Name: 코넥신 43 구조적 파괴를 통한 내피 생체역학 의 교란 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: 학습하세요 코넥신 43 구조적 파괴를 통한 내피 생체역학 교란 측정 방법을. 견인력과 세포 간 응력을 동시에 측정하여 암 전이, 상처 치유 등 병리생리학적 과정에서 세포 힘의 역할을 규명할 수 있습니다.

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이 작품은 중앙 플로리다 대학 창업 기금과 국립 심장, 폐, 그리고 수상 K25HL132098에서 건강의 국립 연구소의 혈액 연구소에 의해 지원되었다.

1. 폴리아크릴아미드 (PA) 젤 만들기
<ol><li>
페트리 접시의 준비
	<ol>
<li>200 mL의 초순수와 80 μL 아세트산 및 50 μL의 3-(트리메톡시실릴) 프로필 메타크릴레이트를 혼합하여 바인드 실란 용액을 준비합니다. 바인드 시레인은 하이드로겔 부착을 위해 유리 바닥 페트리 접시 표면을 기능화하는 데 사용되는 용액이다.</li>
		<li>바인드 시란 용액을 교반판에 적어도 1시간 동안 저어줍니다.</li>
		<li>페트리 접시의 중심을 바인드 실란 용액으로 45분 동안 처리합니다.</li>
		<li>바인드 스틸란 용액을 제거하고 페트리 접시를 초순수 2x-3x로 헹구세요.</li>
		<li>페트리 접시 표면을 말려 실온에서 보관하여 나중에 사용할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
하이드로겔 용액의 준비
	<ol>
<li>표 1에따라 초순수, 40% 아크릴아미드 및 2% 비스-아크릴아미드를 15 mL 원심분리기 튜브에 섞는다.</li>
		<li>하이드로겔 용액에 80 μL의 형광 비드를 추가합니다.</li>
		<li>튜브를 부드럽게 흔들어 구슬을 젤 용액과 섞습니다.</li>
		<li>원심분리기 튜브의 튜브 캡을 가볍게 조이고 진공 챔버에 놓습니다.</li>
		<li>진공 챔버에서 적어도 45 분 동안 젤 용액을 탈기하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
하이드로겔 중합
	<ol>
<li>먼저, 10% 황황산 암모늄(초순수에 용해)의 75 μL을 넣고 8 μL의 TEMED(N,N,N', N'-Tetramelelethane-1,2-diamine)를 하이드로겔 용액에 추가합니다.</li>
		<li>페트리 접시의 중앙에 하이드로겔 용액 24 μL을 놓습니다(표 2참조).</li>
		<li>하이드로겔을 평평하게 하려면 18mm 커버슬립을 사용합니다. 이것은 ~ 100 μm의 높이를 줄 것이다.</li>
		<li>겔 중합을 위해 적어도 30-40 분 기다립니다.</li>
		<li>겔 탈수를 방지하기 위해 고분자 하이드로겔을 초순수에 담급합하십시오.</li>
		<li>형광 비드의 광표백을 방지하기 위해 알루미늄 호일로 페트리 접시를 덮고 4 °C에서 보관하십시오. 참고 : 하이드로 겔은 최대 3 개월의 기간을 저장할 수 있지만, 이 젤은 최상의 결과를 얻기 위해 제조 후 1 주 이상 사용하지 않는 것이 좋습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 세포 배양
<ol><li>배양 인간 배꼽 정맥 내피 세포(HUVECs)는 세포 배양 배지 200(재료 표참조)에서 37°C 및 5%CO2에서0.1% 젤라틴 코팅 플라스크상에 1% 페니실린-스트렙토마이신을 보충하였다.</li>
</ol>3. 마이크로 패턴 스텐실 준비
<ol><li>실리콘 염기를 실리콘 경화제와 20:1 의 비율로 혼합하여 100 mm 페트리 접시에 폴리디메틸실록산(PDMS)의 얇은 층을 경화(base: 경화제). 참고: 경화제 비율(예: 10:1 또는 30:1)에 다른 베이스를 사용할 수 있습니다. 그러나, 경화제 비율이 낮은 염기는 더 단단한 패턴을 산출하고, 경화제 비율이 높을수록 더 부드러운 패턴을 생성할 것이다.</li>
	<li>20:1(기본:경화제) PDMS 용액을 준비하고 50 mL 원심분리기 튜브에 조심스럽게 섞습니다. 불균일한 혼합으로 불완전한 중합을 초래할 것이므로 튜브를 거꾸로 뒤집고 여러 번 격렬하게 흔들어 PDMS 용액의 적절한 혼합을 보장합니다.</li>
	<li>190 x g에서1 분 동안 PDMS 솔루션을 원심 분리하여 위의 단계에서 도입 된 기포를 제거하십시오.</li>
	<li>100mm 페트리 접시의 중앙에 5-6 mL의 PDMS 용액을 붓고 PDMS 용액이 전체 페트리 접시 표면을 덮을 때까지 접시를 교반합니다.</li>
	<li>PDMS 용액을 50-60°C에서 밤새 경화하였다. PDMS는 또한 실온에서 경화될 수 있다.</li>
	<li>구멍 펀처가 있는 원형 직경 16mm PDMS 스텐실을 제거합니다.</li>
	<li>생검 펀치를 사용하여 PDMS 스텐실에 작은 구멍을 만듭니다. 이 프로토콜은 1.25 mm 직경 생검 펀치를 사용합니다.</li>
	<li>PDMS 스텐실을 먼저 70% 에탄올에 2-3분 동안 담근 다음, 과도한 에탄올을 흡입한 다음 UV 광 아래에 5분 동안 두어 멸균합니다.</li>
</ol>4. 콜라겐-I 하이드로겔 코팅
<ol><li>하이드로겔에서 커버슬립을 제거하고 여분의 액체를 흡인합니다.</li>
	<li>PDMS 스텐실을 하이드로겔 표면에 놓습니다. 참고: 핀셋은 PDMS 스텐실에 광압을 가하여 PDMS 스텐실과 하이드로겔 표면 사이의 방수 밀봉을 보장하는 데 사용할 수 있습니다. 당사의 PDMS 스텐실은 수밀성이므로 젤 상부 표면과 PDMS 스텐실 바닥 면 사이의 물 접근을 방지합니다. 또한, 하이드로겔 강성은 PDMS 강성에 대하여 조정될 필요가 없다.</li>
	<li>0.1M HEPES(4-(2-하이드록세틸)-1-피프라진에탄설포산)에 용해된 헥사노에이트(설포-산파아미노)를 설포수니미딜-6-(4-아지도-2-니트로페닐아미노)로 하이드로겔 표면을 100대 농도로 커버한다. 램프(전력 36W)를 8분 동안 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>여분의 설포-SANPAH 및 HEPES 용액을 흡인하고 0.1 M HEPES로 하이드로겔을 두 번 헹구고 초순수로 2 개의 린스를 추가로 헹구습니다.</li>
	<li>0.1 mg/mL 콜라겐-I를 4°C에서 하룻밤 동안 과량의 초순수 및 코팅 하이드로겔을 흡인합니다.</li>
	<li>접시를 덮고 형광 비드를 광표백으로부터 보호하십시오. 참고: PDMS 스텐실은 마이크로 패턴 단층을 만드는 데 사용됩니다. 마이크로 패턴 단층은 각 실험 중에 동일한 형상과 치수의 여러 단층이 동시에 관찰될 수 있도록 하기 때문에 활용됩니다. 그러나, 마이크로패턴이 바람직하지 않은 경우 4.2단계를 제외하고 위의 단계를 따를 수 있다.</li>
</ol>5. 하이드로겔에 HUVEC 단층 만들기
<ol><li>인큐베이터에서 3-5 분 동안 조직 배양 플라스크에서 세포를 분리하기 위해 1x 트립신을 사용하십시오.</li>
	<li>트립시니화 후, 트립신 용액에 세포 배양 배지를 첨가하고 15 mL 원심분리튜브에 첨가한다.</li>
	<li>1710 x g에서3 분 동안 세포 용액을 원심 분리기. 세포의 작은, 백색 펠릿은 원심 분리기 관의 바닥에 표시되어야 합니다.</li>
	<li>50 x 104 세포 / mL의 농도로 매체에서 상류 세포를 흡인하고 재중단.</li>
	<li>하이드로겔에서 콜라겐-I를 제거하고 PBS로 1x 헹구어 주세요.</li>
	<li>PDMS 스텐실의 상부에 75 x 103 세포를 추가하고 세포가 37°C 및 5%CO2에서인큐베이터에서 적어도 1시간 동안 하이드로겔 표면에 부착되도록 한다.</li>
	<li>PDMS 스텐실을 제거하고 페트리 접시에 적어도 2 mL의 미디어를 추가합니다. PDMS 스텐실을 10x 트립신에 담그고 부착된 세포를 제거하고 70% 에탄올로 분무한 다음 UV 광 아래에 5분 동안 소독합니다.</li>
	<li>인큐베이터에 페트리 접시를 놓고 적어도 36 시간 또는 동시 단층이 관찰 될 때까지 기다립니다.</li>
</ol>6. Cx43 중단을 위한 2,5디하이드록시찰콘 처리
<ol><li>디메틸설폭사이드(DMSO)에 2,5디하이드록시찰콘(chalcone)을 용해하여 0.1875 mg/mL 스톡 용액을 만듭니다.</li>
	<li>낮은 chalcone 농도 (0.2 μg/mL) aliquot 및 높은 chalcone 농도 (2 μg/mL) aliquot를 만들기 위해 세포 배양 매체로 주식 용액을 희석.</li>
</ol>7. 데이터 수집
<ol><li>현미경으로 세포 섬을 찾습니다.</li>
	<li>위상 대비 및 비드 이미지를 각각 이미지 셀 형태및 하이드로겔 변위를 획득합니다. 참고: 이 프로토콜은 데이터 수집을 위해 10배 의 목표를 사용했습니다.</li>
	<li>실험의 끝에서, 10x 트립신으로 세포를 분리하고 세포없이 겔 표면의 이미지를 획득 (참조 이미지).</li>
</ol>8. 면역 염색
<ol><li>4% 포름알데히드로 단층을 고정하고 37°C에서 15분 동안 배양합니다.</li>
	<li>4% 포름알데히드를 제거하고 0.2% 트리톤 X-100을 37°C에서 5분 동안 추가하여 세포를 투과시합니다.</li>
	<li>0.2% 트리톤 X-100을 제거하고 PBS 2x-3x로 단층을 헹구고 있습니다.</li>
	<li>37°C에서 45분 동안 2% 소 혈청 알부민(BSA) 용액으로 단층을 덮습니다.</li>
	<li>2% BSA 용액을 제거하고 PBS 2x-3x로 단층을 헹구고 있습니다.</li>
	<li>1차 Cx43 항체를 1:400의 농도로 시료에 넣고 4°C에서 밤새 배양한다.</li>
	<li>원발성 항체를 제거하고 PBS 2x-3x로 시료를 헹구다.</li>
	<li>3:200의 농도로 이차 항체를 첨가하고 37°C에서 2시간 동안 배양한다. 참고: 광표백을 방지하기 위해 샘플을 덮어야 합니다.</li>
	<li>이차 항체를 제거하고 PBS 2x-3x로 헹구어 보시고 자합니다.</li>
	<li>장착 매체(Fluromount-G DAPI)로 시료를 덮고 18mm 커버 슬립으로 밀봉합니다.</li>
</ol>9. 견인력 현미경 검사법 (TFM) 및 단층 응력 현미경 검사법 (MSM)의 구현
<ol><li>
하이드로겔 변형 계산 참고: MATLAB을 사용하는 단계별 변위 계산 절차는 다음과 같습니다.<ol>
<li>MATLAB에서 기본 traction.m 파일을 엽니다(모든 MATLAB 루틴에 대한 보충 자료 참조). 참고: 코드에 제공된 지침을 따라 MATLAB 디렉터리를 설정합니다.</li>
		<li>이미지 형식, 픽셀 대 미크론 변환, 영의 계수, 푸아송 비율 및 현미경 목표의 다음 변수를 정의합니다.</li>
		<li>OpenFiles 서브루틴을 사용하여 비드, 트립신 이미지 및 위상 이미지를 찾습니다. 참고: 대용량 데이터 세트의 경우 파일의 이름을 순차적으로 지정하는 것이 가장 좋습니다. 예를 들어 파일 이름은 "filename1.tif", "filename2.tif" 등이어야 합니다.</li>
		<li>셀 단층 주위에 사각형 ROI(관심 영역)를 정의하고 cell_cropper 서브루틴을 실행하여 원본 이미지를 자르는 것입니다.</li>
		<li>변위_finder 서브루틴을 실행하여 변위를 계산합니다.</li>
		<li>Dedrift 서브루틴을 실행하여 현미경 단계 드리프트로 인해 발생할 수 있는 추가적인 비세포 변위를 제거합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
견인력 계산 참고: 여기서 는 맞춤형 MATLAB 루틴을 사용하여 제한되지 않은 견인력이 계산됩니다. 앞서 언급한 MATLAB 루틴을 이용한 단계별 견인 계산은 아래에 제시되어 있다.<ol>
<li>traction.m 루틴 내에서 경계 조건, 겔 두께, 젤 높이 및 드리프트 내에서 다음 변수를 정의합니다.</li>
		<li>traction_finder 서브루틴을 실행하여 견인을 계산하고 plot_traction 서브루틴을 실행하여 견인을 플롯합니다. 해당 픽셀 위치와 함께 x 방향(Tx) 및 y 방향(Ty)의 모든 트랙션은 코드에 의해 생성되는 traction.dat 파일에서 찾을 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
세포간 응력 계산 참고: 앞에서 언급한 MATLAB 루틴을 사용하여 세포간 응력 계산에 대한 단계별 지침은 다음과 같습니다.<ol>
<li>mark_circular_domain 서브루틴을 실행하여 단일레이어 경계를 지정합니다. 이 루틴은 사용자가 수동으로 단일 레이어 주위에 경계를 그릴 수 있도록 모든 자른 위상 이미지를 순차적으로 묻는 메시지를 표시합니다. 명령 창에서 생성된 nXPt를 기록하고 나중에 FEM 해석을 위해 X축과 Y축의 그리드 매개변수로 사용합니다(9.3.2 단계 참조).</li>
		<li>Run_StressCode를 실행하여 셀룰러 응력을 계산합니다. 이 서브루틴은 "model.in" 파일에서 매개 변수를 직접 읽고 FEM 분석을 수행하기 위해 "island.exe"를 실행합니다. 이 루틴을 실행하기 전에 model.in 파일의 모든 매개변수(예: X 및 Y의 그리드 매개변수, 픽셀에서 미크론 변환, 젤의 영의 계수, 푸아송 비율, 단층 높이 및 단층 패턴(스트립 또는 구멍)가 편집되었는지 확인합니다. 올바르게.</li>
		<li>plot_FEM_결과 서브루틴을 사용하여 모든 FEM 결과를 플로팅합니다. 참고: 생성된 모든 결과는 MATLAB 디렉터리에 있는 결과 폴더에 자동으로 저장됩니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

우리 그룹뿐만 아니라 다른 사람뿐만 아니라,성공적으로시험관 7,15,18,27에서 다양한 병리학 및 생리 적 세포 과정에서 세포 접합의 영향을 조사하기 위해 TFM과MSM을사용하고있다 . 예를 들어, Hardin 등은 세포간 스트레스 전달가이드 내피 세포에서의 파라셀룰러 갭 형성을 시사하는 매우 통찰력 있는 연구를제시15. 우리가 여기 보고하는 Cx43 관련 변경사항을 Hardin 등에서 보고한 변경사항과 관련시킬 수 있지만, 이 프로토콜에서 파라셀룰러 갭 형성을 구체적으로 다루지는 않습니다. 여기에서, 우리는 특히 간격 접합 Cx43를 표적으로 하고 내피 생체 역학에 그것의 영향을 조사하기 위하여 역학 기지를 둔 프로토콜을 제출했습니다.
<p clas...

물리적 인 힘의 효과및 세포 및 조직 생리학 및 병리학에 대한 기계적 특성의 연구를 참조하는 분야는 기계생물학1로알려져 있다. 메카노생물학에서 활용된 몇 가지 유용한 기술은 단층 스트레스 현미경 검사법 및 견인력 현미경입니다. 견인력 현미경법은 세포 기판 인터페이스에서 생성된 견인력을 계산할 수 있게 해주며, 단층 응력 현미경은 단일층 내의 인접 세포 간에 생성된 세포간 응력의 계산을 허용합니다2 ,3,4,5,6. 이전 방법에서 산출된 결과는 세포 유래 기계적 응력이 세포 프로세스의 호스트의 운명을 결정하는 중요한 역할을 한다는 것을건의했습니다 3,4,5. 예를 들어, 외부 기계적 힘에 노출되면 집단으로 이동하는 셀 그룹이 형태를 변경하고 모양을 편광하여 적용된 힘의 방향을 따라 정렬하고 이동하여 부분적으로견인7을 생성할 수 있습니다. 8. 견인은 세포 수축성을 평가하는 데 사용할 수 있는 메트릭을 제공하며 견인력 현미경 검사법(TFM)을 사용하여 계산됩니다. 견인력 현미경 검사법(TFM)은 세포 유도 기질 변형의 결정으로 시작하여 수학적으로 엄격한 역학 기반 계산 접근법을 사용하여 견인장을 계산합니다. 견인력을 계산하는 능력이 꽤 오랜 시간 동안 주변에 있기 때문에, 연구원은 TFM을 활용하여 암9,상처 치유10 및 엔지니어링 심장 평가를 포함한 다양한 프로세스에 대한 견인력이 미치는 영향을 밝혔습니다. 조직11.
TFM 및 MSM의 구현은 다음과 같은 순서로 실행되어야하는 세 가지 필수 단계로 나눌 수 있습니다 : 첫째, 세포에 의해 생성 된 하이드로 겔 변형이 결정됩니다; 둘째, 견인은 하이드로 겔 변형에서 회수됩니다. 셋째, 유한 요소 접근법은 전체 단층 내에서 정상 및 전단 세포 간 응력을 계산하는 데 사용됩니다. 겔 변위를 계산하기 위해, 세포와 형광 비드 이미지를 맞춤형 입자 이미지 속도계(PIV) 루틴을 사용하여 참조 비드 이미지(셀 제외)와 비교하였다. PIV 분석을 위한 상호 상관 윈도우 크기와 겹치는 것은 각각 32 x 32 픽셀 및 0.5로 선택되었다. 이때, 픽셀 시프트는 평면 변위를 얻기 위해 픽셀 대 미크론 변환 인자(우리의 현미경의 경우, 이 변환 인자는 0.65)와 곱하여 미크론으로 변환되었다. 평면 외 변위를 무시하는 것과 관련된 오류는 무시할 수있는 12,13입니다. 겔 변위를 계산한 후, 활용될 수 있는 두 가지 유형의 견인 측정, 제한된 견인력 및 구속되지 않은 견인력8,14가있다. 구속되지 않은 트랙션은 전체 시야(셀이 있는 영역 및 셀이 없는 영역 포함)에 대한 트랙션 필드를 제공하며, 제한된 트랙션은 셀14를포함하는 영역에 대해서만 트랙션 필드를 제공합니다. 그런 다음, 세포간 응력은 견인력 현미경 검사법의 연장인 단층 응력 현미경 검사법(MSM)을 사용하여 계산됩니다. MSM의 구현은 셀 기판 인터페이스에서 세포의 단층이 가하는 국부적 견인력이 뉴턴의 법칙 7에서 요구하는 대로 셀-셀 인터페이스에서 세포 간에 전달되는 기계적 힘에 의해 균형을 이루어야 한다는 가정을 기반으로 합니다7. ,12,13. 여기서 중요한 가정은 단층내의 견인 분포가 알려져 있고 힘 균형이 셀 재료 특성에 의존하지 않기 때문에 셀 단층이 얇은 탄성 시트로 처리 될 수 있다는 것입니다. 또 다른 주요 가정은 견인력이 광학 시야 내의 국소 세포 간 응력(단층 내)에 의해 균형을 이루고 이러한 힘 균형의 영향은 원위 영역(단층 외부)에서 최소화된다는것입니다 13. 따라서 단층 경계에서 세포간 응력, 변위 또는 둘 다의 조합으로 정의된 경계 조건은 MSM13을수행하는 데 매우 중요합니다. 위의 정보를 고려하여 MSM을 사용하여 유한 요소 분석(FEM)을 수행하여 최대 주 응력(σmax)및 최소 주 응력(σmin)을복구하여 단층. 이러한 주 응력은 이후에 전체 단층 내에서 2D 평균 정상 세포간 응력 [(σmax + σmin)/2] 및 2D 최대 전단 간 응력 [(σmax - σmin)/2]를 계산하는 데 사용됩니다. 12,13. 이 절차는 Tambe 등12,13에 의해 더 자세히 설명되어 있습니다.
단층 응력 현미경 검사법 (MSM)은 단층6,7,8,12,13내에서 생성된 세포 간 응력의 계산을 허용합니다. 이러한 세포간 스트레스는 조직 성장 및 수리, 상처 치유 및 암 전이12,15,16,17에중요한 것으로 제안되었다. 또한, 세포간 스트레스는 내피 세포 이동 및 내피 장벽 기능17,18에서도중요할 것으로 제안되었다. 단단한 접합부 및 접착접선 접합부와 같은 세포 세포 접합부는 둘 다 내피 세포 간 응력 생성 및 전송에 있는 중요한 역할을 하기 위하여 건의되는 동안, 간격 접합의 역할은 애매하게 남아 있습니다. 갭 접합부는 인접 한 세포를 물리적으로 연결하고 인접 세포19,20,21사이를 통과하는 전류 및 분자 (&1 KDa)에 대한 경로를 제공합니다. 내피 세포는 Cx37, Cx40 및 Cx43 갭 접합부19,22,Cx43을 발현하지만, Cx43은 틀림없이 질병 진행성23의측면에서 가장 중요하다. Cx43의 중요성의 증거는 마우스에서 Cx43의 유전 적 결실이 저혈압24의 결과이며 혈관 신생25에부작용이 있다는 사실에서 발견 될 수 있습니다. 또한, Cx43은 세포 이동 및 증식및 죽상동맥경화증의 진행에 중요한 것으로 문서화되어있다 18,22,23,24,25 .
이 프로토콜에서, 우리는 TFM 및 MSM을 사용하여 내피, 내피 단층 내의 견인 및 세포 간 스트레스 생성이 내피 갭 접합 Cx43의 붕괴에 의해 영향을 받을 지 여부를 조사했습니다. 우리는 Cx43 발현26을억제하기 위해 문서화된 분자인 2,5-디하이드록시찰콘(chalcone)으로 Cx43을 중단시켰습니다. Chalcone은 Cx43 발현26을중단시키기 위해 이전에 리 외에 의해 보고된 바와 같이 siRNA 대신 Cx43을 중단시키는 데 사용되었다. 또한, 우리는 또한 잠재적으로 다양한 혈관의 예방 및 치료에 사용될 수있는 항 염증 및 항 혈소판 화합물로보고되었기 때문에 내피에 대한 chalcone의 영향에 특히 관심이 있었다 병리학26. Chalcone 처리는 실험 개시 후에 1 시간, chalcone 처리한 단층은 총 6 시간 동안 심상하고, 심상 처리는 견인을 결정하기 위하여 주문을 쓰여진 MATLAB 부호로 수행되고 그 후에 세포 간 스트레스. 우리의 결과는 Cx43이 내피 생체 역학에 있는 중요한 역할을 한다는 것을 건의하는 견인및 세포간 응력에 있는 전반적인 감소를 보여주었습니다.

<table><tbody><tr><td>18mm 커버슬립</td><td>ThermoFisher</td><td>18CIR-1</td><td>폴리아크릴아미드 겔을 평평하게 하는 데 필수</td></tr><tr><td>2% 비스-아크릴아미드</td><td>BIO-RAD</td><td>1610143</td><td>폴리아크릴아미드 겔의 구성 요소</td></tr><tr><td>2&prime;,5&prime;-Dihydroxychalcone</td><td>SIGMA</td><td>IDF00046</td><td>Cx43 구조를 방해하려면</td></tr><tr><td>3-(트리메톡시실릴)프로필 메타크릴레이트</td><td>SIGMA</td><td>2530-85-0</td><td>아세트산 및 초순수</td></tr><tr><td>40 % 아크릴 아미드</td><td>BIO-RAD</td><td>1610140</td><td>폴리 아크릴 아미드 젤</td></tr> 아<tr><td>세트</td>산 <td>Fisher-Sceintific</td><td>64-19-7</td>의 구성 요소와 결합 실란 혼합물을 만드는 원액 <td></td></tr><tr><td>Alexa Fluro 488 염소 안티 마우스 IgG를</td> 만드는 데 필수적입니다.<td>ThermoFisher</td><td>카탈로그 # A-11001</td><td>2차 항체</td></tr><tr><td>과황산 암모늄</td><td>BIO-RAD</td><td>1610700</td><td>폴리아크릴아미드 겔 중합제</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td><td>SIGMA</td><td>9048-46-8</td><td>블로킹 용액 소</td></tr><tr><td>타입 I 아텔로-콜라겐 용액, 3 mg/mL, 100 mL</td><td>Advance Biomatrix</td><td>5005-100ML</td><td>세포 외 매트릭스</td></tr><tr><td>로 사용코닝 세포 배양 인산염 완충 식염수 (1x)</td> <td>Fisher-Sceintific</td><td>21040CV</td><td>세포 배양에 필요한 완충 식염수</td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드, Fisher BioReagents</td><td>Fisher-Sceintific</td><td>67-68-5</td><td>칼콘을 용해하고 원액을 만들기 위해</td></tr><tr><td>DAPI가 포함된 Fluoromount-G</td><td>ThermoFisher</td><td>00-4959-52</td><td>DAPI</td></tr> <tr><td>염색에 사용되는 면역 억제용 장착 매체형광 마이크로스피어 카르복실레이트 변성 비드</td><td>ThermoFisher</td><td>F8812</td><td>0.5 미크론 카르복실레이트 변성 비드(빨간색), 2% 고체</td></tr><tr><td>HEPES 완충 용액 1 M</td><td>SIGMA</td><td>7365-45-9</td><td>LVES에 필수</td></tr><tr><td></td><td>ThermoFisher</td><td>A1460801</td><td>필수 HUEVC 배지 200 보충제</td></tr><tr><td>매체 200 ThermoFisher</td><td></td><td>M200500</td><td>HUVEC 세포 배양을</td></tr> <tr><td>위한 필수 배지마우스 monoclonal Cx43 항체 (CX - 1B1)</td><td>ThermoFisher</td><td>Catalog #13-8300</td><td>Cx43</td></tr><tr><td>Petri dish (35 mm dia)</td>에 대한 일차 항체<td>CellVis</td><td>D35-20-1.5H</td><td>20 mm center well</td></tr><tr><td>Sulfo-SANPAH Crosslinker 100 mg</td><td>Proteochem</td><td>102568-43-4</td><td>polyacrylamide gel surface surface를 기능화하는 데 필수</td></tr><tr><td>SYLGARD 184 실리콘 엘라스토머 키트</td><td>DOW corning</td><td>2646340</td> PDMS TEMED BIO-RAD를 <td>만드는 경화제가 함유 된 실리콘 엘라스토머</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>1610801 폴리 아크릴 아미드 겔 중합제</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>SIGMA</td><td>9002-93-1</td><td>세포를 투과시키기 위해</td></tr><tr><td>Trypsin -EDTA</td><td>ThermoFisher</td><td>25300054</td><td>세포를 분리하는 데 사용됩니다</td></tr></tbody></table>.

코넥신 43 구조적 파괴를 통한 내피 생체역학 의 교란

Perturbing Endothelial Biomechanics via Connexin 43 Structural Disruption

내피 세포는 세포 간 응력과 견인력을 생성하기 위해 설립되었지만, 내피 간 스트레스와 견인 생성에서 역할 갭 접합이 작용한다는 것은 현재 알려져 없습니다. 따라서, 우리는 여기에 갭 접합 코넥신 (Cx43)의 영향을 조사하는 역학 기반 프로토콜을 제시 (Cx43) 알려진 Cx43 억제제 2,5 디하이드록시 찰콘 (chalcone)에 동천 내피 단층을 노출시킴으로써 내피 생체 역학에 있다 이 억제제가 견인력과 세포간 응력에 미치는 영향을 측정합니다. 우리는 대조군과 비교할 때 높은 chalcone 복용량 (2 μg/mL)에서 견인력과 세포 간 응력 모두의 감소를 보여주는 대표적인 결과를 제시합니다. 이 프로토콜은 적절한 억제제가 사용된다는 가정하에 Cx43뿐만 아니라 다른 갭 접합에도 적용될 수 있습니다. 우리는 이 프로토콜이 심혈관 및 메카생물학 연구 분야에서 유용할 것이라고 믿습니다.

대조군 이미지, 0.2 μg/mL, 및 2 μg/mL 단층 처리된 단층은 찰콘 처리 30분 전에 촬영하였다(그림1A-C)및 2시간 후 의 찰콘 처리(도1D-F). 세포-유도 비드 변위(μm)는 HUVEC 단층 대조층 대조층 대조군과 비교했을 때 저용량 chalcone 및 고용량chalcone 조건 모두에서 감소하는 것으로 관찰되었다(그림2E,F). chalcone 처리 이전에, rms 견인은 모든 조건에 대해 약 51±8Pa(도 3A-C)였다. 갈콘 처리 후...

여기에서, 우리는 간격 접합 connexin 43를 중단하고 견인및 세포간 응력의 관측을 통해 내피 생체 역학에 있는 후속 충격을 측정하기 위하여 역학 기지를 둔 프로토콜을 제시합니다.

Endothelial cells have been established to generate intercellular stresses and tractions, but the role gap junctions play in endothelial intercellular ...

이 프로토콜은 예를 들어 상처 치유 및 암 전이와 같은 많은 생리적 및 병리학 적 과정에서 세포 힘이 하는 역할의 용해를 허용하기 때문에 중요합니다. 이 역학 기반 기술의 주요 장점은 세포-세포 접합을 동시에 방해하고 세포 생성 기계력, 주로 견인 및 세포 간 스트레스에 미치는 영향을 측정하는 능력입니다. 우리의 프로토콜은 암 전이, 동맥 경화증 및 고혈압과 같은 광범위한 병리학 적 과정에 적용됩니다.당사의 방법은 장기 온칩 모델, 바이오 엔지니어링 조직 구조, 체외 약물 전달 시스템 및 조직 공동 배양 시스템과 함께 생화학 및 생화학 및 생화학 적 분석을 모두 수행하도록 통합될 수 있습니다. 우리의 프로토콜은 매우 간단합니다. 그러나 이 프로토콜을 수행하는 사람들은 처음으로 인내심을 가지고 이 프로토콜의 단계를 서두르지 말 것을 권고합니다.우리의 프로토콜에는 처음 사용자에게 명확하지 않을 수 있는 고유한 단계가 있습니다. 따라서 사용자가 작성된 단계별 절차를 따르고 시각적 데모를 지침으로 사용하는 것이 좋습니다. 우선, 아세트산 80마이크로리터와 50 마이크로리터의 아세트산과 50마이크로리터의 초순수수 200밀리리터를 혼합하여 블라인드 실레인 용액을 준비하십시오.슬바인드-시레인 용액을 교반판에 넣고 1시간 이상 저어줍니다. 페트리 요리의 중앙 우물을 바인드 실레인 용액으로 45분간 처리합니다. 바인드 시레인 용액을 제거하고 페트리 접시를 초순수물로 2~3회 헹구세요.페트리 접시 표면을 건조하고 나중에 사용하기 위해 실온에서 보관하십시오. 하이드로겔 용액을 준비하려면 12밀리리터의 초순수수 12.49밀리리터를 2.062밀리리터에 40%의 아크릴아미드와 375마이크로리터의 2%의 비사크라이미드를 15밀리리터 원심분리기 튜브에 섞는다. 하이드로겔 용액에 80마이크로리터의 형광 구슬을 추가합니다.튜브를 부드럽게 흔들어 구슬과 젤 용액을 섞습니다. 원심분리기 튜브에 캡을 느슨하게 유지하고 진공 챔버에 놓습니다. 진공 챔버에서 적어도 45 분 동안 젤 용액을 탈가스.하이드로겔을 중합하려면 먼저 10%의 아황산염 75마이크로리터를 추가한 다음 하이드로겔 용액에 8마이크로리터를 추가합니다. 페트리 접시의 중앙에 하이드로겔 용액24마이크로리터를 배치합니다. 하이드로겔을 18mm 커버 슬립으로 하이드로겔에 눌러 하이드로겔을 평평하게 하고 약 100 마이크로미터의 높이를 만듭니다.젤 중합을 위해 적어도 30 ~ 40 분 기다립니다. 젤 탈수를 방지하기 위해 초순수 수에 중합 된 하이드로겔을 담급하십시오. 페트리 접시를 알루미늄 호일로 덮어 형광 구슬의 표백을 방지하고 섭씨 4도에 보관하십시오.먼저, 50밀리리터 원심분리기 튜브에서 20 대 1의 비율로 PDMS 실리콘 베이스를 실리콘 경화제와 혼합한다. 튜브를 거꾸로 뒤집어 놓고 여러 번 격렬하게 흔들어 PDMS 용액을 적절히 혼합하십시오. 100mm 페트리 접시의 중심에 PDMS 용액의 5~6밀리리터를 190배 G.Pour에서 1분 동안 원심분리하여 PDMS 용액의 거품을 제거하고 PDMS 솔루션이 전체 페트리 접시 표면을 덮을 때까지 접시를 교반합니다.PDMS 용액을 섭씨 50~60도에서 하룻밤 사이에 치료합니다. 다음으로, 구멍 펀처와 원형 16밀리미터 직경 PDMS 스텐실을 제거합니다. 1.25 밀리미터 직경의 생검 펀치를 사용하여 PDMS 스텐실에 작은 구멍을 만듭니다.PDMS 스텐실을 70%에 탄올로 2~3분 동안 잠급하여 멸균하고, 과도한 에탄올을 흡수한 다음 5분 동안 UV 조명 아래에 놓습니다. 여분의 액체를 흡인시키고 하이드로겔에서 덮개 슬립을 제거합니다. PDMS 스텐실을 하이드로겔 표면에 놓고 핀셋을 사용하여 PDMS 스텐실과 하이드로겔 표면 사이의 수분 밀폐 씰을 보장하기 위해 PDMS 스텐실에 가벼운 압력을 가합니다.하이드로겔 표면을 0.1 의 어금니 HEPES 버퍼 용액으로 1-000의 농도로 용해시키고 8분 동안 36와트의 힘으로 하이드로겔을 UV 램프 아래에 놓습니다. 과도한 설포-삼파파 및 HEPES 용액을 흡습하고 0.1 개의 어금니 HEPES로 하이드로겔을 두 번 헹구고 초순수수로 2개의 헹구를 추가로 넣습니다. 과도한 초순수수를 흡인하고 200마이크로리터 파이펫을 사용하여 콜라겐-1밀리리터당 0.1밀리그램의 하이드로겔을 코팅합니다.식기를 덮어 형광구를 광표백으로부터 보호하고 하이드로겔을 하룻밤 사이에 섭씨 4도에 보관하십시오. 지금, 플라스크에 1X 트립신의 3 밀리리터를 추가하고 조직 배양 플라스크에서 세포를 분리하기 위해 3 ~ 5 분 동안 37섭씨37도에서 인큐베이터에 배치합니다. 트립시니화 후, 플라스크에 세포 배양 매체의 3 밀리리터를 추가하고, 혼합을 소용돌이시키고, 혼합물을 15 밀리리터 원심분리기 튜브로 옮춥니다.원심분리기 세포 용액은 1, 710회 G.에서 3분 동안 슈퍼나탈을 흡인시키고 밀리리터당 4개의 세포에 50배 10의 농도로 매체의 세포를 다시 중단한다. 냉장고에서 하이드로겔 요리를 꺼내라. 하이드로겔에서 콜라겐-1을 제거하고 PBS로 한 번 헹구는 다.PDMS 스텐실의 상단에 세 번째 세포에 75 회 10을 추가하고 세포가 37 섭씨 및 5 %의 이산화탄소에서 인큐베이터에서 적어도 한 시간 동안 하이드로겔 표면에 부착 할 수 있도록합니다. PDMS 스텐실을 제거하고 부착된 셀을 제거하기 위해 10X 트립신에서 10X 트립신으로 PDMS 스텐실을 잠급합니다. 페트리 접시에 적어도 2밀리리터의 미디어를 추가하고 70%에탄올로 분무한 다음 UV 라이트 아래에 5분간 배치하여 스텐실을 소독합니다.페트리 접시를 인큐베이터에 적어도 36시간 동안 또는 컨물류 단층이 관찰될 때까지 놓습니다. 실콘 치료 30분 전과 샬콘 치료 후 2시간의 위상 대비 영상을 비교했다. 세포 유도 비드 변위는 HUVEC 단층제를 제어하는 것과 비교할 때 저용량 샬콘 및 고용량 샬콘 조건에서 모두 감소하는 것으로 관찰되었다.chalcone 치료 전에, RMS 견인 주위 했다 51 모든 조건에 대 한 파스칼. chalcone 치료 후, RMS 견인에 작은 증가 했다 59 저용량 chalcone 처리 단층에서 파스칼 과 RMS 견인에 거의 두 배 감소 18 고용량 chalcone 처리 단층에서 파스칼 대조군에 비해. Chalcone 치료는 낮은 복용량으로 평균 정상적인 정상 세포 간 스트레스 크기를 증가, 하지만 크게 제어에 비해 높은 복용량으로 평균 정상적인 정상 세포 간 스트레스 크기를 감소.또한 샬콘 치료는 대조군과 비교했을 때 저체콘 농도와 높은 체콘 농도모두에서 최대 세포 간 응력을 감소시켰습니다. chalcone 처리의 충격은 T-시험 및 단 하나 요인 ANOVA 시험 둘 다에 근거를 둔 통계적으로 유의합니다. PDMS 스텐실을 젤 위에 두는 동안, 젤이 충분히 건조하여 PDMS 스텐실과 젤 사이의 방수 씰을 보장하십시오.이 프로토콜은 또한 살아있는 화상 진찰을 가진 세포 세포 접합, 세포 셀 접합, 세포 매트릭스 접착 분자, 또는 세포 외 분자의 생체 역학 적 기여를 탐구하기 위하여 적용될 수 있습니다. 이 체외 프로토콜을 통해 연구자들은 이제 동물 모델없이 조직 수리, 상처 치유 또는 암 전이 중 생화학적 특성뿐만 아니라 생물 역학의 호스트를 성공적으로 조사 할 수 있습니다. 우리는 이러한 약물의 흡입이 유해한 것으로보고로 chalcone 및 DMSO를 처리하는 동안 매우 조심하도록 우리의 시청자를 조언한다.

perturbing-endothelial-biomechanics-via-connexin-43-structural

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

GFP - 굴지 표현 라이브 내피 세포의 미세 영상은 cytoskeletal 구조에서 동적 변화 특성화 수 있습니다. 고정 표본을 사용하는 기술과는 달리,이 방법은 전에 동일한 세포에있는 굴지의 cytoskeleton의 시간적 변화에 대한 자세한 평가, 동안 다양한 물리적, 약리, 또는 염증성 자극 후를 제공합니다.

GFP - 굴지 표현 라이브 내피 세포 굴지의 Cytoskeleton 연구

석판술으로 새겨져와 PDMS에서 가공 Microfluidic 흐름 여왕님 EC 장애와 염증과 관련된 기능적 결과를 알아내기 위해 적용됩니다. 대표 실험에서는 차등 전단 응력의 능력 시토킨 활성화 EC monolayers에 monocytic 세포 접착을 조절하기 위해이 입증되었습니다.

온칩 내피 염증성 Phenotyping

세포 단일 층의 기계적 자극에 의​​한 칼슘 웨이브 전파 : 소 각막 내피 세포의 예

유체 전단의 다양한 수준과 패턴은 내피 유전자 발현, 표현형 및 질병에 대한 감수성을 조절하는 것으로 알려져 있습니다. 우리는 '전단 고리'의 조립과 사용에 대해 논의합니다: 단방향, 주기적인 전단 응력 패턴을 생성하는 모델입니다. 전단 링은 조립이 간단하고 경제적이며 높은 세포 수율을 생성할 수 있습니다.

총회와 &#39;전단 반지&#39;의 응용 프로그램 : 궤도, 단방향 및 정기 유체 흐름 및 전단 응력에 대한 소설 내피 모델

저항 동맥의 세포 문화 모델, 신호 경로 내 피, 평활 근, 또는 피와 부드러운 근육 (myoendothelial 교차점) 사이 해 부에 대 한 수 있도록 설명 되어 있습니다. 이 셀 문화 모델을 사용 하 여 면역 형광 검사, 전자 현미경, 또는 단백질 격리, 촉진제의 선택적 응용 프로그램을 활용할 수 있습니다.

저항 동맥의 세포 문화 모델

여기 설명 (1) 갓 그대로 뇌 내 피 "튜브" 및 내 피 칼슘과 막 내 피 파생 hyperpolarization 동안 잠재적인의 (2) 동시 측정을 분리에 대 한 프로토콜이 있습니다. 또한, 이러한 메서드는 내 피 세포 칼슘 및 개별 또는 대화형 실험 변수로 전기 신호의 약리 튜닝 수 있습니다.

세포내 칼슘과 갓 고립과 그대로 마우스 대뇌 피에 막 잠재력의 동시 측정

우리는 환자 유래 내피와 전혈 상호 작용을 조사하기 위하여 체외 혈관 질병 모형을 제시합니다. 이 시스템은 다양한 상황에서 1 차적인 내피 세포의 혈전 생성 특성의 연구를 허용합니다. 이 방법은 응고의 상이한 단계 도중 시혈전증 및 항응고 요법에서 평가하기위하여 특히 적합합니다.

시험관 에서 미세 유체 질환 모델 전체 혈액 내피 상호 작용 및 혈전 역학을 실시간으로 연구

여기서, 우리는 미세 유체 칩과 자동으로 제어되는 고효율 순환 미세 유체 시스템을 제공하여 신생 혈관화의 초기 미세 환경을 재구성하여 내피 세포 (EC)가 높은 발광 전단 응력, 생리학적 수준의 경내 연골 흐름 및 다양한 혈관 내막 성장 인자 (VEGF)에 의해 자극 될 수 있도록 합니다.

뇌혈관화의 초기 이벤트를 모방하는 미세 유체 모델

우리는 인간 복재 정맥 내피 세포(hSVEC)를 분리하고 배양하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 또한 hSVEC의 기계적 응력을 연구하기 위해 전단 응력과 스트레치를 생성하는 자세한 방법을 제공합니다.

인간 복재 정맥 내피 세포 분리 및 제어된 수준의 전단 응력 및 스트레칭에 대한 노출

여기에서는 하중을 견디는 힘줄 코어 조직과 질병 및 부상에 의해 활성화된 세포 집단을 포함하는 외인성 구획 사이의 힘줄 세포 누화를 모방하는 조립체 모델 시스템을 제시합니다. 중요한 사용 사례로, 외인성 내피 세포의 질병 관련 활성화를 조사하기 위해 시스템을 배포하는 방법을 보여줍니다.

질병 및 복구에서 세포 누화를 조사하기 위한 힘줄 집합체 엔지니어링

학습하세요 코넥신 43 구조적 파괴를 통한 내피 생체역학 교란 측정 방법을. 견인력과 세포 간 응력을 동시에 측정하여 암 전이, 상처 치유 등 병리생리학적 과정에서 세포 힘의 역할을 규명할 수 있습니다.

코넥신 43 구조적 파괴를 통한 내피 생체역학 의 교란

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