Name: GEN1에 의한 홀리데이 정션 분해능의 실시간 조사를 위한 단일 분자 Förster 공명 에너지 전송 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: 배우세요 단일분자 Förster 공명 에너지 전이 방법으로 Holliday junction 분해를 실시간 모니터링하는 기술입니다. 이 프로토콜은 GEN1 효소 작용 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 핵심 자금 및 경쟁 연구 상을 통해 과학 기술의 왕 압둘라 대학에 의해 지원되었다 (CRG3) S. M. H.

<ol><li>Moerner, W. E., Fromm, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+single-molecule+fluorescence+spectroscopy+and+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy.</a> Review of Scientific Instruments. 74 (8), 3597-3619 (2003).</li>
<li>Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+fluorescence+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Single-molecule fluorescence resonance energy transfer.</a> Methods. 25 (1), 78-86 (2001).</li>
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<li>Stryer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+energy+transfer+as+a+spectroscopic+ruler%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler.</a> Annual Review of Biochemistry. 47, 819-846 (1978).</li>
<li>Roy, R., Hohng, S., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+single-molecule+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A practical guide to single-molecule FRET.</a> Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).</li>
<li>Walter, N. G., Huang, C. Y., Manzo, A. J., Sobhy, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do-it-yourself+guide%3A+how+to+use+the+modern+single-molecule+toolkit%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Do-it-yourself guide: how to use the modern single-molecule toolkit.</a> Nature Methods. 5 (6), 475-489 (2008).</li>
<li>Conchello, J. A., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning microscopy.</a> Nature Methods. 2 (12), 920-931 (2005).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology.</a> Methods in Enzymology. 361, 1-33 (2003).</li>
<li>Kim, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mg2%2B-dependent+conformational+change+of+RNA+studied+by+fluorescence+correlation+and+FRET+on+immobilized+single+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mg2+-dependent conformational change of RNA studied by fluorescence correlation and FRET on immobilized single molecules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (7), 4284-4289 (2002).</li>
<li>Lee, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+the+folding+transition+time+of+single+RNA+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Measuring the folding transition time of single RNA molecules.</a> Biophysical Journal. 92 (9), 3275-3283 (2007).</li>
<li>Holliday, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+for+Gene+Conversion+in+Fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Genetical+Research%22%5BJournal%5D)">Mechanism for Gene Conversion in Fungi.</a> Genetical Research. 5 (2), 282-304 (1964).</li>
<li>West, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Formation+and+Resolution+of+Holliday+Junctions+during+the+Recombinational+Repair+of+DNA+Damages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The Formation and Resolution of Holliday Junctions during the Recombinational Repair of DNA Damages.</a> Journal of Cellular Biochemistry. , 269-269 (1995).</li>
<li>Cox, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+repairing+stalled+replication+forks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The importance of repairing stalled replication forks.</a> Nature. 404 (6773), 37-41 (2000).</li>
<li>West, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+views+of+recombination+proteins+and+their+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular views of recombination proteins and their control.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 4 (6), 435-445 (2003).</li>
<li>Duckett, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+Holliday+junction%2C+and+its+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The structure of the Holliday junction, and its resolution.</a> Cell. 55 (1), 79-89 (1988).</li>
<li>Clegg, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+resonance+energy+transfer+analysis+of+the+structure+of+the+four-way+DNA+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Fluorescence resonance energy transfer analysis of the structure of the four-way DNA junction.</a> Biochemistry. 31 (20), 4846-4856 (1992).</li>
<li>McKinney, S. A., Declais, A. C., Lilley, D. M., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+dynamics+of+individual+Holliday+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural dynamics of individual Holliday junctions.</a> Nature Structural Biology. 10 (2), 93-97 (2003).</li>
<li>Joo, C., McKinney, S. A., Lilley, D. M., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+rare+conformational+species+and+ionic+effects+in+DNA+Holliday+junctions+using+single-molecule+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Exploring rare conformational species and ionic effects in DNA Holliday junctions using single-molecule spectroscopy.</a> Journal of Molecular Biology. 341 (3), 739-751 (2004).</li>
<li>Hyeon, C., Lee, J., Yoon, J., Hohng, S., Thirumalai, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hidden+complexity+in+the+isomerization+dynamics+of+Holliday+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Hidden complexity in the isomerization dynamics of Holliday junctions.</a> Nature Chemistry. 4 (11), 907-914 (2012).</li>
<li>Ip, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Holliday+junction+resolvases+from+humans+and+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of Holliday junction resolvases from humans and yeast.</a> Nature. 456 (7220), 357-361 (2008).</li>
<li>Rass, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+Holliday+junction+resolution+by+the+human+GEN1+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Mechanism of Holliday junction resolution by the human GEN1 protein.</a> Genes & Development. 24 (14), 1559-1569 (2010).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+Structure+of+a+Eukaryotic+GEN1+Resolving+Enzyme+Bound+to+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Crystal Structure of a Eukaryotic GEN1 Resolving Enzyme Bound to DNA.</a> Cell Reports. 13 (11), 2565-2575 (2015).</li>
<li>Chan, Y. W., West, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GEN1+promotes+Holliday+junction+resolution+by+a+coordinated+nick+and+counter-nick+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">GEN1 promotes Holliday junction resolution by a coordinated nick and counter-nick mechanism.</a> Nucleic Acids Research. 43 (22), 10882-10892 (2015).</li>
<li>van Gool, A. J., Hajibagheri, N. M., Stasiak, A., West, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+the+Escherichia+coli+RuvABC+resolvasome+directs+the+orientation+of+holliday+junction+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Assembly of the Escherichia coli RuvABC resolvasome directs the orientation of holliday junction resolution.</a> Genes & Development. 13 (14), 1861-1870 (1999).</li>
<li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Holliday+junction+resolvase+GEN1+uses+a+chromodomain+for+efficient+DNA+recognition+and+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Human Holliday junction resolvase GEN1 uses a chromodomain for efficient DNA recognition and cleavage.</a> eLife. 4, (2015).</li>
<li>Chan, Y. W., West, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+control+of+the+GEN1+Holliday+junction+resolvase+ensures+genome+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Spatial control of the GEN1 Holliday junction resolvase ensures genome stability.</a> Nature Communications. 5, 4844(2014).</li>
<li>Liu, Y., Freeman, A. D., Declais, A. C., Lilley, D. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+monovalent+ion+in+the+DNA+binding+interface+of+the+eukaryotic+junction-resolving+enzyme+GEN1%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A monovalent ion in the DNA binding interface of the eukaryotic junction-resolving enzyme GEN1.</a> Nucleic Acids Research. 46 (20), 11089-11098 (2018).</li>
<li>Zhou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Junction+resolving+enzymes+use+multivalency+to+keep+the+Holliday+junction+dynamic%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Junction resolving enzymes use multivalency to keep the Holliday junction dynamic.</a> Nature Chemical Biology. 15 (3), 269-275 (2019).</li>
<li>Bellendir, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+preference+of+Gen+endonucleases+highlights+the+importance+of+branched+structures+as+DNA+damage+repair+intermediates%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Substrate preference of Gen endonucleases highlights the importance of branched structures as DNA damage repair intermediates.</a> Nucleic Acids Research. 45 (9), 5333-5348 (2017).</li>
<li>Sobhy, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+of+the+Holliday+junction+recombination+intermediate+by+human+GEN1+at+the+single-molecule+level%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Resolution of the Holliday junction recombination intermediate by human GEN1 at the single-molecule level.</a> Nucleic Acids Research. 47 (4), 1935-1949 (2019).</li>
<li>Sobhy, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+single-molecule+multi-color+excitation+and+detection+fluorescence+set-up+for+studying+biomolecular+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Versatile single-molecule multi-color excitation and detection fluorescence set-up for studying biomolecular dynamics.</a> Review of Scientific Instruments. 82 (11), 113702(2011).</li>
<li>Kapanidis, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-aided+molecule+sorting%3A+analysis+of+structure+and+interactions+by+alternating-laser+excitation+of+single+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-aided molecule sorting: analysis of structure and interactions by alternating-laser excitation of single molecules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (24), 8936-8941 (2004).</li>
<li>Lee, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+FRET+measurements+within+single+diffusing+biomolecules+using+alternating-laser+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Accurate FRET measurements within single diffusing biomolecules using alternating-laser excitation.</a> Biophysical Journal. 88 (4), 2939-2953 (2005).</li>
<li>Rashid, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+state+of+DNA-Dye+complex+sets+the+stage+for+protein+induced+fluorescence+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Initial state of DNA-Dye complex sets the stage for protein induced fluorescence modulation.</a> Nature Communications. 10 (1), 2104(2019).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+ethanol+precipitation+of+DNA+in+microcentrifuge+tubes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Standard ethanol precipitation of DNA in microcentrifuge tubes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).</li>
<li>Holden, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+limits+of+single-molecule+FRET+resolution+in+TIRF+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Defining the limits of single-molecule FRET resolution in TIRF microscopy.</a> Biophysical Journal. 99 (9), 3102-3111 (2010).</li>
<li>Bronson, J. E., Fei, J., Hofman, J. M., Gonzalez, R. L. Jr, Wiggins, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+rates+and+states+from+biophysical+time+series%3A+a+Bayesian+approach+to+model+selection+and+single-molecule+FRET+data%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Learning rates and states from biophysical time series: a Bayesian approach to model selection and single-molecule FRET data.</a> Biophysical Journal. 97 (12), 3196-3205 (2009).</li>
<li>Kou, S. C., Cherayil, B. J., Min, W., English, B. P., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+Michaelis-Menten+equations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Single-molecule Michaelis-Menten equations.</a> Journal of Physical Chemistry B. 109 (41), 19068-19081 (2005).</li>
<li>Clegg, R. M., Murchie, A. I., Lilley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+solution+structure+of+the+four-way+DNA+junction+at+low-salt+conditions%3A+a+fluorescence+resonance+energy+transfer+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">The solution structure of the four-way DNA junction at low-salt conditions: a fluorescence resonance energy transfer analysis.</a> Biophysical Journal. 66 (1), 99-109 (1994).</li>
<li>Pohler, J. R., Duckett, D. R., Lilley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+four-way+DNA+junctions+containing+a+nick+in+one+strand%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structure of four-way DNA junctions containing a nick in one strand.</a> Journal of Molecular Biology. 238 (1), 62-74 (1994).</li>
<li>Fogg, J. M., Lilley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ensuring+productive+resolution+by+the+junction-resolving+enzyme+RuvC%3A+large+enhancement+of+the+second-strand+cleavage+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Ensuring productive resolution by the junction-resolving enzyme RuvC: large enhancement of the second-strand cleavage rate.</a> Biochemistry. 39 (51), 16125-16134 (2000).</li>
<li>Sobhy, M. A., Joudeh, L. I., Huang, X., Takahashi, M., Hamdan, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+and+multistep+substrate+interrogation+provides+the+scaffold+for+specificity+in+human+flap+endonuclease+1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Sequential and multistep substrate interrogation provides the scaffold for specificity in human flap endonuclease 1.</a> Cell Reports. 3 (6), 1785-1794 (2013).</li>
<li>Rashid, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+FRET+unveils+induced-fit+mechanism+for+substrate+selectivity+in+flap+endonuclease+1%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Single-molecule FRET unveils induced-fit mechanism for substrate selectivity in flap endonuclease 1.</a> eLife. 6, e21884(2017).</li>
<li>Zaher, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Missed+cleavage+opportunities+by+FEN1+lead+to+Okazaki+fragment+maturation+via+the+long-flap+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Missed cleavage opportunities by FEN1 lead to Okazaki fragment maturation via the long-flap pathway.</a> Nucleic Acids Research. 46 (6), 2956-2974 (2018).</li>
<li>Didenko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+probes+using+fluorescence+resonance+energy+transfer+%28FRET%29%3A+designs+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">DNA probes using fluorescence resonance energy transfer (FRET): designs and applications.</a> BioTechniques. 31 (5), 1106-1116 (2001).</li>
<li>Toseland, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+labeling+and+modification+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescent labeling and modification of proteins.</a> Journal of Chemical Biology. 6 (3), 85-95 (2013).</li>
<li>Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+oxygen+scavenging+system+for+improvement+of+dye+stability+in+single-molecule+fluorescence+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments.</a> Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).</li>
<li>Swoboda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+oxygen+scavenging+for+photostability+without+pH+drop+in+single-molecule+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Enzymatic oxygen scavenging for photostability without pH drop in single-molecule experiments.</a> ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).</li>
</ol>

저자는 경쟁적인 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

본 연구에서는 GEN130에의한 HJ 분해능의 역학을 결정하기 위해 다양한 smFRET 기술이 구현되었다. 유사한 smFRET 접근법은 DNA 복제 및 수리 플랩 엔도너플레제 142,43,44에의한 이중 플랩 DNA 형태 요건 및 절단을 따르기 위해 사용되었다. 여기서는 이 프로토콜의 중요한 단계에 대해 설명합니다. 실란화 반응은 습도의 흔적이 없어야합니다. PEG가 용해되면 가분해를 피하기 위해 실란화 유리에 페질화 용액을 신속하게 적용해야합니다. 다중 채널 유동 셀에서 접착 시트에 갇힌 공기를 제거하여 인접 채널 간의 누설을 방지해야 합니다. PCA 용액은 시간이 지남에 따라 산화되기 때문에 신선하게 준비되어야합니다. 10 N NaOH를 추가하는 것은 그 사이에 소용돌이가 있는 드롭와이즈여야 합니다. 커버 슬립의 형광 배경은 형광으로 표시된 HJ를 흐르기 전에 최소화되어야 합니다. 유동 세포에 있는 화상 진찰은 화상 진찰 표백한 지역을 피하기 위하여 한 방향으로 수행되어야 합니다. ALEX 실험에서, 수용자의 급속한 표백을 피하기 위해 적색 레이저의 힘을 감소시켜야 한다. 시간 경과 실험에서 주기 시간은 가장 빠른 이벤트보다 짧아야 합니다.
smFRET는 생체 분자 반응에 귀중한 실시간 통찰력을 제공 할 수있는 민감한 기술입니다. 그러나, 이 방법은 생화확적인 반응 도중 FRET에 있는 측정 가능한 변경을 달성하는 중 몇몇 기술적인 도전이 있습니다. 이것은 히스토그램과 시간 추적에서 구별 가능한 상태에서 잘 분리 된 기능을 얻는 데 필요합니다. 많은 경우에, smFRET는기판(45)의작은 구조적 변화로 인해 기판의 신중한 설계, 형광부 쌍 및 이들의 위치의 선택, DNA 기판에서의 FRET 변화의 증폭을 필요로 한다. FRET를 수행하기 위한 또 다른 접근법은 표지된 단백질46을사용하는 것입니다. FRET에서의 관찰 창은 기증자(Cy3)보다 더 빠르게 표백하는 경향이 있는 Cy5 또는 Alexa Fluor 647과 같은 수용자의 안정성에 의해 제한된다. 따라서, FRET는 형광 신호를 연장하고 신호 대 잡음 비47,48을 최대화하기 위해 산소 제거 시스템을 개발하기 위한 실험 지속 기간 및 개발 노력을 연장하기 위해 안정적인 형광체에 대한 지속적인 검색을 필요로 한다. .
smFRET에서 문제 해결을 위한 팁 중에는 레이저 파워, 노출 시간, 사이클 시간 및 사이클 수와 같은 이미징과 관련된 여러 매개 변수의 균형을 맞추어 형광 방출을 최대화하고 실험 기간을 연장하며 달성합니다. 효소 역학에 대한 적절한 샘플링 간격을 정합니다. 효소 역학을 나타내는 고충실도 의 거침상 분포를 얻기 위해서는 관찰 시간이 길어지고 광표백으로 인한 최소한의 효과가 필수적입니다. ALEX는 이 방법이 단일 색상 FRET에 비해 광표백 입자의 기여도가 낮기 때문에 더 나은 히스토그램을 생성합니다. 그러나 ALEX의 시간 해상도는 단일 색상 FRET의 해상도보다 낮습니다.
마지막으로, 개별 분자의 형태/구조적 변화를 실시간으로 감지하는 데 중점을 두는 smFRET는 고해상도 구조 기술(즉, X선 결정학, 핵 자기 공명, 전자 현미경 검사법) 사이의 격차를 해소합니다. 측정 가능한 속성의 앙상블 평균을 산출하는 정적 조건 및 벌크 방법하에서 원자 분해능 구조 세부 사항을 제공합니다. 많은 양상에서, smFRET는 실시간으로 생물학 시스템을 공부하기위한 강력한 기술로 입증되었습니다.

형광 검출에 기초한 단일 분자 방법은 높은 신호 대 잡음 비율1을제공합니다. FRET는 1-10 nm 범위의 거리를 측정할 수 있는 분광 기술로, 이 기술을 나노미터 범위2,3에서거리를 측정하기 위한 분자 눈금자로 렌더링합니다. 수용자의 흡수 스펙트럼은 더 짧은 파장 단부에서 공자의 방출 스펙트럼과 부분적인 스펙트럼 중첩을 가한다. FRET는 공여자와 수락자 쌍 사이의 방사선이 없는 에너지 전달에 의해 매개되는 반면, 에너지 전달의 효율은 수용자4의거리 및 방향에 의존한다.
배경을 최소화하고 형광 신호5,6의검출 효율을 향상시키기 위해 여러 가지 접근법이 구현되었습니다. 한 가지 접근법은 공초점 현미경 검사법으로, 핀홀이 여기 지점을 회절 한계7이하의 크기로 제한합니다. 또 다른 접근법은 총 내부 반사 형광(TIRF)이며, 이는 빛이 임계 각8위의 오프축을 향하는 광시야 조명 기술이다. 빛은 유리와 수성 용액 사이의 인터페이스에 완전히 내부적으로 반사되어 유리 표면에 부착 된 형광단만 을 비추고 나머지 부분에서 형광로호르의 배경을 방지하는 전도파를 생성합니다. 솔루션.
공초점 현미경 검사법에서, 분자는 자유롭게 확산되거나 표면 고정될 수 있습니다. 달성된 시간적 해상도는 마이크로초에서 몇 밀리초9이내일 수 있습니다. 단일 분자에 대한 공초점 검출은 관심 영역의 단일 광자 눈사태 다이오드(SPAD) 및 점별 스캐닝에 의해 수행된다10. TIRF에서 표면에 고정된 수백 개의 분자의 타임시리즈는 위치 민감도 2차원 전하 결합 검출기(CCD)에 의해 기록됩니다. CCD는 강화된 형광체 스크린 및 마이크로채널 플레이트 또는 광전자(EMCCD)의 온칩 증식에 의해 형광 신호를 증폭시됩니다. 시간적 해상도는 CCD의 판독 속도 및 양자 효율에 따라 달라지며 일반적으로 수십 밀리초6의순서로 달라집니다.
HJ는 DNA 수리 및 재결합11,12,13,14의중앙 중간체이다. HJ는 서로 교차하지 않고 연속 가닥 간에 연결되는 두 개의 연속 및 2개의 교차 가닥을 가지고 있습니다. HJ는 X-스택 응체로서 용액에 존재하며, 이는 연속 가닥이 교차되고 교차 가닥이 다른컨포머(15)에서연속되는 것에 의해 연속적인 이소성화를 겪는다. HJ의 이소머 선호도는 코어 서열 및 이온 환경에 의존하며 FRET16,17,18,19에의해 광범위하게 연구되었다.
GEN120은 용액21에서 단모성 단백질이며 HJ를 갈라기 위해 이량화가 필요하므로 재결합 된 가닥22,23의적절한 분리를 허용합니다. HJ의 스태킹 컨포머 선호도는 HJ resolvases24에의한 해상도의 방향을 설정하여 유전 재결합의 결과에 영향을 미칩니다. GEN1이 HJ를 결합하고, 두 절개를 조정하고, 전체 해상도가 모두 집중적 인 연구21,22,23,25,26을 받고 있는지 이해 ,27,28,29,30.
이 연구에서는, 앞서31에설명된 바와 같이 객관적인 기반 TIRF 설정이 사용된다. 2색 교대로 여기(ALEX)를 적용하여 Gen1과 HJ라벨이 부착된 형광포와의 상호작용시 형태 변화를 결정합니다. ALEX는 2개의 비율 메트릭 파라미터 FRET 효율 E, 이는 공여체-수용자 거리 의존성, 및 공여체-수용기 stoichiometry32를측정하는 stoichiometry 파라미터 S를 기반으로 2D 히스토그램을 생성한다. ALEX는 기증자 전용, 수용자 전용 및 혼합 하위 집단을 포함하여 형광단의 stoichiometries에 근거를 둔 형광 종의 분류를 가능하게 합니다. ALEX는 전체 범위로 FRET의 사용을 확장할 수 있으며 형광부 밝기 및 올리고머화의 차이를 감지할 수 있을 뿐만 아니라 거대분자-리간드상호작용(33)을모니터링할 수 있다.
GEN1은 GEN1-HJ 복합체의 수명 내에서 HJ를 해결하는 데 지속적으로 성공한 것으로 나타났습니다. 히스토그램은 근본적인 인구의 분포를 나타내는 동안 시간 의존하는 형태 변화는 개별 분자의 시간 추적에서 파생됩니다. 타임랩스 단색 FRET를 사용하여 GEN1 디머에 대한 빠른 온레이트와 느린 오프레이트가 입증되어 첫 절개 제품에서 조립된 GEN1 디머의 친화도를 증가시킴을 유발합니다.

<table><tbody><tr><td>(&플러스mn;)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>238813</td><td></td></tr><tr><td>0.1 M 중탄산나트륨 완충액</td><td>Fisher</td><td>144-55-8</td><td></td></tr><tr><td>10 % Novex Tris-Borate-EDTA gel</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EC6275BOX</td><td></td></tr><tr><td>100 X TIRF objective</td><td>Olympus</td><td>NAPO 1.49</td><td></td></tr><tr><td>3,4-dihroxybenzoic acid (PCA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5630</td><td></td></tr>, <tr><td>3-아미노프로필트리에톡시실란(APTES)</td><td>시그마-알드리치</td><td>741442</td><td></td></tr><tr><td>6% Novex, 트리스-붕산염-EDTA 겔</td>, <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EC6265BOX</td><td></td></tr><tr><td>접착 시트</td><td>, Grace bio-labs,</td><td>SA-S-1L</td><td></td></tr><tr><td>, 벤치탑, 냉장 원심분리기</td>, <td>Eppendorf</td><td>Z605212</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-PEG</td><td>Laysan Bio</td><td>비오틴-PEG-SVA 5000</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA)</td><td>New England Biolabs</td><td>B9001S</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘 이수화물</td><td>시그마-알드리치</td><td>31307</td><td></td></tr><tr><td>양이온 교환 컬럼</td><td>GE 헬스케어</td><td>MonoS (4.6/100)</td><td></td></tr><tr><td>세포 분산기</td><td>일정 세포 파괴 시스템</td><td>TS5/40/CE/GA</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue</td><td>MP Biomedicals</td><td>808274</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 방출 필터</td><td>Chroma</td><td>HQ600/40M-25</td><td></td></tr><tr><td>Cy5/Alexa Fluor 647 방출 필터</td><td>Chroma</td><td>HQ700/40M-25</td><td></td></tr><tr><td>DV2 필터 큐브용 이색</td><td>성 Photometrics</td><td>630dcxr-18x26</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0861</td><td></td></tr><tr><td>드릴</td><td>Dremel</td><td>200-1/21</td><td></td></tr><tr><td>전자 절단기</td><td>Copam</td><td>CP-2500</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD 카메라</td><td>Hamamatsu</td><td>C9100-13</td><td></td></tr><tr><td>에폭시 접착제</td><td>Devcon</td><td>14250</td><td></td></tr><tr><td>FPLC Aktapurifier UPC 10</td><td>GE Healthcare</td><td>28406268</td><td></td></tr><tr><td>GelQuant.NET 소프트웨어</td><td>biochemlabsolutions.com</td><td>버전 1.8.2</td><td></td></tr><tr><td>GEN1 엔트리 벡터</td><td>Harvard 플라스미드 저장소</td><td>HSCD00399935</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>시그마 생명 과학</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>녹색 레이저(방출 532nm)</td><td>Coherent</td><td>Compass 315M-100</td><td></td></tr><tr><td>헤파린 컬럼</td><td>GE 헬스케어</td><td>HiTrap 헤파린 컬럼</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>BDH</td><td>BDH4162</td><td></td></tr><tr><td>이미지 스플리터</td><td>광도</td><td>듀얼뷰(DV2)</td><td></td></tr><tr><td>이미다졸</td><td>시그마-알드리치</td><td>I2399</td><td></td></tr><tr><td>도립 현미경</td><td>올림푸스</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>이소프로필-&szlig;-D-티오갈락토시드(IPTG)</td><td>골드바이오.</td><td>12481C100</td><td></td></tr><tr><td>레이저 스캐너</td><td>GE 헬스케어</td><td>태풍 트리오</td><td></td></tr><tr><td>LB 육수</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>BP1426-500</td><td></td></tr><tr><td>롱 패스 532nm 필터</td><td>Semrock</td><td>LPD02-532RU-25</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘</td><td>시그마 생명 과학</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>mPEG</td><td>Laysan Bio</td><td>mPEG-SVA 5000</td><td></td></tr><tr><td>뉴트라비딘</td><td>Pierce</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA 컬럼</td><td>GE 헬스케어</td><td>HisTrap FF</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 10% 비스-트리스 겔</td><td>Novex Life 기술</td><td>NP0301BOX</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 10% 비스-트리스 단백질 겔</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0302PK2</td><td></td></tr><tr><td>Origin 소프트웨어</td><td>OriginLab Corporation</td><td>버전 8.5</td><td></td></tr><tr><td>페닐메틸설포닐 불소(PMSF)</td><td>Alexis Biochemicals</td><td>270-184-G025</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>GIBCO</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>폴리에틸렌 튜브(I.D. 0.76mm O.D. 1.22mm)</td><td>Fisher(Becton Dickinson)</td><td>427416</td><td></td></tr><tr><td>프로토카테추에이트 3,4-디옥시게나제(3,4-PCD)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8279-25UN</td><td></td></tr><tr><td>쿼드 밴드 이색성</td><td>Chroma Inc</td><td>Z405/ 488/532/640rpc</td><td></td></tr><tr><td>적색 레이저(방출 640nm)</td><td>코히런트</td><td>큐브 640 100C</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Fisher Chemical</td><td>S271</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall RC-6 plus 원심분리기</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>46910</td><td></td></tr><tr><td>분광 광도계</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Nanodrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>주사기 펌프</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-3007</td><td></td></tr><tr><td>테프론 핀셋</td><td>루비스</td><td>K35A</td><td></td></tr><tr><td>트리스 베이스</td><td>Promega</td><td>H5135</td><td></td></tr><tr><td>초원심분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima L-90K</td><td></td></tr><tr><td>한외여과막</td><td>Millipore</td><td>UFC90300</td><td></td></tr></tbody></table>

gen1에 의한 홀리데이 정션 분해능의 실시간 조사를 위한 단일 분자 förster 공명 에너지 전송 방법

Single-Molecule F&ouml;rster Resonance Energy Transfer Methods for Real-Time Investigation of the Holliday Junction Resolution by GEN1

벌크 방법은 분자의 앙상블 거동을 측정하며, 이 때 기본 단계의 개별 반응 률은 인구 전체에 걸쳐 평균화됩니다. 단일 분자 Förster 공명 에너지 전달 (smFRET)은 실시간으로 개별 분자에 의해 일어나는 형태 변화의 기록을 제공합니다. 따라서, smFRET는 결합 및 촉매 동안 효소 또는 기판의 구조적 변화를 측정하는데 강력하다. 이 작품은 세포질 상동 재조합 효소인 4방향 홀리데이 접합부(HJ) 및 갭 엔도누클로스 I(GEN1)의 상호작용의 단일 분자 이미징을 위한 프로토콜을 제시한다. 또한 GEN1에 의한 HJ의 분해를 실시간으로 따르기 위한 단색 및 2색 교류(ALEX) smFRET 실험 프로토콜이 제시된다. GEN1 이량화의 역학은 HJ의 해결에 있는 중요한 역할을 하기 위하여 건의된 HJ에서 결정되고 지금까지 애매하게 남아 있습니다. 여기에 기술된 기술은 많은 효소 DNA 시스템의 귀중한 기계론적 통찰력을 얻기 위하여 넓게 적용될 수 있습니다.

여기서 제시된 것은 HJ 분해능을 연구하기 위해 단일 분자 Förster 공명 에너지 전달을 수행하기 위한 프로토콜이다. 2색 교대 여기는 해리 상수를 결정하는 데 사용됩니다. 단색 시간 경과 smFRET는 HJ 분해 전에 거주 시간 분포를 얻기 위해 실시간 절단 분석에 적용된다.

GEN1에 의한 홀리데이 정션 분해능의 실시간 조사를 위한 단일 분자 Förster 공명 에너지 전송 방법

Bulk methods measure the ensemble behavior of molecules, in which individual reaction rates of the underlying steps are averaged throughout the ...

이 프로토콜을 사용하면 단일 분자 수준 및 기타 효소 시스템에서 플랩 엔도넥션 1에 의해 상호 작용 역학 및 홀리데이 접합의 해상도를 모니터링할 수 있습니다. 음, 일부는 분자 인구 전반에 걸쳐 평균 또는 기본 개별 기계화 단계를 확보하고있다. 단일 분자 방법은 개별 분자의 실시간 거동을 모니터링하여 이러한 세부 사항을 제공합니다.단일 분자 방법은 높은 특이성을 가진 피코 및 나노 몰라 범위에서 생체 분자 상호 작용을 효율적으로 검출할 수 있습니다. 이는 진단, 게놈 시퀀싱 및 감지에 있어 많은 실용적인 솔루션에 유용합니다. 광학 및 강제 측정 단일 분자 방법은 물리학, 화학 및 생물학에 널리 적용되며 다른 방법으로는 접근 할 수없는 고귀한 관찰을 제공하는 것으로 입증되었습니다.처음 사용자에게 내 조언은 밀접하게이 프로토콜에 배치 된 세부 단계를 따르는 것입니다. 이 프로토콜의 실습 절차의 시각적 그림은 기술의 성공적인 구현으로 이어질 것입니다. 단일 채널 흐름 셀을 준비하려면 50 x 20mm 쿼츠 슬라이드의 중간 부분에 있는 2개의 1.22mm 직경 구멍과 중앙 37밀리미터, 슬라이드 가장자리에서 6.5밀리미터를 드릴링하는 것으로 시작합니다.전자 커터를 사용하여 41 x 2.25 밀리미터 채널을 이중 접착 시트의 50 x 20 mm 조각으로 자르고 보호 커버의 플라스틱 면을 벗겨냅니다. 곡의 가장자리를 석영 슬라이드의 가장자리와 정렬하고 폴리테트라플루오로틸렌 핀셋을 사용하여 갇힌 기포를 부드럽게 제거합니다. 접착제 조각의 종이 측면을 벗겨 커버 슬립의 기능화 표면에 조각을 장착합니다.다음으로, 입구의 경우 1.22밀리미터길이로 1.22밀리미터의 폴리에틸렌 튜빙 1장, 콘센트용 튜브 1장. 그런 다음 튜브를 유동 셀의 입구 및 출구 튜브로 이전에 뚫은 구멍에 삽입합니다. 그리고 5 분 에폭시 접착제를 사용하여 입구 및 출구 튜브에서 석영 커버 슬립 인터페이스의 가장자리를 밀봉하십시오.세포가 건조되면, 1 밀리미터 주사기를 사용하여 PBS에서 밀리리터 농도 avidin 당 0.03 밀리그램을 플러시하여 완충액으로 채워진 두 번째 주사기를 사용하여 주입의 끝에 있는 모든 과잉 아비딘을 씻어냅니다. 단일 컬러 FRET 실험을 수행하기 위해 먼저 1방울의 침지 오일을 총 내부 반사 형광 목표에 적용하고 광전자의 칩 곱셈을 적절한 이득으로 설정하여 배경에 신호를 최적화하고 채도를 방지합니다. 유동 셀을 샘플 홀더에 조심스럽게 배치하고 코스 조정을 사용하여 오일이 덮개 미끄러짐에 닿을 때까지 점차 목표를 높입니다.532 나노미터 레이저를 켜고 목표의 미세 조정 모드로 전환합니다. 카메라 포트에 방출을 지시하여 모니터의 이미지를 관찰하고 커버 슬립의 기능화 된 표면이 초점으로 가져와 모니터에서 관찰 될 때까지 목표의 높이를 조정합니다. 형광 라벨HJ에서 흐르기 전에 커버 슬립의 기능화 된 표면에서 배경이 몇 지점을 초과하지 않는지 확인합니다. 시스템이 0.2 에서 0.5 마이크로 리터의 희석 된 기판의 마이크로 리터를 산소 청소 시스템을 가진 이미징 버퍼 120 마이크로 리터로 0.5 밀리리터 튜브로 준비되고 느린 셀의 출구를 주사기 펌프에 연결합니다.입구 튜브를 1.5 밀리리터 튜브에 삽입하고 분당 30~50마이크로리터에서 주사기 펌프를 시작하여 튜브에서 용액을 인출합니다. 자주 녹색 레이저와 함께 표면을 잠시 이미지하여 균질적으로 분포된 잘 간격이 있는 기판의 100~300개의 입자로 셀의 좋은 커버리지를 확인합니다. 유동 세포 표면이 적절하게 덮여있는 경우, 분당 30 ~ 50 마이크로 리터의 이미징 버퍼를 추가로 플러시하여 결합되지 않은 HJ를 씻어 내고 유동 셀이 5 분 동안 앉아 산소 캐빙 시스템이 용존 산소를 고갈 할 수 있도록하십시오.노출 시간을 약 60밀리초로 설정합니다. 주기 시간은 데이터 전송 속도에 따라 소프트웨어에 의해 자동으로 설정됩니다. 원하는 사이클 또는 프레임 수를 약 400개로 지정합니다.기증자 및 수용자 형광에서 방출은 이미지 스플리터 장치에 의해 컬러 채널로 분할됩니다. 표면에 적합한 영역을 선택하고 목표 높이를 조정하여 이미지에 초점을 맞추고 영화를 16비트 티프 형식으로 저장합니다. 그런 다음 새 영역으로 이동합니다.분당 30 마이크로리터, 한 번에 하나의 농도로 GEN1의 표시 농도로 보충된 120마이크로리터의 이미징 버퍼로 세포를 플러시한다. HJ 분열 실험의 해상도에서, 분당 110 마이크로리터로 유량을 조정하고 유동 세포로 효소의 입구 5 ~10 초 전에 기록을 시작합니다. 유량 세포로 효소의 입구 5 ~10 초 전에 시작하는 화상 진찰은 사건의 수를 최대화합니다.모든 농도가 테스트된 경우 고정 형광 비드 슬라이드를 사용하여 이미지 분할 장치에서 기증자 및 수락기 입자를 서로 매핑합니다. 변환 매트릭스를 생성하기 위해 적절한 소프트웨어 패키지를 설치한 후 기록된 비드 슬라이드 동영상을 열고 기부자 및 수락자 채널에서 개별 구슬의 위치를 선택합니다. 고정 비드 슬라이드에서 매트릭스가 생성되면 TFORM로드를 클릭하고 변환 행렬 파일을 선택합니다.채널 필터 드롭다운 메뉴에서 D&A 옵션을 클릭하여 기증자와 수락자 로 표시된 파티클을 선택합니다. 그런 다음 설명서에서 지시한 대로 플롯TimetraceCW를 입력하여 각 분자에 대한 시간 추적을 생성합니다. ALEX FRET 실험을 수행하려면 녹색 및 빨간색 레이저로 직접 여기를 사용하여 기증자와 수용자 배출의 연속 프레임으로 구성된 영화를 녹화합니다.취득한 ALEX 영화를 열고 기증자 여기로 인한 기증자 배출, 기증자 여기로 인한 수락자 방출 및 직접 흥분 채널로 인한 수락자 방출로 인해 각 기증자 배출에 대해 약 300에 적합한 검출 임계값을 설정합니다. 적절한 채널 필터를 적용하여 기증자와 수락자였던 파티클을 선택하고 세 채널 각각에 각각 200~300개의 파티클을 연결합니다. 플롯히스트ALEX MATLAB 코드를 사용하여 히스토그램 의 함수에서 다른 피크를 피팅하는 ALEX 히스토그램을 생성하고 적절한 그래프 및 분석 프로그램을 사용하여 각 모집단의 곡선 아래 영역의 백분율을 결정합니다.그런 다음 플롯TimetraceALEX MATLAB 코드를 사용하여 FRET 및 직접 여기로 인한 수용자 배출에서 직접 여기에 의해 기증자 배출을 보여주는 각 분자에 대한 시간 추적을 생성합니다. 인접한 라벨 X-0의 대표적인 접대 FRET 히스토그램은 더 풍부하고 덜 풍부한 이소종의 상호 교환에 해당하는 두 개의 피크를 보여줍니다. 이소머의 Dwell 시간 히스토그램에서 얻은 이소성 화 비율은 이전에 보고된 것과 일치합니다.ALEX가 획득한 다른 GEN1 농도에서 인접한 라벨 X-0 접합의 단일 분자 FRET 히스토그램은 낮은 FRET 피크로부터 덜 풍부한 이좀러의 기여를 빼낸 후 HJ 집단에 대응하는 자유 고FRET 이소머 및 1개의 피크에 대응하는 하나의 피크를 나타낸다. 포화 GEN1 농도에서 X-0의 FRET 히스토그램은 모델에서 예측한 대로 HJ의 isomer에 결합된 GEN1에 해당하는 단일 낮은 FRET 피크만 을 갖는다. Gen1 단조체의 결합은 HJ에 대한 단조량체형성이 그 다음에 이량의 핵형성에 따른 고유의 특징이며, 용액의 희미한 형태로 존재하는 원핵류에 비해 진핵HJ 렐솔바제 GEN1의 독특한 특징이다.GEN1 단조량이 HJ를 결합하고 왜곡한다는 추가 증거는 낮은 GEN1 농도에서 마그네슘이 존재하는 안정적인 낮은 FRET 상태를 가진 삼촌 입자의 상당수의 흔적을 관찰하는 것이다. 중간체의 출현 없이 발생하는 해결된 X-0의 흔적에서 안정적인 낮은 FRET 상태 후 기증자 및 수용자의 동시 이탈은 GEN1 HJ 복합체의 수명 내에서 완전한 해상도가 발생한다는 것을 나타낸다. 기능화된 유리 표면의 배경은 몇 개의 반점을 초과해서는 안 되며 균등하게 분포된 입자는 좋은 결과를 얻기 위해 필수적입니다.직렬화 사진을 준비하는 동안 항상 개인 보호 장비와 연기 후드를 사용합니다. 레이저로 작업할 때 파장에 특색있는 보호 안경을 착용하십시오. 저저온압, 핵자기공명과 같은 다른 방법은 원자수준의 구조적 세부사항을 제공할 수 있다.이 정보는 단일 분자 FRET 실험의 설계 및 해석에 필수적입니다. 단일 분자 FRET는 DNA 복제 분야에서 새로운 견해를 열어 헬리케이스 및 뉴클레아제 의 메커니즘을 더 깊이 이해합니다.

single-molecule-frster-resonance-energy-transfer-methods-for-real

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

우리는 미래의 핵산 기반 치료제를위한 균일한 및 사용자 정의 polyplexes보다 제어하고 합성을 제공하는 것으로 예상된다 고분자 전해질의 polyplexes의 형성을 조사하기 위해 nanophotonics (QD - 걱정)와 microfluidics의 소설과 강력한 통합을 제시한다.

결합 QD - 걱정과 Microfluidics 실시간으로 DNA의 Nanocomplex 자체 어셈블리를 모니터하기 위해

이 문서에서는 우리가 자동 스캔 공촛점 현미경을 사용하여 표면에 고정화 각 DNA 분자의 흔적을 걱정 얻는 방법에 대해 설명합니다.

표면 고정화 Biomolecules의 단일 분자 형광 측정을위한 자동화된 시스템

포스터 공명 에너지 전달은 (걱정) 현미경 기자 등 다양한 바이오 센서를 사용하여 라이브 세포에서 이벤트를 신호의 실시간 모니터링을위한 강력한 기술이다. 여기 어떻게 사용자 정의 epifluorescence를 구축하는 것은 상업적으로 이용 가능한 구성 요소와 방법을 실험을 안달을 위해 사용하는 방법에서 영상 시스템을 초조해 설명합니다.

Unimolecular 바이오 센서를 사용하여 라이브 세포에서 이벤트를 신호의 실시간 모니터링을위한 현미경을 안달

이 연구 결과는 단일 분자 형광 공명 에너지 전달 (FRET)를 사용하여 이중 가닥 DNA의 반복 역학을 측정하는 상세한 실험 절차를 제공합니다. 이 프로토콜은 또한 J 인자라는 반복 확률 밀도를 추출하는 방법에 대해 설명합니다.

단일 분자 FRET에 의해 DNA 루핑을 공부

단일 분자 수준에서 고정밀 FRET 실험을위한 프로토콜이 여기에 제시됩니다. 또한,이 방법론은 N- 메틸 -D- 아스 파르 테이트 (NMDA) 수용체의 리간드 결합 도메인에서 3 개의 구조 상태를 확인하는데 사용될 수있다. 정확한 거리를 결정하는 것은 FRET 실험에 기반한 구조 모델을 구축하기위한 첫 번째 단계입니다.

생체 분자 구조 결정을위한 단일 분자 수준의 고정밀 FRET

여기, 우리는 프로토콜 3 색 smFRET 데이터 및 3D 앙상블 숨겨진 마르코프 모델의 분석을 제시. 이 방법을 과학자 들은 복잡 한 단백질 시스템, cooperativity 또는 서로 상호 작용을 포함 하 여에서 운동 정보를 추출할 수 있습니다.

3 색 단일 분자 무서 워를 사용 하 여 단백질 상호 작용의 상관 관계를 연구 하

형광 공명 에너지 전송 기반 실시간 관측 시스템 DNA의 물가 교환 반응 Rad51 중재 개발 되었다. 여기에 제시 된 프로토콜을 사용 하 여, 우리 반응 중간체 및 또한 반응의 효소 활동을 분석 하는 동안 제품에 그들의 변환의 형성을 감지할 수 있습니다.

중재 Rad51 DNA 물가 교환 반응의 실시간 관찰

이 문서에서는 스위치 켜기부터 정렬 및 초점, 데이터 수집 및 분석에 이르기까지 오픈 소스, 저렴한 smfBox를 사용하여 생체 분자를 자유롭게 확산시키는 개별에 대해 완전히 수정된 정확한 FRET 측정을 만들기 위한 단계별 지침을 제공합니다.

오픈 소스 smfBox를 사용하여 정확하고 정확한 단일 분자 FRET 측정

이 문서는 와이드필드 형광 현미경 검사를 사용하여 모바일, 단일 분자 Förster 공명 에너지 전송 (smFRET) 기반 프로브의 현면 분석을위한 방법을 제시한다. 새로 개발된 소프트웨어 툴킷을 사용하면 정확한 FRET 효율과 분자 위치를 포함한 움직이는 프로브의 smFRET 시간 추적을 시간의 함수로 판단할 수 있습니다.

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이 연구는 라벨링 사이트 선택, 염료 선택, 수집 및 데이터 분석을 포함한 FRET 매핑의 방법론을 자세히 설명합니다. 이 방법론은 단백질 시스템에서 결합 부위, 형태 변화 및 동적 운동을 결정하는 데 효과적이며 기존 3-D 구조 정보와 함께 수행 할 때 가장 유용합니다.

Förster 공명 에너지 전달 매핑: 글로벌 구조적 특징을 밝히기 위한 새로운 방법론

여기에서는 컨포칼 현미경 모드에서 단일 분자 수준에서 시간 분해 형광 이방성을 사용하여 생체 분자의 국소 유연성과 역학을 연구하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

생체 분자의 국소 유연성 특성화를 위한 단일 분자의 시간 분해 형광 이방성(Time-Resolved Fluorescence Anisotropy from Single Molecules)

배우세요 단일분자 Förster 공명 에너지 전이 방법으로 Holliday junction 분해를 실시간 모니터링하는 기술입니다. 이 프로토콜은 GEN1 효소 작용 메커니즘 연구에 활용됩니다.

GEN1에 의한 홀리데이 정션 분해능의 실시간 조사를 위한 단일 분자 Förster 공명 에너지 전송 방법

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