Name: 포르말린 고정 조직에서 리사바이러스 항원 검출을 위한 면역조직화학 시험 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: 배우세요 포르말린 고정 뇌 조직에서 면역조직화학법을 이용한 광견병 바이러스 항원 검출 방법을. 이 기술은 민감하고 특이적인 진단 도구로 조직 형태학 정보를 함께 제공합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

우리는 질병 통제 및 예방 센터에 견본 제출을 위한 공중 위생 부서와 가진 실험실, 역학자 및 계열사에게 감사합니다. 이 보고서의 사실 인정 그리고 결론은 저자의 그이며 반드시 질병 통제 및 예방 센터의 공식적인 위치를 대표하지 않습니다. 무역 이름과 상업 소스의 사용은 식별을위한 것이며 질병 통제 및 예방 센터의 보증을 의미하지는 않습니다.

IHC 프로토콜은 포르말린 고정 조직에서 수행되었지만, 이 조직이 있는 경우 RABV를 비활성화하는 동안 적절한 생체 안전 프로토콜을 적절히 따라야 합니다. 모든 생물안전 절차는 미생물 및 생물의학 연구소(BMBL) 제5판(https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm)의 생물안전에 설명되어 있으며, 여기에는 적절한 개인 보호 장비(PPE) 착용을 포함한, 그리고12에기술된 바와 같이 예방 접종 요건이 기재되어 있다. 또한, 유해 화학물질(예: 포르말린, AEC 및 자일렌)의 적절한 봉쇄 및 취급(예: 연기 후드)을 따라야 합니다.
1. 조직의 포르말린 고정
<ol><li>24-72 h에 대해 13개의 인산염 완충 포르말린 용액(1:20 ~ 1:50 조직/포르말린 비율)으로13년 후에 수집된 3-5mm 뇌 조직을 놓습니다. 주의: 포르말린은 독성 고정제입니다.</li>
	<li>대략적인 조직 중량 (크기), 조직 모형 (두뇌 영역) 및 포르말린의 양을 기록합니다. 실험실은 고정 시간에 대한 레코드를 문서화하고 유지하는 것이 중요합니다.</li>
	<li>포르말린 고정 후 및 처리 전에 더 긴 조직 저장을 위해, 70% 에탄올에 조직을 놓습니다.</li>
</ol>2. 조직 처리
<ol><li>시편 고정에 따라, 뇌간, 소뇌(3개의 로브) 또는 해마(둘 다 해마)의 교차면과 같은 중요한 뇌 영역을 포함하도록 조직을 해부하여 각각 3~5mm 두께를 절단하고 카세트처리에 배치한다.</li>
	<li>파라핀 왁스 침투를 위한 조직 카세트를 처리하고, 파라핀 블록에 내장되어 미세토메에 단면(3~6μm)을 한다.</li>
</ol>3. 재료 준비 /스테인딩 요리
<ol><li>도 1에 도시된 바와같이 염색접시(14)를 설정한다. 각 접시에 250mL의 용액을 채웁니다.</li>
	<li>3-아미노-9-에틸카르비졸(AEC) 기판 스톡 솔루션 준비<ol>
<li>유리 파이펫을 사용하여 N,N, 디메틸포르마미드의 5mL에 3-아미노 9-에틸카르바졸(AEC)의 20 mg 정제를 용해시키면 된다. 주의: AEC는 발암 물질입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>항원 회수용 프로테아제(예를 들어, Pronase) 스톡 솔루션의 제조<ol>
<li>PBS의 200 mL에서 프로테아제 7 mg을 녹입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>헹구는 버퍼 PBS-T의 준비<ol>
<li>PBS의 Tween 80 ~ 990 mL의 10 mL을 추가합니다. 균일 한 용액을 형성하기 위해 잘 섞는다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 분리및 조직 재수화
<ol><li>마이크로토메를 사용하여 5 μm 파라핀 섹션을 만들고 38 °C의 수조에 띄워 유리 슬라이드에 수집하십시오. 시약 저항 펜/마커로 슬라이드에 레이블을 지정합니다.</li>
	<li>슬라이드를 트레이에 놓고 55-60°C 오븐에서 1시간 동안 녹입니다. 바이러스 항원이 파괴 될 수 있으므로 60 °C 이상의 온도를 올리지 마십시오.</li>
	<li>오븐에서 슬라이드를 제거하고 즉시 3 연속 자일렌 헹구기 에서 5 분 씩 요리 1, 2 및 3에서 분리하십시오.</li>
	<li>에탄올의 희석을 감소시켜 분화하여 슬라이드의 섹션을 재수화: (4~11은 딥 린스) 접시 4: 자일렌/100% 에탄올(1:1); 접시 5: 100% 에탄올; 접시 6: 100% 에탄올; 접시 7: 95% 에탄올; 접시 8: 95% 에탄올; 접시 9: 80% 에탄올; 접시 10: 70% 에탄올; 접시 11: 탈이온된 물(그림 1. 접시 설정). 주의: 자일렌은 유해한 화학 물질이며 연기 후드에서 작업을 수행해야합니다.</li>
</ol>5. 프로테올리틱 항원 회수
<ol><li>프로테아제(PBS의 2.5 μg/mL)로 슬라이드를 30분 간 처리하여 접시(12)에서 프로테오리틱 항원 검색을 위해 30분 간 처리합니다.</li>
	<li>그런 다음 PBS-T에서 10 분 동안 헹구습니다 (접시 13).</li>
	<li>과산화수소 3%를 10분 동안 치료합니다(접시 14).</li>
	<li>다시, 10 분 PBS-T로 씻어 (접시 15).</li>
</ol>6. 염색 절차
<ol><li>핸들은 버퍼에 잠긴 나머지 슬라이드를 한 번에 하나씩 슬라이드합니다(전체 슬라이드 홀더를 제거하지 않음 - 슬라이드를 젖은 상태로 유지). 하나의 슬라이드를 제거하고 조직 섹션을 방해하지 않도록주의하는 조직 섹션에서 (종이 타월을 사용하여) 여분의 버퍼 (종이 타월사용)를 제거합니다. 습한 종이 타월을 실온에서14번 실험실 벤치 탑에 15분 동안 일반 염소 세럼(차단)에 배치하여 만든 습도 챔버에서 인큐베이션 슬라이드가 슬라이드됩니다.</li>
	<li>최적의 미리 결정된 희석 제1항광견 항체(마우스 항광견혈청의 1:250 희석, 미공개) 및 음수 대조군 항체를 위와 같은 실온(단계 6.1.)으로 60분 동안 배양하여 그 사이에 세척없이 배양한다.</li>
	<li>60분 후 PBS-T로 10분 간 씻으시면(16분).</li>
	<li>15분 동안 실온에서 습도 챔버에서 생체개화 항체(종 별)를 배양한다(6.1단계와 동일하게 취급).</li>
	<li>PBS-T로 10분 간 씻으시면(접시 16분).</li>
	<li>15분 동안 실온에서 습도 챔버에 스트렙타비딘-HRP 복합체와 함께 배양한다(6.1.와 동일).</li>
	<li>PBS-T로 10분 간 씻으시면(접시 16분).</li>
	<li>퍼록시다아제 기판, 아미노 에틸카르바졸(AEC)으로 10분 동안 실온에서 습도 챔버에 배양한다. 사용하기 직전에 AEC를 만드십시오. 이렇게 하려면 0.1M 아세테이트 버퍼, pH 5.2의 14mL에 AEC 스톡 솔루션 1mL을 추가합니다. 3 % H 2 O2의0.15 mL을추가하십시오. 사용하기 직전에 혼합물을 필터링하십시오(0.45 μm 필터). 참고: AEC의 작업 솔루션은 2-3h에 대해서만 안정적입니다. AEC 스톡 솔루션은 장기간 냉장고에 보관할 수 있습니다.</li>
	<li>탈이온수로 10분 세척(17접시)</li>
	<li>길의 헤마톡클린과 함께 1:2를 희석시켰고, 2분 동안 탈온화된 물로 희석(접시 18).</li>
	<li>여분의 헤마톡슬린을 탈온화된 물 딥 린스(접시 19및 20)로 헹구세요.</li>
	<li>스콧의 수돗물 30 s (블러잉 용액) 접시 21에서 헹구는.</li>
	<li>탈이온수로 세척 10분(접시 22)</li>
	<li>슬라이드를 한 번에 하나씩 제거 - 수용성 장착 매체마운트.</li>
	<li>가벼운 현미경에서 슬라이드를 읽으십시오.</li>
</ol>

<ol><li>Rupprecht, C., Kuzmin, I., Meslin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lyssaviruses+and+rabies%3A+current+conundrums%2C+concerns%2C+contradictions+and+controversies%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Lyssaviruses and rabies: current conundrums, concerns, contradictions and controversies.</a> F1000Research. 6, 184(2017).</li>
<li>Fooks, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+of+rabies+and+prospects+for+elimination%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Current status of rabies and prospects for elimination.</a> Lancet. 384 (9951), 1389-1399 (2014).</li>
<li>Finke, S., Brzozka, K., Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+fluorescence-labeled+rabies+virus%3A+enhanced+green+fluorescent+protein-tagged+phosphoprotein+P+supports+virus+gene+expression+and+formation+of+infectious+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Tracking fluorescence-labeled rabies virus: enhanced green fluorescent protein-tagged phosphoprotein P supports virus gene expression and formation of infectious particles.</a> Journal of Virology. 78 (22), 12333-12343 (2004).</li>
<li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WHO+Expert+Consulation+on+Rabies%2C+Third+Report%5BTitle%5D)+AND+%22WHO+Technical+Report+Series%22%5BJournal%5D)">WHO Expert Consulation on Rabies, Third Report.</a> WHO Technical Report Series. 1012, 1(2018).</li>
<li>Goldwasser, R. A., Kissling, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+antibody+staining+of+street+and+fixed+rabies+virus+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Society+for+Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Fluorescent antibody staining of street and fixed rabies virus antigens.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 98 (2), 219-223 (1958).</li>
<li>Lembo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+direct%2C+rapid+immunohistochemical+test+for+rabies+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a direct, rapid immunohistochemical test for rabies diagnosis.</a> Emerging Infectious Diseases. 12 (2), 310-313 (2006).</li>
<li>Fekadu, M., Greer, P. W., Chandler, F. W., Sanderlin, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+avidin-biotin+peroxidase+system+to+detect+rabies+antigen+in+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Use of the avidin-biotin peroxidase system to detect rabies antigen in formalin-fixed paraffin-embedded tissues.</a> Journal of Virological Methods. 19 (2), 91-96 (1988).</li>
<li>Hamir, A. N., Moser, G., Rupprecht, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+five+year+%281985-1989%29+retrospective+study+of+equine+neurological+diseases+with+special+reference+to+rabies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Pathology%22%5BJournal%5D)">A five year (1985-1989) retrospective study of equine neurological diseases with special reference to rabies.</a> Journal of Comparative Pathology. 106 (4), 411-421 (1992).</li>
<li>Inoue, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-reactive+antigenicity+of+nucleoproteins+of+lyssaviruses+recognized+by+a+monospecific+antirabies+virus+nucleoprotein+antiserum+on+paraffin+sections+of+formalin-fixed+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Pathology+International%22%5BJournal%5D)">Cross-reactive antigenicity of nucleoproteins of lyssaviruses recognized by a monospecific antirabies virus nucleoprotein antiserum on paraffin sections of formalin-fixed tissues.</a> Pathology International. 53 (8), 525-533 (2003).</li>
<li>Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+prolonged+formalin+fixation+on+diagnostic+immunohistochemistry+in+domestic+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).</li>
<li>Feiden, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+staining+of+rabies+virus+antigen+with+monoclonal+and+polyclonal+antibodies+in+paraffin+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Zentralblatt+fur+Veterinarmedizin+Reihe+B%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical staining of rabies virus antigen with monoclonal and polyclonal antibodies in paraffin tissue sections.</a> Zentralblatt fur Veterinarmedizin Reihe B. 35 (4), 247-255 (1988).</li>
<li>Manning, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+rabies+prevention--United+States%2C+2008%3A+recommendations+of+the+Advisory+Committee+on+Immunization+Practices%5BTitle%5D)+AND+%22Morbidity+and+Mortality+Weekly+Reports+Recommendations+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Human rabies prevention--United States, 2008: recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices.</a> Morbidity and Mortality Weekly Reports Recommendations and Reports. 57, 1-28 (2008).</li>
<li>WHO. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Laboratory+techniques+in+rabies%22">Laboratory techniques in rabies</a>. 1, 5th ed, 67-72 (2018).</li>
<li>Patrick, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Rabies+Surveillance+Using+a+Direct+Rapid+Immunohistochemical+Test%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test.</a> Journal of Visualized Experiments. (146), (2019).</li>
<li>Whitfield, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+the+fluorescent+antibody+test+for+rabies+diagnosis+in+fresh+and+formalin-fixed+brain+tissue+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology+Methods%22%5BJournal%5D)">A comparative study of the fluorescent antibody test for rabies diagnosis in fresh and formalin-fixed brain tissue specimens.</a> Journal of Virology Methods. 95 (1-2), 145-151 (2001).</li>
<li>WHO. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Diagnostic+procedures+for+antigen+detection%22">Diagnostic procedures for antigen detection</a>. , https://www.who.int/rabies/about/antigendetection/en (2016).</li>
<li>Jarvis, J. A., Franke, M. A., Davis, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rabies+direct+fluorescent+antibody+test+does+not+inactivate+rabies+or+eastern+equine+encephalitis+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology+Methods%22%5BJournal%5D)">Rabies direct fluorescent antibody test does not inactivate rabies or eastern equine encephalitis viruses.</a> Journal of Virology Methods. 234, 52-53 (2016).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

증상 발병 후 광견병의 높은 사망률로 인해 RABV 감염에 대한 의심스러운 동물의 진단은 적절한 노출 후 예방 치료에 매우 중요합니다. 광견병 진단은 주로 신선하거나 냉동 된 조직을 사용하여 DFA, DRIT 및 PCR 기반 기술에 달려 있습니다. 포르말린 고정 조직의 테스트를 위해 IHC 검사는 RABV 항원의 민감하고 특정 검출을 위한 대체 방법을 제공합니다. 포르말린에 고정된 조직은 교차 연결같이 측사슬의 변형때문에 단백질이 안정되어 있는 동안, 견본은 항원 검출의 앞에 처리될 필요가 있습니다. 본 프로토콜에서, 에피토프는 RNP 복합체에 대한 1차 항체의 결합을 가능하게 하기 위해 프로테아제(예를 들어, Pronase)에 의한 부분적인 프로테오리틱 소화를 통해 회수되었다. N 단백질에 대한 mAbs 반응성이 주로 DFA 및 DRIT에 의존하지만, N 단백질에 대한 여러 전형체에 반응하는 pAbs는 IHC 테스트에 선호될 것입니다. 또한, 반응성 또는 pAbs는 mAbs에 비해 다른 RABV 변이체 및 비 광견병 리사바이러...

광견병은 속 리사바이러스1에속하는 부정적인 감각 RNA 바이러스에 의해 유발되는 급성 진행성 뇌염이다. 광견병 바이러스 (RABV)로 인한 모든 인간 사망의 거의 99 %는 개2에의해 전달됩니다. 의심되는 동물의 광견병 진단은 뇌 조직3에서게놈 RNA (리보뉴클레오 단백질 복합체, RNP)와 복합체에서 항원 (주로 바이러스 인코딩 뉴클레오 단백질, N 단백질)의 검출에 의존한다. 직접 형광 항체(DFA) 시험에 의한 항원 검출은 광견병 진단4에대한 금본위제로 간주된다. 이 방법은 신선하거나 신선한 냉동 뇌 물질, 슬라이드에 터치 인상, 아세톤에 고정, 시판되는 형광 이소티오카네이트(FITC)를 사용하여 염색하고 단클론 또는 폴리클론 항체(mAbs/pAbs)로 표시하고 형광 현미경검사법 5에의해 읽습니다. DFA 시험은 신선한 두뇌 조직에서 광견병 항원 검출을 위해 급속하고, 민감하고, 특정합니다. 최근에는 직접 신속한 면역조직화학시험(DRIT), 수정된 면역조직화학(IHC) 기술이 DFA와 유사한 민감성을 나타내고 있음을 입증했지만, 시각화를 위한 광현미경검사의 장점을6. DRIT에서 사용되는 검출 방법은 IHC와 유사하지만 초기 단계는 신선하거나 냉동된 조직을 사용하여 시료의 터치 노출을 생성한 다음 포르말린에 고정됩니다.
IHC는 파라핀 블록에 내장된 포르말린 고정 조직에서 특정 항체를 사용하여 단백질의 조직학적 변화 및 검출을 결정하는 데 널리 사용되는 기술이다. IHC는 조직 섹션7에서광견병 항원 검출을 위한 확립된 대체 시험이다. IHC는광견병8의 부담을 결정하기 위해 신경질환을 전시한 회고적 사례의 진단을 위해 특히 활용되고 있다. 파라핀-임베디드 포멀린 고정 조직은 주변 온도9에저장될 때 몇 년 후에도 검출을 위한 단백질을 보존한다. 포르말린 치료는 아미노산 측면 사슬을 교차 연결하고 변경하여 단백질을 수정하여, 이는 에피토프가 항체에 대해 더 이상 반응하지 않을 수있습니다(10). 광견병 항원 검출을 위한 IHC 시험은 mAbs 또는 pAbs를 포함하지만, 후자는 다중 에피토프및 발산 리사바이러스가11을검출할 수 있기 때문에 유리하다.
IHC에 관여하는 표준 단계는 조직의 포르말린 고정, 파라핀 블록에 포함, 조직의 단면화, 분리 및 수분 공급, 에피토프 복구, 1 차 및 이차 항체에 대한 반응성, 및 염색체 기판을 사용하여 개발. 이 원고는 광견병 진단을위한 프로토콜의 상세한 설명을 설명합니다. 광견병 항원 검출의 경우, 미국 질병통제예방센터(CDC)에서 생성된 RABV(pAbs)로 면역화된 마우스 혈청이 생물신생 항마우스 이차 항체와 함께 활용된다. 생물요닉 복근은 스트렙타비딘-고추냉이 과로시다제(HRP) 복합체의 첨가에 의해 검출되고, 아미노 에틸카르바졸 기판으로 색이 발달한다.

<table><tbody><tr><td>3% 과산화수소</td><td>Pharamacy 브랜드</td><td></td><td>기성품 3% H2O2</td></tr><tr><td>3-아미노-9-에틸카르바졸(AEC)</td><td>Millipore Sigma</td><td>A6926</td><td></td></tr><tr><td>아세테이트 버퍼 pH 5.2</td><td>Poly Scientific R& D 주식회사</td><td>s140</td><td></td></tr><tr><td>완충 포르말린 10% 인산염 완충</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF100-4</td><td>인증</td></tr><tr><td>커버 슬립 Corning</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-553-471</td><td>24 X 50mm</td></tr><tr><td>에탄올 190 Proof</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>111000190</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 200 Proof</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Gill의 헤마톡실린 제형 #2</td><td>Fisher Scientific</td><td>CS401-1D</td><td></td></tr><tr><td>HistoMark Biotin-Streptavidin Peroxidase Kit</td><td>seracare</td><td>71-00-18</td><td>마우스 기본 항체&nbsp;</td></tr><tr><td>ImmunoHistoMount</td><td>Millipore Sigma</td><td>i1161</td><td>마운팅 미디어</td></tr><tr><td>N,N, 디메틸 포름아미드 GR</td><td>Fisher Scientific</td><td>D119</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수&nbsp;</td><td>HyClone</td><td>RR14440.01</td><td>01M, pH 7.2 (pH 7.2-7.6)</td></tr><tr><td>Plan-APOCHROMAT 40X/0.95 목표</td><td>다중 공급업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan-APOCHROMATIC 20X/0.75 목표</td><td>다중 공급업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Millipore Sigma</td><td>53702</td><td>Protease, Streptomyces griseus</td></tr><tr><td>Scott's Tap Water&nbsp;</td><td>폴리 사이언티픽 R& D 주식회사</td><td>s1887</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek 슬라이드 스테인 세트</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-294-72</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN-80&nbsp;</td><td>Millipore Sigma</td><td>P1754</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Fisher Scientific</td><td>X3S-4</td><td>조직학 등급</td></tr><tr><td>Zeiss Axioplan 2 이미징 - 현미경</td><td>여러 공급업체</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

포르말린 고정 조직에서 리사바이러스 항원 검출을 위한 면역조직화학 시험

Immunohistochemistry Test for the Lyssavirus Antigen Detection from Formalin-Fixed Tissues

광견병에 대한 1 차적인 진단 양식의 한은 감염된 조직 견본에 있는 바이러스성 리보뉴클레오단백질 (RNP) 복합체 (항원)의 검출입니다. 직접 형광 항체(DFA) 테스트 또는 직접적인 신속한 면역 조직화학 시험(DRIT)이 항원 검출에 가장 일반적으로 활용되지만, 두 검사 모두 항체를 사용하여 항원 검출 전에 슬라이드에 대한 노출을 위해 신선 및/또는 냉동 조직을 필요로 한다. 시료를 포름포민에서 채취및 고정하는 경우, 어느 테스트도 항원 검출에 최적이지만, 파라핀 블록 및 단면에 포함된 후 종래의 면역히토화학(IHC)에 의해 시험을 수행할 수 있다. 이 IHC 방법을 사용하면 조직은 항 광견병 항체로 염색되고, 섹션은 탈파화되고, 부분 적인 proteolysis 또는 그밖 방법에 의해 회수된 항원, 및 1 차 및 이차 항체로 배양됩니다. 항원은 고추냉이 과록시다제/아미노 에틸 카르바졸을 사용하여 염색되고 가벼운 현미경을 사용하여 시각화를 위해 헤마톡슬린으로 대응한다. 특정 항원 검출 외에도 포르말린 고정은 조직학적 변화의 결정, 표본 저장 및 운송을 위한 완화된 조건(주변 온도 미만), 회고적 사례를 테스트하는 능력 및 전염성 제의 불활성화를 통한 생물학적 안전 성 향상과 같은 다른 이점을 제공합니다.

도 2는 테스트된 다른 뇌 조직에서 양성 및 부정적인 대조샘플의 대표적인 IHC 염색 결과를 보여줍니다. 그림 2A,D, G는 200x에서 양수 샘플을 나타내고, 그림 2B, E, H는 각각 400배율에 해당한다. 도 2A-C는 뇌간에 해당; 도 2D-F는 소뇌 및 푸르킨제 세포에 해당; 도 2G-I는 해마에 해당합니다. 그림 2C, F,...

여기서, 우리는 조혈 고정 조직을 위한 대체 진단 시험으로서 광견병 바이러스 항원 검출을 위한 면역조직화학 시험 프로토콜을 제시한다.

One of the primary diagnostic modalities for rabies is the detection of viral ribonucleoprotein (RNP) complex (antigen) in the infected tissue samples. ...

면역 조직 화학 및 진단 조직 병리학에 사용되는 조직은 10 %인산염 완충체 포르말린에서 일상적으로 고정됩니다. 포르말린에 고정된 뇌 조직에서 광견병 바이러스 항원 검출은 독특한 도전을 제시하며, IHC 검사는 광견병 바이러스 항원 검출을 위한 민감하고 구체적인 방법인 것으로 밝혀졌다. 생검 또는 다른 검출 방법의 주요 장점은 항원조직 및 세포 형태학과 관련하여 검출될 수 있다는 것입니다.IHC를 사용하면 뇌 및 비 뇌 조직에서 광견병 항원을 국소화하여 일상적인 Hematoxylin 및 Eosin 얼룩 섹션을 통해 얻을 수 없는 추가 정보를 제공합니다. 광견병 진단 테스트는 광견병 바이러스에 노출된 인간에서 노출 후 예방을 개시하는 데 중요합니다. IHC는 포르말린 고정 조직에 대한 가장 일반적으로 수행되는 에세이 중 하나입니다.특정 항체를 사용하면, 각각의 병원체의 검출을 위해 사용될 수 있다. 이 절차를 시작하려면, 뇌 조직의 3 ~ 5 밀리미터 조각을 배치, 부검 후 수집, 에 10% 버퍼링 포르말린 용액에 24 받는 시간 72 시간. 대략적인 조직 중량, 조직 모형 및 포르말린의 부피를 기록합니다.조직을 70%에 탄올에 배치하여 포식포닌 고정 후, 그리고 처리 전에 더 긴 조직 저장을 위해 배치합니다. 표본 고정에 따라, 뇌간, 소뇌, 또는 해마의 단면과 같은 중요한 뇌 영역을 포함하도록 조직을 해부한다. 각각 3~5밀리미터 의 두께로 자른다.조직을 카세트 처리에 넣습니다. 파라핀 왁스 침투를 위한 조직 카세트를 처리합니다. 파라핀 블록에 포함시키고 마이크로톤에 적어 두었습니다.먼저 텍스트 프로토콜의 그림 1에 설명된 대로 염색 접시를 설정합니다. 각 접시에 준비된 용액250밀리리터를 채웁니다. AEC 기판 스톡 솔루션을 준비하려면 유리 파이펫을 사용하여 N- N-Dimethylformamide의 5 밀리리터에 AEC의 20 밀리그램 정제를 용해하십시오.프로테아제스 스톡 솔루션을 준비하려면 PBS의 200 밀리리터에 프로테아제 7 밀리그램을 녹입니다. 헹구는 버퍼를 준비하려면 PBS의 80~990밀리리터의 100밀리리터를 추가하고 잘 섞어 PBT-T의 균일한 용액을 형성합니다. 마이크로토메를 사용하여 5마이크로미터 파라핀 섹션을 만듭니다.섭씨 38도의 수조에 있는 섹션을 적재하고 유리 슬라이드에 수집합니다. 슬라이드에 시약 방지 펜으로 레이블을 지정합니다. 슬라이드를 트레이에 놓고 오븐에서 섭씨 55~60도에서 1시간 동안 녹입니다.그런 다음 오븐에서 슬라이드를 제거하고 즉시 5 분의 3 연속 자일렌 헹구를 사용하여 즉시 분리합니다. 그 후 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 에탄올 희석을 감소시켜 탈온화된 물에 순차적으로 침수하여 슬라이드의 섹션을 다시 수분화합니다. 프로테아제프로 슬라이드를 프로테아제프로 30분 간 치료한 다음 PBS-T에서 슬라이드를 10분 간 헹구고 과산화수산화수소를 10분 동안 3%로 처리합니다.그 후 PBS-T로 슬라이드를 10분 동안 다시 세척합니다. 시작하려면 버퍼에서 슬라이드 를 하나씩 제거하고 한 번에 하나의 슬라이드만 처리하고 다른 슬라이드는 침수 상태로 유지되고 종이 타월을 사용하여 조직 섹션 주위에서 과도한 버퍼를 제거합니다. 슬라이드를 습도 챔버에 넣고 실온에서 일반 염소 세럼으로 15 분 동안 배양하십시오.다음으로, 습도 챔버내의 슬라이드를 최적의 소정의 희석 1차 항광견 항체및 음수 대조항체로 60분 동안 실온에서 배양하여 그 사이에 세척없이 배양한다. 그 후, PBS-T로 슬라이드를 10분 간 세척하고 실온에서 생체화 항체를 15분 동안 습도 챔버에서 배양한다. PBS-T로 슬라이드를 10분 동안 다시 씻으십시오.슬라이드와 습도 챔버를 실온에서 스트립 분할 및 HRB 복합체로 15분 동안 배양하고 PBS-T를 10분 동안 세척합니다. 그런 다음 실온에서 습도 챔버에서 AEC로 10 분 동안 배양하십시오. 슬라이드를 10분 동안 씻어내고 길의 헤마토시린으로 카운터스테인을 사용하여 2분 동안 탈온화된 물로 1-2를 희석시합니다.그 후, 탈이온화된 물에 미끄럼틀을 헹구어 과도한 헤마톡시린을 헹구십시오. 스콧의 수돗물에서 슬라이드를 30초 간 헹구고 탈온화된 물로 10분간 씻어내십시오. 슬라이드를 한 번에 하나씩 제거하고 수용성 장착 매체로 장착합니다.그런 다음 가벼운 현미경을 사용하여 슬라이드를 읽습니다. 이 연구에서는, 면역 세포 화학 시험은 포르말린 고정 조직을 위한 대체 진단 시험으로 광견병 바이러스 항원의 검출을 위해 입증됩니다. 다른 뇌 조직에서 양성 및 부정적인 대조 샘플의 대표적인 면역 세포 화학 염색 결과는 뇌간, 소뇌 및 purkinje 세포 및 해마를 포함하여 여기에 표시됩니다.청색 반염색 배경에 대한 AEC 기판을 사용하여 색 개발을 나타내는 마젠타 적색 염색은 광견병 항원에 대한 항체의 반응성 때문입니다. 면역조직화학의 양성 결과는 조직 단면도에서 자젠타 적색 염색에 해당한다. 세포질 포함 및 다양한 크기의 세분화 된 포함의 염색은 RABV 감염에 대해 긍정적 인 샘플을 나타냅니다.헤마톡슬린으로 인해 특정 적색 염색이나 파란색 배경만 관찰되지 않은 경우 시료는 부정적으로 간주됩니다. 양성 염색 이외에, 포함물의 분포는 조직 견본의 바이러스성 하중에 대응할 수 있는 견본에 있는 광견병 항원의 수준의 간접적인 정량화를 제공할 수 있었습니다. 분포 수준에 관계없이, 임의의 특정 염색은 RABV 항원 검출을 위한 양성으로 견본을 분류할 것입니다.조직은 포르말린에 적절하게 고정되어야하며,이 과정에서 조직을 동결하지 마십시오. 광견병 항원은 IHC에 의해 검출되고, 그 때 분자 기술은 RNA 서열 정보에 근거를 둔 Lyssavirus 이체를 결정하기 위하여 파라핀 단면도에서 수행될 수 있다. 자일렌과 포르말린과 같은 시약은 연기 후드에서 처리해야합니다.발암 물질이기 때문에 AEC를 취급하는 동안 주의해야 합니다.

immunohistochemistry-test-for-lyssavirus-antigen-detection-from

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

현장 tetramer의 얼룩과 현장 하이브리드화 (ISTH)의 결합 기술은 시각화, 매핑 및 분석들은 바이러스에 감염된 대상으로 바이러스에 특정한 CD8 + T 세포의 공간적 근접의 이러한 면역 effectors와 대상 사이의 양적 관계의 결정을 가능하게 감염 결과 수 있습니다.

동시에 바이러스 특정 CD8 + T 세포 바이러스에 감염된 세포를 시각화하는 기술 현장에서</em

이 비디오는 감염된 쥐의 뇌 조직에서 광견병 바이러스 항원 검출을 위한 면역조직화학 염색을 보여줍니다. 이 과정에는 탈파라핀화(deparaffinization) 및 알코올 처리(alcohol treatment)가 포함되며, 항원 접근성을 높이기 위한 단백질 분해 처리(proteolytic treatment)가 이어집니다. 면역조직화학 염색을 통해 붉은 침전물이 나타나 조직 단면에 광견병 항원이 존재함을 확인합니다.

광견병 바이러스 항원 검출을 위한 면역조직화학 염색

여기에서는 포르말린 고정, 파라핀 포매 쥐 중추신경계(CNS) 및 말초 림프절(LN) 조직 절편에서 이중 면역 염색을 위한 최적화되고 상세한 프로토콜을 제시합니다.

쥐 중추 신경계에서 면역 조직 화학 분석 및 주변 림프절 조직 섹션

우리는 동물 모델의 조직 섹션 내의 영속 DNA 바이러스 게놈의 검출을 위해 현장 하이브리드 프로토콜에 형광등을 설치했다. 이 프로토콜은 바이러스 게놈의 codetection, 자사의 RNA 제품, 단일 세포 내에서 바이러스 또는 세포 단백질에 의해 감염 과정을 연구 할 수 있습니다.

형광에 의한 신경 조직의 영구 DNA 바이러스의 게놈 및 성적 증명서의 검출 현장에서 하이브리드 면역 염색과 결합

용매 정리 된 장기의 궁극적 인 3D 이미징과 같은 새로운 면역 염색 호환 조직 지우기 기술은 광견병 바이러스 뇌 감염및 복잡한 세포 환경의 3D 시각화를 허용합니다. 두꺼운 항체 표지 된 뇌 조직 조각은 이미징 깊이를 높이고 공초점 레이저 스캐닝 현미경으로 3D 분석을 가능하게하기 위해 광학적으로 투명하게 만들어집니다.

용매 클리어 뇌 조직에서 광견병 바이러스 감염의 고해상도 3D 이미징

이 프로토콜은 대만의 박쥐에서 lyssavirus 항원의 진단 테스트를위한 표준 실험실 운영 절차를 소개합니다.

대만 박쥐 인구의 Lyssavirus 감시를위한 표준 운영 절차

dsDNA 인터칼레이팅 염료를 사용하는 이러한 실시간 RT-PCR은 리사바이러스 감염을 진단하는 데 적합합니다. 이 방법은 광견병에서 추출한 RNA로 시작하여 영양분 또는 사후 샘플로 의심되는 데, 마스터 믹스 준비, RNA 추가, 실시간 기계 설정 및 결과의 정확한 해석을 자세히 설명합니다.

광견병 진단을 위한 팬-리사바이러스 실시간 RT-PCR

우리는 뇌 생검 샘플링에서 최종 해석에 이르기까지 신속한 면역 크로마토그래피 진단 테스트 (RIDT)를 사용하여 필드 조건하에서 동물 광견병의 사후 진단을위한 완전한 프로토콜을 제시합니다. 우리는 또한 분자 분석 및 바이러스 성 지노티핑을 위한 장치를 사용하여 추가 응용을 설명합니다.

추가 분자 응용을 가진 자원 제한 적인 설정을 위한 필드 사후 광견병 급속한 면역학로토그래피 진단 시험

우리는 냉동 된 조직에 다중 스펙트럼 이미징을 수행하는 빠른 염색 방법을 설명합니다.

냉동 조직 섹션의 다스펙트럼 형광 이미징을위한 신속한 방법

이 프로토콜은 조직 채취에서 결과 해석에 이르기까지 pan-lyssavirus LN34 real-time reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR) 분석을 보여주며, 여기에는 일부 비광견병 lyssavirus 및 lagomorphs에 대한 분석 성능을 개선하기 위한 프라이머 염기서열 및 제형 업데이트가 포함됩니다. 또한 단일 웰 LN34 다중화(LN34M) 형식에 대한 분석 설정을 시연합니다.

업데이트된 멀티플렉스 LN34 Real-Time 역전사-중합효소 연쇄 반응 분석을 통한 동물 광견병의 사후 진단

이 프로토콜은 마이크로RNA와 다중화된 단백질을 동시에 검출하고 정량화하기 위해 포르말린 고정 파라핀 포매 조직을 사용한 탠덤 면역형광 혼성화 분석을 설명합니다.

새로운 검출 및 정량화 방법으로서의 Locked-nucleic-acid In situ Hybridization을 통한 MicroRNA 증폭 및 인식

배우세요 포르말린 고정 뇌 조직에서 면역조직화학법을 이용한 광견병 바이러스 항원 검출 방법을. 이 기술은 민감하고 특이적인 진단 도구로 조직 형태학 정보를 함께 제공합니다.

포르말린 고정 조직에서 리사바이러스 항원 검출을 위한 면역조직화학 시험

더 많은 동영상 탐색