Name: 마우스에서 간세포 핵 Ploidy의 추정을 위한 situ 방법에서 높은 처리량 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: 배우세요 마우스 간 조직에서 고처리량 핵 ploidy 분석 방법을. 고정 또는 냉동 보존 표본에서 간세포 DNA 함량을 측정하여 간 질환 진행을 추적하는 데 활용할 수 있습니다.

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</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

뮤린 간에서 조직 리모델링 및 간세포 핵 계략의 분석에 대한 높은 함량, 높은 처리량 접근법이 설명된다. 이 절차에 익숙해지면 사용자는 3-5일 동안 여러 샘플을 처리, 이미지 및 분석하여 간 건강의 상세한 서명을 제공하는 대규모 테스트 가능한 데이터 세트를 생성할 수 있습니다. 샘플 전처리 방법의 단순성, 분석된 많은 수의 세포 및 조직 영역(평균 14mm 2/샘플)을 감안할 때, 결과는 견고하고 매우 재현성이 있습니다.2 또한 이미지 캡처 및 분석을 자동화하여 이러한 중요한 단계에서 사용자 오류와 잠재적 편향을 제거합니다. 중요한 혁신은 NPC를 시료 내 및 시료 간 간 핵 DNA 함량의 상대적 평가를 가능하게 하는 내부 계략 교정기로 사용하는 것입니다. 따라서 HNF4α 라벨링 단계의 통합은 이전에 게시된 2D 방법3,,12,,22에비해 ...

포유류 간에서 간세포는 이핵세포를 생성하기 위하여 실속된 사이토카인시스를 겪을 수 있고, DNA endoreplicai는 최대 16N DNA 내용을 포함하는 polyploid 핵을 생성하기 위하여. 전반적인 세포 및 핵 ploidy 증가 출생 후 개발 하는 동안, 노화 및 다양 한 세포 스트레스에 대 한 응답1. polyploidization의 과정은 그것의 정확한 생물학 기능이 불분명하게 남아 있더라도, 동적이고 뒤집을 수 있는2입니다3. 증가된 ploidy는 감소된 증식 용량 과 연관됩니다4,유전 적 다양성2,만성 상해에 적응5 및 암 보호6. 간세포 계략 변경은 변경 된 circadian 리듬7의결과로 발생 , 및 weaning8. 가장 주목할 만한, 간계 프로필은 상해 및 질병9에의해 변경되고, 설득력 있는 증거는 증가된 ≥8N 핵 또는 2N 간세포의 손실과 같은 특정 ploidy 변경이, 비 알콜 성 지방 간 질환 (NAFLD) 진행을 추적하기 위한 유용한 서명을 제공한다는 것을 건의합니다3,,10,또는 바이러스 감염의 차동 충격11.
일반적으로 간 손상 및 재생은 간세포 세포 크기 증가 및 핵영역(12)과연관되며, 간세포의 전체 수 감소와 함께, 특히 2N DNA함량이 10,,11인자. 간에서 의 자렌성 손상은 또한 자주 비 parenchymal 세포의 확장을 동반 (NPC), 기질 근섬유 아세포를 포함, 염증 성 세포와 이중 성 간 전구 세포. 또한 NPC의 변화를 고려하면서, 실치 세포 수와 핵 ploidy의 정량적 세포학적 프로파일을 제공하는 높은 처리량 방법은, 따라서 부상과 질병 동안 간 반응을 추적하는 연구 및 임상 도구로 상당한 잠재력을 가지고있다. 간세포암의 인간 샘플에서 계략 스펙트럼의 최근 의 결정적 스펙트럼분석은 또한 핵 계략이 종양 내에서 극적으로 증가하고 TP5313의감소된 분화 및 손실을 가진 더 공격적인 종양 특수형에서 구체적으로 증폭된다는 것을 보여준다. 따라서, 핵 ploidy의 정량적인 평가에 있는 방법론적 진보가 간암의 미래 예후 프로파일링에서 도움이 될 것이라는 강한 가능성이 있습니다.
이 프로토콜에서는, 마우스 간 조직 단면의 비교 분석을 위한 유연한 고처리량 방법론이 설명되며, 이는 간세포 수의 상세한 세포측정 프로파일링, NPC 반응 및 핵 경화추정을 위한 내부적으로 교정된 방법을제공한다(도 1). 간세포는 핵 크기 및 핵 모모시스템의 특성화 이전에 간세포 핵 인자 4 알파(HNF4α) 면역 라벨링에 의해 NPC와 구별된다. "최소 DNA 함량"은 평균 Hoechst 33342 강도(DNA 밀도에 대한 프록시)를 보간된 3차원(3D) 핵 부피를 통합하여 모든 원형 핵 마스크에 대해 추정됩니다. 간세포 최소한의 DNA 함량은 핵 ploidy 단면도를 생성하기 위하여 NPC를 사용하여 그 때 보정됩니다.
이미지 수집, 핵 세분화 및 이미지 분석은 고함량 이미징을 사용하여 수행되므로 수만 개의 세포를 포함하는 2차원(2D) 간 절개의 넓은 영역을 선별할 수 있습니다. 모든 원형 간세포 핵에 대한 샘플 전체 의 ploidy 프로파일을 생성하기 위해 고함량 이미지 분석 데이터의 자동 사후 처리를 위해 사용자 정의 작성 프로그램이 제공됩니다. 이것은 입체 이미지 분석 (SIA)10,,11,,14,,15에기초하여 핵 ploidy를 계산하는 소프트웨어를 다운로드 무료로 사용하여 수행됩니다. SIA 방법론은 이전에 원형 핵 형태와 핵 크기와 DNA 함량 사이의 단조로운 관계를 가정하여 간(14)에서간세포 핵 ploidy를 추정하기위한 정확하고 힘들기는하지만, 방법, 정확하고 힘들기는하지만 유세포 측정에 의해 검증되었습니다. 이 프로토콜에서, 두 핵 매개 변수는 핵 morphometry 및 Hoechst 의 평가에 의해 측정 된다 33342 라벨링. 각 핵 마스크에 대한 "최소 DNA 함량"의 계산은 알려진 2-4N DNA 함량을 가지고 따라서 유용한 내부 제어 역할을 NPC를 사용하여 간세포 핵 ploidy의 교정에 의해 선행된다.
종래의 유세포분석방법(16)에 비해 설명된 접근법은 간세포 핵 계략을 현장에서 평가할 수 있게 하고 결과를 편향시키고 표준화하기 어려운 신선한 조직 또는 분해 방법에 대한 접근을 필요로 하지 않는다. 모든 SIA 기반 접근법과 마찬가지로, 핵 계략 하위 클래스 >2N은 적도 평면 외부의 더 큰 핵의 단면화로 인해 2D 샘플링에 의해 과소 대표됩니다. 조직 전체 ploidy 단면도는 또한 모든 원형 간세포 핵 마스크에 대한 최소 DNA 함량을 설명하고, 동일한 ploidy의 두 개의 이산 ("비 접촉") 핵이 있는 단핵 간세포와 이핵세포 를 직접 구별하지 않습니다. 그러나, 이 프로토콜의 단순성은 핵간 간격 또는 세포 경계 분석과 같은 추가 파라미터를 고려하여 적응될 수 있게 하며, 이는 세포 계략에 대한 보다 상세한 평가를 제공하는 이핵전지의 식별을 용이하게 할 것이다.

<table><tbody><tr><td>3,5-디에톡시카르복신-1,4-디하이드로콜리딘 다이어트(DDC)</td><td>테스트다이어트</td><td>1810704</td><td>수정된 LabDiet 마우스 다이어트 5015(0.1% DDC</td></tr><tr><td>포함) Alexa Fluor 488 당나귀 안티 염소 IgG(H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A11055</td><td>희석 1:500</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>시그마-알드리치</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>저온 유지 장치 라이카 CM1850 UV</td><td>라이카 바이오시스템</td><td>CM1850 UV</td><td>조직 절편</td></tr><tr><td>형광 장착 매체</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad 소프트웨어</td><td>Prism 8</td><td>데이터 그래프 작성을 위한 통계 소프트웨어</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td>최종 농도 5 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>IN 세포 분석기 1000</td><td>GE Healthcare Bio-Sciences Corp</td><td></td><td>High-Content Cellular Imaging and Analysis System</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>R2019a</td><td>핵 ploidy 자동 분석을 위한 데이터 분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>현미경 커버 슬라이드</td><td>VWR International</td><td>630-2864</td><td>24 x 60 mm 크기</td></tr><tr><td>Microsoft Office Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td>Speadsheet 소프트웨어</td></tr><tr><td>OCT Tissue Tek</td><td>Pascual y Furi&oacute;</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>Panreac AppliChem</td><td>141451.121</td><td></td></tr><tr><td>면역 염색용 펜</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z377821-1EA</td><td>5mm 팁 너비</td></tr><tr><td>폴리 사인 현미경 슬라이드</td><td>VWR International</td><td>631-0107</td><td></td></tr><tr><td>토끼 다클론 항-HNF4&알파;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PA5-79380</td><td>희석 1:250 (대체)</td></tr><tr><td>라빗 폴리클로날 Anti-HNF4&alpha;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-6556</td><td>희석 1:200 (연구에 사용된 항체)</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5927</td><td></td></tr></tbody></table>

마우스에서 간세포 핵 ploidy의 추정을 위한 situ 방법에서 높은 처리량

A High-Throughput In Situ Method for Estimation of Hepatocyte Nuclear Ploidy in Mice

간이 손상되면 간세포 수가 감소하고 세포 크기, 핵 크기 및 ploidy가 증가합니다. 담관iocytes, myofibroblasts, 전구체 및 선동적인 세포와 같은 비 parenchymal 세포의 확장은 또한 만성 간 손상, 조직 개조 및 질병 진행을 표시합니다. 이 프로토콜에서는 부상, 만성 질환 및 암과 관련된 간 세포 구성의 변화를 계산하기 위한 간단한 높은 처리량 접근법을 설명합니다. 우리는 2 차원 (2D) 조직 섹션에서 추출 한 정보가 샘플 내에서 간세포 핵 ploidy를 정량화하고 교정하는 데 사용할 수있는 방법을 보여주고 사용자가 내부에서 간 내에서 특정 ploidy 하위 세트를 찾을 수 있습니다. 우리의 방법은 고정 / 냉동 간 재료, 기본 면역 세포 화학 시약 및 표준 고함량 이미징 플랫폼에 대한 액세스를 필요로한다. 그것은 표준 유동 세포 분석 기술에 대한 강력한 대안으로, 갓 수집 된 조직의 중단, 공간 정보 손실 및 잠재적 인 분리 편향을 필요로합니다.

이 방법은 0.1% 3,5-디에톡시카보닐-1,4-디하이드로콜린(DDC)17을함유하는 간독성 식이요법으로 0-21일 동안 동물에게 먹이를 주어 성인 마우스 간에서 담낭성 손상의 영향을 측정하는데 사용되어 왔다. 만성 DDC 공급 결과 간 세포 손상 증가 ploidy 및 NPC의 periportal 확장. 사용자는 마우스 균주와 연령에 따른 차이가 핵 계략에 존재할 수 있으며 모든 분석은 12-16주 령성인 여성 C57BL/6 마우스를 사용하여 수행되었다는 것을 알고 있어야 합니다.
HNF4α 면역 라벨링 후(프로토콜 섹션 3), 기존의 형광 현미경검사법을 사용하여 모든 슬라이드를 검사하여 양호한 품질 고정 및 염색을 보장하는 것이중요하다(도 2A).</st...

우리는 유세포 측정을 필요로하지 않는 고정 / 저온 보존 조직 샘플 내에서 간세포 수와 핵 ploidy의 변화를 측정하기위한 강력하고 비용 효율적이며 유연한 방법을 제시합니다. 우리의 접근 방식은 간 손상과 질병의 진행을 추적하는 데 이상적인 간 세포학의 강력한 샘플 전체 서명을 제공합니다.

마우스에서 간세포 핵 Ploidy의 추정을 위한 situ 방법에서 높은 처리량

When the liver is injured, hepatocyte numbers decrease, while cell size, nuclear size and ploidy increase. The expansion of non-parenchymal cells such as ...

이 방법을 통해 사용자는 간 발달, 재생 및 만성 질환에 대한 연구를 위해 2D 조직 섹션에서 간세포 핵 DNA 함량의 프로파일을 생성할 수 있습니다. 이 자동화 된 높은 처리량 접근법은 모든 2D 간 조직 섹션에 적용 될 수 있으며, 모든 간단한 원형 간세포 핵에 대한 핵 계략의 내부적으로 보정 된 판독을 제공합니다. 간세포 핵 계포의 변화는 노화, 만성 간 질환 및 암과 관련이 있습니다.이 기술은 고정 또는 냉동 보존 간 표본에서 핵 계략을 프로파일하는 간단한 수단을 제공합니다. situ ploidy 프로파일링 방법은 조직 분리 또는 신선한 물질에 대한 액세스를 필요로하지 않기 때문에 간 질환 진행을 추적하기위한 연구 및 임상 도구로 상당한 잠재력을 가지고 있습니다. 뮤린 간 조직 샘플을 수확 한 후, 최적의 절단 온도 매체에 간 소구를 포함 하 고 즉시 빠른 동결을 보장 하기 위해 건조 얼음에 금형을 배치.냉동 간 소굴 샘플의 조각을 얻으려면 샘플을 6 마이크로미터 두께로 섹션화하여 각 샘플에 5초 동안 폴리아미드 코팅 슬라이드를 배치하여 각 샘플이 슬라이드에 달라붙도록 합니다. 모든 슬라이스를 채취하면 면역 라벨링 전에 실온에서 3~5분 동안 샘플을 평형화할 수 있습니다. 평형의 끝에서, 실온에서 10 분 동안 PBS에서 4 %의 파라 포름 알데히드의 1 밀리리터와 연기 후드에 조직 섹션을 수정합니다.고정이 끝나면 부드러운 동요로 PBS에서 3분 동안 세 번 의 세차처리로 슬라이드를 헹구십시오. 마지막 세척 후 각 조직 섹션 주변을 건조시키고 소수성 펜을 사용하여 각 샘플 주위에 원을 그립니다. 시료를 투과화하려면 PBS에서 0.5% 비이온 계면활성제로 실온에서 15분 동안 섹션을 처리합니다.인큐베이션이 끝나면 PBS에서 3분 동안 시료를 부드러운 교반으로 2회 세척한 후 1%소 세럼 알부민, 5%말 세럼, 0.2%의 비이온 계면활성제를 실내 온도에서 최소 1시간 동안 여과된 용액으로 차단합니다. 다음으로, 빛으로부터 보호되는 습한 염색실에서 밤새 섭씨 4도에서 버퍼를 차단하는 데 희석된 HHF4-알파 항체로 슬라이드를 배양한다. 다음날 아침, 적절한 형광컨이차항체와 Hoechst가 1%의 소세럼 알부머와 0.2%의 비이온 계면활성제로 희석되어 적절한 형광을 결합하여 PBS에서 부드러운 교반으로 PBS에서 4회 세척하여 빛으로부터 보호되는 습한 얼룩챔버의 실온에서 2시간 동안 PBS에서 희석된다.인큐베이

a-high-throughput-situ-method-for-estimation-hepatocyte-nuclear

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Oocytes는 meiotic 성숙하는 동안 염색체 분리의 오류로 인해 aneuploidy하는 경향이 있습니다. Aneuploid 계란은 다운 증후군과 같은 불임, 유산 또는 발달 장애를 일으킬 수 있습니다. 여기서 우리는 oocytes과 meiotic 성숙을 연구하고 ploidy 평가 방법에 선택의 자료를 소개하는 방법을 설명합니다.

마우스 Oocyte의 Microinjection, 성숙과 Ploidy 평가

여기, 우리는 효율 높은 처리량을...

높은 처리량 현장에서</em태아 마우스 로우어 Urogenital 트랙트의 mRNA의 표현 패턴을 특성화> 하이브리드화 방법

심장 핵​​은 밀도 침강 통해 격리 및 유동세포계측법 의해 cardiomyocyte 핵 파악하고 정렬하는 pericentriolar 소재 1 (PCM-1)에 대한 항체로 immunolabeled있다.

사후 조직에서 Cardiomyocyte 핵의 분리

심근세포 회전율의 정량화는 어렵습니다. 여기에 설명된 프로토콜은 신심근세포 핵 생성 및 핵 ploidy의 정확하고 민감한 정량화를 가능하게 함으로써 이러한 과제에 중요한 기여를 합니다.

심근 DNA 합성 및 배수성의 동시 평가 : Method는 심근 재생 및 회전율의 정량을 지원합니다

여기, 우리 현재 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 hepatocytes를 사용 하 여 가족성 콜레스테롤 혈 증의 인간 간 공상 마우스 모델을 생성 하는 프로토콜. 콜레스테롤 혈 증에 대 한 새로운 치료법을 테스트 하기 위한 유용한 모델입니다.

가족성 콜레스테롤 혈 증 인간의 간 공상 마우스 모델을 사용 하 여 유도 만능 줄기 세포 유래 Hepatocytes

리보솜 친화도 정제(TRAP)를 번역하면 세포 유형별 번역 mRNA를 신속하고 효율적으로 분리할 수 있습니다. 여기서, 우리는 간 재모독 및 TRAP의 마우스 모델에서 유체역학적 꼬리 정맥 주입을 결합하여 간세포를 재채우는 발현 프로필을 검사하는 방법을 입증한다.

마우스 간에서 세포 유형 별 유전자 발현 프로파일링

이 프로토콜은 간으로부터 원발성 마우스 간세포를 단리하고 리보뉴클레오단백질 및 mRNA로서 CRISPR-Cas9를 전기천공하여 간장의 유전된 대사성 질환과 관련된 치료적 표적 유전자를 교란시키는 기술을 기술한다. 기술된 방법은 전기천공 후 높은 생존력과 높은 수준의 유전자 변형을 초래한다.

갓 분리된 일차 마우스 간세포로의 Cas9 리보뉴클레오단백질 및 mRNA의 전기천공-매개 전달

여기에서 우리는 간동맥 결찰을 포함하거나 포함하지 않는 동소 간세포 암종 이종이식편을 만들고 [18 F]플루오로미소니다졸([18 F]FMISO) 및 [18F]플루오로데옥시글루코스([18F]FDG).

간세포 암종의 동소 마우스 모델에서 비침습적 PET/MR 이미징

여기에서는 단일 핵 RNA-seq, ATAC-seq 및 관절 다중오믹스(RNA-seq 및 ATAC-seq)에 대해 급속 냉동되고 보관된 간 조직에서 핵을 분리하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

단일 세포 다중오믹스를 위한 급속 동결 간 조직으로부터 핵 분리

여기에서 우리는 세포핵 준비를 설명하는 프로토콜을 제시합니다. 심장 조직을 단일 세포로 미세 해부 및 효소 해리한 후, 전구 세포를 동결한 다음, 순수 생존 세포를 분리하여 단일 핵 RNA 시퀀싱 및 고처리량 시퀀싱 분석을 통한 전이효소 접근 가능한 염색질에 대한 단일 핵 분석에 사용했습니다.

단일 세포 분해능에서 후성유전체 및 유전자 발현 프로파일링을 위한 마우스 심장 전구 세포에서 핵 분리

이 연구는 다운스트림 단일 핵 RNA 염기서열 분석을 위해 냉동 포유류 조직에서 고품질 핵을 분리하는 간단하고 빠르며 부분적으로 자동화된 프로토콜을 설명합니다.

단일 핵 염기서열분석을 위해 냉동 포유류 조직에서 단일 핵을 분리하기 위한 간단하고 빠르며 부분적으로 자동화된 프로토콜

배우세요 마우스 간 조직에서 고처리량 핵 ploidy 분석 방법을. 고정 또는 냉동 보존 표본에서 간세포 DNA 함량을 측정하여 간 질환 진행을 추적하는 데 활용할 수 있습니다.

마우스에서 간세포 핵 Ploidy의 추정을 위한 situ 방법에서 높은 처리량

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