Name: 에플로프 펌프 억제를 통해 조혈 줄기 및 전조 세포에서 미토콘드리아 막 전위성 유동 세포 측정 평가의 정확도 향상 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: 배우세요 조혈 줄기 및 전조 세포에서 베라파밀을 이용한 에플로프 펌프 억제로 TMRM 형광 염료를 활용한 미토콘드리아 막 전위성 유동 세포 측정의 정확도를 향상시키는 방법을.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

저자는 이토 실험실의 모든 구성원을 감사, 특히 K 이토와 H 사토, 의견과 아인슈타인 흐름 세포 분석 및 분석 이미징 핵심 시설에 대한 아인슈타인 줄기 세포 연구소 (국립 암 연구소 보조금 P30 CA013330)에 대한 실험을 수행하는 데 도움이됩니다. K.I.는 아인슈타인 단세포 유전체학/후성유전체학(C029154)의 핵심 이사로서 국립보건원(R01DK98263, R01DK115577 및 R01DK100689)과 뉴욕 주 보건부의 보조금으로 지원됩니다. K.I. 이토는 백혈병과 림프종 학회의 연구 학자입니다.

여기에 설명 된 모든 방법은 의학의 알버트 아인슈타인 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.
1. 솔루션 준비
<ol><li>염색 완충제 (인산 완충 식염수 (PBS) + 2 % 태아 소 혈청 (FBS)): 멸균 PBS 용액의 500 mL에 FBS 10 mL을 추가하십시오. 참고: 이 용액은 멸균 상태에서 적어도 1 개월 동안 4 °C에서 보관될 수 있다. 다음 절차를 시작하기 전에 이 용액(50 mL)의 별칭을 얼음 위에 놓습니다.</li>
	<li>ACK (암모늄 염화물 칼륨) 라이징 버퍼 : 절차를 시작하기 전에 ACK 라이징 버퍼 (1 mL)의 aliquot를 얼음위에 놓습니다. 참고: 동일한 비상업적 완충액을 준비하려면, NH4Cl 8.02 g, KHCO3 g 1 g 및 Na2EDTA 의 37.2 mg을 H2O의 1 L에 용해하여 pH를 7.2-7.4로 조정한다. 실온에서 최대 6개월간 보관하십시오.</li>
	<li>배양 배지: 조혈 세포의 배양 및 확장을 위한 혈청이 없는 배지에 50 ng/mL 줄기 세포 인자(SCF)와 50 ng/mL 혈전포이에틴(TPO)을 추가합니다(상업용 배지용 재료 표 참조).</li>
	<li>TMRM 스톡 용액: 에탄올 10 mL에 5 μg의 TMRM 분말을 용해시킴으로써 TMRM(1 μM) 용액을 준비한다. 이 용액을 빛으로부터 보호된 -20°C에 보관하십시오.</li>
	<li>Verapamil 스톡 솔루션: 에탄올 1 mL에 24 mg의 베라파밀을 희석하여 베라파밀(50 mM) 용액을 준비합니다. 이 용액을 -20 °C에 보관하십시오.</li>
	<li>FCCP 스톡 솔루션: 에탄올 1 mL에 254 mg을 용해시켜 카보닐시아니드 p-트리플루오메톡시페닐히드라존(FCCP) (1M) 용액을 준비합니다. 이 용액을 빛으로부터 보호된 -20°C에 보관하십시오.</li>
</ol>2. 골수 격리
<ol><li>기관 지침에 따라CO2 흡입에 의해 마우스를 안락사시키고 마우스를 70% 에탄올로 분무하였다. 참고: 이 단계는 실험 결과를 손상시키지 않으면서 관심 있는 세포의 오염을 방지합니다.</li>
	<li>집게와 날카로운 가위를 사용하여 마우스의 복부 피부에 작은 스니핑을하고 피부를 스트레칭하십시오.</li>
	<li>대퇴골과 경골은 대퇴골의 머리를 빼내지 않도록 주의하면서 다량의 골수 세포를 함유하고 있습니다. 제거된 뼈를 1.5 mL의 염색 버퍼로 채워진 6웰 플레이트에 놓습니다. 참고: 이 절차는 멸균 영역을 필요로하지 않습니다.</li>
	<li>뼈에서 근육을 제거하고 골수의 출구를 허용 뼈의 끝을 잘라 (그림1A). 1.5 mL의 염색 버퍼로 깨끗한 뼈를 새 우물에 놓습니다. 참고: 근육과 다른 조직은 다음 단계에서 주사기 막힘을 피하기 위해 신중하게 제거해야합니다.</li>
	<li>25G 바늘로 3 mL 주사기를 사용하여 골수를 씻어 내보하십시오. 참고: 뼈가 하얗게 될 때까지 골수를계속 씻어 내보릅니다(그림 1B).</li>
	<li>1.5 mL 튜브에 있는 모든 세포를 수집하고, 원심분리기를 180 x g에서 5분 간 제거한 다음 상월체를 버린다(도1C).</li>
	<li>300 μL의 얼음 차가운 ACK 용해 완충액에서 펠릿을 매우 신중하게 중단하고 1 분 동안 얼음에 넣고 즉시 비활성 용해1 mL의 염색 버퍼를 추가하십시오. 원심분리기 180 x g에서5 분. 참고: 세포 펠릿이 흰색으로 나타납니다(그림1D). 분리된 세포의 총 수는 약 2-4x 10 7이다.</li>
	<li>단핵 세포를 얻기 위해 통합 된 35 μm 나일론 메쉬로 셀 스트레이너캡 (12 x 75 mm 2, 5 mL 용량)을 사용하여 1 mL의 염색 버퍼 및 필터에서 펠릿을 다시 일시 중단하십시오. 차단 한 후, 얼음에 샘플을 유지합니다.</li>
</ol>3. HSC 검출을 위한 면역 염색
<ol><li>리니지(린) 칵테일을 준비합니다. 염색 완충액의 400 μL에서, CD3e, CD4, CD8, B220, CD11b, Gr1, Ter119, CD19, Nk1.1, IgM 및 Il7Ra에 대하여 다음의 생체질화 항체의 4 μL을 첨가하여 최종 희석 1:100을 얻었다.</li>
	<li>형광공 컨쥬게이터 항체 (Abs)를 준비하십시오. 400 μL의 염색 완충제에서, 다음 복근의 4 μL을 첨가하여 최종 희석 1:100을 얻었다. 스트렙타비딘-퍼시픽 블루, Sca1-PE/Cy7, c-kit-APC/Cy7, CD48-APC, CD150-PerCP/Cy5.5 및 CD34-FITC. 빛으로부터 보호, 얼음에 보관합니다.</li>
	<li>샘플을 180 x g에서 5 분 동안 원심 분리한 다음 상한체를 버립니다.</li>
	<li>세포 펠릿에 린 칵테일 용액 400 μL을 추가합니다. 4 μL의 CD135-바이오틴틸화된 Ab. Vortex를 빠르게 넣고 얼음에서 30분 동안 혼합하고 배양합니다.</li>
	<li>3 mL의 염색 버퍼를 추가 한 샘플을 씻고 180 x g에서 5 분 동안 회전시키고 상한제를 버립니다.</li>
	<li>400 μL의 복근 용액을 추가하십시오. 소용돌이는 빠르게 혼합하고 얼음에 30 분 동안 배양.</li>
	<li>3 mL의 염색 버퍼로 샘플을 씻고 180 x g에서 5 분 동안 회전시키고 상한을 버립니다.</li>
</ol>4. TMRM 염색
<ol><li>TMRM 염색 용액을 준비합니다. TPO를 사용하여 배양 및 조혈 세포의 배양 및 확장을 위한 혈청이 없는 배지의 1.1 mL에 TMRM 스톡 용액 2.2 μL과 Verapamil 1.1 μL(각각 최종 농도로 50 μM)을 추가합니다(상업용 배지권장 재료 표 참조). 및 SCF. 참고: 이것은 프로토콜의 가장 중요한 단계입니다. Verapamil 추가는 HSC에서 고도로 표현되고 TMRM을 돌출할 수 있는 유출 펌프를 막기 위해 필요합니다.</li>
	<li>TMRM 염색 용액의 1 mL에서 골수를 재중단하고, 와류를 빠르게 37°C에서 1시간 동안 배양합니다. 참고: TMRM 염색은 씻어낼 수 없습니다. PE 전용 보상 제어는 또한 TMRM 염색 용액의 100 μL에서 재중단되고, 빠른 와류 후 37°C에서 1시간 동안 인큐베이션을 행하였다.</li>
	<li>유세포계의 막힘을 방지하기 위해 35 μm나일론 메쉬로 셀 스트레이너 캡(12 x 75 mm 2, 5 mL 용량)을 사용하여 샘플을 필터링합니다. 참고: TMRM 염색은 시료에서 막힘 형성의 가능성을 증가시킨다. 유동 검문바로 전에 시료의 여과가 권장됩니다.</li>
	<li>유세포 측정에 의한 죽은 세포를 배제하기 위해 4',6-디아미디노-2-페닐린들레(DAPI)의 1 μL을 추가합니다.</li>
</ol>5. 유세포계에 의한 취득
<ol><li>골수 샘플을 실행하고 적어도 1 x 106 이벤트를 획득합니다.</li>
	<li>
게이팅 전략을 설정하여 상이한 조혈 인구를 식별합니다(그림 2).
	<ol>
<li>디스플레이 라이브 골수 모노 핵 세포 (BM-MNCs), DAPI- 분율, CD135를 식별하기 위해 태평양 블루 플롯-린- (린-) 및 린+ 분수.</li>
		<li>플롯 린- C 키트+ Sca-1+로, 다능한 선조 (MPP) 분율을 식별하기 위해 PE / Cy7 (Sca-1) 대 APC / Cy7 (c 키트)에 대한 분율 .</li>
		<li>CD150+ 및 CD48로, HSC 분수를 식별하기 위해 PerCP / Cy5.5 (CD150)에 대한 APC (CD48) 대 MPP 분획을 플롯-.</li>
		<li>-HSC 및 CD34+-HSC-- - - - - - FITC (CD34)에 대한 HSC 분획을 표시합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>각 집단에서 TMRM 강도(PE 채널)를 획득한다.</li>
	<li>획득 후, FCCP의 샘플 1 μL을 첨가하여 1 mM의 최종 농도를 얻고 37°C에서 5분 동안 배양한 다음 1 x 10 6개의 이벤트를 획득한다. 참고: FCCP는 ΔΘm을 발산하는 데 사용되는 미토콘드리아 비커플러입니다. TMRM 염색이 올바르게 작동하는지 확인하기 위해 실험 제어로 사용됩니다. FCCP의 투여 후, TMRM 강도는 크게감소되어야한다 (그림 3A).</li>
	<li>모든 BM-MNIC의 PE 강도에 따라 각 모집단의 PE의 평균 강도를 정상화하는 데이터를 분석합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Weissman, I. L., Anderson, D. J., Gage, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+and+progenitor+cells%3A+origins%2C+phenotypes%2C+lineage+commitments%2C+and+transdifferentiations%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Stem and progenitor cells: origins, phenotypes, lineage commitments, and transdifferentiations.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, 387-403 (2001).</li>
<li>Morrison, S. J., Shah, N. M., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+mechanisms+in+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulatory mechanisms in stem cell biology.</a> Cell. 88 (3), 287-298 (1997).</li>
<li>Wilson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cells+reversibly+switch+from+dormancy+to+self-renewal+during+homeostasis+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair.</a> Cell. 135 (6), 1118-1129 (2008).</li>
<li>Morrison, S. J., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bone+marrow+niche+for+haematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The bone marrow niche for haematopoietic stem cells.</a> Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).</li>
<li>Frenette, P. S., Pinho, S., Lucas, D., Scheiermann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell%3A+keystone+of+the+hematopoietic+stem+cell+niche+and+a+stepping-stone+for+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell: keystone of the hematopoietic stem cell niche and a stepping-stone for regenerative medicine.</a> Annual Review of Immunology. 31, 285-316 (2013).</li>
<li>Ito, K., Bonora, M., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+as+master+of+hematopoietic+stem+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">Metabolism as master of hematopoietic stem cell fate.</a> International Journal of Hematology. 109 (1), 18-27 (2019).</li>
<li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-renewal+of+a+purified+Tie2%2B+hematopoietic+stem+cell+population+relies+on+mitochondrial+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Self-renewal of a purified Tie2+ hematopoietic stem cell population relies on mitochondrial clearance.</a> Science. 354 (6316), 1156-1160 (2016).</li>
<li>Bonora, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+synthesis+and+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Purinergic+Signal%22%5BJournal%5D)">ATP synthesis and storage.</a> Purinergic Signal. 8 (3), 343-357 (2012).</li>
<li>Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+catalysis+in+ATP+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">The regulation of catalysis in ATP synthase.</a> Current Opinion in Structural Biology. 4 (6), 912-918 (1994).</li>
<li>Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+mitochondrial+membrane+potential+using+fluorescent+rhodamine+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives.</a> Biophysical Journal. 76, 469-477 (1999).</li>
<li>Bonora, M., Ito, K., Morganti, C., Pinton, P., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-potential+compensation+reveals+mitochondrial+volume+expansion+during+HSC+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Membrane-potential compensation reveals mitochondrial volume expansion during HSC commitment.</a> Experimental Hematology. 68, 30-37 (2018).</li>
<li>Goodell, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dye+efflux+studies+suggest+that+hematopoietic+stem+cells+expressing+low+or+undetectable+levels+of+CD34+antigen+exist+in+multiple+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dye efflux studies suggest that hematopoietic stem cells expressing low or undetectable levels of CD34 antigen exist in multiple species.</a> Nature Medicine. 3 (12), 1337-1345 (1997).</li>
<li>Spangrude, G. J., Johnson, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+and+activated+subsets+of+mouse+multipotent+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Resting and activated subsets of mouse multipotent hematopoietic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (19), 7433-7437 (1990).</li>
<li>Scharenberg, C. W., Harkey, M. A., Torok-Storb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ABCG2+transporter+is+an+efficient+Hoechst+33342+efflux+pump+and+is+preferentially+expressed+by+immature+human+hematopoietic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The ABCG2 transporter is an efficient Hoechst 33342 efflux pump and is preferentially expressed by immature human hematopoietic progenitors.</a> Blood. 99 (2), 507-512 (2002).</li>
<li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ABC+transporter+Bcrp1%2FABCG2+is+expressed+in+a+wide+variety+of+stem+cells+and+is+a+molecular+determinant+of+the+side-population+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype.</a> Nature Medicine. 7 (9), 1028-1034 (2001).</li>
<li>Simsek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distinct+metabolic+profile+of+hematopoietic+stem+cells+reflects+their+location+in+a+hypoxic+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche.</a> Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).</li>
<li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+haematopoietic+stem+cell+fate+via+modulation+of+mitochondrial+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity.</a> Nature Communications. 7, 13125(2016).</li>
<li>Xiao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cells+lacking+Ott1+display+aspects+associated+with+aging+and+are+unable+to+maintain+quiescence+during+proliferative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cells lacking Ott1 display aspects associated with aging and are unable to maintain quiescence during proliferative stress.</a> Blood. 119 (21), 4898-4907 (2012).</li>
<li>de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dye-Independent+Methods+Reveal+Elevated+Mitochondrial+Mass+in+Hematopoietic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).</li>
<li>Hall, A. M., Rhodes, G. J., Sandoval, R. M., Corridon, P. R., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+multiphoton+imaging+of+mitochondrial+structure+and+function+during+acute+kidney+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">In vivo multiphoton imaging of mitochondrial structure and function during acute kidney injury.</a> Kidney International. 83 (1), 72-83 (2013).</li>
<li>Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLAM+family+markers+resolve+functionally+distinct+subpopulations+of+hematopoietic+stem+cells+and+multipotent+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors.</a> Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).</li>
<li>Nicolli, A., Basso, E., Petronilli, V., Wenger, R. M., Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+cyclophilin+with+the+mitochondrial+inner+membrane+and+regulation+of+the+permeability+transition+pore%2C+and+cyclosporin+A-sensitive+channel%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Interactions of cyclophilin with the mitochondrial inner membrane and regulation of the permeability transition pore, and cyclosporin A-sensitive channel.</a> The Journal of Biological Chemistry. 271 (4), 2185-2192 (1996).</li>
<li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NAD-Booster+Nicotinamide+Riboside+Potently+Stimulates+Hematopoiesis+through+Increased+Mitochondrial+Clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">The NAD-Booster Nicotinamide Riboside Potently Stimulates Hematopoiesis through Increased Mitochondrial Clearance.</a> Cell Stem Cell. 24 (3), 405-418 (2019).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

미토콘드리아 막 전위 측정은 세포의 대사 상태에 중요한 미토콘드리아의 분석 그리고 평가의 초석입니다. 여기서, TMRM 염색에 의한 ΔΘm의 분석을 위한 프로토콜을 설명한다. TMRM은 ΔΘm으로 인해 활성 미토콘드리아에 축적되는 세포-천형형 염료이며, 각각의 수준은 세포외, 세포질 및 미토콘드리아구획(10)사이의 평형 상태로 유지된다. 이 프로토콜은 테트라메틸호다민, 에틸 에스테르(TMRE) 및 JC-1을 포함하는 다양한 염료에 적응될 수 있다. 정확한 결과를 얻으려면 적절한 염색 조건이 중요합니다. 여기에는 빛 노출로부터의 보호, 적절한 배양 시간, 일정한 온도 유지 (37 °C) 및 세포 외 농도가 포함됩니다. TMRM 염료 수준이 아직 완벽한 평형에 도달하지 않은 경우 유세포 분석 공정에서 데이터를 수집하는 동안 예기치 않은 염색 강도 의 변화를 감지할 수 있습니다. 따라서 TMRM의 권장 염색 기간은 30분이 아닌 1시간입니다(한 TMRM 제조업체의 프로토콜에서 언급한 대로)....

조혈 줄기 세포 (HSC)는 자가 갱신, 다중 강력하며 혈액의 모든 세포를 발생시킬 수있습니다 1,2. 세포 대사는 전사 인자, 본질적인 신호 및 미세 환경3,4,5와함께 HSC 유지 보수의 주요 조절제입니다. 따라서 미토콘드리아 기능 및 품질의 적절한 제어는HSC 유지 보수 6,7에매우 중요합니다.
미토콘드리아 멤브레인 전위(ΔΘm)는 미토콘드리아의 기능을 직접 반영하기 때문에 미토콘드리아의 평가에서 핵심 적인 매개 변수이며, 이는 전자 수송 사슬에서 양성자 펌핑 활성의 평형과 F를 통한 양성자 흐름에서 파생됩니다. 1/FO ATP 신디사이저. 이들은 모두 ATP8,9에대한 ADP의 산소 의존성 인산화에 대해 (유전자 발현 및 기질 가용성에 따라 다름)이 요구된다. 미토콘드리아 구획의 전기적 성전성을 활용하여, ΔΘm을 측정하기 위해 다양한 전위성 염료가 개발되었습니다. 그 중 하나는 테트라메틸호다민 메틸에스테르 과염소산염(TMRM)으로, 이는 조혈줄기 및 전구세포(11)를포함하는 다양한 세포에서 유세포분석에 의해 ΔΔm을 측정하는데 광범위하게 사용되고 있다.
미토콘드리아 염료는 이러한 세포의 엑세바이오틱 액피펌프의 높은 활성이 염료 압출(12)을 초래할 수 있기때문에, HSC에서 몇 가지 주의를 기울여 사용해야 한다. 실제로, 로다민 123과 같은 미토콘드리아 염료의 압출은 연구원이 HSCs13을 격리하거나 염료 Hoechst Blue 및 Hoechst Red14의 차동 압출을 이루에 의해 HSC "측군수"를 식별할 수 있게 해 주었습니다. 도 15. 또한 FUmitremorgin C, ATP 결합 카세트 하위 패밀리 G 부재 2 (ABCG2) 수송의 특정 차단제, HSPC16에서미토 트래커의 염색 패턴에 영향을미치지 않는 것으로 나타났다. 이러한 결과의 출판 후, 여러 연구는 xenobiotic 유출 펌프 억제제의 부재에 미토콘드리아 염료를 사용하여 수행되었다, HSC는 낮은 Δm 16미토콘드리아의 소수만 가지고 있다는 광범위한 인상으로 이어지는 , 17세 , 18.
그러나 최근에는, 프럭스 펌프의 광범위한 스펙트럼 억제제인 베라파밀이 미토콘드리아 염료 미토트래커 그린(MitoTracker Green)의 염색 패턴을 현저하게 수정한다는 것이 입증되었다. 이러한 불일치는 Fumitremorgin C가 Abcg2에 대해 매우 선택적이라는 사실 로 인한 것일 수 있으며, HSC는 또한 Abcb1a (Fumitremorgin C에 약하게 민감함)와 같은 다른 운송업체를 표현합니다19. 우리는 또한 다른 미토 콘 드리 아 염 염 염, TMRM 등, Nonyl 아크리딘 오렌지, 그리고 미토 트래커 오렌지 (MTO) 미토 트래커 그린과 동일한 패턴을 전시. 더 중요한 것은, 우리는 HSPC의 유동 세포 측정 패턴이 미토콘드리아 질량11이외에 그들의 ΔΘm을 반영한다는 것을 관찰했습니다.
TMRM 염료의 섭취는 엄격하게 미토콘드리아의 음전하에 따라 달라지지만, 그 결과 로 인한 염료 축적은 efflux 펌프20에의한 섭취와 클리어런스 사이의 일정한 균형입니다. HSC와 성숙한 세포 집단 사이의 xenobiotic 유출 펌프 발현의 차이는 이 균형에 영향을 미치고 편향된 결과로 이끌어 낼 수 있습니다. Verapamil과 같은 전용 억제제의 사용은 전위성 염료에 의한 ΔΘm의 분석에서 고려되어야 합니다. 여기에서 우리는 전용 억제제의 사용을 통해 xenobiotic 수송기 활동을 정정하는 TMRM 기지를 둔 유량 세포측정에 의하여 정확한 ΔΘm 측정을 위한 수정된 프로토콜을 기술합니다.

<table><tbody><tr><td>ACK 용해 완충액</td><td>Life Technologies</td><td>A1049201</td><td></td></tr><tr><td>B220-biotin</td><td>BD Bioscience</td><td>553086</td><td></td></tr><tr><td>CD3e-biotin</td><td>Life Technologies</td><td>13-0031-85</td><td></td></tr><tr><td>CD4-biotin</td><td>Fischer Scientific</td><td>BDB553782</td><td></td></tr><tr><td>CD8-biotin</td><td>Life Technologies</td><td>13-0081-85</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-biotin</td><td>BD Bioscience</td><td>553309</td><td></td></tr><tr><td>CD19-biotin</td><td>BD Bioscience</td><td>553784</td><td></td></tr><tr><td>CD34-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0341-85</td><td></td></tr><tr><td>CD48-APC</td><td>eBioscience</td><td>17-0481-82</td><td></td></tr><tr><td>CD135-biotin</td><td>eBioscience</td><td>13-1351-82</td><td></td></tr><tr><td>CD150-PerCP/Cy5.5&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>115922</td><td></td></tr><tr><td>c-kit-APC/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>105826</td><td></td></tr><tr><td>Cyclosporin H</td><td>Millipore Sigma</td><td>SML1575-1MG</td><td></td></tr><tr><td>DAPI 용액 (1 mg/mL)</td><td>Life Technologies</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청(FBS)</td><td>Denville</td><td>FB5001-H</td><td></td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Millipore Sigma</td><td>C2920-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Gr1-비오</td>틴 <td>바이오레전</td>드 <td>108404</td><td></td></tr><tr><td>IgM-비오틴</td><td>Life Technologies</td><td>13-5790-85</td><td></td></tr><tr><td>Il7R&alpha;-비오틴</td><td>eBioscience</td><td>13-1271-85</td><td></td></tr><tr><td>Nk1.1-비오</td>틴 <td>Fischer Scientific</td><td>BDB553163</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Life Technologies</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Sca-1-PE/Cy7</td><td>eBioscience</td><td>25-5981-81</td><td></td></tr><tr><td>SCF 쥐</td><td>PEPROTECH</td><td>250-03-10UG</td><td></td></tr><tr><td>StemSpan SFEM 매체</td><td>STEMCELL 기술</td><td>9605</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-Pacific Blue</td><td>eBioscience</td><td>48-4317-82</td><td></td></tr><tr><td>Ter119-biotin</td><td>Fischer Scientific</td><td>BDB553672</td><td></td></tr><tr><td>TMRM</td><td>Millipore Sigma</td><td>T5428-25MG</td><td></td></tr><tr><td>TPO</td><td>PEPROTECH</td><td>315-14-10UG</td><td></td></tr><tr><td>베라파밀 염산염</td><td>Millipore Sigma</td><td>V4629-1G</td><td></td></tr></tbody></table>

에플로프 펌프 억제를 통해 조혈 줄기 및 전조 세포에서 미토콘드리아 막 전위성 유동 세포 측정 평가의 정확도 향상

Improving the Accuracy of Flow Cytometric Assessment of Mitochondrial Membrane Potential in Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Through the Inhibition of Efflux Pumps

세포 대사가 조혈 줄기 세포 (HSC) 자기 갱신의 중요한 레귤레이터이기 때문에, 조혈 항상성에서 미토콘드리아가 하는 다양한 역할은 HSC 연구원에 의해 광범위하게 연구되었습니다. 미토콘드리아 활성 수준은 TMRM(테트라메틸라호다민, 메틸 에스테르)과 같은 세포-식양이온염료로 측정할 수 있는 막 전위(ΔΘm)에 반영됩니다. 그러나 세포에서 이러한 염료를 돌출하는 유출 펌프의 능력은 그 유용성을 제한할 수 있습니다. xenobiotic 수송기는 분화한 세포에서 보다는 HSC에 있는 발현 그리고 활동의 상부를 전시하기 때문에 결과 측정 편향은 HSC를 평가할 때 특히 중요합니다. 여기에서는 여러 골수 집단에서 ΔΘm을 정확하게 측정하기 위해 유출 펌프 억제제인 Verapamil을 활용하는 프로토콜을 설명합니다. 펌프 활동의 결과 억제는 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC)에서 TMRM 강도를 증가시키는 것으로 나타났으며 성숙한 분획에서 상대적으로 변하지 않은 채로 남습니다. 이것은 ΔΘm 의존염료가 사용될 때 요구되는 염료-유출 활동에 주의를 강조하고, 서면 및 시각화될 때, 이 프로토콜은 골수 내의 다른 인구, 또는 동일 인구를 정확하게 비교하기 위하여 이용될 수 있습니다 다양한 실험 모델에 걸쳐.

위에서 설명한 프로토콜을 사용하면 마우스 모델에서 BM-MNIC를 쉽게 격리할 수 있습니다. 그림 1은 프로토콜의 주요 단계를 요약합니다: 골수 분리, 골수에서 플러시, 적혈구 포리해, 및 항체 염색 다음에 TMRM 염색은 특정 조혈 집단에서 미토콘드리아 막 전위를 측정하기 위해 .
BM-MNIC는 HSC를 포함하여 몇몇 세포 인구를 포함합니다. 이 프로토콜에 사용되는 항체 칵테일은 HSCs (CD34- 및 CD34+), 다능성 전구 세포 (MPPs), 린- 린+ 세포의 정제에 각각 21. 이러한 분수를 격리하기 위한 게이팅 전략은 그림2에 나와 있습니다.
관심 있는 인구의 확인 후, 밝은 신호로 나타나야...

Xenobiotic efflux 펌프는 조혈 줄기와 전구 세포 (HSPC)에서 매우 활성화되어 미토콘드리아 막 잠재적 형광 염료인 TMRM의 압출을 유발합니다. 여기서, 우리는 유출 펌프 억제제인 Verapamil의 존재 에 있는 TMRM에 의하여 HSPC에 있는 미토콘드리아 막 전위를 정확하게 측정하는 프로토콜을 제시합니다.

As cellular metabolism is a key regulator of hematopoietic stem cell (HSC) self-renewal, the various roles played by the mitochondria in hematopoietic ...

미토콘드리아 기능은 조혈 줄기 세포 자체 재생에 매우 중요합니다. 미토콘드리아 활성은 내부 미토콘드리아 막 전위의 반사약으로, 이는 세포 형광, 세포-퍼큐릭 양이온염인 TMRM에 의해 측정될 수 있다. 제노바이오틱 efflux 펌프는 HSC에서 매우 활발하며 TMRM 압출을 유발합니다.이 프로토콜의 주요 장점은, 베라파밀, efflux 펌프의 억제제를 활용, 이 효과의 보정이다. 마우스 대퇴골에서 골수를 격리하여 시작합니다. 두 개의 후방 발을 잘라 집게와 날카로운 가위를 사용합니다.그런 다음 마우스의 복부 피부에 작은 스니핑을하고 스트레칭합니다. 대퇴골과 경골을 추출하고 대퇴골의 머리를 빼내지 않도록 주의하면서 뼈를 염색 버퍼 1.5 밀리리터로 채워진 6웰 플레이트에 놓습니다. 뼈에서 근육을 제거하고 뼈의 끝을 잘라 골수가 빠져 나갈 수 있도록합니다.1.5 밀리리터의 염색 버퍼로 청소된 뼈를 새 우물에 놓습니다. 그런 다음 뼈가 흰색이 될 때까지 3 밀리리터 주사기와 25 게이지 바늘로 골수를 내뿜습니다. 1.5 밀리리터 튜브에 있는 모든 세포를 수집하고, 180회 G에서 5분 동안 원심분리한 다음, 상퍼를 폐기하십시오.조심스럽게 얼음 차가운 ACK 용해 버퍼의 300 마이크로 리터에 펠릿을 다시 중단하고, 1 분 동안 얼음에 세포를 넣어. 그런 다음 염색 버퍼의 밀리리터 1밀리리터를 추가하여 즉시 리시스를 비활성화합니다. 180회 G.Resuspend에서 5분 동안 세포를 원심분리하여, 이는 염색 버퍼의 1밀리리터에서 흰색으로 나타나야 합니다.세포 스트레이너 캡을 사용하여 세포를 필터링하고 35 마이크로미터 나일론 메쉬를 사용하여 단핵 세포를 얻습니다. 계보 칵테일을 준비하는 것으로 시작하며, 원고 의 지시에 따라 형광소가 항체를 연상시니다. 항체를 얼음 위에 보관하고 빛으로부터 보호합니다.그런 다음 180회 G에서 5분간 시료를 원심분리하고 상체부를 폐기합니다. 리니지 칵테일의 400 마이크로리터와 CD135 바이오티니드 항체 의 4마이크로리터를 세포 펠릿에 추가하고 혼합물을 소용돌이시다. 그런 다음 30 분 동안 얼음에 배양하십시오.인큐베이션 후, 염색 버퍼의 3 밀리리터를 추가하고, 180회 G에서 5분간 회전하고, 상체를 폐기하여 샘플을 세척합니다. 그런 다음 항체 용액의 400 마이크로 리터를 추가하고 혼합물을 소용돌이시다. 얼음에 30분 간 배양하고 염색 버퍼로 세척을 반복합니다.TMRM 염색 용액을 준비하려면 혈청이 없는 혈청 프리 조혈 배양 배지의 1.1 밀리리터에 2.2 마이크로리터의 TMRM 스톡 솔루션과 1.1 마이크로리터를 혈전포이에틴 및 줄기 세포 인자를 첨가하십시오. TMRM 염색 용액의 1 밀리리터에서 골수를 다시 중단하고, 빠르게 소용돌이를 하고, 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 35 마이크로미터 나일론 메쉬를 사용하여 체료를 필터링하여 유동 세포계를 막히는 것을 방지합니다.그런 다음 DAPI의 마이크로 리터 를 추가하고 흐름 세포 측정을 진행합니다. 골수 샘플을 실행하고 적어도 백만 이벤트를 수집합니다. 그런 다음 살아있는 골수 단핵 세포를 태평양 파란색 플롯에 표시하여 CD135 Lin-negative 및 Lin 양성 분획을 식별합니다.APC/Cy7 대 PE/Cy7에 대한 린 음성 분획을 플롯하여 다능성 선조 또는 MPP 분획을 식별합니다. 그런 다음 APC 대 PerCP/Cy5.5에 대한 MPP 분획을 플롯하여 조혈 줄기 세포 또는 HSC 분획을 식별합니다. FITC 또는 CD34에 대한 HSC 분획을 표시하여 CD34 음수 HSC 및 CD34 양수 HSC 분획으로 나눕니다.마지막으로 각 모집단에서 TMRM 강도를 획득합니다. TMRM 염색이 올바르게 작동하는지 확인하려면 샘플에 FCCP 마이크로리터 1개를 추가하고 1 밀리머의 최종 농도를 위해 5분 동안 섭씨 37도에서 배양합니다. 그런 다음 백만 개의 이벤트를 획득합니다.FCCP가 추가된 후 TMRM 강도를 크게 늘려야 합니다. 이 프로토콜은 TMRM 염료를 사용하여 다양한 세포 집단에서 미토콘드리아 막 전위를 정량화하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 배양 배지에서 PBS와 FBS의 존재가 TMRM 신호 강도에 영향을 미친다는 것이 입증되었습니다.따라서 혈청없는 확장 매체에서 TMRM 염색을 수행하는 것이 중요합니다. 조혈 줄기 세포는 TMRM 염료를 돌출하는 xenobiotic efflux 펌프의 높은 활동 수준을 표현합니다. 따라서 TMRM 프로파일은 펌프를 차단하는 베라파밀 또는 사이클로스포린 H의 존재에도 다릅니다.TMRM 염색의 정확도를 확인하기 위해 FCCP는 미토콘드리아를 탈극화하고 TMRM 강도를 감소시킬 수 있습니다. 이 프로토콜은 TMRE 또는 JC-1을 포함하여 다른 미토콘드리아 막 잠재적 염료로 HSC를 연구하기 위해 쉽게 적응될 수 있습니다. 뿐만 아니라 미토트래커 또는 미토삭스와 같은 다른 미토콘드리아 염료.골수 인구 중 efflux 펌프의 다른 활동에 의해 상속 된 중요한 문제는 최근에 지적되었다. 따라서 이 프로토콜은 이전 결과 간의 불일치를 줄이기 위한 것입니다.

improving-accuracy-flow-cytometric-assessment-mitochondrial-membrane

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

여기, 선물이 hypoxia/reoxygenation 또는 보호 에이전트 없이 노출 되 고 후 세포의 미토 콘 드리 아 막 잠재력을 평가 하기 위해 JC 1 염료를 사용 하는 프로토콜.

Hypoxia/Reoxygenation 후 심장 Myocytes에서 미토 콘 드리 아 막 잠재력을 측정 하기 위한 교류 Cytometry 기반 분석

우리는 급성 골수성 백혈병 (AML)의 마우스 모델에서 뮤린 건강한 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC) 및 백혈병 세포에서 미토콘드리아 반응성 산소 종 (ROS)을 검출하기 위해 다매개 변수 흐름 세포측정법을 사용하는 방법을 설명합니다. MLL-AF9.

뮤린 조혈 줄기 및 선조 세포 및 MLL-AF9 구동 백혈병에서 미토콘드리아 반응성 산소 종의 유동 세포 분석

조혈 줄기 전구 세포 (HSPC) 혈액 형성 동안 그들의 신진 대사 가소성으로 인해 분화 상태로 정지 상태에서 전환. 여기에서는 HSPC의 미토콘드리아 호흡 및 당화 분석을 측정하기 위한 최적화된 방법을 제시합니다.

조혈 줄기 선조 세포 대사 분석

여기서 우리는 생체배양조 조혈줄기세포 및 T세포에서 미토콘드리아 질량 및 막 전위를 측정하는 신뢰할 수 있는 방법을 설명한다.

유세포측정에 의한 조혈줄기세포 및 T세포의 미토콘드리아 질량 및 막 전위 측정

대사 적응은 분화, 지속성 및 세포 독성을 지시하기 때문에 T 세포의 기본입니다. 여기서, 생체외 사이토카인-분화된 인간 일차 T 세포에서 미토콘드리아 호흡을 모니터링하기 위한 최적화된 프로토콜이 제시된다.

사이토카인 분화된 인간 일차 T 세포에서 미토콘드리아 호흡의 실시간 모니터링

여기에 제시된 방법은 HSPC의 세포외 산성화 속도 (ECAR) 및 산소 소비 속도 (OCR)를 실시간으로 측정하기 위해 세포외 플럭스 분석기를 사용하여 비 부착성 마우스 조혈 줄기 및 원시 전구 세포 (HSPCs)에서 세포 생물 에너지를 평가하기위한 최적화 된 프로토콜을 요약합니다.

세포외 플럭스 분석기를 사용한 마우스 조혈 줄기 및 원시 전구 세포의 세포 생체 에너지 평가

이 연구는 미토콘드리아 부피, 미토콘드리아 막 전위, 활성 산소 종 수준, 미토콘드리아 호흡 사슬 조성 및 미토콘드리아 DNA의 변화를 감지하기 위해 두 개의 형광 리포터 또는 항체를 사용한 유세포 분석 및 이중 염색을 기반으로 여러 미토콘드리아 기능 매개 변수를 측정하는 새로운 접근 방식을보고합니다.

인간 유도 만능 줄기 세포와 그 신경 및 신경교 유도체에서 여러 미토콘드리아 파라미터의 유세포 분석

여기에서 우리는 쥐 골수 세포를 표현형 조혈 줄기 및 전구 세포와 함께 지지하는 틈새 내피 및 중간엽 줄기 세포로 분리 및 염색하기 위한 간단한 프로토콜을 설명합니다. 내골 및 중앙 골수 영역에 위치한 세포를 풍부하게 하는 방법도 포함됩니다.

쥐 골수, 조혈 줄기 및 전구 세포, 기질 틈새 세포의 유세포 분석

이 기술은 형광 기반 라이브 이미징을 사용하여 HeLa 세포 내의 미토콘드리아 막 전위와 과산화물 수준을 시각화하고 정량적으로 측정하는 효과적인 워크플로우를 설명합니다.

HeLa 세포에서 라이브 이미징을 사용한 미토콘드리아 막 전위 및 슈퍼옥사이드 수준의 형광 기반 정량화

면역 세포에서 생리학적으로 관련된 기질 농도 하에서 미토콘드리아 생체 에너지학을 연구하는 방법은 제한적입니다. 당사는 고분해능 폐활량 측정법을 사용하여 인간 T 세포, 단핵구 및 말초 단핵 세포의 에너지 수요에 대한 미토콘드리아 막 전위의 반응 변화를 평가하는 상세한 프로토콜을 제공합니다.

인간 면역 세포에서 미토콘드리아 막 전위의 동적 변화를 평가하기 위한 고분해능 폐활량 측정법

배우세요 조혈 줄기 및 전조 세포에서 베라파밀을 이용한 에플로프 펌프 억제로 TMRM 형광 염료를 활용한 미토콘드리아 막 전위성 유동 세포 측정의 정확도를 향상시키는 방법을.

에플로프 펌프 억제를 통해 조혈 줄기 및 전조 세포에서 미토콘드리아 막 전위성 유동 세포 측정 평가의 정확도 향상

더 많은 동영상 탐색