내피 콜로니 형성 세포및 중간엽 줄기 세포에 의해 형성된 공동 배양 스페로이드를 이용한 3차원 혈관신생 분석 시스템

이 3D 공동 배양 스페로이드 시스템은 생리성 혈관 신생을 모방하도록 설계되었습니다. 잠재적인 혈관 유발 변조기를 평가하는 데 효과적이며 생체 내 연구에 앞서 예측 가능한 정보를 제공합니다. 이 시스템은 두 개의 혈관 전구 세포에 의해 형성된 공동 배양 스페로이드를 이용하고 생리성 혈관신생의 세포 상호 작용, 발아 및 관 성숙을 조사하는 데 사용될 수 있습니다.

환자 세포를 사용하여 공동 배양 스페로이드를 형성할 수 있다면, 이 시스템을 사용하여 암과 같은 비정상적인 혈관 신생 관련 질병에 대한 맞춤형 치료법을 개발할 수 있습니다. 이 분석 시스템은 혈관 신생 및 약물 개발 연구의 민감도와 효율성을 증가시킬 수 있습니다. 05%트립신-EDTA를 사용하여 세포 배양 인큐베이터에서 3~5분 동안 ECC 및 MSC를 80~90%의 컨실루셀 배양을 분리합니다.

신선한 완전한 DMEM 배지로 트립신을 비활성화하고, 단일 셀 서스펜션을 생성하기 위해 세포를 몇 번 피펫. 원심분리로 세포를 수집하고, 세럼이 없는 배지로 두 개의 세시징을 넣습니다. 두 번째 세척 후, 개별 2밀리리터 마이크로센리후지 튜브에서 중간 농도의 밀리미터당 2배 10~6개의 세포로 중질 농도의 밀리리터당 6개의 세포로 ECfC를 3배 10으로 희석한다.

원심분리에 의해 세포를 펠렛하고, 각 세포 샘플에서 마지막 15~25 마이크로리터를 제외한 모든 것을 조심스럽게 흡인한다. 다음으로, 형광 염료 키트에서 희석 C의 250 마이크로 리터에 각 펠릿을 다시 중단하고, 완전한 분산을 보장하기 위해 셀 현탁액을 부드럽게 파이펫. ECC튜브에 갓 준비된 20마이크로몰러 PKH67 250마이크로리터를 추가합니다.

12 마이크로몰라 PKH26의 250 마이크로리터를 MSC 튜브에 추가합니다. 실온에서 5분 동안 흔들림이 있는 후, 빛으로부터 보호된 후, 튜브당 0.5 밀리리터의 FBS에서 1분 동안 배양하여 염색 과정을 중단하십시오.

인큐베이션의 끝에서, 원심 분리에 의해 세포를 수집하고 신중하게 슈퍼 나탄을 제거, 세척 당 신선한 완전한 매체의 두 밀리리터에 두 세척. 그런 다음 15 밀리리터 튜브에서 각각의 배지에서 세포를 일시 중단합니다. 스페로이드 생성의 경우, 제2 세척 후, 먼저 내피 세포 성장 배지 MV2의 적절한 농도에서 세포 현탁액을 희석하여 20% 메틸 셀룰로오스 용액과 5%의 태아 소 혈청 농도로 보충하였다.

다음으로 각 셀 서스펜션을 멸균 폴리스티렌 직사각형 저장소에 추가합니다. 멀티채널 파이펫을 사용하여 150mm 배양 판의 덮개에 약 125 마이크로리터 의 셀 방울을 추가합니다. 모든 세포가 첨가되면 PBS의 15 밀리리터를 함유한 접시의 바닥에 덮개를 반하고 24시간 동안 세포 배양 배양에 플레이트를 놓습니다.

다음 날, 접시 당 하나의 50 밀리리터 튜브에 PBS의 다섯 밀리리터와 접시 커버를 헹구십시오. 나머지 스페로이드를 수집하기 위해 PBS의 추가 5 밀리리터로 커버를 헹구고, 원심분리에 의해 스페로이드를 펠렛. 마지막 100~200마이크로리터를 제외한 모든 수퍼나티를 조심스럽게 버리고 튜브 벽을 살짝 눌러 나머지 상체에서 스페로이드가 자유롭게 정지되도록 합니다.

내피 세포 성장 배지 MV2의 적절한 볼륨을 5%의 태아 소 혈청과 40% 메틸 셀룰로오스 용액을 각 튜브에 추가하여 중간 농도의 밀리리터당 100스페로이드로 스페로이드를 재연합니다. 직경 3~5mm의 1밀리리터 파이펫 팁을 사용하여 스페로이드 서스펜션을 부드럽게 혼합합니다. 새로운 와이드 팁, 1밀리리터 파이펫을 사용하여 스페로이드 서스펜션 용액과 중화형 I 콜라겐 젤을 얼음의 일대일 비율로 혼합합니다.

각 스페로이드 서스펜션 콜라겐 젤 용액 900마이크로리터를 미리 따뜻하게 데운 24웰 플레이트의 우물에 넣습니다. 현탁액이 세포 배양 인큐베이터에서 30분 동안 중합하도록 허용하고, 내피 세포 성장 매체 MV2의 100 마이크로리터로 스페로이드를 커버하기 전에 ECFC 전용 스페로이드 및 MSC-MSC 균주에만 FBS-spheroids 및 MSC-SPHERoids로 보충된 2.5%FBS 및 50나노그램의 비약으로 보충하였다. 그런 다음 각 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 설치된 실시간 셀 레코더에 넣고, 무작위로 10배배율로 5~10개의 스페로이드에 초점을 맞추어 매시간 24시간 동안 각 형광 표지 스페로이드의 발아 형성을 모니터링한다.

스페로이드 발아를 정량화하기 위해 이미지 파일을 ImageJ로 가져오고 실험 그룹당 무작위로 선택된 5개 스페로이드로부터 적절한 형광 신호를 표현하는 새싹의 수와 길이를 측정한다. ECFC 플러스-MSC 스페로이드의 경우, 새싹과 누적 새싹 길이의 수는 항상 ECFC 전용 스페로이드에 비해 상당히 높습니다. MSC 전용 스페로이드는 새싹을 형성하지 않지만 스페로이드 외부의 MSC의 개별 이동을 보여줍니다.

ECFC 플러스-MSC 스페로이드를 생성하기 전에 녹색 형광 염료와 MSC를 적색 형광 염료로 ECFC의 라벨링은 ECFC 매개 새싹 구조가 MSC로 덮여 있음을 보여 주며, 결합된 MSC가 새싹 형성 시 계각 세포역할을 하며, 두 혈관 세포 사이의 단단한 연관성에 의해 새싹 안정성과 내구성을 향상시킵니다. 혈관 신생 억제제로 전처리 된 ECFC 플러스 -MSC 스페로이드는 ECFC 플러스 -MSC 스페로이드를 제어하는 것에 비해 투여량 의존적 방식으로 감소 된 새싹 수와 누적 새싹 길이를 보여줍니다. 병렬 실험에서, ECFC 전용 스페로이드는 억제제로 전처리된 후 VEGF를 통해 자극을 받은 후 또한 용량 의존적인 방식으로 성장 인자 유발 새싹 수 및 누적 새싹 길이가 감소하는 것을 입증한다.

참고로, ECFC 전용 스페로이드에 비해 ECFC 플러스-MSC 스페로이드를 억제하기 위해서는 혈관신생 억제제의 농도가 높다. 종양 성장은 인간 제노이식 종양 마우스 모델에서 대조군 치료 동물과 저용량 혈관신생 억제제-치료동물모두에 비해 고용량 혈관신생 억제제 처리된 동물에서 현저히 억제된다. 고용량 처리된 마우스에서 bevacizumab의 혈장 농도는 ECFC 전용 스페로이드가 아닌 ECFC-플러스-MSC 스페로이드에서 누적 새싹 길이를 억제하기 위한 bevacizumab의 IC50 값에 가까웠던 밀리리터당 568 플러스 또는 마이너스 40.62 마이크로그램이었습니다.

이는 ECFC 플러스-MSC 공동 배양 스페로이드 시스템이 동물 연구 전에 효과적인 혈장 농도를 예측하는 데 적합하다는 것을 시사한다. 넓은 팁의 1mL 파이펫을 사용하여 스페로이드를 부드럽게 혼합하여 얼음에 콜라겐 젤을 사용하는 동안 스페로이드의 무결성을 보호하는 것이 중요합니다. 우리는 혈관 신생 도중 세포 매트릭스 횡단을 조사하기 위하여 면역 세포 및 그밖 세포외 행렬과 같은 그밖 세포 모형을 소개하기 위하여 이 시스템을 수정할 수 있습니다.