Name: 마우스에서 간세포 핵 Ploidy의 추정을 위한 situ 방법에서 높은 처리량 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: 배우세요 마우스 간 조직에서 고처리량 핵 ploidy 분석 방법을. 고정 또는 냉동 보존 표본에서 간세포 DNA 함량을 측정하여 간 질환 진행을 추적하는 데 활용할 수 있습니다.

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<ol><li>Gentric, G., Desdouets, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyploidization+in+liver+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Polyploidization in liver tissue.</a> American Journal of Pathology. 184 (2), 322-331 (2014).</li>
<li>Duncan, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ploidy+conveyor+of+mature+hepatocytes+as+a+source+of+genetic+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The ploidy conveyor of mature hepatocytes as a source of genetic variation.</a> Nature. 467 (7316), 707-710 (2010).</li>
<li>Gentric, G., Desdouets, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+polyploidy%3A+Dr+Jekyll+or+Mr+Hide%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Liver polyploidy: Dr Jekyll or Mr Hide?</a> Oncotarget. 6 (11), 8430-8431 (2015).</li>
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<li>Wilkinson, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyploid+Hepatocytes+Facilitate+Adaptation+and+Regeneration+to+Chronic+Liver+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Polyploid Hepatocytes Facilitate Adaptation and Regeneration to Chronic Liver Injury.</a> The American Journal of Pathology. 189 (6), 1241-1255 (2019).</li>
<li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Polyploid+State+Plays+a+Tumor-Suppressive+Role+in+the+Liver%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">The Polyploid State Plays a Tumor-Suppressive Role in the Liver.</a> Developmental Cell. 44 (4), 447-459 (2018).</li>
<li>Chao, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+clock+regulates+hepatic+polyploidy+by+modulating+Mkp1-Erk1%2F2+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Circadian clock regulates hepatic polyploidy by modulating Mkp1-Erk1/2 signaling pathway.</a> Nature Communications. 8 (1), 2238(2017).</li>
<li>Celton-Morizur, S., Merlen, G., Couton, D., Margall-Ducos, G., Desdouets, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+insulin%2FAkt+pathway+controls+a+specific+cell+division+program+that+leads+to+generation+of+binucleated+tetraploid+liver+cells+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">The insulin/Akt pathway controls a specific cell division program that leads to generation of binucleated tetraploid liver cells in rodents.</a> Journal of Clinical Investigation. 119 (7), 1880-1887 (2009).</li>
<li>Wang, M. J., Chen, F., Lau, J. T. Y., Hu, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte+polyploidization+and+its+association+with+pathophysiological+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte polyploidization and its association with pathophysiological processes.</a> Cell Death & Disease. 8 (5), e2805(2017).</li>
<li>Gentric, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+promotes+pathologic+polyploidization+in+nonalcoholic+fatty+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress promotes pathologic polyploidization in nonalcoholic fatty liver disease.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (3), 981-992 (2015).</li>
<li>Toyoda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+to+hepatocyte+ploidy+and+binuclearity+profiles+during+human+chronic+viral+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Changes to hepatocyte ploidy and binuclearity profiles during human chronic viral hepatitis.</a> Gut. 54 (2), 297-302 (2005).</li>
<li>Miyaoka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypertrophy+and+Unconventional+Cell+Division+of+Hepatocytes+Underlie+Liver+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Hypertrophy and Unconventional Cell Division of Hepatocytes Underlie Liver Regeneration.</a> Current Biology. 22 (13), 1166-1175 (2012).</li>
<li>Bou-Nader, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyploidy+spectrum%3A+a+new+marker+in+HCC+classification%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Polyploidy spectrum: a new marker in HCC classification.</a> Gut. , (2019).</li>
<li>Danielsen, H., Lindmo, T., Reith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+determining+ploidy+distributions+in+liver+tissue+by+stereological+analysis+of+nuclear+size+calibrated+by+flow+cytometric+DNA+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">A method for determining ploidy distributions in liver tissue by stereological analysis of nuclear size calibrated by flow cytometric DNA analysis.</a> Cytometry. 7 (5), 475-480 (1986).</li>
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<li>Morales-Navarrete, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+pipeline+for+the+multi-scale+digital+reconstruction+and+quantitative+analysis+of+3D+tissue+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A versatile pipeline for the multi-scale digital reconstruction and quantitative analysis of 3D tissue architecture.</a> eLife. 4, e11214(2015).</li>
<li>Baratta, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+organization+of+normal+mouse+liver%3A+A+histological%2C+quantitative+immunocytochemical%2C+and+fine+structural+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular organization of normal mouse liver: A histological, quantitative immunocytochemical, and fine structural analysis.</a> Histochemistry and Cell Biology. 131 (6), 713-726 (2009).</li>
<li>Pandit, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E2F8+is+essential+for+polyploidization+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">E2F8 is essential for polyploidization in mammalian cells.</a> Nature Cell Biology. 14 (11), 1181-1191 (2012).</li>
<li>Vinogradov, A. E., Anatskaya, O. V., Kudryavtsev, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+of+hepatocyte+ploidy+levels+with+body+size+and+growth+rate+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Genome%22%5BJournal%5D)">Relationship of hepatocyte ploidy levels with body size and growth rate in mammals.</a> Genome. 44 (3), 350-360 (2001).</li>
<li>Tanami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+zonation+of+liver+polyploidy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Dynamic zonation of liver polyploidy.</a> Cell and Tissue Research. 368 (2), 405-410 (2017).</li>
<li>Kudryavtsev, B. N., Kudryavtseva, M. V., Sakuta, G. A., Stein, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+hepatocyte+polyploidization+kinetics+in+the+course+of+life+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Archiv+B+Cell+Pathology+Including+Molecular+Pathology%22%5BJournal%5D)">Human hepatocyte polyploidization kinetics in the course of life cycle.</a> Virchows Archiv B Cell Pathology Including Molecular Pathology. 64 (1), 387-393 (1993).</li>
<li>Gentric, G., Celton-Morizur, S., Desdouets, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyploidy+and+liver+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics+and+Research+in+Hepatology+and+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Polyploidy and liver proliferation.</a> Clinics and Research in Hepatology and Gastroenterology. 36 (1), 29-34 (2012).</li>
<li>Uhlén, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-based+map+of+the+human+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue-based map of the human proteome.</a> Science. 347 (6220), 1260419(2015).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

뮤린 간에서 조직 리모델링 및 간세포 핵 계략의 분석에 대한 높은 함량, 높은 처리량 접근법이 설명된다. 이 절차에 익숙해지면 사용자는 3-5일 동안 여러 샘플을 처리, 이미지 및 분석하여 간 건강의 상세한 서명을 제공하는 대규모 테스트 가능한 데이터 세트를 생성할 수 있습니다. 샘플 전처리 방법의 단순성, 분석된 많은 수의 세포 및 조직 영역(평균 14mm 2/샘플)을 감안할 때, 결과는 견고하고 매우 재현성이 있습니다.2 또한 이미지 캡처 및 분석을 자동화하여 이러한 중요한 단계에서 사용자 오류와 잠재적 편향을 제거합니다. 중요한 혁신은 NPC를 시료 내 및 시료 간 간 핵 DNA 함량의 상대적 평가를 가능하게 하는 내부 계략 교정기로 사용하는 것입니다. 따라서 HNF4α 라벨링 단계의 통합은 이전에 게시된 2D 방법3,,12,,22에비해 ...

포유류 간에서 간세포는 이핵세포를 생성하기 위하여 실속된 사이토카인시스를 겪을 수 있고, DNA endoreplicai는 최대 16N DNA 내용을 포함하는 polyploid 핵을 생성하기 위하여. 전반적인 세포 및 핵 ploidy 증가 출생 후 개발 하는 동안, 노화 및 다양 한 세포 스트레스에 대 한 응답1. polyploidization의 과정은 그것의 정확한 생물학 기능이 불분명하게 남아 있더라도, 동적이고 뒤집을 수 있는2입니다3. 증가된 ploidy는 감소된 증식 용량 과 연관됩니다4,유전 적 다양성2,만성 상해에 적응5 및 암 보호6. 간세포 계략 변경은 변경 된 circadian 리듬7의결과로 발생 , 및 weaning8. 가장 주목할 만한, 간계 프로필은 상해 및 질병9에의해 변경되고, 설득력 있는 증거는 증가된 ≥8N 핵 또는 2N 간세포의 손실과 같은 특정 ploidy 변경이, 비 알콜 성 지방 간 질환 (NAFLD) 진행을 추적하기 위한 유용한 서명을 제공한다는 것을 건의합니다3,,10,또는 바이러스 감염의 차동 충격11.
일반적으로 간 손상 및 재생은 간세포 세포 크기 증가 및 핵영역(12)과연관되며, 간세포의 전체 수 감소와 함께, 특히 2N DNA함량이 10,,11인자. 간에서 의 자렌성 손상은 또한 자주 비 parenchymal 세포의 확장을 동반 (NPC), 기질 근섬유 아세포를 포함, 염증 성 세포와 이중 성 간 전구 세포. 또한 NPC의 변화를 고려하면서, 실치 세포 수와 핵 ploidy의 정량적 세포학적 프로파일을 제공하는 높은 처리량 방법은, 따라서 부상과 질병 동안 간 반응을 추적하는 연구 및 임상 도구로 상당한 잠재력을 가지고있다. 간세포암의 인간 샘플에서 계략 스펙트럼의 최근 의 결정적 스펙트럼분석은 또한 핵 계략이 종양 내에서 극적으로 증가하고 TP5313의감소된 분화 및 손실을 가진 더 공격적인 종양 특수형에서 구체적으로 증폭된다는 것을 보여준다. 따라서, 핵 ploidy의 정량적인 평가에 있는 방법론적 진보가 간암의 미래 예후 프로파일링에서 도움이 될 것이라는 강한 가능성이 있습니다.
이 프로토콜에서는, 마우스 간 조직 단면의 비교 분석을 위한 유연한 고처리량 방법론이 설명되며, 이는 간세포 수의 상세한 세포측정 프로파일링, NPC 반응 및 핵 경화추정을 위한 내부적으로 교정된 방법을제공한다(도 1). 간세포는 핵 크기 및 핵 모모시스템의 특성화 이전에 간세포 핵 인자 4 알파(HNF4α) 면역 라벨링에 의해 NPC와 구별된다. "최소 DNA 함량"은 평균 Hoechst 33342 강도(DNA 밀도에 대한 프록시)를 보간된 3차원(3D) 핵 부피를 통합하여 모든 원형 핵 마스크에 대해 추정됩니다. 간세포 최소한의 DNA 함량은 핵 ploidy 단면도를 생성하기 위하여 NPC를 사용하여 그 때 보정됩니다.
이미지 수집, 핵 세분화 및 이미지 분석은 고함량 이미징을 사용하여 수행되므로 수만 개의 세포를 포함하는 2차원(2D) 간 절개의 넓은 영역을 선별할 수 있습니다. 모든 원형 간세포 핵에 대한 샘플 전체 의 ploidy 프로파일을 생성하기 위해 고함량 이미지 분석 데이터의 자동 사후 처리를 위해 사용자 정의 작성 프로그램이 제공됩니다. 이것은 입체 이미지 분석 (SIA)10,,11,,14,,15에기초하여 핵 ploidy를 계산하는 소프트웨어를 다운로드 무료로 사용하여 수행됩니다. SIA 방법론은 이전에 원형 핵 형태와 핵 크기와 DNA 함량 사이의 단조로운 관계를 가정하여 간(14)에서간세포 핵 ploidy를 추정하기위한 정확하고 힘들기는하지만, 방법, 정확하고 힘들기는하지만 유세포 측정에 의해 검증되었습니다. 이 프로토콜에서, 두 핵 매개 변수는 핵 morphometry 및 Hoechst 의 평가에 의해 측정 된다 33342 라벨링. 각 핵 마스크에 대한 "최소 DNA 함량"의 계산은 알려진 2-4N DNA 함량을 가지고 따라서 유용한 내부 제어 역할을 NPC를 사용하여 간세포 핵 ploidy의 교정에 의해 선행된다.
종래의 유세포분석방법(16)에 비해 설명된 접근법은 간세포 핵 계략을 현장에서 평가할 수 있게 하고 결과를 편향시키고 표준화하기 어려운 신선한 조직 또는 분해 방법에 대한 접근을 필요로 하지 않는다. 모든 SIA 기반 접근법과 마찬가지로, 핵 계략 하위 클래스 >2N은 적도 평면 외부의 더 큰 핵의 단면화로 인해 2D 샘플링에 의해 과소 대표됩니다. 조직 전체 ploidy 단면도는 또한 모든 원형 간세포 핵 마스크에 대한 최소 DNA 함량을 설명하고, 동일한 ploidy의 두 개의 이산 ("비 접촉") 핵이 있는 단핵 간세포와 이핵세포 를 직접 구별하지 않습니다. 그러나, 이 프로토콜의 단순성은 핵간 간격 또는 세포 경계 분석과 같은 추가 파라미터를 고려하여 적응될 수 있게 하며, 이는 세포 계략에 대한 보다 상세한 평가를 제공하는 이핵전지의 식별을 용이하게 할 것이다.

<table><tbody><tr><td>3,5-디에톡시카르복신-1,4-디하이드로콜리딘 다이어트(DDC)</td><td>테스트다이어트</td><td>1810704</td><td>수정된 LabDiet 마우스 다이어트 5015(0.1% DDC</td></tr><tr><td>포함) Alexa Fluor 488 당나귀 안티 염소 IgG(H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A11055</td><td>희석 1:500</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>시그마-알드리치</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>저온 유지 장치 라이카 CM1850 UV</td><td>라이카 바이오시스템</td><td>CM1850 UV</td><td>조직 절편</td></tr><tr><td>형광 장착 매체</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad 소프트웨어</td><td>Prism 8</td><td>데이터 그래프 작성을 위한 통계 소프트웨어</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td>최종 농도 5 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>IN 세포 분석기 1000</td><td>GE Healthcare Bio-Sciences Corp</td><td></td><td>High-Content Cellular Imaging and Analysis System</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>R2019a</td><td>핵 ploidy 자동 분석을 위한 데이터 분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>현미경 커버 슬라이드</td><td>VWR International</td><td>630-2864</td><td>24 x 60 mm 크기</td></tr><tr><td>Microsoft Office Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td>Speadsheet 소프트웨어</td></tr><tr><td>OCT Tissue Tek</td><td>Pascual y Furi&oacute;</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>Panreac AppliChem</td><td>141451.121</td><td></td></tr><tr><td>면역 염색용 펜</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z377821-1EA</td><td>5mm 팁 너비</td></tr><tr><td>폴리 사인 현미경 슬라이드</td><td>VWR International</td><td>631-0107</td><td></td></tr><tr><td>토끼 다클론 항-HNF4&알파;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PA5-79380</td><td>희석 1:250 (대체)</td></tr><tr><td>라빗 폴리클로날 Anti-HNF4&alpha;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-6556</td><td>희석 1:200 (연구에 사용된 항체)</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5927</td><td></td></tr></tbody></table>

마우스에서 간세포 핵 ploidy의 추정을 위한 situ 방법에서 높은 처리량

A High-Throughput In Situ Method for Estimation of Hepatocyte Nuclear Ploidy in Mice

간이 손상되면 간세포 수가 감소하고 세포 크기, 핵 크기 및 ploidy가 증가합니다. 담관iocytes, myofibroblasts, 전구체 및 선동적인 세포와 같은 비 parenchymal 세포의 확장은 또한 만성 간 손상, 조직 개조 및 질병 진행을 표시합니다. 이 프로토콜에서는 부상, 만성 질환 및 암과 관련된 간 세포 구성의 변화를 계산하기 위한 간단한 높은 처리량 접근법을 설명합니다. 우리는 2 차원 (2D) 조직 섹션에서 추출 한 정보가 샘플 내에서 간세포 핵 ploidy를 정량화하고 교정하는 데 사용할 수있는 방법을 보여주고 사용자가 내부에서 간 내에서 특정 ploidy 하위 세트를 찾을 수 있습니다. 우리의 방법은 고정 / 냉동 간 재료, 기본 면역 세포 화학 시약 및 표준 고함량 이미징 플랫폼에 대한 액세스를 필요로한다. 그것은 표준 유동 세포 분석 기술에 대한 강력한 대안으로, 갓 수집 된 조직의 중단, 공간 정보 손실 및 잠재적 인 분리 편향을 필요로합니다.

이 방법은 0.1% 3,5-디에톡시카보닐-1,4-디하이드로콜린(DDC)17을함유하는 간독성 식이요법으로 0-21일 동안 동물에게 먹이를 주어 성인 마우스 간에서 담낭성 손상의 영향을 측정하는데 사용되어 왔다. 만성 DDC 공급 결과 간 세포 손상 증가 ploidy 및 NPC의 periportal 확장. 사용자는 마우스 균주와 연령에 따른 차이가 핵 계략에 존재할 수 있으며 모든 분석은 12-16주 령성인 여성 C57BL/6 마우스를 사용하여 수행되었다는 것을 알고 있어야 합니다.
HNF4α 면역 라벨링 후(프로토콜 섹션 3), 기존의 형광 현미경검사법을 사용하여 모든 슬라이드를 검사하여 양호한 품질 고정 및 염색을 보장하는 것이중요하다(도 2A).</st...

우리는 유세포 측정을 필요로하지 않는 고정 / 저온 보존 조직 샘플 내에서 간세포 수와 핵 ploidy의 변화를 측정하기위한 강력하고 비용 효율적이며 유연한 방법을 제시합니다. 우리의 접근 방식은 간 손상과 질병의 진행을 추적하는 데 이상적인 간 세포학의 강력한 샘플 전체 서명을 제공합니다.

마우스에서 간세포 핵 Ploidy의 추정을 위한 situ 방법에서 높은 처리량

When the liver is injured, hepatocyte numbers decrease, while cell size, nuclear size and ploidy increase. The expansion of non-parenchymal cells such as ...

이 방법을 통해 사용자는 간 발달, 재생 및 만성 질환에 대한 연구를 위해 2D 조직 섹션에서 간세포 핵 DNA 함량의 프로파일을 생성할 수 있습니다. 이 자동화 된 높은 처리량 접근법은 모든 2D 간 조직 섹션에 적용 될 수 있으며, 모든 간단한 원형 간세포 핵에 대한 핵 계략의 내부적으로 보정 된 판독을 제공합니다. 간세포 핵 계포의 변화는 노화, 만성 간 질환 및 암과 관련이 있습니다.이 기술은 고정 또는 냉동 보존 간 표본에서 핵 계략을 프로파일하는 간단한 수단을 제공합니다. situ ploidy 프로파일링 방법은 조직 분리 또는 신선한 물질에 대한 액세스를 필요로하지 않기 때문에 간 질환 진행을 추적하기위한 연구 및 임상 도구로 상당한 잠재력을 가지고 있습니다. 뮤린 간 조직 샘플을 수확 한 후, 최적의 절단 온도 매체에 간 소구를 포함 하 고 즉시 빠른 동결을 보장 하기 위해 건조 얼음에 금형을 배치.냉동 간 소굴 샘플의 조각을 얻으려면 샘플을 6 마이크로미터 두께로 섹션화하여 각 샘플에 5초 동안 폴리아미드 코팅 슬라이드를 배치하여 각 샘플이 슬라이드에 달라붙도록 합니다. 모든 슬라이스를 채취하면 면역 라벨링 전에 실온에서 3~5분 동안 샘플을 평형화할 수 있습니다. 평형의 끝에서, 실온에서 10 분 동안 PBS에서 4 %의 파라 포름 알데히드의 1 밀리리터와 연기 후드에 조직 섹션을 수정합니다.고정이 끝나면 부드러운 동요로 PBS에서 3분 동안 세 번 의 세차처리로 슬라이드를 헹구십시오. 마지막 세척 후 각 조직 섹션 주변을 건조시키고 소수성 펜을 사용하여 각 샘플 주위에 원을 그립니다. 시료를 투과화하려면 PBS에서 0.5% 비이온 계면활성제로 실온에서 15분 동안 섹션을 처리합니다.인큐베이션이 끝나면 PBS에서 3분 동안 시료를 부드러운 교반으로 2회 세척한 후 1%소 세럼 알부민, 5%말 세럼, 0.2%의 비이온 계면활성제를 실내 온도에서 최소 1시간 동안 여과된 용액으로 차단합니다. 다음으로, 빛으로부터 보호되는 습한 염색실에서 밤새 섭씨 4도에서 버퍼를 차단하는 데 희석된 HHF4-알파 항체로 슬라이드를 배양한다. 다음날 아침, 적절한 형광컨이차항체와 Hoechst가 1%의 소세럼 알부머와 0.2%의 비이온 계면활성제로 희석되어 적절한 형광을 결합하여 PBS에서 부드러운 교반으로 PBS에서 4회 세척하여 빛으로부터 보호되는 습한 얼룩챔버의 실온에서 2시간 동안 PBS에서 희석된다.인큐베이션이 끝나면 슬라이드를 시연한 대로 4번 세척한 다음, 부드러운 교반으로 이중 증류수로 23분간 세척합니다. 마지막 세척 후, 커버슬립에 형광 장착 배지 2방울로 샘플을 장착하고 거품을 제거하기 위해 필요에 따라 부드러운 압력을 가합니다. 그런 다음, 좋은 고정 및 면역 라벨링을 보장하기 위해 기존의 형광 현미경을 사용하여 슬라이드를 확인합니다.형광 이미지 수집의 경우, 사용되는 형광에 대한 적절한 흥분을 사용하여 형광 이미지를 획득하기 위해 고함량 이미징 플랫폼에 매개 변수를 설정합니다. 그런 다음 샘플을 스캔하여 충분한 이미지를 획득하여 조직 섹션의 완전한 커버리지를 얻습니다. 스캔의 끝에서, 핵이 최적으로 분리되도록 소프트웨어의 핵 분할 매개변수를 조정하고 HNF4 알파 양성 간세포 및 HNF4-알파 음의 비 parenchymal 세포의 최적의 게이팅을 보장하기 위해 임계 값 강도를 수정한다.핵 정량화를 위해, 원자력 영역을 호흐트스트 염색, 주요 핵 호흐트 스트론, 핵 신장 계수, 평균 핵 원반 지수, HNF4 알파 상태 및 핵 X, Y 좌표를 기반으로 한 정사각형 마이크로미터로 설정합니다. 간세포 핵 계수 분석을 수행하기 위해 먼저 플로이디 정량화 분석 프로그램을 다운로드하고 설치합니다. MATLAB에서 도구 스트립의 앱 탭으로 이동하여 앱 설치를 클릭합니다.Ploidy 응용 프로그램 ML 응용 프로그램 설치 프로그램을 엽니 다. 성공적인 설치를 확인하는 메시지가 나타납니다. 각 데이터 분석 파일에는 표시된 대로 열에 설정된 ploidy 분석에 필요한 모든 데이터를 포함하는 셀 측정이라는 시트가 포함됩니다.각 실험 조건에 대해, 2~4개의 N 핵 교정에 대한 내부 제어를 계산하는 데 사용되는 제어 데이터 집합을 제공합니다. 생물학적 복제의 경우 각 스프레드시트를 자체 폴더에 저장하여 폴더 접두사 이름을 점진적으로 지정합니다. 다음으로, Ploidy 응용 프로그램을 시작합니다.Ploidy 응용 프로그램 그래픽 사용자 인터페이스가 나타납니다. 제어 데이터가 복제되는 폴더로 이동하려면 데이터 제어 경로 단추를 클릭합니다. 그런 다음 이 데이터 경로가 인터페이스에 나타납니다.폴더 접두사에서 출력 파일에 부여할 이름을 입력합니다. 다른 데이터로 가는 경로 단추를 클릭하고 비교 데이터가 복제되는 폴더로 이동합니다. 그런 다음 이 데이터 경로가 인터페이스에 나타납니다.그런 다음 실행을 클릭합니다. 분석이 완료되면 상태 표시줄에서 분석 완료를 읽습니다. 면역 라벨링 후, 종래의 형광 현미경 검사법에 의한 모든 슬라이드를 검사하여 양질의 고정 및 염색이 수득되었는지 확인하는 것이 중요하다.Hoechst 염료의 번짐 또는 흐림은 고정 전에 부적절한 고정 또는 시료 분해를 나타낼 수 있습니다. 핵 분리 및 HNF4-알파 임계값 파라미터는 형광 현미경 검사법에 의해 관찰된 면역염색의 시각적 패턴을 광범위하게 반영하기 위해 자동 이미지 분석 전에 신중하게 최적화되어야 한다. 이미지 분석에 따라, 데이터는 DDC 상해를 가진 간 내의 HNF4 알파 양성 핵 수의 비 parenchymal 세포 및 작지만 중요한, 감소의 증가를 반영해야 합니다.건강한 대조군 간에서는 HNF4-알파 양성 핵의 약 63%가 간단한 원형 morphometry를 나타낸다. 대조군과 DDC 처리군 간의 상대적인 핵계포이를 비교하면 8C 세포보다 많은 수와 함께 부상을 입은 2C 및 4C 간세포 핵의 현저한 손실을 반영해야 한다. 각 계피 하위 그룹에 대한 상대적 위치 정보는 고함량 이미지 분석 소프트웨어 내에서 특정 간세포 하위 집합의 2D 위치를 검색하여 심문될 수 있다.Ki-67과 같은 추가 항체를 가진 면역 라벨링은 세포 복제및 간세포 핵 morphometry 데이터를 평가하기 위해 수행될 수 있으며, 이는 ploidy 분석을 칭찬하기 위해 더 심문될 수 있다. 이 방법에 의해 생성된 조직 전체 계피 프로파일은 모든 원형 간세포 핵에 대한 최소 DNA 함량을 설명하지만 단핵 세포와 이중 핵 간세포 를 구별하지는 않습니다. 이 방법은 잠재적으로 세포 둘레와 같은 매개 변수를 고려하여, 이중 핵 세포의 식별을 용이하게 하고 세포 계략의 추가 판독을 제공하기 위하여 적응될 수 있습니다.

a-high-throughput-situ-method-for-estimation-hepatocyte-nuclear

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

Oocytes는 meiotic 성숙하는 동안 염색체 분리의 오류로 인해 aneuploidy하는 경향이 있습니다. Aneuploid 계란은 다운 증후군과 같은 불임, 유산 또는 발달 장애를 일으킬 수 있습니다. 여기서 우리는 oocytes과 meiotic 성숙을 연구하고 ploidy 평가 방법에 선택의 자료를 소개하는 방법을 설명합니다.

마우스 Oocyte의 Microinjection, 성숙과 Ploidy 평가

여기, 우리는 효율 높은 처리량을...

높은 처리량 현장에서</em태아 마우스 로우어 Urogenital 트랙트의 mRNA의 표현 패턴을 특성화> 하이브리드화 방법

심장 핵​​은 밀도 침강 통해 격리 및 유동세포계측법 의해 cardiomyocyte 핵 파악하고 정렬하는 pericentriolar 소재 1 (PCM-1)에 대한 항체로 immunolabeled있다.

사후 조직에서 Cardiomyocyte 핵의 분리

이 연구는 기형종의 생성 없이 생체 내에서 다능성을 향한 체세포의 재프로그래밍을 보여줍니다. 우리는 Yamanka 인자를 인코딩하는 플라스미드 DNA의 유체역학적 꼬리 정맥 주입을 사용하여 성체 간세포의 생체 내 재프로그래밍을 강화된 다능성의 세포로 유도했습니다.

야마나카 인자의 과발현에 의해 능성에 성인 체세포 세포의 생체 내 재 프로그램

심근세포 회전율의 정량화는 어렵습니다. 여기에 설명된 프로토콜은 신심근세포 핵 생성 및 핵 ploidy의 정확하고 민감한 정량화를 가능하게 함으로써 이러한 과제에 중요한 기여를 합니다.

심근 DNA 합성 및 배수성의 동시 평가 : Method는 심근 재생 및 회전율의 정량을 지원합니다

여기, 우리 현재 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 hepatocytes를 사용 하 여 가족성 콜레스테롤 혈 증의 인간 간 공상 마우스 모델을 생성 하는 프로토콜. 콜레스테롤 혈 증에 대 한 새로운 치료법을 테스트 하기 위한 유용한 모델입니다.

가족성 콜레스테롤 혈 증 인간의 간 공상 마우스 모델을 사용 하 여 유도 만능 줄기 세포 유래 Hepatocytes

리보솜 친화도 정제(TRAP)를 번역하면 세포 유형별 번역 mRNA를 신속하고 효율적으로 분리할 수 있습니다. 여기서, 우리는 간 재모독 및 TRAP의 마우스 모델에서 유체역학적 꼬리 정맥 주입을 결합하여 간세포를 재채우는 발현 프로필을 검사하는 방법을 입증한다.

마우스 간에서 세포 유형 별 유전자 발현 프로파일링

이 프로토콜은 간으로부터 원발성 마우스 간세포를 단리하고 리보뉴클레오단백질 및 mRNA로서 CRISPR-Cas9를 전기천공하여 간장의 유전된 대사성 질환과 관련된 치료적 표적 유전자를 교란시키는 기술을 기술한다. 기술된 방법은 전기천공 후 높은 생존력과 높은 수준의 유전자 변형을 초래한다.

갓 분리된 일차 마우스 간세포로의 Cas9 리보뉴클레오단백질 및 mRNA의 전기천공-매개 전달

여기에서 우리는 간동맥 결찰을 포함하거나 포함하지 않는 동소 간세포 암종 이종이식편을 만들고 [18 F]플루오로미소니다졸([18 F]FMISO) 및 [18F]플루오로데옥시글루코스([18F]FDG).

간세포 암종의 동소 마우스 모델에서 비침습적 PET/MR 이미징

여기에서는 단일 핵 RNA-seq, ATAC-seq 및 관절 다중오믹스(RNA-seq 및 ATAC-seq)에 대해 급속 냉동되고 보관된 간 조직에서 핵을 분리하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

단일 세포 다중오믹스를 위한 급속 동결 간 조직으로부터 핵 분리

여기에서 우리는 세포핵 준비를 설명하는 프로토콜을 제시합니다. 심장 조직을 단일 세포로 미세 해부 및 효소 해리한 후, 전구 세포를 동결한 다음, 순수 생존 세포를 분리하여 단일 핵 RNA 시퀀싱 및 고처리량 시퀀싱 분석을 통한 전이효소 접근 가능한 염색질에 대한 단일 핵 분석에 사용했습니다.

단일 세포 분해능에서 후성유전체 및 유전자 발현 프로파일링을 위한 마우스 심장 전구 세포에서 핵 분리

배우세요 마우스 간 조직에서 고처리량 핵 ploidy 분석 방법을. 고정 또는 냉동 보존 표본에서 간세포 DNA 함량을 측정하여 간 질환 진행을 추적하는 데 활용할 수 있습니다.

마우스에서 간세포 핵 Ploidy의 추정을 위한 situ 방법에서 높은 처리량

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