Name: 인트스타스타스테어링 전달을 통해 마우스에서 수막구균 수막염 혈청계S C유도 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: 배우세요 성인 마우스에서 뇌수막염균 수막염을 유도하는 방법을. intracisternal 경로를 통해 Neisseria meningitidis를 접종하고 생존율과 세균 부하를 평가합니다. 이 모델은 치료 전략 개발에 활용됩니다.

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연구는 PRIN 2012 [부여 번호 2012WJSX8K]에 의해 부분적으로 지원되었다: "점막 감염에 있는 호스트 미생물 상호 작용 모형: 새로운 치료 전략의 발달" 및 PRIN 2017 [2017SFBFER]에 의해: "상호 작용을 해결하기 위한 통합된 접근법 적응, 스트레스 조건 및 도전 병원 체의 항균 저항".

이 프로토콜은 1986년 11월 24일(86/609/EEC)의 유럽 공동체 이사회 지침에 따라 동물의 고통을 최소화하고 마우스 수를 줄이기 위해 수행되었습니다. 이 연구에서 보고된 생체 내 실험은 윤리적 동물 관리 및 사용 위원회(Prot. Number. 2, 14 12월 2012)와 이탈리아 보건부(Prot. number 0000094-A-03/01/2013)에 의해 승인되었습니다. 모든 절차는 BSL2 룸의 생물 안전 캐비닛 2 (BSC2) 내부에서 수행되어야하며, 잠재적 인 감염된 폐기물은 전용 용기에 폐기해야합니다.
1. N. 수막염 혈청 그룹 C 균주를 가진 마우스의 감염
주의: N. 뇌막염은 잠재적으로 유해한 병원체이며이 미생물을 처리 할 때 필요한 모든 예방 조치를 취해야합니다. 전체 실험에는 생물 안전 성 수준 2 (BSL2) 봉쇄가 필요합니다. 동물 연구에 관여하는 연구원은 실험 기간 동안 일회용 개인 보호 장비(PPE)를 착용해야 합니다.
<ol><li>생체 내 감염 연구를 위한 박테리아의 준비
	<ol>
<li>GC (Gonococcal) 한천 플레이트에 신선한 Neisseria 수막염 배양물에서 1% (vol/vol) 폴리비톡스 보충제를 보충하고 GC 국물의 10 mL에서 접종한 단일 식민지를 선택하십시오.</li>
		<li>220 rpm의 속도로 궤도 셰이커 인큐베이터에서 37 °C에서 박테리아를 성장시킵니다. 분광광도계로 배양물의 O.D.를 계속 확인하십시오. 0.7의 광학 밀도 OD600nm에서 초기 지수 단계까지 배양, ° 7 x 108 CFU/mL에 해당한다.</li>
		<li>필요한 O.D.를 얻으면 10 % 글리세롤을 추가하여 냉동 주식을 만듭니다. 저온에서 배양 1 mL을 분배합니다. 사용할 때까지 바이알을 -80°C에서 보관하십시오. 참고: 신선한 세균 배양을 사용하는 것이 더 낫지만, 냉동 된 주식은 생체 내 실험을 단순화하고 표준화하는 데 사용되었습니다. 일반적으로 냉동 주식은 준비후 약 6개월 이내에 사용되었습니다.</li>
		<li>감염 전에, 실온에서 냉동 박테리아를 해동.</li>
		<li>1,500 x g에서 15 분 동안 원심 분리로 세균 세포를 수확하고 철 덱스렌 (5 mg / kg)을 함유 한 신선한 GC 국물 1 mL에서 다시 중단하십시오. 참고: GC 국물은 숙주조직14,18,27에서수막구균의 복제를 선호하기 위해 철 덱스트란(5 mg/kg)을 첨가하여 제조된다.</li>
		<li>사용 하기 전에, 감염에 대 한 CFU의 정확한 수를 확인 하려면 박테리아의 가능한 수를 수행. 이렇게하려면, 세균 현탁액의 10 μL을 선택하고 직렬 희석을 진행하고 GC 한천 플레이트에 각 희석을 확산하고 18-24 시간 동안 5 %CO2로37 °C에서 배양하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>쥐의 인트라 -시스테나 주사제 참고:전체 절차는 무균 조건을 유지하기 위해 층류 캐비닛에서 수행됩니다.<ol><li>집 실험실 마우스 (8 주 오래 된, 여성 Balb/c) 특정 병원 체 무료 조건 에서. 음식 펠릿 및 물 광고 리비텀을 제공합니다.</li>
		<li>실험을 시작하기 전에 1 주일 동안 새로운 환경에서 동물을 정착시키자.</li>
		<li>실험을 시작하기 전에 체온을 측정하고 평가하십시오. 참고: 8주령의 근친 봉제발/c 암컷 마우스의 무게는 평균 약 19g이다. 실험실 마우스의 평균 온도 는 36-38 °C24에서생리적으로 배열.</li>
		<li>목에서 동물을 스크럽하고, 70% 에탄올로 복부 부위를 청소하고, 25 G 바늘 0.5 mm x 16 mm를 사용하여 뮤린 복부의 오른쪽 아래 사분면에 철 덱스터n (1 % 인산염 염수 완충액, 250 mg / kg)을 주입합니다. , 감염 전에 약 2-3 시간. 참고: 복강 내 주사는 요로 방광, 장골 등과 같은 복부 장기손상을 피하기 위해 뮤린 복부의 오른쪽 사분면에서 수행되었습니다. 외인성 철공급원을 투여한 것은, 철의 형태로 덱스렌의 형태로, 감염 이전에 동물에게 숙주14,18,27에서세균 증식을 선호한다.</li>
		<li>2-3 시간 후 케타민 (50 mg / kg)과 자일라진 (3 mg / kg) 및 안과 윤활유로 동물 마취를 하십시오.</li>
		<li>발가락을 꼬집어 때 통증 반응이 없는지 확인하여 마취의 깊이를 확인하십시오.</li>
		<li>마우스를 흉골 용이한 상태로 놓고 사지와 자궁 경부를 조심스럽게 스트레칭하여 척추 기둥을 직선 위치에 유지하십시오.</li>
		<li>30G 바늘 x 8mm의 주사기를 적재하기 전에 일관된 서스펜션을 유지하기 위해 세균 현탁액을 부드럽게 혼합합니다. 참고: 세균 현탁액을 주사 시간에 가능한 한 가깝게 준비; 한편, 실온에서 보관하십시오.</li>
		<li>포스트 해동 세균 성가자(CFU/mL)에 기초하여, 감염될 동물의 총 수에 대하여 사용될 총 CFU의 계산을 진행한다(동물 수당 CFU 세균 투여량). 유리병으로부터 취해질 정확한 부피의 계산을 진행하여 포스트 해동 세균 역가(CFU/mL)와 n 마우스의 감염에 유용한 총 CFU(포스트 해동 세균 역가 CFU) 사이의 비율을 적용하는 총 CFU를 획득합니다. : ml = 총 CFU : x). 감염될 동물의 총 수에 대하여 최종 부피를 설정한다. 참고: 이러한 실험에서, 동물당 10 4~109의 광범위한 적시가 사용되었다.</li>
		<li>70% 에탄올로 수술 부위를 청소하십시오.</li>
		<li>바늘의 도움으로 주사 점을 확인하고 수막구균 (야생 형 균주 및 등소 생성 돌연변이 균주) 또는 GC 국물을 대조군으로 철 덱스트란 (5 mg / kg)으로 보충 한 확립 된 CFU를 쥐의 시스터나 마그나에 총 부피 10 μL로 주입하십시오. 후두 버 구멍을 통해 30 G 바늘 x 8 mm를 사용 한다.<ol>
<li>특히 등지주지압 공간에서 두개내 각체 접합부에 바늘을 배치하여 시스터내 접종을 수행합니다. 벤트로 플렉스이 공간에 액세스 할 수 있도록 머리28.</li>
			<li>간단히, 측면 recumbency에 동물을 배치, 길에서 귀를 잡고 적당히 목을 구부리다 (90 에 100 °). 목과 머리의 중간선이 (코에서 occiput까지)가 탁상과 완벽하게 평행한 위치에 있는지 확인하십시오.</li>
			<li>아틀라스 날개를 터치하고 축 회전을 제거하여 겹치는지 확인하십시오. 자연적인 들여쓰기는 일반적으로 바늘이 후두 구멍에 들어가기 위하여 확률이 높은 중간선에 만질 수 있습니다.</li>
			<li>Neisseria와마우스의 주입 후 안전하게 주사기와 바늘을 폐기.</li>
		</ol></li>
		<li>케이지에 동물을 놓고 각성과 움직임의 완전한 회복을 기다립니다.</li>
		<li>감염된 마우스가 있는 케이지를 층류 캐비닛 아래에 보관하십시오.</li>
		<li>모니터 마우스, 24 시간 포스트 감염, 혼수 상태에 따른 혼수 상태에 대한 임상 징후29. 혼수 상태에 : 1 = 혼수 상태에, 2 = 뒤로 설정 된 후 똑바로 서 있지 않습니다, 3 = 3초 이내에 똑바로 서, 4 = 5 초 이내에 똑바로 서, 최소 외래 활동, 5 = 정상. 
		 참고: 동물에서 통증을 기록 했을 때, 멜 록 시 캄과 진통 (5 mg/kg i.p. 연구 기간 동안) 관리 되었다.</li>
		<li>2단계에서 상세히 설명한 바와 같이 감염된 동물에 대한 동물 생존 또는 CFU 카운트 분석기를 진행한다.</li>
		<li>자궁 경부 탈구에 의해 2의 점수로 마우스의 안락사를 수행하고 통계 분석을 위해 죽은 것으로 기록.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 동물 생존 및 CFU 카운트
<ol><li>
동물 생존
	<ol>
<li>다른 복용량에서 세균 성 inocula준비 (에 이르기까지 104 받는 사람 109 마우스 당 CFU) i.cist에 의해 동물을 감염. 경로(1.2단계 참조).</li>
		<li>GC 국물로 대조군 마우스를 접종하고 철 분 덱스렌 (5 mg/kg)을 동일한 방식으로 보충하십시오.</li>
		<li>임상 증상에 대 한 동물을 모니터링: 주름 모피, 구부러진 된 외관, 저체온증, 체중 감소, 혼 수, 또는 moribund24,25,26,30,매일 에 대 한 전체 실험에 걸쳐 168 시간 (7일) 실험 기간 동안 적어도 하루에 두 번.</li>
		<li>매일 디지털 저울과 직장 온도계를 사용하여 체중과 온도를 측정합니다.</li>
		<li>일주일 동안 마우스의 생존을 기록합니다. 참고: 관찰의 168 시간 이상 살아남는 동물이 2의 혼수 상태에 도달하는 동안 동물 포스트 감염의 자연적인 죽음을 기록합니다 안락사될 것입니다.</li>
		<li>혼수 상태에 2의 마우스를 마취하거나 케타민 (50 mg / kg)과 자일라진 (3 mg / kg)으로 관찰 시간 동안 생존하고 안과 연고를 적용하십시오.</li>
		<li>발가락 핀치로 통증 반응이 없는지 확인합니다.</li>
		<li>자궁 경부 탈구에 의해 마우스의 안락사를 수행하고 통계 분석을 위해 죽은 것으로 기록.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
말초 기관에서 콜로니 형성 단위 (CFU) 카운트의 평가
	<ol>
<li>i.cist에 의해 동물을 접종하는 동물 생존 결과에 기초하여 서브 치명적인 세균 투여량 (5 x 105CFU / 마우스)을 사용하십시오. 경로(하위 섹션 1.2 참조).</li>
		<li>감염 동안 매일 직장 온도를 모니터링하고 2 단계에서 언급 한 바와 같이 48 시간 후 감염에서 동물의 마취를 수행합니다.</li>
		<li>가슴의 70% 에탄올 소독을 진행하고 25 G 바늘 0.5 mm x 16 mm를 사용하여 흉강의 심장 천자에 의해 혈액의 600-700 μL을 인출한다.</li>
		<li>3.8% 구연산나트륨을 함유하는 튜브에서 혈액을 수집하고 나중에 실행 가능한 세균 세포 수를 위해 -80°C에서 저장한다.</li>
		<li>동물을 희생하기 위해 자궁 경부 탈구를 수행합니다. 모든 관련 기관 및 윤리 지침에 따라 마우스를 희생 한 후 심장 박동이 없는 죽음을 확인하십시오.</li>
		<li>마우스를 척추 위치에 놓고 가위와 집게를 사용하여 신체의 시상 면을 따라 모피의 절단을 진행합니다. 핀으로 몸의 측면에 모피로 피부를 고정합니다.</li>
		<li>날카로운 가위를 사용하여 막막을 잘라냅니다. 가위와 일회용 집게를 사용하여 장기(예: 비장및 간)를 절제하고 10% (vol/vol) 글리세롤로 보충한 GC 국물 1 mL로 멸균 페트리 접시에 각각 넣습니다.</li>
		<li>IACUC 지침에 따라 마우스 본문을 안전하게 폐기합니다.</li>
		<li>단일 세포 현탁액이 형성될 때까지 약 2-3 분 동안 5 mL 주사기의 플런저로 실온에서 기계적으로 기관을 균질화하고 튜브로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김을 전달합니다.</li>
		<li>균질화된 조직 샘플로 튜브를 드라이 아이스에 즉시 넣습니다. 참고: 시료는 2 mL 멸균 튜브에 -80°C에서 저장되어 나중에 가능한 세균 세포 수 계산 평가를 수행할 수 있다.</li>
		<li>필요한 경우 항생제로 GC 한천 접시를 만드십시오. 사용 전에 플레이트를 37°C에서 2-3시간 동안 사전 배양한다.</li>
		<li>각 균질화된 조직및 플레이트에서 GC 국물에서 샘플의 10배 직렬 희석을 GC 한천 플레이트에 준비합니다. 37 °C에서 5 %CO2로밤새 배양하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. CFU 카운트에 대 한 뇌 조직의 준비
<ol><li>i.cist에 의해 동물을 접종하는 동물 생존 결과에 기초하여 서브 치명적인 세균 투여량 (5 x 105 CFU / 마우스)을 사용하십시오. 경로(하위 섹션 1.2 참조).</li>
	<li>2단계에서 언급한 바와 같이 확립된 감염 시간에 동물의 마취를 수행한다.</li>
	<li>자궁 경부 탈구에 의해 동물의 안락사를 수행합니다.</li>
	<li>70% 에탄올로 수술 부위를 청소하십시오.</li>
	<li>큰 가위를 사용하여 마우스의 머리를 잘라.</li>
	<li>작은 수술 가위와 미세 한 기울어진 강철 집게의 도움으로 모피와 피부를 절제하여 두개골 꼭대기쪽으로 진행하여 봉합사를 명확하게 보고 두개골의 개구부를 안내하십시오.</li>
	<li>작은 가위 끝을 두개골을 열기 위해 포라멘 매그넘을 통해 삽입합니다.</li>
	<li>두개골의 중심을 향해 두개골의 반대쪽에 정수리 뼈의 중간선을 가로 질러 잘라. 양두 봉합사의 측면 가장자리를 따라 부드럽게 자릅니다.</li>
	<li>후방 정수리 코너에서 시작하여 두개골을 들어 올리고 미세한 기울어진 집게를 사용하여 뇌를 발견하기 위해 대각선으로 위로 당깁니다.</li>
	<li>두개골이 들어 올릴 때 뇌 조직이 머리의 뼈에 부착되지 않았는지 확인하십시오.</li>
	<li>일회용 집게를 사용하여 두개골과 뇌 사이의 결합 조직을 제거하여 두개골과 함께 뇌 조직이 제거되도록하십시오.</li>
	<li>뇌 조직이 너무 많이 마르지 않도록하십시오. 일회용 집게를 사용하여 1 mL의 GC 국물을 10 % (vol / vol) 글리세롤로 보충 한 페트리 접시에 뇌를 놓습니다.</li>
	<li>5 mL 주사기의 플런저로 뇌를 기계적으로 균질화하십시오 (단계 2.2.9 참조). 2mL 멸균 튜브로 샘플을 옮기고 2.2단계에서 논의된 바와 같이 나중에 실행 가능한 세균 세포 카운트 평가를 위해 -80°C를 저장한다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

이 연구에서는, 우리는 i.cist에 의해 성인 마우스에 있는 수막구균 뇌막염을 유도하는 실험적인 프로토콜을 기술합니다. 수막 구균 박테리아의 접종. 우리의 지식에, 수막 구균 뇌막염의 다른 모델은 i.cist에 의해 감염된 실험실 마우스에서 개발되지 않았습니다. 경로; 과거에는, 이 쪽은 쥐(31)와 토끼(32)둘 다에 있는 수막구균 뇌막염의 모형을 제공하기 위하여 탐구되었습니다. 수막구균 질환의 가장 높은 비율이 어린 아이들, 청소년 및 젊은 성인33,34,35사이에서 발견되는 것으로 잘 알려져 있습니다. 이러한 이유로, 우리의 뇌막염 마우스 모형에서는, 신생아 또는 유아 동물에 집중하는 대신에, 8 주 된 면역 적격 동물이 채택되었습니다.
<p class="jove_...

Neisseria 뇌막염은 인간 호스트에 국한된 그람 음성 β-proteobacterium, 잘 전 세계에 걸쳐 인간 인구에 있는 뇌막염 그리고 패혈증의 일반적인 원인의 한개인 것으로 잘 알려져 있습니다. 그것은 건강하고 무증상 운반대의 상부 호흡기 (코와 목)를 식민지화합니다 (인구의 2-30%), 그러나 박테리아는 때때로 각종 호스트 면역 방어를 회피하고 통제되지 않는 현지를 일으키는 원인이 되는 두뇌에 혈류량에서 퍼집니다 염증, 수막 구균 수막염으로 알려진. 숙주와 세균계수의 조합은 공생에서 침습적행동으로의전환에 기여하는 것으로 보인다 1 .
N. 뇌막염은 인간 식민지화 및 감염에 독점적으로 전문화됩니다. 그것은 좁은 숙주 범위를 가지고 있고, 따라서, 인간 수막구균 질병을 재생하는 적당한 동물 모형의 부족 때문에 생체 내 병인 성 연구에서 제한되었습니다. 그 결과, 수막구균에 의한 패혈증과 뇌막염의 병인에 관한 이해의 근본적인 간격으로 이어졌습니다. 지난 수십 년 동안, 많은 시험관 내 시스템의 발달은 여러 수막 구균 독성 인자2,3,4의식별을 허용했다. 이러한 귀중한 연구는 성공적인 수막 구균 감염을 위한 이 요인의 역할을 이해하기 위하여 중요한 통찰력을 제공했더라도, 이 모형은 체액성 및 세포와 세균성 상호 작용의 결과의 평가를 허용하지 않았습니다 면역 체계와 전체 조직도 적습니다. 감염의 생체 내 동물 모델은 백신 제형에 의해 부여된 보호 정도의 평가뿐만 아니라 큰 관련성을 가지고 있다. 인간 열대 병원체로서, 수막구균은 표면 구조 (즉, 타입 IV 필리 및 불투명도 단백질) 및 인간 수용체 및 수송 단백질을 위한 철 섭취 시스템 (즉, 및 수송 단백질)과 같은 성공적인 감염에 필요한 적절한 결정요인을 가지고 있습니다. transferrin 및 락토페린)5,6,7을 올바르게 부착하고 생존하고 인간 숙주에게 침입합니다. 마지막으로, 인간의 면역 반응을 회피 및/또는 차단하는 병원체의 유전적 변이 능력은 고종 트로피즘8,9에더욱 기여한다. 따라서, 상호 작용에 관여하는 특정 숙주 인자의 부재는 병원체의 수명 주기의 단계를 차단할 수 있으며, 수막 구균 수명 주기를 요약하는 작은 동물 모델의 개발에 상당한 어려움을 확립 할 수 있습니다.
지난 수십 년 동안, 수막구균 전염주기의 우리의 이해를 향상시키기 위하여 몇몇 접근은 개발되었습니다. 두 동물 모델, 마우스와 쥐의 감염, 복강 내 (i.p.) 또는 intranasally (i.n.), 수막 구균 질환을 재현하기 위해 개발되었다10,11,12,13,14 ,15,16,17. 실험실 마우스는 아마 실험적인 수막구균 감염을 유도하기 위한 더 다재다능한 동물의 한개입니다.
그러나, i.p. 감염의 방법은 감염의 자연적인 경로를 모방하지 않더라도 가혹한 패혈증의 발달로 이끌어 냅니다, 반면 감염의 i.n. 경로는 폐 감염을 유도할 수 있더라도 수막구균 병인증을 평가하기 위하여 유용했습니다 패혈증10,11,12, 13,14,15,16,17.
i.p. 마우스 모델은 수막구균 도전10,11,12로부터의보호를 평가하는 데 중요한 역할을 했다. 감염의 i.n. 경로에 기초한 수막구균 식민지화의 마우스 모형은 인간에 있는 수막구균 질병의 과정을 모방하는 침략적인 감염을 재생하기 위하여, 수막구균에 더 영향을 받기 쉽기 때문에, 유아 마우스로 개발되었습니다 13,14,15,16,17. 더욱이, 뮤린 숙주에서 수막구균 복제를 촉진하기 위해, 감염을 개선하기 위해 동물에게 철분 투여, 높은 세균접종의 사용, 마우스-통로 세균성 균주뿐만 아니라 유아 또는 면역 손상된 동물의고용은 10,13,15,18,19. CD4620 또는 트랜스퍼린21과 같은 특정 인간 요인의 발현은 이 인간-열대 박테리아에 대한 마우스의 감수성을 증가시켰습니다. 감염의 인간 피부 이종이식 모델의 고용은 또한 인간내피(22,23)에대한 수막구균의 부착 능력을 평가하는 데 유용하였다. 종합적으로, 인간화형 형질전환 마우스의 최근 발달은 수막구균 병인 및 숙주 상호작용의 이해를 향상시켰다.
이전에는 쥐계세균24를 이용한 성인마우스의 시스터나 마그나로 세균의 접종을 수행한 수막구균 수막염의뮤린 모델을 개발하였다. 임상 적 매개 변수 및 감염된 마우스의 생존율은 인간 숙주에서 볼 수있는 것과 유사한 특성을 가진 뇌막염의 확립뿐만 아니라 뇌의 미생물 및 조직학적 분석을 입증했습니다. 이 감염된 마우스로부터, 박테리아는 또한 혈액, 간 및 비장으로부터 회복되었고, 말초 장기로부터의 세균 부하가 감염성 투여량과 상관되었다. 특히, 이 모델은 L-글루타메이트 수송기GltT 24에서결함이 있는 이소제성 돌연변이균의 독성을 평가하기 위해 사용되었다. 최근, i.cist에 근거를 둔 수막구균 뇌막염의 우리의 마우스 모형을 이용하. 혈청군 C균93/42862,24 및 UDP-N-아세틸루코민 2-에피메라제2-에피메라아제2에 대한 cssA 유전자 인코딩에 결함이 있는 이소제돌연변이결함25를 가진 경로, 우리는 설립시 에피메라제(25)에 노출된 시알산의 역할을 분석하였다. 쥐의 질병.
이 프로토콜에서, 우리는 i.cist에 근거를 둔 실험적인 수막구균 뇌막염을 유도하는 간단한 방법을 기술합니다. Balb/c 성인 마우스에서 감염 경로. 이 방법은 특히 뮤린 숙주에서 수막구균 감염의 특성화뿐만 아니라 야생형 참조 균주 및 동인 성 돌연변이체 사이의 독성의 평가에 유용하다. 감염의 내부 -cisternal 경로는 차례로 뇌척수액 (CSF)에서 세균 복제를 용이하게하고 그 모방 기능을 가진 뇌막염을 유도 하는 시스터나 마그나에 직접 수막 구균의 완전한 전달을 보장 인간에 존재하는2,24,25,26.

<table><tbody><tr><td>1,8 스커트 Cryovial 외부 스레드</td><td>Starlab</td><td>E3090-6222</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 폴리 프로필렌 원추형 튜브</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td>30 mm x 115 mm</td></tr><tr><td>Adson 집게</td><td>F.S.T.</td><td>11006-12</td><td>스테인레스 스틸</td></tr><tr><td>알람 온도계</td><td>TESTO</td><td>9000530</td><td></td></tr><tr><td>BactoTM 프로테오스 펩톤</td><td>BD</td><td>211693</td><td></td></tr><tr><td>BD 마이크로 파인 주사기</td><td>BD</td><td>320837</td><td>U-100 인슐린</td></tr><tr><td>BD Plastipak 주사기 1 mL 25 G 5/8 인치</td><td>BD</td><td>300014</td><td>05 mm x 16 mm</td></tr><tr><td>BD Plastipak 주사기 5 mL</td><td>BD</td><td></td><td>308062 07 mm x 30 mm</td></tr><tr><td>BIOHAZARD AURA B 수직 층류 캐비닛</td><td>Bio Air s.c.r.l.</td><td>Aura B3</td><td></td></tr><tr><td>BioPhotometer</td><td>Eppendorf</td><td>모델 #6131</td><td></td></tr><tr><td>병 D</td><td>Tecniplast</td><td>D</td><td>눈금 매기기: 400 mL, 총 용량 450 mL, 72 mm x 72 mm x 122 mm</td></tr><tr><td>C150 CO2 인큐베이터</td><td>바인더</td><td>9040-0078</td><td></td></tr><tr><td>케이지 본체 Eurostandard Type II</td><td>Tecniplast</td><td>1264C</td><td>267 x 207 x 140 mm3, 바닥 면적 370 cm2</td></tr><tr><td>세포 배양 페트리 접시(뚜껑 포함</td>) <td>Thermo Scientific</td><td>150288</td><td>작업량: 5 mL</td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>microcentrifuge 5415R</td><td></td></tr><tr><td>Cuvetta semi-micro L. Form</td><td>Kartell S.p.A.</td><td>01938-00</td><td></td></tr><tr><td>디-인산수소 칼륨 삼수화물</td><td>Carlo erba</td><td>471767</td><td></td></tr><tr><td>디-인산수소 나트륨 무수 ACS-분석용</td><td>Carlo Erba</td><td>480141</td><td>g1000</td></tr><tr><td>Diete 표준 인증서</td><td>Mucedola s.r.l.</td><td>4RF21</td><td>동물용 식품 펠릿</td></tr><tr><td>Dumont Hp 핀셋 5 스테인레스 스틸</td><td>F.S.T. by DUMONT</td><td>AGT5034</td><td>0.10 x 0.06 mm2 팁</td></tr><tr><td>전자 저울</td><td>Gibertini</td><td>EU-C1200</td><td>Max 1200 g, d = 0.01 g, T = -1200 g</td></tr><tr><td>Eppendorf Microcentrifuge tube safe-lock</td><td>Eppendorf</td><td>T3545-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>에리스로마이신</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E-6376</td><td>25g</td></tr><tr><td>엑스트라 파인 본 가위</td><td>FST</td><td>14084-08</td><td>스테인레스 스틸</td></tr><tr><td>필터 탑 (미니 아이솔레이터), 잠금 클램프가있는 H-Temp</td><td>Tecniplast</td><td>1264C400SUC</td><td></td></tr><tr><td>GC 한천 기본</td><td>OXOID</td><td>CM0367</td><td></td></tr><tr><td>Gillies 집게 1 x2 치아</td><td>FS</td><td>11028-15</td><td>스테인레스 스틸</td></tr><tr><td>글리세린 RPE</td><td>Carlo Erba</td><td>453752</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Graefe 집게</td><td>F.S.T.</td><td>11052-10</td><td>톱니 모양 팁 너비: 0.8 mm</td></tr><tr><td>내부 뚜껑</td><td>Tecniplast</td><td>1264C116</td><td></td></tr><tr><td>철 덱스트란 솔루션</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8517-25ML</td><td></td></tr><tr><td>케타민</td><td>인터벳</td><td></td><td></td></tr><tr><td>미생물 안전 캐비닛 BH-EN 및 BHG 클래스 II</td><td>더 빠른</td><td>BH-EN 2004</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브 1.5 mL&nbsp;</td><td>브랜드</td><td>PP780751</td><td>나사 캡 PP, 그라드</td></tr><tr><td>마우스 핸들링 핀셋</td><td>F.S.T.</td><td>11035-20</td><td>톱니 모양 고무; 그립 표면 : 15mm x 20mm</td></tr><tr><td>Mucotit-F2000</td><td>MERZ</td><td>61846</td><td>2000 mL</td></tr><tr><td>천연 라텍스 장갑</td><td>Medica</td><td>M101</td><td></td></tr><tr><td>New Brunswick Classic C24 인큐베이터 셰이커</td><td>PBI 국제</td><td>C-24 클래식 벤치 탑 인큐베이터 셰이커</td><td></td></tr><tr><td>페트리 PS 접시</td><td>VWR</td><td>391-0453</td><td>90 x 14.2 mm2</td></tr><tr><td>Pipetman Classic P20</td><td>길슨</td><td>F123600</td><td>2-20 &mu; L</td></tr><tr><td>Pipetman 클래식 P200</td><td>Gilson</td><td>F123601</td><td>20-200 &mu; LL</td></tr><tr><td>Pipetman Classim P1000</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td>200-1,000 &mu; L</td></tr><tr><td>Polyvitox</td><td>OXOID</td><td>SR0090A</td><td></td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>J.T. 베이커 화학 변환기</td><td>0208</td><td>250g</td></tr> 인<tr><td>산이수소</td>칼륨 <td>J.T. Baker Chemicals B.V.</td><td>0240</td><td>1kg</td></tr><tr><td>PS 일회용 집게</td><td>VWR</td><td>232-0191</td><td></td></tr><tr><td>탈착식 분배기</td><td>Tecniplast</td><td>1264C812</td><td></td></tr><tr><td>둥근 바닥 폴리 프로필렌 튜브</td><td>Falcon</td><td>352063</td><td>5mL</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>MOLEKULA</td><td>41272436</td><td></td></tr><tr><td>SS 리테이너 및 폴리 에스테르 필터 시트</td><td>Tecniplast</td><td>1264C</td><td></td></tr><tr><td>표준 패턴 겸자</td><td>F.S.T.</td><td>11000-12</td><td>스테인레스</td></tr><tr><td>스티븐스 테노토미 가위</td><td>F.S.T.</td><td>14066-11</td><td>스테인레스 스틸</td></tr><tr><td>수술 용 가위-ToughCut</td><td>FS</td><td>14130-17</td><td>스테인레스</td></tr><tr><td>터치 N 응회암 일회용 니트릴 장갑</td><td>Ansell</td><td>92-500</td><td></td></tr><tr><td>초저온(ULT) 냉동고</td><td>Haier</td><td>DW-86L288</td><td>용량 = 288L</td></tr><tr><td>Wagner 가위</td><td>FST</td><td>14070-12</td><td>스테인레스 스틸</td></tr><tr><td>자일라진</td><td>인터벳</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

인트스타스타스테어링 전달을 통해 마우스에서 수막구균 수막염 혈청계s c유도

Inducing Meningococcal Meningitis Serogroup C in Mice via Intracisternal Delivery

Neisseria 수막염 (meningococcus)는 세균성 뇌막염의 주요 원인으로 세계적으로 인식되는 좁은 호스트 범위 미생물입니다. 수막구균은 건강한 대상체의 약 10%의 인간 비인두의 일시적인 식민지입니다. 특히 상황에서, 그것은 점 막 장벽을 관통 하 고 패 혈 증을 일으키는 혈 류를 침공 하는 침략 능력을 취득. 최신 케이스에서는, 완충 패혈증은 뇌막염의 결과적인 발달 없이조차 생길 수 있었습니다. 반대로, 박테리아는 혈 류에서 제대로 증식 수 있습니다., 혈액 뇌 장벽을 교차, 중앙 신 경계에 도달, 충만 뇌 막염으로 이어지는. 세균성 뇌막염의 murine 모형은 호스트 병원체 상호 작용을 조사하고 이 치명적인 질병에 책임 있는 병원유전적 기계장치를 분석하기 위하여 유용한 공구를 나타냅니다. 비록, 몇몇 실험적인 모형 시스템은 지난 십년간 에 걸쳐 평가되었더라도, 이들 중 어느 것도 수막구균 질병의 특징적인 병리학 적인 사건을 재현할 수 없었습니다. 이 실험 프로토콜에서, 우리는 박테리아의 내성 계발성 접종에 근거를 둔 마우스 모형에 있는 수막구균 뇌막염의 유도를 위한 상세한 절차를 기술합니다. 인간 뇌막염의 특이한 징후는 임상 매개 변수 (예를 들어, 온도, 체중), 생존율 평가, 미생물 학적 분석 및 뇌 손상의 조직 학적 검사의 평가를 통해 뮤린 호스트에 기록되었다. intracisternal를 사용하는 경우 (i.cist.) 접종, 수막 구균은 시스터나마그나로 직접 전달, 뇌 조직에서 매우 효율적인 수막 구균 복제로 이어지는. 박테리아의 실행 가능한 수의 1,000 배 증가는 대략 18 시간에서 관찰됩니다. 더욱이, 수막구균은 또한 감염된 마우스의 비장, 및 간에서 발견되며, 이는 간이 수막구균 복제를 위한 표적 기관을 나타낼 수 있음을 시사한다.

N. 수막염 야생 유형 및 등소생성 돌연변이 균주에 감염된 마우스의 생존. 이러한 대표적인 결과에 사용되는 Neisseria 수막염 균주는 혈청 그룹 C 기준 균주 93/4286 (ET-37) 및 cssA 유전자의 삽입 불활성화에 의해 얻어진 동위 생성 돌연변이 체93/4286ΩcssA, 코딩 상기 UDP-N-아세틸루카민 2-에피메라아제라아제는 캡슐 합성 궤적25에지도한다. 본 뮤린 모델에서 cssA-결함균의독성 정도를 평가하기 위해, 감염된 동물(LD50)의50%의 사망을 결정할 수 있는 치명적인 용량을 평가하였다. 이 목적을 위해 동물의 세 그룹은 야생 형 변형 93/4286의 104 ~ 106 CFU에 이르기까지 용량으로 감염되었고 돌연변이 균주 93/4286ΩcssA 107</sup...

여기에서, 우리는 성인 마우스에 있는 감염의 내성인종 경로를 통해 수막구균 뇌막염을 유도하는 방법을 기술합니다. 우리는 접종의 준비에서 내질 감염에 수막 구균 감염의 단계 프로토콜에 의해 단계를 제시; 그런 다음 동물의 생존을 기록하고 뮤린 조직에서 세균 부하를 평가합니다.

인트스타스타스테어링 전달을 통해 마우스에서 수막구균 수막염 혈청계S C유도

Neisseria meningitidis (meningococcus) is a narrow-host-range microorganism, globally recognized as the leading cause of bacterial meningitis. ...

Neisseria 뇌막염은 전 세계 인간 인구 중 패혈증과 뇌막염의 일반적인 원인 중 하나이며 박테리아는 인간의 숙주로 제한됩니다. 이 실험 프로토콜에서, 우리는 박테리아의 인종 차별성 접종을 기반으로 마우스 모델에서 수막 구균 수막염의 유도를위한 맞춤형 절차를 설명합니다. 이 뮤린 모델은 심각한 인간 질환으로 수막 구균 수막염의 특징적인 병리학적 사건을 재현했습니다.따라서 숙주 병원체 상호 작용을 평가하고 이 치명적인 질병에 대한 병원체 메커니즘을 분석하는 유용한 도구를 나타냅니다. 감염 모형은 CSF로 박테리아 복제를 직접 방지하기 위하여 혁신적인 치료 전략을 평가하는 것 뿐만 아니라 인간 병원체에 대하여 가능한 수동 면역 요법의 효험을 분석하기 위하여 유용할 수 있었습니다. 이 기술은 인인종 차별성 무접종뿐만 아니라 일반적으로 질병 유도의 성공을 보장하기 위해 훈련 단계가 필요합니다.절차를 시연하는 것은 연구원으로 로버타 콜리치오와 키아라 Pagliuca, 그리고 엘레나 스카글리오네 박사 과정 학생으로, 모두 내 실험실에 의해 될 것입니다. 시작하려면, 신선한 Neisseria 수막염 문화에서 단일 식민지를 선택 고노코칼 한천 판에 1% 폴리비톡 스 보충 및 접종 10 밀리리터 GC 브로스. 수막구치의 사용을 포함하는 모든 절차는 라미나르 흐름 바이오 안전 큐브 캐비닛에서 수행해야합니다.220 RPM에서 궤도 쉐이크 인큐베이터에서 37도에서 박테리아를 성장시키고 분광계로 다른 시점에서 배양의 광학 밀도를 계속 검사합니다. 초기 지수 단계에 해당하는 0.7의 OD600에 도달할 때까지 배양을 성장시다. 이 광학 밀도가 얻어지면 10% 글리세롤을 추가하고 저온 바이알에 배양 1밀리리터를 분배하여 냉동 주식을 만듭니다.사용 전까지 바이알을 섭씨 80도에 보관하십시오. 감염 전에, 실온에서 냉동 박테리아를 해동한 다음 1500xG에서 15 분 동안 원심분리기의 원심분리기 튜브로 옮기고 1킬로그램 철 분당 5 밀리그램을 포함하는 신선한 GC 국물의 1 밀리리터에서 다시 중단하십시오. 실험을 시작하기 전에 동물의 무게를 측정하고 체온을 평가합니다.동물을 목 아래에서 긁어 내고 복부를 70%에탄올로 소독합니다. 감염 전 약 2시간 전에, 25 게이지 바늘을 사용하여 복부의 오른쪽 아래 사분면에 철 드레이펜을 내분비로 주입한다. 동물을 마취 한 후 발가락을 꼬집을 때 통증 반응의 부재를 확인하여 마취의 깊이를 확인하십시

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

출처: Zamboni, M., et al., induction of leptomeningeal cells modification by cisternal injection. J. Vis. 경험. (2020년)이 비디오는 마취된 마우스의 수조에 유도 약물을 전달하는 절차를 보여줍니다. 주사는 형광 영상으로 확인된 뇌척수액을 통해 접근할 수 있는 뇌 표면 세포에서 형광 마커 발현을 선택적으로 유도합니다.

Cisterna Magna Injection을 통한 마우스 모델의 표적 약물 전달

이 비디오에서는 Neisseria meningitidis를 마우스 모델로 시추 내 전달하여 수막염 감염을 생성하는 방법을 보여줍니다.

수막구균성 수막염을 유발하기 위해 마우스 모델로 수막구균의 수막구균 내 전달(Intracisternal Delivery of meningococci into mouse models to induce meningococcal meningitis)

이 비디오는 마우스의 비강 내 BCG 면역을 보여주며, 선천성 면역 반응과 적응 면역 반응을 모두 활성화하여 폐 상주 기억 T 세포와 효과기 B 세포의 발달로 이어져 마이코박테리움 감염에 대한 보호를 강화합니다.

마우스 모델에서 BCG를 사용한 비강 내 면역

이 비디오는 신생아 마우스 뇌에서 쥐 거대세포바이러스(MCMV) 분포를 연구하기 위한 뇌내폐 주사 과정을 보여줍니다. 가시성을 위해 강화된 녹색 형광 단백질(EGFP)을 발현하도록 설계된 MCMV는 새끼 쥐의 뇌 외측심실에 주입됩니다. 주입된 바이러스는 뇌척수액을 통해 순환하여 가장자리 영역, 맥락막 신경총 및 심실하 영역을 포함한 뇌실 주위 영역의 세포를 감염시킵니다.

신생아 마우스 뇌에서 쥐 사이토메갈로바이러스 분포를 분석하기 위한 뇌실 내 주사

이 비디오는 CNS에 감염된 마우스 모델의 생성을 보여줍니다. 젖먹이 새끼는 두개골 내 및 복강 내 바이러스를 주입합니다. 바이러스가 퍼져 중추신경계를 감염시켜 신경 세포 사멸과 염증을 일으킵니다. 새끼는 질병이 진행됨에 따라 감염 증상을 평가합니다.

중추신경계 감염이 있는 쥐 모델의 생성

출처: Li, D., et al. 성인 마우스에서 재조합 아데노 관련 바이러스의 직접 척수강내 주사. J. Vis. 경험. (2019년)이 비디오는 깨어 있는 마우스의 뇌척수액(CSF)에 아데노 관련 바이러스(AAV)를 척수강내 주사하는 절차를 보여주며 주사기 준비, 척추 정렬 및 정확한 바늘 삽입을 다룹니다. 이 방법은 표적 유전자 전달을 검증하여 CNS 치료의 잠재력을 뒷받침합니다.

중추신경계 질환 치료를 위한 마우스 모델에서 바이러스의 척수강내 전달

나이 세리아 수막염은 혈관을 감염시키는 인간의 특정 병원체이다. 이 프로토콜에서 인간의 미세 혈관은 면역 억제 쥐에 인간의 피부를 이식하여 마우스에 도입된다. 박테리아는 일반적으로 인간의 경우에 관찰 부르르 발진, 혈관 손상과 발전에 선도적 인, 인간의 혈관에 광범위하게 준수합니다.

인간 답게 된 마우스 모델은 미세 혈관을 대상으로 세균 감염을 연구하는

본 문서에서는 마우스 모델에서 BCG를 사용하여 비강 내 및 피하 면역에 의해 유도된 보호 효능 및 폐 면역 반응을 비교하기 위해 따랐던 방법론을 자세히 설명합니다. 본 연구의 결과는 폐 백신 접종의 이점을 보여주며, 백신 유도 보호에서 IL17 매개 반응의 역할을 시사한다.

보호 효능 및 폐 면역 반응은 마우스에 피하 및 비강 BCG 관리에 따라

이 보고서는 성공적으로 유도 실험 자가 면역 신경 염 (EAN) myelin 단백질을 사용 하 여 0 (P0)180-199 펩타이드 Freund의 완전 한 보조 및 백 일 해 독 소와 함께 하는 간단한 방법을 설명 합니다. 우리는 정확 하 게 기능적인 적자와이 상품에서 발생 하는 neuropathology의 정도 평가 정교한 패러다임 제시.

기능과 Neuropathological 평가 대 한 C57BL/6 쥐에 실험 자가 면역 신경 염을 유발 하는 간단한 방법

여기 선물이 vivo에서 백신의 평가 위한 우아한 프로토콜 효과 호스트 면역 반응. 이 프로토콜은 바이러스 성, 세균성, 백신 모델 또는 기생 병원 균에 대 한 적응 될 수 있다.

호스트 병원 체 응답 및 쥐에 백신의 효능 평가

우리는 두개골에 안정될 수 있는 끝에 바늘을 구부린, 따라서 근본적인 자렌치에 손상의 리스크를 제거하는 intracisternal 주입을 기술합니다. 이 접근법은 렙토메닝 세포의 유전적 운명 매핑 및 조작및 뇌척수액 이동 추적에 사용될 수 있습니다.

내분비주주입을 통한 렙토메닝 세포 변형 유도

배우세요 성인 마우스에서 뇌수막염균 수막염을 유도하는 방법을. intracisternal 경로를 통해 Neisseria meningitidis를 접종하고 생존율과 세균 부하를 평가합니다. 이 모델은 치료 전략 개발에 활용됩니다.

인트스타스타스테어링 전달을 통해 마우스에서 수막구균 수막염 혈청계S C유도

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