를 헹구고 각 배양에 1.5 밀리리터의 감소된 혈청 배지를 추가합니다. 플라스미드 지방 흡입 시약 리젠리 컴플렉스의 150 마이크로리터를 각 접시에 넣고 세포를 세포 배양 인큐베이터로 48시간 동안 되돌려 보입니다. 인큐베이션의 끝에서, 슈퍼 나티퍼를 흡인하고 각 접시에 두 개의 마이크로 몰러 paBhc 헥스 피치 후광으로 보충 갓 준비 DMEM의 1 밀리리터를 추가합니다.섭씨 37도에서 30분 후, 케이지 화합물을 함유한 배지를 흡인하고 PBS 1밀리리터로 세포를 두 번 헹구어 언바운드 화합물을 제거합니다. 각 접시에 500개의 혈청 배지를 추가하고 세포를 세포배양배양인큐베이터로 돌려 보내 세포에 들어간 화합물을 제거합니다. 인큐베이션이 끝나면 PBS 1밀리리터와 접시당 1밀리리터로 세포를 두 번 헹구고 각 배양에 페놀 레드 없이 1밀리리터의 배지를 추가합니다.그런 다음 레이저 스캐닝 공초점 현미경 검사법에 의해 꽃집 이미지를 기록합니다. 클릭 가능한 케이지 화합물을 사용하여 키나아제 국산화의 사진 매개 변조의 경우, 35 밀리리터 유리 바닥 접시당 햄의 F12 배지 2밀리리터에서 5번째 TOC-A-1 세포에 약 5회 10회 시드를 드시면 됩니다. 다음 날, GFP 디아실리세롤 키나제 감마에 대한 플라스미드 코딩을 통해 세포를 48시간 동안 방금 시연하였다.경질이 끝난 후, 경피 성 수퍼네티를 감소된 혈청 배지의 2밀리리터로 교체하십시오. 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 5~60분 동안 세포에 100배 의 마이크로리터 20편을 추가합니다. 인큐베이션의 끝에서, 이중 광원 형광 조명이 장착 된 반전 형광 현미경의 객관적인 단계에 접시를 놓습니다.실험 프로토콜에 따라 적절한 실험 시점 및 파 길이에서 세포를 조사하면서 10분마다 세포를 10초마다 이미지화합니다. 입증 된 바와 같이이 방법을 사용하여, 파클리 탁셀과 아라키돈산을 포함한 일부 생물학적으로 흥미로운 분자의 클릭 가능한 케이지 화합물은 성공적으로 합성 될 수있다. 물 용해도 및 세포 표적화 능력과 같은 추가 특성은 구리 1촉매 사이클화 클릭 반응을 통해 paBhc 모의 파클리탁셀에 도입될 수 있다.이러한 클릭 가능한 케이지 파클리탁셀은 350 나노미터에서 조사시 부모 화합물을 생성하기 위해 사진을 촬영할 수 있습니다. 클릭 가능한 케이지 화합물의 물리적 및 광화학적 특성은 표에 요약됩니다. 살아있는 세포 실험에서, paBhc 헥스 피치 후광을 배양된 포유류 세포로 표적화하여 HaloTagged 단백질과 표피 성장 인자 수용체를 일시적으로 발현하여 세포막에 형광푸스 PAHBHC 헥스 피치 후광으로부터 녹색 플로레시엔션 신호를 유도한다.또한, 아라키돈산을 가진 GFP 디아실 글리세롤 키나제 감마를 과도하게 발현하는 CHO-K1 세포의 치료는 디아실 글리세롤 키나제 감마의 세포외 국소화의 변조를 일으킨다. 디아실 글리세롤 키나제 감마 국소화의 유사한 변화는 또한 UV 광 노출 후 paBhc-AA 처리 된 세포에서 관찰된다. 배양 배지를 증가시키는 수성 솔루션에서 caging 실험을 수행할 때는 항상 단파 길이 캡 필터가 있는 형광램프 아래에서 작업해야 합니다.이 절차에 따라, 당신은 때문에 수용성, 막 투과성 또는 세포 타겟팅 능력의 부족으로 생물학적 실험에 사용하기 위해 풍부한 케이지 화합물을 연구 할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

아데노 바이러스 입자는 변칙적인 아미노산 아나로그의 azidohomoalanine 또는 azido 설탕 중 하나를 포함할 수 있도록...

Bioorthogonal 클릭 화학을 통해 바이러스성 표면 Chemoselective 변경

우리의 GPCR의 다양한 타겟 위치에 부 자연스러운 아미노산, P-아지도-L-페닐알라닌을 유전자 인코딩 및 다른 응용 프로그램에서 아지 그룹의 다양성을 보여줍니다. 이들은 GPCR의 리간드 결합 주머니에 잔류를 확인하는 대상으로 광 가교 기술 및 펩티드 에피토프 태그 또는 형광 프로브의 GPCR의 특정 사이트 bioorthogonal 수정이 (가) 있습니다.

유전자 인코딩 분자 프로브는 G 단백질 결합 수용체를 연구하는

유기 염료 분자와 올레산으로 코팅된 상향 변환 나노 입자는 수용성이 아닙니다. 이 프로토콜은 유기 염료 분자를 전달하고 입자를 초기 소수성 용매에서 물로 상향 변환할 수 있는 '플러그 앤 플레이' 방법을 설명합니다.

&#39;플러그 앤 플레이&#39;방법은 양친 매성 고분자, 유기 염료 및 업 컨버팅 나노 입자를 포함하는 수분 산성 Nanoassemblies 만들기

광안정 시아닌 염료는 올리고뉴클레오티드에 부착되어 에너지 전달에 의한 혼성화를 모니터링합니다.

광 안정성 시아닌 염료를 사용하여 파장 변환 DNA 혼성화 프로브의 합성

이 프로토콜은 시약 정제 반응 조건 bioconjugate 정화 및 bioconjugate 특성화를 포함하여 말레이 미드로 단백질을 함유하는 시스테인의 바이오 콘쥬 게이션에 필요한 중요한 단계를 자세히.

단백질 Bioconjugates의 합성<em&gt;를 통해</em&gt; 시스테인 - 말레이 미드 화학

여기에서는 광친화성 라벨링을 사용하여 소분자 결합 단백질을 식별하는 방법을 설명합니다. 이 기술의 장점은 살아있는 세포 환경 내에서 표적 단백질의 결합 및 공유 라벨링이 발생하여 세포 용해 시 네이티브 단백질 구조 및 결합 조건을 파괴할 위험을 제거한다는 것입니다.

라이브 셀 Photoaffinity 라벨에 의해 기본 셀룰러 환경에서 작은 분자 결합 단백질의 식별

여기에서는 아지드 함유 아미노산을 유전적으로 통합한 후 균주 촉진 아지드-알킨 고리첨가(SPAAC)에 의해 아지드를 화학 프로브와 결합하여 항체 조각에 화학적 프로브를 부위 특이적으로 도입하는 프로토콜을 제시합니다.

효율적이고 사이트 별 스트레인 승진 아 지드 - 알킨 사이클로에 의해 항체 라벨링

이 프로토콜에 갇힌된 단백질 키 니 아 제 A (PKA), 셀룰러 신호 변환 bioeffector 나노 입자 표면에 움직일, cytosol에 microinjected 이었고 upconverted 근처-적외선 (NIR) 방사선에서 자외선에 의해 활성화 유도 다운스트림 스트레스는 cytosol에서 섬유 분해.

원격으로 업 컨버전 나노 중재 니 Photoactivation에 의해 세포내 신호 변환 하는 통합된 시스템

손쉬운 형광 분석 결과 포유류 세포에 표현 된 단백질에 비정규-아미노산 (ncAAs)를 통합 하는 아미노-acyl-tRNA-합성/tRNA 쌍의 효율성을 평가 하 여. G-단백질 결합 수용 체 (GPCRs) 공부 ncAAs의 응용 프로그램, 바인딩 사이트 및 bioorthogonal GPCR 라이브 셀 라벨의 사진-가교 매핑을 포함 하 여 설명 합니다.

사진-가교 매핑 및 라이브 포유류 세포에서 Bioorthogonal 화학 GPCRs에 프로브 화학의 유전 결합을 최적화

이 프로토콜에 갇힌된 분자 접착제 태그를 사용 하 여 살아있는 세포에서 핵 전 좌를 빛 트리거 설명 합니다. 이 방법은 사이트 선택적 핵 타겟팅 약물 전달에 대 한 약속입니다.

Photoactivatable 태그 갇힌된 분자 접착제를 사용 하 여 살아있는 세포에서 핵 전 좌 spatiotemporally 제어

학습하세요 클릭 가능한 케이지 화합물의 설계 및 합성 방법을 광화학적 특성 분석과 함께. 이 기술은 신경과학 연구에서 세포 표적화와 광 활성화 실험에 활용됩니다.

클릭 가능한 케이지 화합물의 설계, 합성 및 광화학적 특성

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