마우스에서 간세포 핵 Ploidy의 추정을 위한 situ 방법에서 높은 처리량
2020년 4월 19일
우리는 유세포 측정을 필요로하지 않는 고정 / 저온 보존 조직 샘플 내에서 간세포 수와 핵 ploidy의 변화를 측정하기위한 강력하고 비용 효율적이며 유연한 방법을 제시합니다. 우리의 접근 방식은 간 손상과 질병의 진행을 추적하는 데 이상적인 간 세포학의 강력한 샘플 전체 서명을 제공합니다.
이 방법을 통해 사용자는 간 발달, 재생 및 만성 질환에 대한 연구를 위해 2D 조직 섹션에서 간세포 핵 DNA 함량의 프로파일을 생성할 수 있습니다. 이 자동화 된 높은 처리량 접근법은 모든 2D 간 조직 섹션에 적용 될 수 있으며, 모든 간단한 원형 간세포 핵에 대한 핵 계략의 내부적으로 보정 된 판독을 제공합니다. 간세포 핵 계포의 변화는 노화, 만성 간 질환 및 암과 관련이 있습니다.
이 기술은 고정 또는 냉동 보존 간 표본에서 핵 계략을 프로파일하는 간단한 수단을 제공합니다. situ ploidy 프로파일링 방법은 조직 분리 또는 신선한 물질에 대한 액세스를 필요로하지 않기 때문에 간 질환 진행을 추적하기위한 연구 및 임상 도구로 상당한 잠재력을 가지고 있습니다. 뮤린 간 조직 샘플을 수확 한 후, 최적의 절단 온도 매체에 간 소구를 포함 하 고 즉시 빠른 동결을 보장 하기 위해 건조 얼음에 금형을 배치.
냉동 간 소굴 샘플의 조각을 얻으려면 샘플을 6 마이크로미터 두께로 섹션화하여 각 샘플에 5초 동안 폴리아미드 코팅 슬라이드를 배치하여 각 샘플이 슬라이드에 달라붙도록 합니다. 모든 슬라이스를 채취하면 면역 라벨링 전에 실온에서 3~5분 동안 샘플을 평형화할 수 있습니다. 평형의 끝에서, 실온에서 10 분 동안 PBS에서 4 %의 파라 포름 알데히드의 1 밀리리터와 연기 후드에 조직 섹션을 수정합니다.
고정이 끝나면 부드러운 동요로 PBS에서 3분 동안 세 번 의 세차처리로 슬라이드를 헹구십시오. 마지막 세척 후 각 조직 섹션 주변을 건조시키고 소수성 펜을 사용하여 각 샘플 주위에 원을 그립니다. 시료를 투과화하려면 PBS에서 0.5% 비이온 계면활성제로 실온에서 15분 동안 섹션을 처리합니다.
인큐베이션이 끝나면 PBS에서 3분 동안 시료를 부드러운 교반으로 2회 세척한 후 1%소 세럼 알부민, 5%말 세럼, 0.2%의 비이온 계면활성제를 실내 온도에서 최소 1시간 동안 여과된 용액으로 차단합니다. 다음으로, 빛으로부터 보호되는 습한 염색실에서 밤새 섭씨 4도에서 버퍼를 차단하는 데 희석된 HHF4-알파 항체로 슬라이드를 배양한다. 다음날 아침, 적절한 형광컨이차항체와 Hoechst가 1%의 소세럼 알부머와 0.2%의 비이온 계면활성제로 희석되어 적절한 형광을 결합하여 PBS에서 부드러운 교반으로 PBS에서 4회 세척하여 빛으로부터 보호되는 습한 얼룩챔버의 실온에서 2시간 동안 PBS에서 희석된다.
인큐베이션이 끝나면 슬라이드를 시연한 대로 4번 세척한 다음, 부드러운 교반으로 이중 증류수로 23분간 세척합니다. 마지막 세척 후, 커버슬립에 형광 장착 배지 2방울로 샘플을 장착하고 거품을 제거하기 위해 필요에 따라 부드러운 압력을 가합니다. 그런 다음, 좋은 고정 및 면역 라벨링을 보장하기 위해 기존의 형광 현미경을 사용하여 슬라이드를 확인합니다.
형광 이미지 수집의 경우, 사용되는 형광에 대한 적절한 흥분을 사용하여 형광 이미지를 획득하기 위해 고함량 이미징 플랫폼에 매개 변수를 설정합니다. 그런 다음 샘플을 스캔하여 충분한 이미지를 획득하여 조직 섹션의 완전한 커버리지를 얻습니다. 스캔의 끝에서, 핵이 최적으로 분리되도록 소프트웨어의 핵 분할 매개변수를 조정하고 HNF4 알파 양성 간세포 및 HNF4-알파 음의 비 parenchymal 세포의 최적의 게이팅을 보장하기 위해 임계 값 강도를 수정한다.
핵 정량화를 위해, 원자력 영역을 호흐트스트 염색, 주요 핵 호흐트 스트론, 핵 신장 계수, 평균 핵 원반 지수, HNF4 알파 상태 및 핵 X, Y 좌표를 기반으로 한 정사각형 마이크로미터로 설정합니다. 간세포 핵 계수 분석을 수행하기 위해 먼저 플로이디 정량화 분석 프로그램을 다운로드하고 설치합니다. MATLAB에서 도구 스트립의 앱 탭으로 이동하여 앱 설치를 클릭합니다.
Ploidy 응용 프로그램 ML 응용 프로그램 설치 프로그램을 엽니 다. 성공적인 설치를 확인하는 메시지가 나타납니다. 각 데이터 분석 파일에는 표시된 대로 열에 설정된 ploidy 분석에 필요한 모든 데이터를 포함하는 셀 측정이라는 시트가 포함됩니다.
각 실험 조건에 대해, 2~4개의 N 핵 교정에 대한 내부 제어를 계산하는 데 사용되는 제어 데이터 집합을 제공합니다. 생물학적 복제의 경우 각 스프레드시트를 자체 폴더에 저장하여 폴더 접두사 이름을 점진적으로 지정합니다. 다음으로, Ploidy 응용 프로그램을 시작합니다.
Ploidy 응용 프로그램 그래픽 사용자 인터페이스가 나타납니다. 제어 데이터가 복제되는 폴더로 이동하려면 데이터 제어 경로 단추를 클릭합니다. 그런 다음 이 데이터 경로가 인터페이스에 나타납니다.
폴더 접두사에서 출력 파일에 부여할 이름을 입력합니다. 다른 데이터로 가는 경로 단추를 클릭하고 비교 데이터가 복제되는 폴더로 이동합니다. 그런 다음 이 데이터 경로가 인터페이스에 나타납니다.
그런 다음 실행을 클릭합니다. 분석이 완료되면 상태 표시줄에서 분석 완료를 읽습니다. 면역 라벨링 후, 종래의 형광 현미경 검사법에 의한 모든 슬라이드를 검사하여 양질의 고정 및 염색이 수득되었는지 확인하는 것이 중요하다.
Hoechst 염료의 번짐 또는 흐림은 고정 전에 부적절한 고정 또는 시료 분해를 나타낼 수 있습니다. 핵 분리 및 HNF4-알파 임계값 파라미터는 형광 현미경 검사법에 의해 관찰된 면역염색의 시각적 패턴을 광범위하게 반영하기 위해 자동 이미지 분석 전에 신중하게 최적화되어야 한다. 이미지 분석에 따라, 데이터는 DDC 상해를 가진 간 내의 HNF4 알파 양성 핵 수의 비 parenchymal 세포 및 작지만 중요한, 감소의 증가를 반영해야 합니다.
건강한 대조군 간에서는 HNF4-알파 양성 핵의 약 63%가 간단한 원형 morphometry를 나타낸다. 대조군과 DDC 처리군 간의 상대적인 핵계포이를 비교하면 8C 세포보다 많은 수와 함께 부상을 입은 2C 및 4C 간세포 핵의 현저한 손실을 반영해야 한다. 각 계피 하위 그룹에 대한 상대적 위치 정보는 고함량 이미지 분석 소프트웨어 내에서 특정 간세포 하위 집합의 2D 위치를 검색하여 심문될 수 있다.
Ki-67과 같은 추가 항체를 가진 면역 라벨링은 세포 복제및 간세포 핵 morphometry 데이터를 평가하기 위해 수행될 수 있으며, 이는 ploidy 분석을 칭찬하기 위해 더 심문될 수 있다. 이 방법에 의해 생성된 조직 전체 계피 프로파일은 모든 원형 간세포 핵에 대한 최소 DNA 함량을 설명하지만 단핵 세포와 이중 핵 간세포 를 구별하지는 않습니다. 이 방법은 잠재적으로 세포 둘레와 같은 매개 변수를 고려하여, 이중 핵 세포의 식별을 용이하게 하고 세포 계략의 추가 판독을 제공하기 위하여 적응될 수 있습니다.
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개요
이 기사는 고정되거나 극저온 보존된 간 조직 샘플에서 간세포 수와 핵의 배수체 수 변화를 측정하는 강력하고 유연한 방법을 제시합니다. 이 접근 방식은 간 세포학의 강력한 특징을 제공하며, 이는 간 손상 및 질병 진행을 추적하는 데 필수적입니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 생물학
- 간 병리학
배경
- 간세포 핵의 배수체 수는 간 발달 및 질병을 이해하는 데 중요합니다.
- 핵의 배수체 수 변화는 노화, 만성 간 질환 및 암과 연관되어 있습니다.
- 전통적인 방법은 종종 흐름 세포 분석과 신선한 조직 샘플을 필요로 합니다.
- 이 방법은 조직 해체 없이 프로파일링을 가능하게 합니다.
연구 목적
- 2D 조직 단면에서 간세포 핵 DNA 함량을 프로파일링하는 방법을 개발합니다.
- 다양한 간 조직 샘플에 적용할 수 있는 고처리량 접근 방식을 제공합니다.
- 연구 및 임상 환경에서 간 질환 진행 추적을 용이하게 합니다.
사용된 방법
- 2D 간 조직 단면의 자동화된 고처리량 분석.
- 원형 간세포 핵에 대한 핵의 배수체 수의 내부 보정 판독.
- 최적 절단 온도 매체를 사용한 간 샘플의 빠른 동결.
- 신선한 물질 없이 현장에서의 배수체 수 프로파일링.
주요 결과
- 이 방법은 간세포 핵의 배수체 수의 신뢰할 수 있는 프로파일을 제공합니다.
- 고정되거나 극저온 보존된 간 시편에 적용할 수 있습니다.
- 간 질환 진행 추적의 가능성을 입증합니다.
- 다양한 조건과 관련된 핵의 배수체 수 변화를 평가할 수 있는 간단한 수단을 제공합니다.
결론
- 이 방법은 간 병리학을 연구하는 연구자들에게 귀중한 도구입니다.
- 시간 경과에 따른 간 손상 및 질병 모니터링 능력을 향상시킵니다.
- 미래 응용은 임상 진단 및 치료 모니터링으로 확장될 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
This method enables high-throughput, spatially resolved quantification of hepatocyte nuclear ploidy from fixed or cryopreserved liver tissue, supporting target validation in liver disease models. By preserving tissue architecture and avoiding disaggregation bias, it provides internally calibrated, reproducible readouts of polyploidization events linked to disease progression. The approach enhances predictive confidence in preclinical studies by linking nuclear DNA content changes to pathophysiological states without requiring fresh tissue or flow cytometry.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by correlating hepatocyte nuclear ploidy shifts with liver injury, regeneration, and disease models.
- Operational Value: Supports biological de-risking through internal calibration using control datasets, reducing variability in ploidy measurements across experiments.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by identifying dose- or genotype-dependent increases in >8C hepatocyte nuclei as a biomarker of pathological polyploidization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, imaging-based readouts of nuclear area, Hoechst intensity, elongation, roundness, and HNF4-alpha status for high-content screening applications.
- Operational Value: Enables assay standardization via optimized nuclear segmentation and threshold gating parameters, improving reproducibility across users and sites.
- Scalability: Compatible with standard high-content imaging platforms, allowing scalable analysis of numerous tissue sections without specialized equipment.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Preserves spatial information, enabling retrieval of 2D locations of specific ploidy subsets (e.g., 2C, 4C, >8C) within liver lobules for regional disease correlation.
- Preclinical Model Relevance: Detects significant loss of 2C/4C nuclei and increase in >8C cells following DDC injury, mirroring clinical observations in chronic liver disease and cancer.
- Risk-Adjusted Advancement: Provides a mechanistic readout to support go/no-go decisions by quantifying polyploidization as a feature of maladaptive repair or neoplastic transformation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through preclinical profiling, offering a reusable platform for assessing liver cytology in disease models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking changes in hepatocyte nuclear DNA content to pathway modulation in injury and cancer models.
- Screening: Delivers assay-ready, standardized outputs through automated image acquisition and segmentation, enabling reliable compound or genetic perturbation evaluation.
- Analytics: Generates ploidy profiles based on Hoechst staining and HNF4-alpha status, providing quantitative comparisons between control and treated conditions.
- Translational Research: Maintains histological context, allowing correlation of ploidy shifts with fibrosis, inflammation, or tumorigenic regions in liver sections.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, transferable capability for ploidy profiling across multiple liver disease models and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in hepatocyte ploidy changes during disease progression.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized fixation, staining, and imaging protocols compatible with frozen tissue archives.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing early, spatially resolved biomarkers of liver pathology, reducing late-stage attrition.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on their ability to modulate pathological polyploidization in preclinical models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunohistochemistry, fluorescence microscopy, and high-content image analysis software.
- Dependent on access to cryostat, fluorescence microscope or high-content imaging system, and MATLAB-based ploidy quantification tool.
- Necessitates cross-team standardization of nuclear segmentation and HNF4-alpha threshold settings to ensure consistent gating across datasets.
- Adaptation considerations include adjusting parameters for non-circular nuclei or binuclear hepatocytes to improve specificity in certain models.
- Practical limitations include inability to distinguish mononuclear from binuclear hepatocytes and reliance on optimal circular morphometry for accurate ploidy estimation.
