파라핀 내장 된 조직에서 인간과 뮤린 호중구 세포 외 트랩의 면역 형광 라벨링

호중구 세포 외 트랩 (NETs)은 자극 된 호중구 과립구에 의해 생성 된 3 차원 구조입니다. 최근 몇 년 동안 NET가 다양한 질병에 관여하고 있음이 분명해졌습니다. 조직에서 NET를 검출하는 것은 진단 관련성이 있을 수 있으므로 NET 성분을 라벨링하기 위한 표준화된 프로토콜이 필요합니다.

오늘 우리는 일반적인 열 유도 항원 검색 프로토콜의 변종을 보여주고 싶습니다. 그것은 호중구 엘라스테아제 항원 및 히스톤에 필요한 높은 pH 값에 대한 낮은 온도의 장점을 결합합니다. 이 기술은 마우스 또는 남자 둘 다에서 파라핀 조직에서 NETs, 호중구 세포 외 함정을 연구할 수 있습니다.

또한 보관된 자료 나 회고전 연구를 연구하는 것으로 간주됩니다. 먼저 준비된 슬라이드를 랙에 넣고 탈수 및 클리어링에 사용되는 미디어에 각각 5분 동안 역순으로 잠급됩니다. 다음으로 온도 조절 핫 플레이트로 수조를 섭씨 70도까지 가열합니다.

열유발 에피토프 리트리버 버퍼와 10% 글리세롤로 채워진 항아리를 수조에 넣습니다. 버퍼가 섭씨 70도에 도달하면 슬라이드가 있는 랙을 버퍼 항아리에 넣습니다. 슬라이드를 섭씨 70도에서 120분 동안 배양합니다.

그 후, 수조에서 항아리를 제거하고 실온으로 식힙니다. 냉각된 부분을 이온화 된 물로 세 번 헹구고 TBS로 한 번 헹구십시오. 압연 필터 종이 또는 면봉을 사용하여 슬라이드의 섹션 사이에 액체를 조심스럽게 제거하여 섹션을 수화 상태로 둡니다.

그런 다음 소수성 장벽 펜을 사용하여 각 섹션 주위에 장벽을 만듭니다. 특이하지 않은 바인딩을 방지하기 위해 실온에서 버퍼를 차단하는 섹션을 30분 동안 배양합니다. 밀리리터당 1마이크로그램의 농도로 완충을 차단하는 1차 항체를 희석시다.

슬라이드에서 차단 버퍼를 제거하고 희석 된 1 차 항체를 추가하여 건조를 방지하기에 충분한 부피를 사용해야합니다. 촉촉한 용기를 닫고 실온에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 다음 날, 각 세척5 분 지속 TBS와 섹션을 세 번 세척합니다.

버퍼 차단에 이차 항체의 작업 용액을 준비합니다. 이차 항체 용액으로 조직 섹션을 덮고 슬라이드를 습한 용기로 옮습니다. 촉촉한 용기를 밀봉하고 실온에서 1 시간 동안 배양하십시오.

그 후, TBS로 섹션을 세 번, 각 세척이 5 분 동안 지속되는 물에 한 번 세척하십시오. 세척된 부분을 장착 매체로 덮고 거품 형성을 피하면서 커버 글래스를 발라주세요. 마운팅 배지가 고화된 후, 적절한 대역 패스 필터를 사용하여 공초점 현미경 또는 광시야 현미경을 사용하여 면역 불면을 분석합니다.

슬라이드 스캐너를 사용하여 전체 섹션을 디지털화하려면 음수 및 양수 컨트롤을 사용하여 형광 강도를 설정합니다. 호중구 엘라스타제 염색을 사용하여 호중구가 풍부한 영역을 찾아 해당 영역을 확대하여 호중구 엘라스타제 신호가 과립 또는 세포외인지 확인합니다. 신호가 세포외이고 히스톤과 DNA 염색과 겹치는 경우 호중구 세포 외 트랩이 얻어졌습니다.

이 연구에서NET 구성 요소는 인간과 뮤린 기원 모두 파라핀 임베디드 조직에서 성공적으로 검출됩니다. 조직 섹션에 2~3마이크로미터 사이의 두께가 있는 경우 10배 또는 20배 의 목표를 사용하여 광야 현미경 검사법에 의해 분석될 수 있다. 염색을 올바르게 평가하기 위해 음수 및 양성 샘플이 모두 처리되었습니다.

인간 장부염 조직의 대표적인 섹션은 NE, H2B 및 Hoechst 33342에 염색된 조직을 보여줍니다. 왼쪽의 이미지는 NET가 포함된 섹션의 영역에서, 오른쪽이미지는 수많은 호중구를 포함하지만 NET가 없는 동일한 섹션의 다른 영역에서 나온 것입니다. 세 개의 NET 구성 요소가 모두 구불구불한 세포 외 구조에서 자주 공존하기 때문에 거대한 NET 형성이있는 영역은 낮은 배율에서도 쉽게 찾을 수 있습니다.

이는 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 녹색, 빨간색 및 파란색에 대해 긍정적인 중복 신호의 픽셀을 사용하여 보라색 오버레이를 생성하여 정량화할 수 있는 희끄무레한 세포 외 섬유로 세 채널의 오버레이에 나타납니다. 더 높은 해상도의 경우, 공초점 현미경 또는 감소가 있는 광야 현미경은 초점이 벗어난 흐림을 최소화하는 데 사용해야합니다. 동일한 인간 장악염 표본에서 넷이 풍부한 영역의 공초점 스택의 최대 투영은 NE가 과립에서 발견되지만 H2B및 DNA와 공존하는 세포외가 풍부하다는 것을 보여줍니다.

세포 외 공동 지역화는 희끄무레한 색상 조합을 초래합니다. 녹색, 빨간색 및 파란색에 대해 양수 픽셀을 다시 사용하여 NET를 표시하는 보라색 오버레이를 만들 수 있습니다. 마이코박테리움 결핵에 감염된 마우스 폐에서 중앙 단면의 대표적인 세부 사항은 NETs를 나타내는 보라색 층을 만드는 데 사용할 수 있는 호중구 사이의 희끄무레한 영역으로 명확하게 보이는 세 개의 NET 성분의 공동 국화의 또 다른 예를 제공한다.

염색 절차 동안, 이 거짓 양성 얼룩 또는 높은 배경을 일으킬 수 있기 때문에 섹션이 건조 떨어지지 않아야합니다. 보관 된 물질의 분석은 질병에 있는 NET의 충격을 이해하는 것을 도울 수 있습니다. 파라핀 조직은 거대한 배경을 가질 수 있기 때문에 얼룩과 배경을 구별 할 수있는 긍정적이고 부정적인 대조를 갖는 것이 중요합니다.

탈수는 연기 후드 아래에서 수행되어야합니다. 장갑과 실험실 코트를 착용해야합니다.