Name: 초고성능 액체 크로마토그래피에 의한 면역글로불린 G N-글리칸 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: 학습하세요 초고성능 액체 크로마토그래피(UPLC)를 이용한 면역글로불린 G N-글리칸 분석 방법입니다. 이 기술은 글리칸 이성질체를 정확하게 분리하며 높은 재현성과 비용 효율성을 제공하여 면역학 연구 및 임상 진단에 활용됩니다.

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이 작품은 중국 국립 자연 과학 재단 (81673247 및 81872682)과 호주 - 중국 협력 보조금 (NH & MRC - APP1112767 -NSFC 81561128020)의 보조금으로 지원되었습니다.

이 의정서에 포함된 모든 과목은 중국 베이징 의과대학의 윤리위원회의 승인을 받았습니다12. 서면 동의는 연구의 시작 부분에 각 과목에서 얻은.
1. IgG 격리
<ol><li>결합 완충제 (인산완충식염수, PBS): 1x PBS (pH = 7.4), 중화 버퍼 : 10x PBS (pH = 6.6-6.8), 용리액 : 0.1 M 포름산 (pH = 2.5), 용리액용 중화 액: 1 M 암모늄 중탄산염, 저장 버퍼 를 포함한 화학 물질을 준비하십시오. 에탄올 + 20 mM 트리스 + 0.1 M NaCl (pH = 7.4), 단백질 G용 세정 용액 : 0.1 M NaOH + 30 % 프로판 -2-올. 참고: 이 프로토콜에서는 pH 수준이 매우 중요합니다. IgG의 용출은 매우 낮은 pH를 필요로하며, 산 가수 분해로 인한 시실산의 손실 위험이 있다. 따라서 용출은 몇 초 내에 발생하고 pH는 IgG 및 시실산의 무결성을 보존하여 중성으로 신속하게 복원됩니다.</li>
	<li>시료 를 준비 : 냉동 플라즈마 샘플을 해동 한 다음 10 분 동안 80 x g에서 원심 분리를 하고, 실온 (RT)에서 30 분 동안 단백질 G 모놀리식 플레이트와 상기 화학 물질을 둡니다.</li>
	<li>100 μL 샘플(첫 번째 실패를 방지하기 위해 2x를 검출하는 데 사용할 수 있음)을 2mL 수집 플레이트(총 6개의 표준 샘플, 1개의 제어 샘플 [초순수]) 및 89개의 플라즈마 샘플을 96개의 웰 플레이트에 대해 설계하고 무작위로 할당했습니다. 접시에)를 제공합니다.</li>
	<li>샘플을 1x PBS로 1:7(v/v)로 희석합니다.</li>
	<li>0.45 μm 친수성 폴리프로필렌(GHP) 필터 플레이트를 200 μL의 초순수(반복 2x)로 청소합니다.</li>
	<li>희석된 샘플을 필터 플레이트로 옮기고 진공 펌프(266.6-399.9Pa에서 진공 압력 제어)를 사용하여 샘플을 수집 플레이트로 필터링합니다.</li>
	<li>단백질 G 모놀리식 플레이트의 제조<ol>
<li>저장소 버퍼를 삭제합니다.</li>
		<li>초순수 2mL, PBS 1mL 2mL, 0.1M 포름산 1mL, 10x PBS 2 mL, 1x PBS 2 mL(순차적으로) 모놀리식 플레이트를 청소하고 진공 펌프를 사용하여 흐르는 액체를 제거합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>여과된 샘플을 IgG 결합 및 세척을 위해 단백질 G 모놀리식 플레이트로 옮긴 다음, 1x PBS 2 mL로 모놀리식 플레이트를 세척합니다(청소 2x 반복).</li>
	<li>0.1 M 포르믹산 1 mL로 IgG를 호루라기 하고 진공 펌프로 샘플을 수집 플레이트에 걸러낸 다음 1M 암모늄 중탄산염 170 μL을 수집 플레이트에 추가합니다.</li>
	<li>흡수 분광광도계(최적 파장 = 280 nm)를 사용하여 IgG 농도를 검출합니다.<ol>
<li>소프트웨어를 열고 단백질 CY3 모드를 선택합니다.</li>
		<li>2 μL의 초순수물을 그린 다음 화면에 로드한 다음 소프트웨어의 공백을 클릭하여 화면을 지우고(1x 반복).</li>
		<li>초순수 2μL을 그린 다음 화면에 로드한 다음 소프트웨어의 샘플을 클릭하여 초순수를 감지합니다.</li>
		<li>IgG 샘플 2 μL을 그려 서 화면에 로드 한 다음 소프트웨어의 샘플을 클릭하여 샘플을 감지합니다.</li>
		<li>2 μL의 초순수물을 그린 다음 화면에 로드한 다음 소프트웨어의 공백을 클릭하여 화면을 지웁습니다.</li>
		<li>소프트웨어를 닫습니다. 참고: IgG 농도를 계산하는 공식은 다음과 같습니다. CIgG = 흡광도 x 소멸 계수 (13.7) x 1,000 μg/mL</li>
	</ol></li>
	<li>추출된 IgG를 60°C에서 오븐에서 건조시키고 추출된 IgG(300 μL 추출된 IgG 4시간)를 보존한다.<ol>
<li>농도가 1,000 μg/mL보다 큰 경우 추출된 IgG의 300 μL을 제거합니다.</li>
		<li>농도가 500-1,000 μg/mL 인 경우 추출된 IgG의 350 μL을 제거합니다.</li>
		<li>농도가 200-500 μg/mL 인 경우 추출 된 IgG의 400 μL을 제거하십시오.</li>
		<li>농도가 200 μg/mL보다 작은 경우 추출된 IgG의 600 μL을 제거합니다. 참고: IgG의 농도는 후속 검출을 위해 바람직하게는 >200 μg/mL이어야 합니다. IgG의 평균 양은 바람직하게는 >1,200 μg이어야하며, 첫 번째 테스트가 실패할 경우 2배 테스트할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>재사용을 위해 단백질 G 모놀리식 플레이트 청소<ol>
<li>초순수 2mL, 0.1M NaOH 1 mL(침전된 단백질 제거용), 초순수 4mL, 1x PBS 4mL(순차적으로)로 플레이트를 세척한 다음 진공 펌프를 사용하여 흐르는 액체를 제거합니다.</li>
		<li>초순수 2mL, 프로판-2-ol 2mL(결합 소수성 단백질 제거용), 초순수 2mL, 1x PBS 4mL(순차적으로) 2mL로 플레이트를 세척한 다음 진공 펌프를 사용하여 흐르는 액체를 제거합니다.</li>
		<li>완충액 1 mL (20 % 에탄올 + 20 Mm Tris + 0.1 M NaCl)으로 플레이트를 씻고 완충액 1 mL (20 % 에탄올 + 20 mm Tris + 0.1 M NaCl)을 접시에 추가한 다음 플레이트를 4 °C에서 둡니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 글리칸 방출
<ol><li>건조 된 IgG를 준비하고 1.33 % SDS, 4 % Igepal (빛에서 멀리 저장) 및 RT에서 5 x PBS를 포함한 화학 물질을 저장합니다.</li>
	<li>250 U 효소를 250 μL의 초순수로 희석하여 PNGase F 효소를 준비합니다.</li>
	<li>IgG의 변성<ol>
<li>30 μL의 1.33% SDS를 넣고 소용돌이에 의해 혼합하고 샘플을 65 °C 오븐으로 10 분 동안 옮은 다음 오븐에서 제거한 다음 15 분 동안 놓습니다.</li>
		<li>4% 이게팔 10 μL을 넣고 5분 동안 흔들리는 인큐베이터에 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>글리칸 제거 및 방출<ol>
<li>5x PBS 20 μL과 0.1 mol/L NaOH의 30-35 μL을 추가하여 8.0의 pH를 조절하고 소용돌이로 혼합합니다. PNGase F 효소 4 μL을 넣고 와르싱하여 섞습니다. 이어서, 37°C 수조에서 18-20시간 동안 배양한다.</li>
		<li>방출된 글리칸을 2.5-3.0시간 동안 60°C에서 오븐에서 건조시다.</li>
		<li>방출된 글리칸을 추가 측정이 될 때까지 -80°C에서 저장합니다. 참고: 이 단계는 매우 중요합니다. 글리칸 방출의 핵심은 PNGase F 효소의 활성을 개선하여 효율성을 극대화하는 것입니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 글리칸 라벨링 및 정제
<ol><li>2-아미노벤자미드(2-AB) 라벨링 시약을 0.70 mg의 2-AB, 10.50 μL의 아세트산, 6 mg의 시아노보로하이드라이드 나트륨(NaBH3CN), 그리고 24.50 μL의 디메틸 설산화물(DMSO) (총 부피 = 35μL)을 준비한다. 이어서, 아세트산, 2-AB 및 NaBH3CN을 순서대로 DMSO에 첨가한다.</li>
	<li>2-AB 라벨 시약 35 μL을 사용하여 글리칸에 라벨을 붙인 후 5 분 동안 발진기로 옮기고 65 °C에서 3 시간 동안 오븐으로 옮은 다음 30 분 동안 RT로 옮김하십시오. 참고: 전체 글리칸 라벨링 단계는 빛으로부터 보호하면서 수행해야 합니다.</li>
	<li>0.2 μm GHP 필터 플레이트를 70% 에탄올 200 μL, 초순수 200 μL, 96% 아세토니트릴(4°C)의 200 μL로 처리한 다음 진공 펌프를 사용하여 폐기물을 제거합니다.</li>
	<li>2-AB 표지 글리칸의 정화<ol>
<li>2-AB 표지 글리칸에 100% 아세토니트릴 700 μL을 넣고 5분 동안 흔들리는 인큐베이터로 옮김을 옮김을 넣습니다.</li>
		<li>134 x g에서 5 분 (4 °C)의 원심 분리기.</li>
		<li>샘플을 0.2 μm GHP 필터 플레이트로 2분 동안 옮기고 진공 펌프를 사용하여 여과액(흐르는 액체)을 제거합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>2-AB 표지 글리칸을 96% 아세토니트릴(4°C)의 200 μL로 세척하고 진공 펌프5x-6x를 사용하여 여과액(흐르는 액체)을 제거합니다.</li>
	<li>100 μL의 초순수 3x로 2-AB 라벨이 붙은 글리칸.</li>
	<li>2-AB 라벨이 붙은 글리칸을 오븐에 옮겨 60°C에서 3.5시간 동안 건조시다.</li>
	<li>라벨이 붙은 N-글리칸을 추가 측정이 될 때까지 -80°C에서 저장합니다. </li>
</ol>4. 친수성 상호 작용 크로마토그래피 및 글리칸 분석
<ol><li>UPLC 계측기의 컨디셔닝 및 이월 상 준비<ol>
<li>용매 A: 100 mM 암모늄 포메이트 (pH = 4.4), 용매 B : 100 % 아세토니트릴, 용매 C : 90 % 초순수 (10 % 메탄올), 및 용매 D : 50 % 메탄올 (초순수)을 포함한 이상을 준비합니다.</li>
		<li>소프트웨어를 열어 모바일 단계를 제어합니다.</li>
		<li>UPLC 계측기는 0.2 mL/min(50% 용매 B 및 50% 용매 C)의 유량으로 30분 동안 밸런싱한 다음 0.2 mL/min(25% 용매 A 및 75% 용매 B)의 유량속도로 20분 동안 밸런싱한 다음 0.4 mL/min 밸런싱의 유량으로 세척합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>라벨이 붙은 N-글리칸을 100% 아세토니트릴과 초순수의 혼합물25 μL로 2:1 비율(v/v)으로 용해시다. 이어서, 134×g에서 5분(4°C)의 원심분리기를 UPLC 계측기에 라벨이 붙은 N-글리칸의 10 μL을 적재한다. </li>
	<li>25 분 동안 75 % ~ 62 %의 아세토니트릴의 선형 구배와 0.4 mL / min의 유량으로 라벨이 붙은 N-글리칸을 분리하십시오. 이어서, 60°C에서 UPLC상에서 덱스트란 교정 사다리/글리코펩타이드 컬럼에 의한 분석 실행을 수행하였다(여기서, 시료는 주입 전에 4°C에서 보관하였다).</li>
	<li>N-글리칸 형광을 각각 330 nm 및 420 nm의 여기 및 방출 파장에서 검출합니다. </li>
	<li>피크 위치 및 유지 시간에 따라 글리칸을 통합합니다.</li>
	<li>각 글리칸 피크(GP)/모든 글리칸 피크(GP)의 상대값 계산(백분율, %) 다음과 같이: GP1: GP1/GP*100, GP2: GP2/GP*100, GP3: GP3/GP*100, 기타</li>
</ol>

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<li>Berruex, L. G., Freitag, R., Tennikova, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+antibody+binding+to+immobilized+group+specific+affinity+ligands+in+high+performance+monolith+affinity+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+and+Biomedical+Analysis%22%5BJournal%5D)">Comparison of antibody binding to immobilized group specific affinity ligands in high performance monolith affinity chromatography.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 24, 95(2000).</li>
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</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

UPLC는 상대정량분석방법5,15. 결과는 UPLC가 좋은 재현성과 상대적인 정량적 정확도를 갖춘 안정적인 검출 기술임을 나타냅니다. 각 피크의 글리칸 양은 상대값인 UPLC를 사용하여 총 통합 영역의 백분율로 표현됩니다. 상대 정량화는 시험 샘플의 비교 가능성을 향상시킵니다. 또한, 96웰 프로틴 G 플레이트는 높은 처리량 검출을 위해 한 번에 96개의 샘플로 IgG를 정화하는 데 사용됩니다. IgG를 결합하는 단백질 G의 능력은 이전 연구15,16에기재된 바와 같이 단백질 A보다 크다.
또한, IgG N-글리칸의 구조는 명확하게 분리된다. 유래 IgG 글리칸은 초기 IgG N-글리칸에 의해 계산되는 갈락토실화, 시알릴레이션, 이등분 GlcNAc <em...

인간단백질의 N-글리코실화는 일반적이고 필수적인 번역 후 변형1이며 질병의 발생 및 발병을 비교적 정확하게 예측하는 데 도움이 될 수 있다. 그 구조의 복잡성으로 인해 5,000 개 이상의 글리칸 구조가 있을 것으로 예상되며, 질병에 대한 진단 및 예측 바이오 마커로서 큰 잠재력을 제공합니다2. 면역글로불린 G(IgG)에 부착된 N-글리칸들은 IgG의 기능에 필수적인 것으로 나타났으며, IgG N-glycosylation은 프로-및 항염증 시스템 사이의 균형에 참여한다3. 차동 IgG N-glycosylation은 질병 병리학에 관여하는 소인 및 기능적 메커니즘을 모두 나타내는 질병 발달 및 진행에 관여한다. IgG N-glycosylation의 염증성 역할은 노화, 염증성 질환, 자가면역 질환 및 암4와관련이 있다. 
감지 기술의 개발과 함께, 형광 검출 (UPLC-FLR) 친수성 상호 작용 크로마토그래피 (HILIC) 초고성능 액체 크로마토그래피, 레이저 유도 형광을 이용한 멀티플렉스 모세관 겔 전기 영동등 은 높은 처리량 글리코믹에서 가장 널리 사용됩니다. esccence 검출 (xCGE-LIF), 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 비행 시간 질량 분광법 (MALDI-TOF-MS), 액체 크로마토그래피 전기 분무 질량 분석법 (LC-ESI-MS) . 이러한 방법은 낮은 유속, 불안정한 결과 및 불량 감도 특이성의 이전의단점을 극복했다5,6.
UPLC는 IgG N-glycosylation 및 특정 질병 사이의 연관성을 탐구하는 데 널리 사용됩니다 (즉, 노화7,비만8,이상지질혈증9,타입 II 당뇨병10,고혈압11,허혈성 뇌졸중12,파킨슨 병13). 위에서 언급한 다른 세 가지 방법에 비해 UPLC는다음과같은 장점을 가지고5,14. 첫째, 상대적 정량 분석 방법을 제공하고, 전체 면적 정규화를 수반하는 데이터 분석은 각 샘플의 비교성을 향상시킨다. 둘째, 장비 비용과 필요한 전문 지식이 상대적으로 적기 때문에 글리코실화 바이오마커를 임상 응용 분야로 쉽게 구현하고 변환할 수 있습니다. 여기에 제시된 UPLC에 대한 소개이므로 더 널리 사용될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>2-아미노벤즈아미드, 2-AB</td><td>시그마, 중국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-웰 수집 플레이트</td><td>AXYGEN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-웰 필터 플레이트</td><td>Pol</td><td>0.45 um GHP</td><td></td></tr><tr><td>96-웰 모놀리식 플레이트</td><td>BIA 분리</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-웰 플레이트 로터</td><td>Eppendorf Co., Ltd, 독일</td><td>T_1087461900</td><td></td></tr><tr><td>아세트산</td><td>시그마, 중국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Huihai Keyi Technology Co., Ltd, 중국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ammonium bicarbonate</td><td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, 중국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ammonium formate</td><td>Beijing Minruida Technology Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>일정한 흔들림 인큐베이터/로커</td><td>Zhicheng 분석 기기 제조 co., Ltd, 중국</td><td>ZWY-10313</td><td></td></tr><tr><td>덱스트란 교정 사다리/글리코펩타이드 컬럼</td><td>Watts technology Co., Ltd, 중국</td><td>BEH 컬럼</td><td></td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드(DMSO)</td> <td>시그마, 중국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨</td><td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, 중국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>전기 오븐</td><td>테스터 기기 유</td>한 <td>공사 202-2AB</td><td></td></tr><tr><td>Empower 3.0</td><td>Waters technology Co., Ltd, 미국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Huihai Keyi Technology Co., Ltd, 중국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>포름산</td><td>시그마, 중국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GlycoProfile 2-AB 라벨링 키트</td><td>시그마, 중국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Junrui Biotechnology Co., Ltd, 중국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>고속 원심분리기</td><td>Eppendorf Co., Ltd, 독일</td><td>5430</td><td></td></tr><tr><td>Igepal</td><td>Sigma, 중국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>저온 원심분리기</td><td>Eppendorf Co., Ltd, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>저온 냉장고</td><td>Qingdao Haier Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>매니폴드 96웰 플레이트</td><td>와트 기술 Co., Ltd, 중국</td><td>186001831</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Huihai Keyi Technology Co., Ltd, 중국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q 순수 수량계</td><td>Millipore Co., Ltd, 미국</td><td>Advantage A10</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, 중국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PH 테스터</td><td>Sartorius Co., Ltd, 독일</td><td>PB-10</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수, PBS</td><td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, 중국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>피펫</td><td>Eppendorf Co., Ltd, 독일</td><td>4672100, 0.5-10&mu; 엘 & 10-100&뮤; 엘 & 20-200&뮤; 엘 & 1000&뮤; l</td><td></td></tr><tr><td>PNGase F 효소</td><td>시그마, 중국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>인산 이수소 칼</td>륨 <td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, 중국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Propan-2-ol</td><td>Huihai Keyi Technology Co., Ltd, 중국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma, 중국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, 중국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>나트륨 시아노보로하이드라이드(NaBH3CN)</td><td>시그마, 중국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>분광 광도계</td><td>Shanghai Yuanxi instrument Co., Ltd</td><td>B-500</td><td></td></tr><tr><td>Transfer liquid gun</td><td>Smer Fell Science and Technology Co., Ltd, China</td><td>4672100</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amresco, America</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultra-low temperature refrigerator</td><td>Thermo Co., Ltd, 미국</td><td>MLT-1386-3-V; MDF-382E</td><td></td></tr><tr><td>초고성능 액체 크로마토그래</td>피 <td>Watts technology Co., Ltd, 중국</td><td>Acquity MLtraPerformance LC</td><td></td></tr><tr><td>진공 펌프</td><td>Watts technology Co., Ltd, 중국</td><td>725000604</td><td></td></tr><tr><td>휘발기/건조기</td><td>Eppendorf Co., Ltd, 독일</td><td>T_1087461900</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Changzhou Enpei instrument Co., Ltd, 중국</td><td>NP-30S</td><td></td></tr><tr><td>수조</td><td>테스터 기기 유한 공사</td><td>DK-98-IIA</td><td></td></tr><tr><td>계량 저울</td><td>Shanghai Jingke Scientific Instruments Co., Ltd.</td><td>MP200B</td><td></td></tr></tbody></table>

초고성능 액체 크로마토그래피에 의한 면역글로불린 g n-글리칸 분석

Immunoglobulin G N-Glycan Analysis by Ultra-Performance Liquid Chromatography

글리코믹스는 오믹스 시스템 연구의 새로운 특수 분야로, 질병 감수성, 약물 표적 발견 및 정밀 의학을 위한 차세대 바이오마커 를 발견하는 데 상당한 잠재력을 제공합니다. 대안 IgG N-glycans는 몇몇 일반적인 만성 질병에서 보고되고 임상 응용 (즉, 질병의 진단 및 예측을 위한 바이오마커)에 있는 중대한 잠재력을 가지고 제안되었습니다. IgG N-글리칸널리 친수성 상호 작용 크로마토그래피 (HILIC) 초고성능 액체 크로마토그래피 (UPLC)의 방법을 사용하여 특징지어진다. UPLC는 재현성이 뛰어나고 상대적 정량이 높은 안정적인 검출 기술입니다. 또한, IgG N-glycan의 구조는 명확하게 분리되고, 혈장내의 글리칸 조성및 상대적 풍부도가 특징지어진다.

도 1에나타낸 바와 같이, IgG N-글리칸스는 피크 위치 및 유지 시간에 기초하여 24개의 초기 IgG 글리칸 피크(GPs)로 분석되었다. N-글리칸구조는 이전 연구(표1)15에따른 질량 분석 검출을 통해 사용할 수 있다. 결과를 비교하기 위해, 각 피크의 글리칸 양을 총 통합 영역의 백분율로 표현한 총 면적 정규화가 적용되었습니다.
방법의 반복성 및 안정성을 평가하기 위해, 표준 샘플을 6회 병렬로 시험하였다. 표 2에나타낸 바와 같이, 24GPs의 변동계수(CV)는 1.84%-16.73%, 15(62.50%)의 범위범위 그 중 10% 미만이었습니다. 상대적으로 작은 비율...

면역글로불린 G(IgG) N-글리칸은 친수성 상호작용 UPLC를 사용하는 것을 특징으로 한다. 또한, IgG N-글리칸의 구조는 명확하게 분리된다. 여기에 제시된 이 실험 방법에 대한 소개는 연구 환경에서 널리 사용될 수 있도록 한다.

초고성능 액체 크로마토그래피에 의한 면역글로불린 G N-글리칸 분석

Glycomics is a new subspecialty in omics system research that offers significant potential in discovering next-generation biomarkers for disease ...

초고성능 액체 크로마토그래피는 IgG n-글리칸의 정확한 분석을 위한 기술이 확립되어 있어 민감성이 높고 글리칸의 특정 정보를 제공할 수 있는 능력이 있어 사용하기 쉽고 상대적으로 낮은 증분, 높은 재현성, 높은 재현성 의 수의 이소마저에 대한 능력이 있다. 플라즈마에서 단백질의 측정은 매력적일 수 있습니다. 의학에서.또한 글리코제 염기 및 인구를 포함하는 이러한 및 생물학적 제제에서 IgG와 연관. 불순한 상태의 글리칸에서 IgG를 테스트하는 데 사용된다는 것을 알고 있습니다. 실제로, 그것은 단백질의 n-글리칸을 테스트할 수 있습니다.이는 2개의 순수한 상태의 교차 결합 단백질에서 필요하며, 실험 공정이 표준화되어야 하는 동안 OR 실험 공정이 비교적 간단하다단백질에 적용될 수 있다. 종단 간 실험 과정은 작동하는 데 3 일이 걸리며 실험 기술을 습득하기 위해 실험 단계를 암기해야합니다. 샘플을 준비하려면 냉동 플라즈마 샘플을 해동하십시오.그런 다음 원심 분리기는 80 배 G에서 10 분 동안. 단백질 G 모놀리식 플레이트를 실온에서 30분 동안 그대로 둡니다. 2밀리리터 수집 플레이트의 각 우물에 100 마이크로미터의 샘플을 전달합니다.하나의 제어 샘플로 초순수수를 추가합니다. 1개의 X PBS로 샘플을 부피 비율로 1~7부씩 희석합니다. 0.45 마이크로론 수성 성수기 폴리프로폴렌 필터 플레이트를 200 마이크로리터의 초순수 수로 청소하십시오.청소를 두 번 더 반복합니다. 희석된 샘플을 필터 플레이트로 옮기고, 266.6 내지 399.9 파스칼의 압력을 가진 진공 펌프를 사용하여 샘플을 집단 판으로 필터링한다. 단백질 G 모놀리식 플레이트를 준비하려면 먼저 저장 버퍼를 폐기하십시오.초순수 수분 2밀리리터, X PBS 2개, 어금니 포름산 1밀리리터, 10X PBS 2개, X PBS 1개 밀리리터 2개 순차적으로 모놀리식 플레이트를 청소합니다. 진공 펌프를 사용하여 다음 액체를 제거합니다. 멀티채널 파이프를 사용하여 여과된 샘플을 IgG 결합 및 세척을 위한 단백질 G 모놀리식 플레이트로 전달합니다.그런 다음 한 개의 X PBS의 밀리리터 2개를 추가하여 모놀리식 플레이트를 청소합니다. 진공 펌프를 사용하여 PBS를 제거하고 청소를 두 번 더 반복합니다. 0.17 의 1 밀리리터의 0.17 어금니 포름산으로 일루트 IgG, 진공 펌프에 의해 수집 판으로 샘플을 필터링.그런 다음, 수집 판에 1개의 어금다 암모늄 중탄산염170마이크로리터를 추가합니다. 280 나노미터의 최적 파장에서 흡수 스펙로프토미터를 사용하여 IgG 농도를 감지합니다. 추출된 IgG를 오븐에 넣고 섭씨 60도에서 3시간 동안 건조시다.원고에 설명된 바와 같이 농도에 따라 관찰되는 양을 결정하고 영하 80도에서 보존한다. 말린 IgG를 수집하고 실온에서 1.33 % SDS, 4 % IgePal 및 5 %PBS를 포함한 화학 물질을 저장합니다. 250 마이크로리터의 초순수수로 250단위의 효소를 희석하여 인독리코시다아제 F 효소를 준비하십시오.IgG를 분해하려면 1.33%의 SDS의 마이크로리터 30기를 추가하고 소용돌이로 혼합합니다. 샘플을 섭씨 65도 오븐으로 10분간 옮김합니다. 그런 다음 오븐에서 꺼내 서 15 분 동안 식힙니다.동일한 샘플에 4%의 IgePal의 마이크로리터 10개를 추가하고 흔들리는 인큐베이터에 5분간 놓습니다. 5개의 X PBS와 30~35마이크로리터의 마이크로리터를 추가하여 0.1 의 어금니 나트륨 수산화나트륨을 추가하여 pH를 8.0으로 조절하고, 소용돌이에 섞는다. endoglycosidase F 효소의 4 개의 마이크로 리터를 추가하고, 소용돌이에 의해 혼합.그런 다음 섭씨 37도의 수조에서 18~20시간 동안 배양합니다. 다음 날, 방출 된 질칸을 오븐에 60섭씨 60도에 놓고 2 시간 반에서 3 시간 동안 건조하십시오. 추가 측정이 될 때까지 방출 글리칸을 영하 80도에서 절약하십시오.2개의 아미노 벤지미드 라벨링 시약은 DMSO 24.5 마이크로리터, 아세트산 10.5 마이크로리터, 아세트산 10.5마이크로리터, 2개의 아미노 벤지미드의 0.7 밀리그램, 그리고 시아노보로하이드라이드 나트륨 6밀리그램을 준비합니다. 다음으로, 어두운 방에서, 두 개의 아미노 벤지미드 라벨 시약의 35 마이크로 리터를 추가하여 글리칸을 라벨. 라벨이 부착된 글랜캔을 발진기로 5분간 옮은 다음, 섭씨 65도에서 3시간 동안 오븐으로 옮기습니다.그 후, 30 분 동안 실온으로 전송합니다. IgG n-glycase는 불순한 상태의 형광 검출에 의해 검출되기 위해 라벨을 붙일 것입니다. Pretreat는 70%에탄올20마이크로리터, 초순수 수분 200마이크로리터, 96%의 아세토 니트리어 200마이크로리터를 섭씨 4도에 장착한 0.2 마이크로론 GHP 필터 플레이트를 제공합니다.그런 다음 진공 펌프를 사용하여 폐기물을 제거합니다. 두 개의 아미노 벤지미드 라벨 글리칸을 정화하려면 100% 아세토닐릴의 700 마이크로리터를 샘플에 넣고 흔들리는 인큐베이터로 5분 간 옮김합니다. 섭씨 4도에서 5분간 134회 G의 원심분리기.수퍼네텐트를 0.2미크론 GHP 필터 플레이트로 2분간 전송하고 진공을 사용하여 여과물을 제거한다. 아미노 벤지미드 라벨이 부착된 글리칸 2개를 섭씨 4도에서 96%의 아세토닐트리어200마이크로리터로 세척하고 진공 펌프를 사용하여 5~6회 여과물을 제거합니다. 아미노 벤지미드 라벨 글리칸 2개에 100마이크로리터의 초순수수 3회.라벨이 붙은 두 개의 아미노 벤지미드 글리칸을 오븐에 넣고 섭씨 60도에서 3시간 반 동안 건조시다. 라벨이 부착된 n-글리칸을 추가 측정전까지 영하 80도에서 저장하십시오. 먼저 소프트웨어를 열어 모바일 단계를 제어합니다.UPLC 계측기를 50%의 용매 B와 50%의 용매 C로 분당 0.2 밀리리터의 유량으로 30분간 세척합니다. 그런 다음 분당 0.2 밀리리터의 유량으로 25%의 용매 A와 75%의 용매 B로 20분 간 세척합니다. 그런 다음 분당 0.4 밀리리터의 유량을 추가합니다.라벨이 부착된 n-글리칸을 100%의 아세토닐릴과 초순수수를 2대 1부피 비율로 혼합하여 25마이크로리터로 녹입니다. 그런 다음, 원심분리기는 섭씨 4도에서 5분 동안 134회 G로 원심분리기를 사용하고, 드라이 파이프를 사용하여 SUPERNATENT 의 10 마이크로리터를 UPLC 기기에 적재합니다. 라벨이 부착된 n-글리칸을 분당 0.4 밀리리터의 유량으로 분리하여 25분 동안 75%에서 62%의 아세토니틀을 선형 그라데이션으로 분리합니다.그런 다음 UPLC에서 덱스터란 교정 사다리 글리코펩티드 컬럼이 섭씨 60도에서 실행한 분석을 수행합니다. 각각 330나노미터 및 420나노미터의 X 인용 및 방출 파장에서 n-글리칸 형광을 검출한다. 본 그림과 같이, IgG n-글리칸은 피크 위치 및 보존 시간을 기준으로 24개의 초기 IgG 글리칸 피크로 분석되었다.n-글리칸 구조는 질량 분석 검출을 통해 24가지 유형으로 제공됩니다. 방법의 반복성 및 안정성을 asses하기 위해 표준 샘플을 6 번 병렬로 테스트했습니다. 상대적으로 작은 비율을 가진 글리칸 피크는 변동계수의 10% 이상의 높은 측정 오차를 보였다.이 조각에서 IgG n-글리칸 구조의 확립된 형성에 중요한 것은, 특히 말단을 확립하기 위해, 3.3 IgG n-glycase 대신에 IgG의 중요성이 중요하다. 글리칸에서 온 글리칸은 다른 것으로 알려져 있습니다. 글리칸 프로토믹의 발전과 함께 글리칸에 결합하여 오늘날의 진단의 잠재력으로 사용될 수 있도록 정보를 탐구합니다.이 기술 개발 후, 그것은 탐구하는 새로운 방법을 제공합니다

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

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Glycomics-guided glycoproteomics는 복잡한 종양 미세환경에서 당단백질체의 포괄적인 프로파일링을 용이하게 합니다. 

여기에서는 뮤신에서 O-글리칸을 방출하고 MALDI-TOF 질량 분석법을 사용한 후속 탈염, 과메틸화 및 분석에 대한 자세한 프로토콜을 제시합니다.

Profiling of Permethylated Mucin O-glycans Using Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight 질량 분석기

학습하세요 초고성능 액체 크로마토그래피(UPLC)를 이용한 면역글로불린 G N-글리칸 분석 방법입니다. 이 기술은 글리칸 이성질체를 정확하게 분리하며 높은 재현성과 비용 효율성을 제공하여 면역학 연구 및 임상 진단에 활용됩니다.

초고성능 액체 크로마토그래피에 의한 면역글로불린 G N-글리칸 분석

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