GEN1에 의한 홀리데이 정션 분해능의 실시간 조사를 위한 단일 분자 Förster 공명 에너지 전송 방법

이 프로토콜을 사용하면 단일 분자 수준 및 기타 효소 시스템에서 플랩 엔도넥션 1에 의해 상호 작용 역학 및 홀리데이 접합의 해상도를 모니터링할 수 있습니다. 음, 일부는 분자 인구 전반에 걸쳐 평균 또는 기본 개별 기계화 단계를 확보하고있다. 단일 분자 방법은 개별 분자의 실시간 거동을 모니터링하여 이러한 세부 사항을 제공합니다.

단일 분자 방법은 높은 특이성을 가진 피코 및 나노 몰라 범위에서 생체 분자 상호 작용을 효율적으로 검출할 수 있습니다. 이는 진단, 게놈 시퀀싱 및 감지에 있어 많은 실용적인 솔루션에 유용합니다. 광학 및 강제 측정 단일 분자 방법은 물리학, 화학 및 생물학에 널리 적용되며 다른 방법으로는 접근 할 수없는 고귀한 관찰을 제공하는 것으로 입증되었습니다.

처음 사용자에게 내 조언은 밀접하게이 프로토콜에 배치 된 세부 단계를 따르는 것입니다. 이 프로토콜의 실습 절차의 시각적 그림은 기술의 성공적인 구현으로 이어질 것입니다. 단일 채널 흐름 셀을 준비하려면 50 x 20mm 쿼츠 슬라이드의 중간 부분에 있는 2개의 1.22mm 직경 구멍과 중앙 37밀리미터, 슬라이드 가장자리에서 6.5밀리미터를 드릴링하는 것으로 시작합니다.

전자 커터를 사용하여 41 x 2.25 밀리미터 채널을 이중 접착 시트의 50 x 20 mm 조각으로 자르고 보호 커버의 플라스틱 면을 벗겨냅니다. 곡의 가장자리를 석영 슬라이드의 가장자리와 정렬하고 폴리테트라플루오로틸렌 핀셋을 사용하여 갇힌 기포를 부드럽게 제거합니다. 접착제 조각의 종이 측면을 벗겨 커버 슬립의 기능화 표면에 조각을 장착합니다.

다음으로, 입구의 경우 1.22밀리미터길이로 1.22밀리미터의 폴리에틸렌 튜빙 1장, 콘센트용 튜브 1장. 그런 다음 튜브를 유동 셀의 입구 및 출구 튜브로 이전에 뚫은 구멍에 삽입합니다. 그리고 5 분 에폭시 접착제를 사용하여 입구 및 출구 튜브에서 석영 커버 슬립 인터페이스의 가장자리를 밀봉하십시오.

세포가 건조되면, 1 밀리미터 주사기를 사용하여 PBS에서 밀리리터 농도 avidin 당 0.03 밀리그램을 플러시하여 완충액으로 채워진 두 번째 주사기를 사용하여 주입의 끝에 있는 모든 과잉 아비딘을 씻어냅니다. 단일 컬러 FRET 실험을 수행하기 위해 먼저 1방울의 침지 오일을 총 내부 반사 형광 목표에 적용하고 광전자의 칩 곱셈을 적절한 이득으로 설정하여 배경에 신호를 최적화하고 채도를 방지합니다. 유동 셀을 샘플 홀더에 조심스럽게 배치하고 코스 조정을 사용하여 오일이 덮개 미끄러짐에 닿을 때까지 점차 목표를 높입니다.

532 나노미터 레이저를 켜고 목표의 미세 조정 모드로 전환합니다. 카메라 포트에 방출을 지시하여 모니터의 이미지를 관찰하고 커버 슬립의 기능화 된 표면이 초점으로 가져와 모니터에서 관찰 될 때까지 목표의 높이를 조정합니다. 형광 라벨HJ에서 흐르기 전에 커버 슬립의 기능화 된 표면에서 배경이 몇 지점을 초과하지 않는지 확인합니다. 시스템이 0.2 에서 0.5 마이크로 리터의 희석 된 기판의 마이크로 리터를 산소 청소 시스템을 가진 이미징 버퍼 120 마이크로 리터로 0.5 밀리리터 튜브로 준비되고 느린 셀의 출구를 주사기 펌프에 연결합니다.

입구 튜브를 1.5 밀리리터 튜브에 삽입하고 분당 30~50마이크로리터에서 주사기 펌프를 시작하여 튜브에서 용액을 인출합니다. 자주 녹색 레이저와 함께 표면을 잠시 이미지하여 균질적으로 분포된 잘 간격이 있는 기판의 100~300개의 입자로 셀의 좋은 커버리지를 확인합니다. 유동 세포 표면이 적절하게 덮여있는 경우, 분당 30 ~ 50 마이크로 리터의 이미징 버퍼를 추가로 플러시하여 결합되지 않은 HJ를 씻어 내고 유동 셀이 5 분 동안 앉아 산소 캐빙 시스템이 용존 산소를 고갈 할 수 있도록하십시오.

노출 시간을 약 60밀리초로 설정합니다. 주기 시간은 데이터 전송 속도에 따라 소프트웨어에 의해 자동으로 설정됩니다. 원하는 사이클 또는 프레임 수를 약 400개로 지정합니다.

기증자 및 수용자 형광에서 방출은 이미지 스플리터 장치에 의해 컬러 채널로 분할됩니다. 표면에 적합한 영역을 선택하고 목표 높이를 조정하여 이미지에 초점을 맞추고 영화를 16비트 티프 형식으로 저장합니다. 그런 다음 새 영역으로 이동합니다.

분당 30 마이크로리터, 한 번에 하나의 농도로 GEN1의 표시 농도로 보충된 120마이크로리터의 이미징 버퍼로 세포를 플러시한다. HJ 분열 실험의 해상도에서, 분당 110 마이크로리터로 유량을 조정하고 유동 세포로 효소의 입구 5 ~10 초 전에 기록을 시작합니다. 유량 세포로 효소의 입구 5 ~10 초 전에 시작하는 화상 진찰은 사건의 수를 최대화합니다.

모든 농도가 테스트된 경우 고정 형광 비드 슬라이드를 사용하여 이미지 분할 장치에서 기증자 및 수락기 입자를 서로 매핑합니다. 변환 매트릭스를 생성하기 위해 적절한 소프트웨어 패키지를 설치한 후 기록된 비드 슬라이드 동영상을 열고 기부자 및 수락자 채널에서 개별 구슬의 위치를 선택합니다. 고정 비드 슬라이드에서 매트릭스가 생성되면 TFORM로드를 클릭하고 변환 행렬 파일을 선택합니다.

채널 필터 드롭다운 메뉴에서 D&A 옵션을 클릭하여 기증자와 수락자 로 표시된 파티클을 선택합니다. 그런 다음 설명서에서 지시한 대로 플롯TimetraceCW를 입력하여 각 분자에 대한 시간 추적을 생성합니다. ALEX FRET 실험을 수행하려면 녹색 및 빨간색 레이저로 직접 여기를 사용하여 기증자와 수용자 배출의 연속 프레임으로 구성된 영화를 녹화합니다.

취득한 ALEX 영화를 열고 기증자 여기로 인한 기증자 배출, 기증자 여기로 인한 수락자 방출 및 직접 흥분 채널로 인한 수락자 방출로 인해 각 기증자 배출에 대해 약 300에 적합한 검출 임계값을 설정합니다. 적절한 채널 필터를 적용하여 기증자와 수락자였던 파티클을 선택하고 세 채널 각각에 각각 200~300개의 파티클을 연결합니다. 플롯히스트ALEX MATLAB 코드를 사용하여 히스토그램 의 함수에서 다른 피크를 피팅하는 ALEX 히스토그램을 생성하고 적절한 그래프 및 분석 프로그램을 사용하여 각 모집단의 곡선 아래 영역의 백분율을 결정합니다.

그런 다음 플롯TimetraceALEX MATLAB 코드를 사용하여 FRET 및 직접 여기로 인한 수용자 배출에서 직접 여기에 의해 기증자 배출을 보여주는 각 분자에 대한 시간 추적을 생성합니다. 인접한 라벨 X-0의 대표적인 접대 FRET 히스토그램은 더 풍부하고 덜 풍부한 이소종의 상호 교환에 해당하는 두 개의 피크를 보여줍니다. 이소머의 Dwell 시간 히스토그램에서 얻은 이소성 화 비율은 이전에 보고된 것과 일치합니다.

ALEX가 획득한 다른 GEN1 농도에서 인접한 라벨 X-0 접합의 단일 분자 FRET 히스토그램은 낮은 FRET 피크로부터 덜 풍부한 이좀러의 기여를 빼낸 후 HJ 집단에 대응하는 자유 고FRET 이소머 및 1개의 피크에 대응하는 하나의 피크를 나타낸다. 포화 GEN1 농도에서 X-0의 FRET 히스토그램은 모델에서 예측한 대로 HJ의 isomer에 결합된 GEN1에 해당하는 단일 낮은 FRET 피크만 을 갖는다. Gen1 단조체의 결합은 HJ에 대한 단조량체형성이 그 다음에 이량의 핵형성에 따른 고유의 특징이며, 용액의 희미한 형태로 존재하는 원핵류에 비해 진핵HJ 렐솔바제 GEN1의 독특한 특징이다.

GEN1 단조량이 HJ를 결합하고 왜곡한다는 추가 증거는 낮은 GEN1 농도에서 마그네슘이 존재하는 안정적인 낮은 FRET 상태를 가진 삼촌 입자의 상당수의 흔적을 관찰하는 것이다. 중간체의 출현 없이 발생하는 해결된 X-0의 흔적에서 안정적인 낮은 FRET 상태 후 기증자 및 수용자의 동시 이탈은 GEN1 HJ 복합체의 수명 내에서 완전한 해상도가 발생한다는 것을 나타낸다. 기능화된 유리 표면의 배경은 몇 개의 반점을 초과해서는 안 되며 균등하게 분포된 입자는 좋은 결과를 얻기 위해 필수적입니다.

직렬화 사진을 준비하는 동안 항상 개인 보호 장비와 연기 후드를 사용합니다. 레이저로 작업할 때 파장에 특색있는 보호 안경을 착용하십시오. 저저온압, 핵자기공명과 같은 다른 방법은 원자수준의 구조적 세부사항을 제공할 수 있다.

이 정보는 단일 분자 FRET 실험의 설계 및 해석에 필수적입니다. 단일 분자 FRET는 DNA 복제 분야에서 새로운 견해를 열어 헬리케이스 및 뉴클레아제 의 메커니즘을 더 깊이 이해합니다.