Name: 체외내 내측 전정 핵 신경 감도 평가를 위한 경상 시잡한 소음 응용 프로그램 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 s
Description: 배우세요 C57BL/6 마우스 내측 전정 핵 신경에 전기적 잡음을 적용하여 개별 뉴런 반응을 평가하는 방법을. 이 기술은 평형 장애 치료제 개발을 위한 자극 매개변수 최적화에 활용됩니다.

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SPS는 시드니 대학 대학원 연구 장학금에 의해 지원되었다.

설명된 모든 실험 프로토콜은 시드니 동물 윤리 위원회(승인된 프로토콜 번호: 2018/1308)에 의해 승인되었습니다.
1. 동물
참고: 마우스는 오스트레일리아 설치류 센터(ARC;;) 퍼스, 오스트레일리아) 시드니 대학의 의료 재단 건물 동물 시설에서 개최.
<ol><li>환경 농축과 정상적인 12 시간 빛 / 어두운 주기에 마우스를 유지합니다.</li>
	<li>모든 실험에 남성 및 여성 C57BL/6 마우스(3-5주)를 사용하십시오.</li>
</ol>2. 솔루션 준비
<ol><li>29 mM NaHCO3,11 mM 포도당, 120 mM NaCl, 3.3 mM KCl, 1.4 mM NaH2PO4,2.2 mM MgCl2,2.77 mM CaCl2로구성된 인공 뇌척수액 (ACSF) 1 L을 준비하십시오.</li>
	<li>29 mM NaHCO 3, 11 mM 포도당, 241.5mM KCl, 3.3 mM KCl, 1.4 mM NaH2PO4,2.2 mM MgCl2,2.77 mM CaCl2를포함하는 자당 ACSF (sACSF)의 200 mL를 준비하십시오. ACSF 및 sACSF에 CaCl2를 포함하기 전에, 7.4의 pH를 확립하고 칼슘 침전 (흐림)을 피하기 위해 카보겐 (95 % O2 및 5 % CO2)으로 용액을 가스.</li>
	<li>70 mM 칼륨 글루코네이트, 70 mM KCl, 2 mM NaCl, 10 mM HEPES, 4 mM EGTA, 4 mM Mg2-ATP, 0.3 mM Na3-GTP로 구성된 K+기반 세포 내 용액을 준비; 최종 pH는 7.3(KOH를 사용하여 조정). 참고: 0.22 μm 필터로 세포내 용액을 필터링하고 용액의 0.5mL aliquots를 -20°C에 저장하는 것이 좋습니다.</li>
</ol>3. 뇌간 준비
<ol><li>뇌간 추출 전에 sACSF를 카보겐과 평형화하고 얼음 슬러리가 형성되도록 -80 °C에서 25 분 동안 식힙니다.</li>
	<li>이소플루란으로 마우스를 마취 (3-5 %) 산소 (3 mL / 분)에서 포화. 뒷발 반사 신경이 없으면 날카로운 스테인레스 스틸 가위로 마우스를 참수하십시오.</li>
	<li>면도날(#22 둥근)을 사용하여 피부에 시상 절개를 하여 두개골을 노출시다.</li>
	<li>표준 패턴 가위 쌍의 뾰족한 끝을 사용하여 람다에서 작은 절개를하고 세로 균열을 따라 잘라냅니다.</li>
	<li>쌍이 짝을 이루는 정수리 뼈와 후두 뼈를 얕은 구부러진 피어슨 롱게르를 사용하여 조심스럽게 반사합니다. 참고: 이 전체 절차 동안 뇌는 지속적으로 이전에 준비 된 얼음 차가운 sACSF 슬러리를 사용하여 자리에서 목욕된다.</li>
	<li>뇌간을 전뇌와 그 뼈에서 분리면도날(#11 스트레이트)를 사용하여 파리에토-문피탈 설커스를 잘라내고 꼬리 수질에서 분리합니다.</li>
	<li>이전에 절단 된 사다리꼴 폴리스티렌 블록에 고립 된 뇌간 복부 끝을 아래로 마운트합니다. 절단 단계에 좋은 조직 접착을 보장하기 위해 티슈 페이퍼의 심지로 해부 된 조직 주위의 과잉 유체를 제거하십시오. 참고: 폴리스티렌 블록은 사다리꼴 모양으로 절단되어 중뇌의 로스트랄 끝이 척수에 맞고 테이퍼되도록합니다.</li>
	<li>시아노아크릴레이트 접착제를 사용하여 부착된 뇌간 로스트랄 끝이 있는 폴리스티렌 블록을 절단 단계까지 고정합니다.</li>
	<li>0.16mm/s의 전진 속도와 3.00mm의 진동 진폭을 사용하여 MVN의 200 μm 횡단 슬라이스를 준비합니다. 참고: MVN의 위치는 Paxinos 및 프랭클린 마우스 뇌 아틀라스 (도 79-89)20을사용하여 결정된다. MVN (아틀라스에서 MVe로 나열)즉시 4 심실에 뇌측에 놓여 있으며 소뇌의 부착 직전에 가장 큽니다 (열등한 콜리큘리와 obex 사이).</li>
	<li>플라스틱 트리밍 파이펫을 사용하여 25°C에서 25°C의 ACSF에 있는 필터 종이 디스크에 적어도 30분 동안 조각을 옮기자.</li>
</ol>4. 악기
<ol><li>표준 전기 생리학적 설정을 사용하여 전체 세포 패치클램프 기술(21)을 수행한다.</li>
	<li>마이크로파이펫 풀러에서 2단계 프로토콜(열 단계 1: 70; 열 단계 2:45)을 사용하여 마이크로파이펫을 준비합니다(재료 표참조). 마이크로파이펫은 욕조에 배치할 때 내부 용액으로 3-5MΩ에 이르는 최종 저항을 가져야 합니다. 참고: 사용 설정은 실내 온도에 따라 다를 수 있으며 매우 자주 변경될 수 있습니다.</li>
</ol>5. 전 세포 패치 클램프 전기 생리학
<ol><li>MVN의 개별 뉴런으로부터 전체 세포 패치 클램프 기록을 얻기 위해, K+기반 내부 용액은 기록 파이펫 내에서 사용된다.</li>
	<li>인큐베이션 챔버에서 단일 조직 슬라이스를 기록 챔버로 옮기고 U 자형 무게에 나일론 실을 사용하여 슬라이스를 고정합니다. 3 mL/min의 유량으로 25°C에서 카보겐화 ACSF로 기록 챔버를 지속적으로 정유합니다.</li>
	<li>마이크로파이펫을 내부 용액으로 채운 후 저전력(10x) 대물 렌즈를 사용하여 MVN을 찾습니다. 고전력(40x) 목표를 사용하여 MVN 내의 개별 뉴런을 위치시킬 수 있습니다. 참고: 셀 품질은 전체 셀 구성을 달성하려고 할 때 셀의 품질 기록 및 내구성을 보장하는 데 필수적입니다. 좋은 세포는 구형 모양, 반사 세포막 및 보이지 않는 핵을 보여줍니다. 나쁜 세포는 큰 눈에 보이는 핵 (계란 같이) 및 부은/수축한 외관이 있을 것입니다.</li>
	<li>파이펫으로 조직을 위반하기 전에 소량의 양압을 가하여 파이펫 팁에서 이물질을 밀어 내보하십시오.</li>
	<li>마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 피펫을 선택한 뉴런쪽으로 이동하고 작은 보조개가 뉴런 막에 형성되어야합니다. 양압을 해제하고 소량의 음압을 가합니다.</li>
	<li>1GΩ 씰이 달성되면 흡입 포트를 통해 피펫 홀더에 부드러운 짧고 날카로운 양압을 적용하여 멤브레인을 파열시키고 전체 셀 구성을 만듭니다.</li>
	<li>표준 기술21,22를사용하여 전체 셀 전류 클램프 기록을 확인합니다.</li>
</ol>6. 개별 내측 전정 핵 뉴런에 정현수 및 경위 노이즈 적용
<ol><li>3에서 24 pA까지의 진폭 범위에서 경상 및 정현파 노이즈를 적용하여 뉴런 임계값과 발사 속도를 결정합니다.</li>
	<li>더 낮고 더 높은 자극 강도를 그룹화하여 감각 임계값을 결정하고 ANOVA를 수행하여 임의의 차이를 관찰합니다(보충 도1에 나타난 바와 같이).</li>
	<li>탈분극 전류 단계가 각 개별 전류 수준(즉, 총 7개 에피소드)에 대해 주입되는 10s 기간 동안의 평균 발사 속도를 계산합니다. 그림1).</li>
	<li>평균 발사 속도 값을 사용하여 현재 플롯과 비교하여 발사 속도를 생성하고 선형 회귀 해석을 수행하여 최적 맞춤 선의 그라데이션을 결정합니다. 가장 적합한 선의 그라데이션은 뉴런 게인22를나타냅니다.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60044/60044fig1.jpg"> 그림 1: 제어, 정현수 및 경위 노이즈 프로토콜의 도식 프로파일. (A) MVN 뉴런에 적용된 제어(노이즈 없음) 프로토콜. (B) 전력 스펙트럼의 대부분이 ≤2 Hz인 확률 노이즈 프로토콜은 2Hz의 주파수를 가진 정현파 노이즈 프로토콜입니다. 여기에 제시된 각 프로토콜은 ±6 pA의 진폭을 가지며 10s의 탈분극 전류는 최대 50 pA까지 10 pA씩 증가한다. 진정한 자극은 탈분극 전류 단계를 갖지 않으며 따라서 뉴런 이득 변화를 결정하기 위한 이러한 프로토콜의 첫 번째 에피소드이다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60044/60044fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<ol><li>Amiridis, I. G., Hatzitaki, V., Arabatzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-induced+modifications+of+static+postural+control+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Age-induced modifications of static postural control in humans.</a> Neuroscience Letters. 350 (3), 137-140 (2003).</li>
<li>Iwasaki, S., Yamasoba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dizziness+and+imbalance+in+the+elderly%3A+age-related+decline+in+the+vestibular+system%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+and+disease%22%5BJournal%5D)">Dizziness and imbalance in the elderly: age-related decline in the vestibular system.</a> Aging and disease. 6 (1), (2015).</li>
<li>Fujimoto, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noisy+galvanic+vestibular+stimulation+induces+a+sustained+improvement+in+body+balance+in+elderly+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Noisy galvanic vestibular stimulation induces a sustained improvement in body balance in elderly adults.</a> Scientific Reports. 6, 37575(2016).</li>
<li>Breen, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+tactile+sensory+perception+of+older+adults+improved+using+subsensory+electrical+noise+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Engineering+%26+Physics%22%5BJournal%5D)">Peripheral tactile sensory perception of older adults improved using subsensory electrical noise stimulation.</a> Medical Engineering & Physics. 38 (8), 822-825 (2016).</li>
<li>Yamamoto, Y., Struzik, Z. R., Soma, R., Ohashi, K., Kwak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noisy+vestibular+stimulation+improves+autonomic+and+motor+responsiveness+in+central+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Noisy vestibular stimulation improves autonomic and motor responsiveness in central neurodegenerative disorders.</a> Annals of Neurology. 58 (2), 175-181 (2005).</li>
<li>Soma, R., Nozaki, D., Kwak, S., Yamamoto, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1%2Ff+noise+outperforms+white+noise+in+sensitizing+baroreflex+function+in+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">1/f noise outperforms white noise in sensitizing baroreflex function in the human brain.</a> Physical Review Letters. 91 (7), 078101(2003).</li>
<li>Wiesenfeld, K., Moss, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+resonance+and+the+benefits+of+noise%3A+from+ice+ages+to+crayfish+and+SQUIDs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stochastic resonance and the benefits of noise: from ice ages to crayfish and SQUIDs.</a> Nature. 373 (6509), 33-36 (1995).</li>
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<li>Goel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+low+levels+of+stochastic+vestibular+stimulation+to+improve+balance+function%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Using low levels of stochastic vestibular stimulation to improve balance function.</a> PloS one. 10 (8), e0136335(2015).</li>
<li>Inukai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+noisy+galvanic+vestibular+stimulation+on+center+of+pressure+sway+of+static+standing+posture%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Stimulation%3A+Basic%2C+Translational%2C+and+Clinical+Research+in+Neuromodulation%22%5BJournal%5D)">Effect of noisy galvanic vestibular stimulation on center of pressure sway of static standing posture.</a> Brain Stimulation: Basic, Translational, and Clinical Research in Neuromodulation. 11 (1), 85-93 (2018).</li>
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<li>Iwasaki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noisy+vestibular+stimulation+increases+gait+speed+in+normals+and+in+bilateral+vestibulopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+stimulation%22%5BJournal%5D)">Noisy vestibular stimulation increases gait speed in normals and in bilateral vestibulopathy.</a> Brain stimulation. 11 (4), 709-715 (2018).</li>
<li>Serrador, J. M., Deegan, B. M., Geraghty, M. C., Wood, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+vestibular+function+in+the+elderly+with+imperceptible+electrical+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Enhancing vestibular function in the elderly with imperceptible electrical stimulation.</a> Scientific Reports. 8 (1), 336(2018).</li>
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<li>Flores, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+resonance+in+the+synaptic+transmission+between+hair+cells+and+vestibular+primary+afferents+in+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Stochastic resonance in the synaptic transmission between hair cells and vestibular primary afferents in development.</a> Neuroscience. 322, 416-429 (2016).</li>
<li>Huidobro, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brownian+Optogenetic-Noise-Photostimulation+on+the+Brain+Amplifies+Somatosensory-Evoked+Field+Potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Brownian Optogenetic-Noise-Photostimulation on the Brain Amplifies Somatosensory-Evoked Field Potentials.</a> Frontiers in Neuroscience. 11, 464-464 (2017).</li>
<li>Goldberg, J., Ferna, C., Smith, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+of+vestibular-nerve+afferents+in+the+squirrel+monkey+to+externally+applied+galvanic+currents%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Responses of vestibular-nerve afferents in the squirrel monkey to externally applied galvanic currents.</a> Brain Research. 252 (1), 156-160 (1982).</li>
<li>Baird, R., Desmadryl, G., Fernandez, C., Goldberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vestibular+nerve+of+the+chinchilla.+II.+Relation+between+afferent+response+properties+and+peripheral+innervation+patterns+in+the+semicircular+canals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">The vestibular nerve of the chinchilla. II. Relation between afferent response properties and peripheral innervation patterns in the semicircular canals.</a> Journal of Neurophysiology. 60 (1), 182-203 (1988).</li>
<li>Remedios, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Short-Term+Random+Noise+Electrical+Stimulation+on+Dissociated+Pyramidal+Neurons+from+the+Cerebral+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Effects of Short-Term Random Noise Electrical Stimulation on Dissociated Pyramidal Neurons from the Cerebral Cortex.</a> Neuroscience. 404, 371-386 (2019).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, K. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+mouse+brain+in+stereotaxic+coordinates%22">The mouse brain in stereotaxic coordinates</a>. , Gulf professional publishing. (2004).</li>
<li>Camp, A. J., Callister, R. J., Brichta, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+synaptic+transmission+differs+in+mouse+type+A+and+B+medial+vestibular+nucleus+neurons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Inhibitory synaptic transmission differs in mouse type A and B medial vestibular nucleus neurons in vitro.</a> Journal of Neurophysiology. 95 (5), 3208-3218 (2006).</li>
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<li>Iwasaki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Noisy+Galvanic+Vestibular+Stimulation+on+Ocular+Vestibular-Evoked+Myogenic+Potentials+to+Bone-Conducted+Vibration%5BTitle%5D)+AND+%22Front+in+Neurology%22%5BJournal%5D)">Effect of Noisy Galvanic Vestibular Stimulation on Ocular Vestibular-Evoked Myogenic Potentials to Bone-Conducted Vibration.</a> Front in Neurology. 8, 26(2017).</li>
<li>Goldberg, J., Smith, C. E., Fernandez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relation+between+discharge+regularity+and+responses+to+externally+applied+galvanic+currents+in+vestibular+nerve+afferents+of+the+squirrel+monkey%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Relation between discharge regularity and responses to externally applied galvanic currents in vestibular nerve afferents of the squirrel monkey.</a> Journal of Neurophysiology. 51 (6), 1236-1256 (1984).</li>
</ol>

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

전정 계에 대한 갈바닉 전정 자극(GVS)의 효과는 인간3,13,23,기니피그14,설치류18 및 비인간 영장류(24)에서 생체 내에서 강조되었다. 그러나, 이러한 연구의 아무도 전정 시스템에 개별 뉴런의 감도전기 잡음의 직접적인 영향을 평가. 여기에서 우리는 개별 내측 전정 핵 (MVN) 뉴런에 직접 경상 핵의 첫번째 시험관 내 응용을 보여줍니다.
개별 MVN 뉴런에 직접 경위 노이즈를 적용하는 주요 목적은 노이즈가 뉴런 민감도에 직접 영향을 미치는지 여부를 확인하는 것입니다. 따라서, 어떻게 SR (SR)가 인간에 있는 균형에 영향을 미치는 방법 확립. SR이 분명하게 드러나기 위해서는...

전정 (또는 균형) 시스템은 청각, proprioceptive, 체감각 및 시각 정보를 통합하여 균형의 감각을 제어합니다. 전정 시스템의 열화는 연령의 함수로 발생하는 것으로 나타났으며 균형 적자1,2. 그러나, 전정 시스템의 기능을 표적으로 하는 치료는 부족합니다.
갈바닉 전정 자극 (GVS)은 인간 3,4,5,6내의 균형 측정, 자율 기능 및 기타 감각 적 양상을 개선하는 것으로 나타났습니다. 이러한 개선은 서브임계값 노이즈7,8의적용을 통해 비선형 시스템에서 약한 신호의 검출이 증가하는 SR(SR) 현상에 기인한다고 한다. 이러한 연구는 정적9,10 및 동적11,12 균형, 및 안구 카운터 롤 (OCR)13과같은 전정 출력 테스트에서 개선을 보여 주었다. 그러나, 이러한 연구의 대부분은 백색 잡음 9, 착색된 잡음13,다른 자극 주파수 범위 및 임계 값 기술과 같은 자극 매개 변수의 다른 조합을 사용했다. 따라서 최적의 자극 파라미터는 알 수 없으며 이 프로토콜은 가장 효과적인 파라미터를 결정하는 데 도움이 될 수 있습니다. 자극 매개 변수 외에도 자극의 유형은 치료 및 실험 효능에도 중요합니다. 인간에서 위의 작업은 전기 소음 자극을 사용하여 수행되었으며, 생체 내 동물 작업의 대부분은 기계적14,15 또는 광유전학16 노이즈 자극을 사용했습니다. 이 프로토콜은 전기 노이즈를 사용하여 전정 핵에 미치는 영향을 검사합니다.
이전에는 1차 전정구를 자극하는 GVS를 다람쥐 원숭이17,친칠라스18,닭배아15 및 기니피그14에서생체 내에서 실시하였습니다. 그러나, 이 연구 결과의 단지 2개는 GVS가 1차 전정 구심점14,15의이득에 있는 효력을 검토했습니다. 이러한 실험은 전정 핵에 부과된 정확한 자극 패턴을 결정할 수 없다는 것을 의미하는 생체 내에서 수행되었다. 우리의 지식에, 단 하나의 다른 연구는 중추 신 경계에 개별 효소 해리 뉴런에 경위 잡음을 적용했다 19. 그러나, 적절한 자극 파라미터 및 임계값 기술을 평가하기 위해 중앙 전정 핵에서 실험이 수행되지 않았으며, 전정 내의 개별 뉴런에 대한 자극 효과를 결정하는 데 있어 이 프로토콜을 보다 정확하게 만듭니다. 핵.
여기에서는 내측 전정 핵(MVN)의 개별 뉴런에 정현부 및 경위(전기) 노이즈를 직접 적용하고, 뉴런 임계값을 결정하고, 게인/감도의 변화를 측정하는 방법을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>CaCl</td><td>Scharlau</td><td>CA01951000</td><td>ACSF 및 sACSF</td></tr><tr><td>D-(+)-글루코스</td><td>시그마</td><td>G8270</td><td>ACSF 및 sACSF에 사용</td></tr><tr><td>EGTA 시</td><td>그마</td><td>E0396-25G</td><td>K 기반 세포 내 용액에 사용</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375-25G</td><td>K 기반 세포 내 솔루션에 사용</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Chem-supply</td><td>PA054-500G</td><td>ACSF, sACSF 및 세포 내 용액에 사용</td></tr><tr><td>K-글루코네이</td>트 <td>시그마</td><td>P1847-100G</td><td>K 기반 세포 내 용액에 사용</td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>시그마</td><td>A9187-500MG</td><td>K 기반 세포 내 솔루션에 사용</td></tr><tr><td>MgCl</td><td>Chem-supply</td><td>MA00360500</td><td>ACSF 및 sACSF</td></tr><tr><td>Na3-GTP</td>에 사용 <td>Sigma</td><td>G8877-100MG</td><td>K 기반 세포 내 솔루션에 사용</td></tr><tr><td>ACSF와 세포내 해결책</td> <td>NaH를 위한 NaCl</td><td>화학 공급</td><td>SO02270500</td> 사용</tr><tr><td>NaH2PO4&#8226; 2H2O</td><td>Ajax</td><td>AJA471-500G</td><td>ACSF 및 sACSF에 사용</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761-1KG</td><td>ACSF 및 sACSF</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Chem-supply</td><td>SA030-500G</td><td>sACSF</td></tr><tr><td>Isoflurane</td>에 사용 <td>Henry Schein</td><td>1169567762</td><td>마우스 마취에 사용</td></tr><tr><td>장비</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>붕규산 유리 모세관</td><td>Warner instruments</td><td>GC150T-7.5</td><td>1.5 mm OD, 1.16 mm ID, 7.5 cm</td></tr><tr><td>길이 데이터 수집 소프트웨어</td><td>Axograph</td><td></td><td>전기 생리학 및 분석에 사용</td></tr><tr><td>Friedmen-Pearson Rongeurs</td><td>World 정밀 기기</td><td>14089</td><td>해부에 사용</td></tr><tr><td>마이크로 피펫 풀러</td><td>Narishige</td><td>PP-830</td><td>마이크로 피펫에 사용</td></tr><tr><td>멀티 클램프 증폭기</td><td>축삭 기기</td><td>700B</td><td>전기 생리학에 사용</td></tr><tr><td>pH 측정기</td><td>Sper 과학</td><td>860033</td><td>내부 용액에 사용</td></tr><tr><td>표준 패턴 가위</td><td>FST</td><td>14028-10</td><td>해부에 사용</td></tr><tr><td>Sutter micromanipulator</td><td>Sutter</td><td>MP-225 / M</td><td>전기 생리학에 사용</td></tr><tr><td>정립 현미경</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td>전기생리학에 사용</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1200</td><td>뇌 조직 절단에 사용</td></tr></tbody></table>

체외내 내측 전정 핵 신경 감도 평가를 위한 경상 시잡한 소음 응용 프로그램

Stochastic Noise Application for the Assessment of Medial Vestibular Nucleus Neuron Sensitivity In Vitro

갈바닉 전정 자극 (GVS)는 균형 또는 전정 장애를 가진 개인의 균형 측정을 개선하는 것으로 나타났습니다. 이는 약한 신호의 검출을 증가시키기 위해 비선형 시스템에 낮은 레벨/서브임계값 자극의 적용으로 정의되는 sR(sR) 현상에 기인하는 것으로 제안된다. 그러나, 그것은 여전히 알 수 없는 어떻게 SR 인간의 균형에 그것의 긍정적인 효과 전시. 이것은 개별 뉴런에 대한 정현제 및 경층 잡음의 효과의 첫 번째 데모 중 하나입니다. 전체 세포 패치 클램프 전기 생리학을 사용하여, 정현파 및 경위 잡음은 C57BL/6 마우스의 내측 전정 핵(MVN)의 개별 뉴런에 직접 적용될 수 있다. 여기서 우리는 정현부 및 경위 자극이 서브 임계값임을 보장하기 위해 MVN 뉴런의 임계값을 결정하는 방법을 설명하고, 이로부터, 각 유형의 노이즈가 MVN 뉴런 이득에 미치는 영향을 결정합니다. 우리는 서브 임계값 정현부 및 경위 잡음이 기저 발사 속도에 영향을 미치지 않고 MVN에서 개별 뉴런의 민감도를 조절할 수 있음을 보여줍니다.

초기 기록은 정현부 및 경위 잡음이 개별 MVN 뉴런의 기저 발사 속도에 미치는 영향과 자극이 뉴런의 이득에 미치는 영향에 대한 정보를 제공할 수 있습니다. 도 2는 대조군(노이즈 없음) 기록과 비교할 때 Sinusoidal 또는 stochastic noise가 MVN 뉴런의 기저 발사 속도를 변화하지 않는다는 것을 보여줍니다. 이 정보는 개별 뉴런의 임계값을 결정하는 데 중요합니다. 인간에게 갈바닉 전정 자극을 적용하는 동안, 자극이 서브 임계값13임을보장하기 위해 감각 역치 작업이 수행된다. 서브임계값 자극은 7,8. 시험관내에서, 이 임계값 화 태스크는 다르게 수행되어야 하고 뉴런의 활성 또는 기저 발사 속도는 이를 위해 선택되었다. 이것은 자극이 가능한 한 하위 임계값에 가깝고 따라서 인...

인간에 있는 갈바닉 전정 자극은 전정 기능에 있는 개선을 전시합니다. 그러나, 그것은 이러한 효과 발생 하는 방법을 알 수 없습니다. 여기서, 우리는 정현파 및 경위 전기 노이즈를 적용하는 방법을 설명하고 C57BL/6 마우스에서 개별 내측 전정 핵 뉴런에서 적절한 자극 진폭을 평가합니다.

Galvanic vestibular stimulation (GVS) has been shown to improve balance measures in individuals with balance or vestibular impairments. This is proposed ...

이 프로토콜은 조직 조각의 개별 뉴런에 전기 잡음의 직접 적용의 첫 번째 데모 중 하나입니다. 전기 자극에 대한 신경 반응을 관찰하기 위해. 이 기술의 주요 장점은 개별 뉴런에 대한 특정 자극 매개 변수 세트를 평가할 수 있다는 것입니다.이 기술은 특정, 기능신경 유형을 대상으로 자극 매개 변수의 최적화를 허용한다. 이것은 균형 기능 장애에 대한 더 나은 치료법의 개발에 대한 의미가 있습니다. 뇌간 추출을 시작하기 전에 CARPOGEN을 사용하여 S-ACSF를 원평하고 얼음 슬러리가 형성될 때까지 25분 동안 영하 80도의 용액을 식힙니다.용액이 차가워진 후, 22번 의 둥근 면도날을 사용하여 3~5주 된 C-57 블랙 6마우스의 두개골에 처진 피부 절개를 하고, 람다에서 시작하여 작은 절개를 하기 위해 표준 패턴 가위 한 쌍의 뾰족한 끝을 사용하여 좌골 봉합사를 따라 작은 절개를 합니다. 얕은 벤드 피어슨 폰 주르의 쌍을 사용하여, 조심스럽게 수리 된 정수리와 외수성 뼈를 반사하고, 얼음 차가운 s-ACSF에 뇌를 목욕. 그런 다음, 뇌줄기를 전뇌와 그 뼈가 11번 직선 면도날을 사용하여 정수리 외수성 황액과 소달 부정을 잘라낸다.격리 된 뇌 줄기 복부를 장착하고 광범위하게 사다리꼴 폴리스티렌 블록을 잘라, 해부 조직 주위에서 여분의 액체를 제거하기 위해 티슈 페이퍼의 조각을 사용합니다. 시아노아크라일트 접착제를 사용하여 폴리스티렌 블록을 부착된 뇌간 로스트랄 및 다운으로 절단 단계로 고정하십시오. 초당 0.16밀리미터의 고급 속도와 3mm의 진동 진폭을 사용하여 MVN의 200 마이크로미터 가로 조각을 얻습니다.그런 다음 플라스틱 트리밍 파이펫을 사용하여 조직 조각을 필터 종이 디스크에 전달하여 적어도 섭씨 25도에서 ACSF로 30 분 이상 옮김하십시오. 전세포 패치 클램프 전기생리학의 경우, 칼륨 기반 내부 용액으로 채워지고 욕조에 배치할 때 3메가 옴까지 3메가 옴에 이르는 최종 저항을 가진 마이크로 파이펫을 먼저 당깁니다. MVN의 개별 뉴런으로부터 전세포 패치 클램프 레코딩을 얻으려면, 인큐베이션 챔버에서 표준 전기생리학적 설정의 기록 챔버로 단일 조직 조각을 전송하고, U 자형 중량에 나일론 실을 사용하여 슬라이스를 확보한다.분당 3밀리리터의 유량으로 25도의 탄산 ACSF로 기록 챔버를 지속적으로 침투시키고 마이크로 파이펫을 내부 용액으로 채웁니다. 파이펫 을 사용하여 소량의 양압을 적용하여 파이펫 끝에서 이물질을 밀어 넣습니다. 낮은 전력 목표를 사용하여 MVN을 찾아 MVN 내에서 개별 뉴런을 찾기 위해 고전력으로 전환하기 전에 MVN을 찾습니다.파이펫으로 조직을 위반하기 전에 소량의 양압을 적용하여 피펫 끝에서 이물질을 밀어내고 마이크로 조작기를 사용하여 피펫을 선택한 뉴런으로 이동시합니다. 작은 보조개신경막에 형성되어야 합니다. 양압을 방출하고 소량의 음압을 가한다.기가 옴 씰 1개가 달성되면 흡입 포트를 통해 파이펫 홀더에 부드러운 짧고 날카로운 음압을 적용하여 멤브레인을 파열시키고 전체 셀 구성을 생성합니다. 그런 다음 표준 프로토콜에 따라 전셀 전류 클램프 레코딩을 가져옵니다. 개별 내측 전정 핵 뉴런에 관능 및 부비동성 잡음을 적용하려면 3에서 24 피코 앰프까지 진폭의 범위를 설정하여 신경 임계값을 결정하고 발사 속도를 결정하고 더 높고 낮은 자극 강도를 그룹화하여 감각 임계값을 결정합니다.다음으로, 10초 기간 동안의 평균 발사 속도를 계산하여 각 개별 전류 레벨에 대해 탈극화 전류 단계를 주입합니다. 평균 발사 속도 값을 사용하여 현재 플롯대비 발사 속도를 생성합니다. 그런 다음 선형 회귀 분석을 수행하여 가장 적합한 선의 그라데이션을 결정하여 신경 이득을 결정합니다.부비동성이나 금욕적인 소음은 소음 기록 제어를 제어하는 것과 비교하여 MVN 뉴런의 바질 발사 속도를 변경하지 않습니다. 본 실험에서, 선택된 노이즈 레벨 6 피코 앰프는 서브 임계값이며, 평균 발사 속도가 12피코 암페어의 실험 임계값으로부터 증가하기 시작한다는 것을 관찰할 수 있다. 이 임계값은 실험 임계값 을 위와 이하로 그룹화하여 객관적으로 결정되었습니다.뉴런 이득은 소음 없이 10피코 앰프 단위로 0에서 50 피코 앰프까지 현재 단계의 탈극화 의 제품군에 뉴런을 적용하여 평가되었다. 실제로, 6개의 피코 앰프의 서브 임계값 진폭에 적용된 부비동및 금욕적 잡음은 MVN 뉴런의 이득을 바꿀 수 있다. 확립된 자극 매개변수는 개별 뉴런을 혁신하는 신경에 적용되어 보다 자연스런 자극을 제공할 수 있다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

방법은 자유의 여섯도 (6DF) 모션 시뮬레이터를 사용하여 인간의 입체 전정 안구 반사 신경을 (3D VOR)를 측정하기 위해 설명되어 있습니다. 3D 각도 VOR의 이득과 어긋남은 전정 기능의 품질을 직접 측정을 제공합니다. 건강한 주제에 대한 대표적인 데이터가...

자유 모션 플랫폼의 여섯도를 사용하여 세 가지 차원 전정 안구 반사 테스트

이 비디오는 새끼 쥐의 내이에서 전정 뉴런을 분리하는 방법을 보여줍니다. 이 책은 내이를 해부하고, 전정 신경절을 적출하고, 이어서 신경절을 단일 세포로 해리하는 단계를 꼼꼼하게 설명합니다. 그런 다음 이 세포를 유리 바닥 접시에서 배양하여 전정 뉴런 배양을 확립합니다.

전정신경절 뉴런(Vestibular Ganglion Neurons from a Mouse Inner Ear)

이 비디오는 전기 자극에 대한 뉴런 민감도에 대한 노이즈 전류의 영향을 연구하기 위해 전체 세포 패치 클램프 기술을 사용하여 내측 전정 핵 뉴런에 하위 임계값 노이즈 전류를 적용하는 것과 관련된 프로토콜을 보여줍니다.

Whole-Cell Patch-Clamp 기술을 사용하여 내측 전정핵 뉴런에 잡음 전류 적용

전정 헤어 세포 기능의 분석은 두개골, 추체 측두골의 가장 어려운 부분 깊은 곳의 위치가 복잡합니다. 대부분의 기능 모발 세포 연구는 심하게 고립 된 유모 세포를 사용했습니다. 여기에서 우리는 전기 생리학 및 2 광자 현미경 연구를위한 마우스 전정 상피 세포의 반 그대로 준비에 대해 설명합니다.

전기 생리학 및 고해상도 두 광자 현미경을위한 마우스 전정 감각 상피의 격리 된 세미 그대로 준비

모터 제어 및 균형 성과는 나이와 함께 저하하는 것으로 알려져있다. 이 논문은 노화의 쥐 모델에서 균형 성능 전정 시스템 및 표시 변경에 도전 할 수있는 간단한 회전 자극의 추가와 함께 표준 비 침습적 행동 검사의 번호를 제공합니다.

노화 마우스 전정 시스템의 행동 평가

이 프로토콜 vestibular 시스템 공부에 대 한 유용한 방법은 쥐의 외과 labyrinthectomy에 설명 합니다.

Vestibular 시스템 공부를 쥐의 외과 Labyrinthectomy

프로토콜은 엘리베이터 수직 모션 및 관람수 회전을 사용하여 설치류의 수동 모션의 자율 및 행동 효과를 평가하기 위해 제공됩니다.

엘리베이터 수직 모션 및 관람대 회전을 사용하여 쥐의 수동 모션의 자율 및 행동 효과 평가

이 기사에서는 6자유도 모션 플랫폼을 사용하여 전정 지각 역치를 추정하는 데 필요한 방법, 절차 및 기술에 대해 설명합니다.

6자유도 모션 플랫폼을 사용한 전정 지각 역치 추정

이 기사에서는 7 Tesla 자기 공명 단층 촬영(7T-MRT) 스캐너에서 자기 전정 자극 하에서 반사적 안구 운동, 자기 움직임 인식 및 인지 작업과 전정 기관의 해부학적 방향을 평가하기 위한 실험 설정, 재료 및 절차를 설명합니다.

7T MRT에서 안진, 자기 움직임 인식 및 인지 능력에 대한 자기 전정 자극의 영향 측정

여기에 제시된 방법은 내이의 전정 신경절 및 나선형 신경절 뉴런에서 해부, 해리, 배양 및 패치 클램프 기록에 대한 자세한 지침을 제공합니다.

Patch-Clamp 기록을 위해 신생아 설치류에서 전정 및 나선형 신경절 소마타를 분리 및 배양합니다.

배우세요 C57BL/6 마우스 내측 전정 핵 신경에 전기적 잡음을 적용하여 개별 뉴런 반응을 평가하는 방법을. 이 기술은 평형 장애 치료제 개발을 위한 자극 매개변수 최적화에 활용됩니다.

체외내 내측 전정 핵 신경 감도 평가를 위한 경상 시잡한 소음 응용 프로그램

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