Name: 무혈 식단으로 무혈 모기를 후두 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: 배우세요 Anopheles 모기를 무혈 인공 식단으로 사육하는 방법을. 이 기술은 산란과 난자 성숙을 지원하며 윤리적 제약을 해결하고 말라리아 연구를 혁신합니다.

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우리는 아노라 로페스 (IHMT-NOVA 동물 시설) 기술 지원에 감사드립니다, 조아나 고메스와 아나 카타리나 알베스 (IHMT-NOVA 곤충 시설) 아노헬레스 모기 식민지를 유지. 빌과 멜린다 게이츠 재단 (OPP1138841), Fundação 파라 Ciência e Tecnologia (UID / 멀티 / 04413/201, UID / 멀티 / 04326 / 2013, SFRH / BPD / 89811/2012, CEECIND/2012).

마우스는 IHMT 동물 집에서 수득하였다. 동물 실험은 포르투갈 법과 실험실 동물의 사용에 대한 지침에 따라 엄격하게 수행되었다. 디레카오-제랄 드 베테리나리아, 미니스테리오 다 아그리큘라 두 데센볼비멘토 농촌 e 다스 페스카스, 포르투갈은 모든 연구 프로토콜을 승인했다 (ID 승인: 023351 및 023355).
참고: 모든 수유 검사를 ~26°C에서 수행합니다.
1. 모기
<ol><li>26 °C에서 Anopheles coluzzii (전 Anopheles 감비아 M 형태) Yaoundé 균주 모기를 유지, 75% 습도 12 h:12 h빛에서: 어두운 주기. 결합을 보장하기 위해 표준 곤충 조건을 사용하여 모기를 집.</li>
	<li>작은 물 용기에 모기 새끼를 수집합니다. 어른 모기가 나타나고 짝짓기를 할 수 있도록 모기 장 안에 용기를 놓습니다. 10% 포도당 공급 용액을 제공합니다. 출현 3 일 후 흡입구를 사용하여 재고 케이지에서 필요한 수의 모기를 수집합니다.</li>
	<li>수유 시험 하루 전에 10 % 포도당 공급 용액을 제거하십시오. 참고: 실험 기간 내내 3일된 모기를 사용하였다.</li>
</ol>2. 모기 먹이주기
<ol><li>인공 액체 다이어트의 준비<ol>
<li>층류 캐비닛에서 멸균 조건하에서 인공 액체 식단을 준비하십시오. 초기 액체 식단(i-liq_diet에 다음을 첨가하여 풍부한 액상 식단(r-liq_diet)을 준비한다. 덜베코의 수정된 독수리 배지 [L-글루타민을 가진 높은 포도당], 표 1참조: 0.55 g/L ATP, 1 g/L 콜레스테롤, 그리고 200 g/L 소 혈 청 알부민 (BSA). 모든 재료를 철저히 혼합하고 0.45 μm 마이크로 필터를 사용하여 여과하십시오. 참고 : 다이어트를 저장하지 마십시오; 그들은 저장 될 때 품질을 잃게로 각 실험에 대한 재고 솔루션에서 갓 다이어트를 준비합니다. 식단의 구성 요소는 표 1에기재되어 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>마우스 혈액 수집<ol>
<li>6-8주된 CD1 암컷마우스(근육근육)를케타민(120 mg/kg)과 자일라진(16 mg/kg)으로 자궁내 경로를 사용하여 마취시다.</li>
		<li>마우스가 상이한 물리적 자극(예를 들어, 발가락 및 꼬리 핀치)에 반응하여 근육 반응을 보이지 않는 경우 심장펑크(그림 1)를수행한다.</li>
		<li>혈전 형성을 방지하기 위해 1mg/mL 헤파린(나트륨 염)의 100 μL을 함유한 27G x 1/2°C(0.4 x 12 mm2)바늘로 멸균 된 1 mL 주사기를 사용하여 혈액을 수집하십시오. 수조를 사용하여 37 °C에서 혈액을 유지하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>인공 수유<ol>
<li>흡입기를 사용하여 스톡 케이지에서 약 30마리의 암컷 모기를 수집합니다.</li>
		<li>암컷 모기를 500 mL 종이 컵에 옮기고 탈출할 수 없도록 미세한 모기장 그물망으로 덮습니다. 플라스틱 튜브에 연결된 유리 피더를 적용하여 각 컵의 상단으로 일정한 물 흐름을 유지합니다(그림2). 원통형 튜브 및 피더에 일정한 물 흐름을 제공하여 내부 온도가 약 37.5 °C로 유지되도록 합니다. 참고: 표준 유리벨 인공 수유장치(16)를 사용하여 여성 모기에 제형식이 공급되었다.</li>
		<li>파라핀 막막을 유리 피더의 입에 걸쳐 스트레칭하여 식사를 포함시킵니다.</li>
		<li>수조를 사용하여 37°C에서 i-liq_diet r-liq_diet 미리 데운다. 유리 공급에 1 mL를 바하십시오. i-liq_diet, r-liq_diet 또는 신선한 마우스 혈액으로 어둠 속에서 모기를 60 분 동안 먹이세요. 26 °C에서 검사를 수행합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>공급 속도의 평가.<ol>
<li>인공 수유 후, 30 초에 -20 °C에서 모기를 마취.</li>
		<li>완전히 격분한 암컷 모기의 수를 기록한다(그림3) 참고 : 먹이 모기의 비율은 먹이 성공을위한 프록시로 사용됩니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 삶의 역사 특성
<ol><li>계란 생산 및 불 임<ol>
<li>브러시를 사용하여 완전히 응축된 암컷을 개별 케이지(20cm x 20cm x 20cm)로 옮김을 옮니다.</li>
		<li>모기를 26 ± 1 °C, 75 % 습도 및 12 h : 12 h : 12 h 의 빛 : 10 % 포도당 광고 리비텀이있는 어두운 주기로 유지하십시오.</li>
		<li>수유 후 48시간, 가습 된 여과지를 달걀 누워서 바닥에 추가합니다(그림 4). 핸드헬드 돋보기를 사용하여 계란 누워 종이를 추가 한 후 48 시간 및 72 시간에서 계란을 계산합니다. 계란을 수집하기 위해 증류수로 필터 종이를 홍수.</li>
	</ol>
</li>
	<li>유충 사망률<ol>
<li>계란을 증류수로 채워진 쟁반(23cm x 15cm x 6cm)에 넣습니다(그림5). 실험 중에 트레이의 수위를 일정하게 유지합니다.</li>
		<li>트레이 당 약 13 mg의 생선 사료로 매일 애벌레에게 먹이주세요. 모든 복제 트레이에 유사한 공급 체제를 적용합니다.</li>
		<li>죽은 번데기와 애벌레를 매일 제거하십시오. 모든 번데어가 성인으로 발전했을 때 실험을 마무리하고 성인 남성과 여성의 수를 계산합니다.</li>
		<li>해칭 및 사망 날짜를 등록하고 사망률을 계산합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>근속 기간<ol>
<li>각 다이어트 그룹의 F1 세대에서 성인 남성 15명과 성인 여성 15명 수컷과 암컷을 같은 케이지에 보관하십시오.</li>
		<li>성인에게 10% 포도당 용액 광고 리비텀을 먹이게 하십시오. 죽은 성인을 매일 제거하십시오.</li>
		<li>위에서 설명한 것과 동일한 온도, 습도, 광순환 조건 및 설탕 공급 체제에서 모기를 유지합니다.</li>
		<li>사망 날짜를 등록하고 수명을 계산합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>날개 길이 측정<ol>
<li>감기-마취 5 일 된 F1 성인 모기 (남성과 여성) 각 다이어트 그룹에서 -20 °C에서 90 s.</li>
		<li>스테레오스코프 아래에서, 집게로 각 모기의 흉부들을 부드럽게 잡고 복부 쪽을 위로 놓습니다.</li>
		<li>메스를 사용하여 두 날개를 수집하고 장착 매체의 건조 한 방울을 포함하는 깨끗한 현미경 슬라이드에 배치합니다. 20G 바늘의 도움으로 커버 슬립의 테두리에 추가 장착 매체를 추가하고 천천히 날개에 커버 슬립을 낮춥습니다.</li>
		<li>마이크로미터를 사용하여 스테레오스코프로 날개 길이를 측정합니다(그림6).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

우리의 제형무혈 식단의 성공은 i-liq_diet 첨가된 모든 성분(설탕, 아미노산, 비타민 및 미량 원소가 풍부함)의 상승작용적 생리적 효과의 결과일 가능성이 높습니다: BSA (단백질 공급원), ATP (식균제) 및 콜레스테롤(지질 공급원). 개별 성분을 단독으로 liq_diet 보충하는 것은 계란 생산을 자극하는 데 효과적이지 않았다 (데이터는 도시되지 않음). 프로토콜의 한 가지 단점은 콜레스테롤과 같은 일부 구성 요소의 비용일 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 곤충이19를 합성 할 수 없기 때문에 이 분자는 절지동물20에서노른자 합성 및 계란 성숙을 조절하는 ecdysteroid 호르몬의 전구체입니다. 콜레스테롤의 낮은 금액은 비용을 절감 하 고 인공 다이어트의 혜택을 증가 의 목적으로 필요한 수량을 최적화 하기 위해 테스트 해야 합니다.
방법의 또 다른 제한은 인공 식단이 재고 용액에서 신선하게 준비되어야한다는 것입니다. 미래에 우리의 공식화 된 식단은 Aedes aegypti 모기(21)의인공 혈액 식사 대체물인 SkitoSnackt와 유사한 건조 된 힘으로 준비 될 수 있습니다.
필요한 영양소를 공급하는 것 외에도, 인공 식사는 척추 동물신선한 혈액을 먹을 때와 같은 방식으로 먹이를 여성 모기를 유치하고 자극해야합니다. 본 명세서에 기재된 인공 무혈 식단은 척추동물 혈액 공급 군에 비해 완전히 응고된 여성 모기의 20% 증가를 초래하였다. 인공 식단이 신선한 혈액보다 모기에 더 매력적이고 매력적임을 확인하기 위해 olfactometer를 사용하여 이 간접적인 매력 측정을 더 명확히 할 수 있습니다.
유충 사망률에 대한 식단의 가장 큰 영향은 혈액에 공급된 모기에서 파생된 애벌레에 대해 관찰되었으며, 이는 안정적인 구성의 인공 식단이 신선한 혈액에 비해 사망률을 감소시키고 모기 번식 성공을 개선하는 데 기여할 수 있음을 시사합니다. 혈액 식사의 덜 예측 가능한 결과는 조성물17의 숙주 변화와 모기생리학(22)을방해할 수 있는 분자의 혈액에서의 존재로부터 발생할 수 있다. 앞의 사실은 신선한 혈액이없는 식단의 고품질 모기 사육의 장점을 강조합니다.
전반적으로 우리의 연구에서 마련된 계란의 평균 수는 일부 곤충에서 보고된 계란에 비해 낮았지만, 평균 난자 수는 인간의 혈액에 공급된 A. 감비아 실험실 사육 균주(22.6±5.5 난자/암컷)와 비교하였다. 신선한 혈액이나 인공 식에 먹이는 실험그룹(표 2)에서는인공 멤브레인 공급 시스템을 공식화한 식단으로 구현하는 것만으로도 아노페레스 모기 식민지를 유지 및 전파하기에 충분하다는 통계적 차이가 관찰되지 않았습니다.
인공 혈액이 없는 식사는 Aedes 식민지22를유지할 수 있지만, 아노헬레스 모기에 적용하면 제한적이거나 성공하지 못했다11. 최근, Anopheles 모기에 대 한 플라즈마 기반 인공 식사 설명했다 24 하지만 먹이 속도 및 생식 잠재력낮은. 우리의 결과는 우리의 공식화 된 r-liq_diet 표준 척추 동물 혈액 식사보다 유사하거나 더 나은 성능을 가지고 있기 때문에 최첨단 (곤잘레스와 한센11에의해 검토)에서 상당한 발전을 나타냅니다. 스토리지 안정성과 비용에 대한 추가 개선은 응용 프로그램의 범위를 넓히어야 합니다.

벡터 매개 질병은 전 세계적으로 수백만 명의 인간에게 영향을 미치고 매년 수백만 명의 사망을 초래합니다. 그(것)들은 감염된 호스트에게서 혈액을 먹을 때 취득한 질병 생성 미생물 (원생 동물, 바이러스)에 감염된 곤충에 의해 전달됩니다. 이어서, 감염된 벡터는 다음 혈액 식사 동안 새로운 숙주에게 병원체를 전달할 것이다. 말라리아는 Anopheles 모기의 몇몇 다른 종에 의해 전달되고 세계 인구의 40%에 영향을 미치는 치명적인 벡터 품어진질병입니다 1. 말라리아 protist 기생충은 400,000의 죽음 이상 에 책임 있고, 그 중 대부분은 5 세 이하 아이들입니다 (세계 보건 기구). 암컷 아노필레스 모기는 척추동물 혈액을 먹을 때 인간과 다른 동물 사이에 플라스모듐 속의 말라리아 기생충을 전달하며, 계란 생산 및 발달에 필요한단계2.
말라리아 및 기타 신흥 치명적인 모기 벡터 매개 질병의 박멸을위한 현재의 전략은 곤충에서 사육 된 많은 모기의 야생으로 방출을 포함하는 혁신적인 모기 제어 전략3,4,5의개발에 의존합니다. 그러나, 중요한 제한 요인은 효과적인 모기 사육 및 사육을 위한 신선한 혈액의 공급에 의존합니다. 척추 동물 혈액의 가변 구성은 모기 불임과 자손 적당에 부정적인 영향을 미칠 수 있으며 포로 사육 식민지의 신뢰성과 지속 가능성을 제한 할 수 있습니다. 모기 방출 및 통제 프로그램은 대규모 모기 생산 시스템과 대량의 척추 동물 혈액의 정기적 인 공급을 필요로한다. 이것은 모기 생산에 대한 주요 장애물이며 살아있는 동물의 사용과 관련된 일련의 윤리적 문제와 관련 까다로운 안전 규정으로 인한 물류 제한문제를 제기합니다. 이것은 모기 식민지의 유지 보수 및 보안의 비용을 높게 만들고 말라리아의 위협이 훨씬 더 큰 저소득 국가에서 특히 현재 모기 사육 관행의 지속 가능성에 도전합니다.
최근 연구는 척추동물 혈액식사를 모방하는 혈액대체제의 개발에 초점을 맞추고 있으나, 지금까지는6, 7,8,9에한정된 성공만이뤄지고있다. 성공적인 인공 식단은 (1) 전체 여성 모기 engorgement을 자극할 필요가 있고, (2) 트리거 vitellogenin 생산, (3) 실행 가능한 계란의 큰 배치를 생산하고, (4) 히스 자손10을생성한다. 또한, 인공 식단은 표준 구성을 가지고 있으므로 연구 및 제어 목적으로 모기의 생산을 위해 더 신뢰할 수 있습니다. 성공적인 무혈 식단은 Aedes 모기 (곤잘레스와 한센11에의해 검토됨)를 위해 개발되었지만 Anopheles spp. 기존 인공 식단에는 파고 자극제 (예 : ATP10),계란 성숙을위한 단백질 공급원6,12,탄수화물이 에너지의 원천으로, 아미노산 (aa)은 13 가지 의 원천이며, 아미노산 (aa)은13 가지 의 주요 생산 인자입니다. 인공 혈액 무료 다이어트 또한 콜레스테롤을 제공 해야15,계란 생산을 향상 시키는. 여기에서 우리는 여성 Anopheles 모기를 위한 인공 적인 무혈 식단을 설명하고 고품질 척추동물 혈액 식사에 일관되고 동등한 성과를 가지고 있다는 것을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>아데노신 5'-트리포스페이트(ATP) 디소듐 염 수화물</td><td>시그마 알드리치</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>BSA-소 혈청 알부민</td><td>시그마 알드리치</td><td>A790G</td><td></td></tr><tr><td>콜레스테롤</td><td>MP Biomedicals</td><td>199342</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco의 변형된 독수리 배지(L-글루타민이 포함된 고포도당)</td><td>Lonza Bioscience</td><td>BE12-604F</td><td></td></tr><tr><td>Entellan 장착 미디엄</td><td>머크</td><td>1079610100</td><td></td></tr><tr><td>글라스피더</td><td>로컬 글레이저</td><td>디자인</td><td></td></tr><tr><td>헤파린 나트륨 솔</td>트 <td>팬 Reac AppliChem</td><td>A3004,0001</td><td></td></tr><tr><td>Imalg&egrave; ne 1000</td><td>Merial, Portugal</td><td>01MER122</td><td></td></tr><tr><td>바늘 20 G x 1" 0.9 x 25 mm 바늘</td><td>Terumo Europe</td><td>NN-2025R</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6543-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Rompun</td><td>Bayer, Portugal</td><td>7427831</td><td></td></tr><tr><td>Sterilization Millex-HV 0,45</td><td>Millipore</td><td>SLHVR25KS</td><td></td></tr><tr><td>Syringe, 1ml, 27 G x &frac12; " 0.4 x 12mm 바늘</td><td>Terumo 유럽</td><td>BS-NIN2713</td><td></td></tr><tr><td>Teich Mix Astra Pond</td><td>Astra</td><td>4030733100957</td><td></td></tr><tr><td>Tetra 금붕어 플레이크</td><td>Tetra</td><td>4004218742642</td><td></td></tr></tbody></table>

무혈 식단으로 무혈 모기를 후두

A Blood-Free Diet to Rear Anopheline Mosquitoes

말라리아 연구는 포로에 있는 모기(Anopheles 종)를 위한 대규모 사육 그리고 생산 조건을 요구합니다. 모기의 지속 가능하고 신뢰할 수있는 생산은 현재 신선한 척추 동물 혈액의 공급에 의해 억제된다. 혈액에 대한 대안은 혈액 공급 곤충에 의해 전달되는 말라리아 및 기타 벡터 매개 질병에 대한 효율적인 제어 전략을 촉진하는 데 필요합니다. 이 점을 염두에 두고 인공 액체 식단은 신선한 척추 동물 혈액의 대체품으로 공식화되었습니다. 본 명세서에서 우리는 혈액과 유사한 수유율을 제공하고 신선한 척추동물 혈액 식사의 생리적 효과를 모방하는 무혈액 인공 액체 식단을 보고합니다. 규정식은 Anopheles 모기의 난소 그리고 계란 성숙을 유도하고 또한 기능성 성인의 좋은 애벌레 생존 그리고 발달을 일으킵니다. 무혈 액체 식단은 포로생활에서 지속 가능한 모기 사육을 향한 중요한 진전이며 모기 식민지의 유지 보수 비용을 줄이고 신선한 척추 동물 혈액의 필요성을 제거할 것입니다.

아래에 설명된 결과는 초기 액체 식단(i-liq_diet) 또는 신선한 혈액 식사에 공급된 풍부한 인공 식사(r-liq_diet)와 모기를 공급한 여성 Anopheles 모기의 성과를 비교합니다. 이 식단은 도 7에도시된 회로도 프로토콜에 따라 테스트되었습니다. 본 명세서에 기재된 r-liq_diet 특허의 일부입니다(PCT/IB2019/052967).
완전히 응고 된 여성의 비율
r-liq_diet 공급된 암컷 모기의 수(89%) 혈액에 공급 된 여성의 수보다 상당히 높았다 (56%) (그림8).
여성스러움과 다산
첫 번째 gonotrophic 주기에 대 한 여성 fecundity 및 불 임 i-liq_diet 및 r-liq_diet 영양 품질을 평가 하는 데 사용 되었다. 평균 24 ±11 계란신선한 척추 동물 혈액에 공급 하는 여성에 의해 마련 되었다, 반면 r-liq_diet 먹이 암컷 25 ± 5 계란의 평균 을 마련(표 2). i-liq_diet 먹이를 준 암컷은 알을 낳는 것이 관찰되지 않았다.
F1 사망률
F1 모기의 적합성은 척추동물 혈액에 공급된 식민지 사이 또는 r-liq_diet 평가되었습니다. 유충, 번데기 및 성인 사망률이 기록되었다. 가변성(평균 [SEM]의 표준 오차)는 r-liq_diet 공급한 모기에 비해 혈액공급모기(도 9 및 표 2)에서더 높았다. 혈액 또는 r-liq_diet 먹이 모기의 F1 세대는 비교 사망률 및 생존율을 했다.
F1 기대 수명
그것은 야생 성인 여성 모기가 한 달까지 살고 있지만 아마 1-2 주 이상 생존하지 않고 수컷이 약 일주일 동안 살고 꿀과 다른 설탕 소스에 독점적으로 공급하는 질병 통제 및 예방 센터에 의해 추정된다. 부모 음식 섭취량의 차이는 모기자손17의생존에 영향을 미칠 수 있다는 점에 유의하십시오. 우리의 실험에서, 성인 여성과 혈액에서 남성 (여성 24.5 ± 6.8; 남성 18.5 ± 6.9) 및 r-liq_diet (여성: 22.5 ± 8.1; 남성: 11.9 ± 6.9) 그룹은 유사한 평균 평균 수명을 가지고 있었다(표 3)여성에 비해 수명 증가 기간을 보였다.
F1 본체 사이즈
날개 길이는 성인의 신체 사이즈의 지표로 사용되었습니다. 다른 종에 비해, Anopheles 성인은 2.8 에 4.4 mm 날개 길이18사이 날개 길이를 가진 중소형 모기입니다. R-liq_diet 공급한 F1 Anopheles 모기의 성인 체크기는 예상 범위 내에 있었고, 혈액을 공급하는 곤충 모기와 유사하였다(그림10).
통계 분석
제시된 데이터는 적어도 3개의 독립적인 실험의 평균을 나타낸다(달리 명시되지 않는 한). 오류 막대는 SEM을 나타냅니다. 데이터가 가우시안 분포를 따랐을 때, 독립 그룹은 학생의 t 시험을 사용하여 비교되었고, 그렇지 않으면 Mann-Whitney 시험이 적용되었다. 인공 식이 공급 그룹 간의 차이는 피셔의 정확한 시험을 사용하여 분석되었고 P ≤ 0.05에서 유의한 것으로 간주되었다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig1a.jpg"> 그림 1: 심장 내 천자에 의한 CD1 마우스 혈액 수집. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig2a.jpg"> 그림 2: 표준 인공 공급 장치. 유리 피더에는 여성 아노페레스 모기에게 공급되는 r-liq_diet 포함되어 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig03v3.jpg"> 그림 3: 인공 수유 후 모기를 아노헬레스. 왼쪽에서 오른쪽으로: r-liq_diet 제공 된 완전히 engorged 여성, r-liq_diet 제공 된 비-engorged 여성, 남성, 그리고 마우스 혈액을 제공 했다 완전히 engorged 여성. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig03largev3.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig04.jpg"> 그림 4: Anopheles 계란 r-liq_diet 가진 암컷의 사후 공급 48 시간 낳은. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig4alarge.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig05.jpg"> 그림 5: L2 유충 단계는 계란으로부터 개발되어 여과지에서 수집되고 증류수를 함유하는 트레이에 놓였다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig06.jpg"> 그림 6: Anopheles coluzzii 여성 모기의 F1 세대에서 오른쪽 날개. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig07v3.jpg"> 그림 7: 인공 식단 테스트의 회로도 프로토콜. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig07largev3.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig08v3.jpg"> 그림 8: 암컷 모기의 먹이 비율은 인공 식이요법이나 혈액을 먹였다. 별표는 r-액체와 i-액체 규정식 및 혈액 공급통제단을 공급한 모기 사이 중요한 다름을 표시합니다. 양면 피셔의 정확한 검사: ****P ≤ 0.0001 (상대 위험: 0.4828, 95% 자신감 수준 [CL]: 0.3776 받는 번째 0.6194) r-액체 다이어트 대 혈액에 대 한, *P = 0.0335 (상대 위험: 1.379, 95% CL: 1.044 에 대 한 혈액. 파란색: fed; 빨간색: 먹이. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig08largev3.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig09v3.jpg"> 그림 9: F1 Anopheles coluzzii 모기의 사망률 및 남성/여성 비율에 제형화된 무혈 식사의 효과. 3개의 독립적인 실험이 각각 규정식 당 30개의 모기를 사용하여 수행되었습니다. 짝을 이루지 않은 t-검정은 혈액공급군과 r-liq_diet공급군(P값은 0.5047에서 0.8491로 다양함) 사이에 유의한 차이를 보이지 않았다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig09largev3.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig10v3.jpg"> 그림 10: 날개 길이. 변두리 세타를 제외한 R4+5 정맥까지의 축 절개로부터의 거리를 날개 길이를 결정하는데 사용되었다. 크기는 각 식이 그룹(평균 ± SEM)에서 5명의 암컷 및 5명의 남성에 대해 평가되었다. 값은 평균 ± SEM. 연어: r-liq_diet; 빨간색: 척추혈액. 페어링되지 않은 t-검정; 여성 왼쪽 날개: t = 1.300, df = 8, P = 0.2298; 남성 왼쪽 날개: t = 2.400, df = 8, P = 0.0432; 여성 오른쪽 날개: t = 1.300, df = 8, P = 0.2298; 남성 오른쪽 날개: t = 2.277, df = 7, P = 0.0569. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig10largev3.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>구성 요소</td>
			<td>g /L</td>
		</tr>
<tr>
<td>*아데노신 트리포스페이트</td>
			<td>0.55</td>
		</tr>
<tr>
<td>*소 세럼 알부민</td>
			<td>200</td>
		</tr>
<tr>
<td>*콜레스테롤</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>무수 염화칼슘</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>콜린 염화물</td>
			<td>0.004</td>
		</tr>
<tr>
<td>D 칼슘 판토텐산 (비타민 B5)</td>
			<td>0.004</td>
		</tr>
<tr>
<td>D-포도당 무수</td>
			<td>4.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>페릭 질산염 비나하이드레이트</td>
			<td>0.0001</td>
		</tr>
<tr>
<td>엽산</td>
			<td>0.004</td>
		</tr>
<tr>
<td>글리신</td>
			<td>0.03</td>
		</tr>
<tr>
<td>이이노시톨</td>
			<td>0.007</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-아르기닌 모노하이드로클로라이드</td>
			<td>0.084</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-시스틴 디하이드로클로라이드</td>
			<td>0.063</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-글루타민</td>
			<td>0.584</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-히스티딘 모노하이드로클로라이드 모노하이드레이트</td>
			<td>0.042</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-이솔루신</td>
			<td>0.105</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-류신</td>
			<td>0.105</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-리신 모노하이드로클로라이드</td>
			<td>0.146</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-메티오닌</td>
			<td>0.03</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-페닐알라닌</td>
			<td>0.066</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-세린</td>
			<td>0.042</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-스레오닌</td>
			<td>0.095</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-트립토판</td>
			<td>0.016</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-티로신 디소듐 염 이수산염</td>
			<td>0.104</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-발린</td>
			<td>0.094</td>
		</tr>
<tr>
<td>황산 마그네슘 무수</td>
			<td>0.098</td>
		</tr>
<tr>
<td>니아신아마이드 (니코틴아미드)</td>
			<td>0.004</td>
		</tr>
<tr>
<td>페놀 레드</td>
			<td>0.015</td>
		</tr>
<tr>
<td>염화칼륨</td>
			<td>0.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>피리독신 모노하이드로클로라이드</td>
			<td>0.004</td>
		</tr>
<tr>
<td>피루브산 나트륨 염</td>
			<td>0.011</td>
		</tr>
<tr>
<td>리보플라빈 (비타민 B2)</td>
			<td>0.0004</td>
		</tr>
<tr>
<td>중탄산나트륨</td>
			<td>3.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>염화나트륨</td>
			<td>6.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>나트륨 인산나트륨 모노베이직 무수</td>
			<td>0.109</td>
		</tr>
<tr>
<td>티아민 아모노하이드로염화물 (비타민 B1)</td>
			<td>0.004</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">*r-liq_diet</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: i-액체 식이및 r-액체 식이의 조성물.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>총 계란 수 (± SEM)</td>
			<td>계란/암 (± SEM)</td>
		</tr>
<tr>
<td>혈액</td>
			<td>733 ± 330</td>
			<td>24 ± 11</td>
		</tr>
<tr>
<td>r-liq_diet</td>
			<td>763 ± 164</td>
			<td>25 ± 5</td>
		</tr>
<tr>
<td>아이 liq_diet</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2: 아노필레스 콜루지 암컷이 생산한 달걀 배치. 각각 30마리의 암컷 모기를 사용하여 각 실험 식단에 대해 3개의 독립적인 실험을 수행하였다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>여성 (일 ± SEM)</td>
			<td>남성 (일 ± SEM)</td>
		</tr>
<tr>
<td>혈액</td>
			<td>24.5 ± 6.8</td>
			<td>18.5 ± 6.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>r-liq_diet</td>
			<td>22.5 ± 8.1</td>
			<td>11.9 ± 6.9</td>
		</tr>
</tbody></table>표 3: F1 아노헬레스 모기의 평균 수명. 인위적으로 공급된 F0에서 F1 모기의 장수는 동일한 식이 그룹 (15 명의 암컷과 15 명의 남성이 뒤따랐다)에서 오는 각 모기의 출생과 사망 날짜를 기록하여 평가되었다. 결과는 규정식 단 당 평균 모기 수명 으로 표현됩니다.

무혈 인공 식단을 배합하여 아노헬레스 모기를 포로로 먹이는 프로토콜이 제시됩니다. 이 규정식은 척추동물 혈액에 유사한 성과가 있고 난족증과 계란 성숙을 시작하고 실행 가능한 성인 자손을 일으킵니다.

Malaria research requires large-scale breeding and production conditions for mosquitoes (Anopheles spp.) in captivity. The sustainable and reliable ...

질병의 퍼짐에 중요한 역할을 하는 모기에 의해 만나는 것과 같은 말라리아 기생충. 지금까지, 혈액 없이 말라리아 모기를 양육하는 것은 불가능했습니다. 그리고 이 한계를 극복하기 위하여는, 우리의 프로토콜은 부속품에 있는 모기 사육을 지원할 수 있는 혈액 대체 규정식을 기술합니다.혈액이 없는 식단의 사용은 혈액보다 매우 유리합니다. 혈액이 없는 식단은 인간의 혈액 또는 실험 동물의 사용으로 윤리적 제약이 없습니다. 실험에 동물을 교체하는 것은 우리의 세 가지 R 정책의 일부입니다.교체, 감소, 정제. 혈액을 사용하지 않는 것은 비용을 절감하고 적혈구의 수집, 보관 및 유지 보수와 관련된 물류를 줄입니다. 인공 식단의 사용은 항 플라스모듐 분자의 테스트를 용이하게 할 수 있습니다.지금까지, 우리는 다른 폐경 종을 사용하여 우리의 규정식을 시험했습니다. 그들 모두에서, 규정식은 잘 여성에 의해 유혹하고 계란 생산 및 누워를 허용했습니다. 우리는 이 규정식이 그밖 모기 종의 양육을 위한 잠재적인 사용이 있다고 믿습니다.실제로, 우리는 지금 뎅기열, Zika 바이러스, 또는 황열병과 같은 많은 질병의 벡터인 aedes를 위해 그것을 시험하고 있습니다. 섭씨 26도, 습도 75%, 12시간에서 12시간 에서 12시간 정도의 가벼운 어두운 주기 아래에서 요안 콜루지 야오데 균주 모기를 실내에 보관하십시오. 결합을 보장하기 위해 단일 케이지에서 표준 구역 조건을 사용하여 모기를 집.플라스틱 파이펫을 사용하여 작은 물 용기에 모기 새끼를 수집합니다. 성인용 모기가 나타나서 짝짓기를 하기 위해 용기를 모기 케이지 안에 놓습니다. 케이지에 10%의 포도당 공급 용액을 제공합니다.출현 후 3 일, 지독기를 사용하여 종이 컵에 스톡 케이지에서 필요한 여성의 수를 수집합니다. 구별하기 위해, 여성은 더 크고 남성은 넓고 깃털 proboscis가 있습니다. 먹이 길 의 하루 전에, 제거 10% 포도당 공급 솔루션.다음 날, 원고에 따라 라미나르 흐름 캐비닛의 멸균 조건하에서 인공 액체 식단을 준비합니다. 모든 재료를 플라스틱 튜브에 추가합니다. 모든 성분을 완전히 섞고 0.45 미크론 마이크로 필터를 사용하여 필터링하십시오.밀리리터 헤파린 당 1밀리그램의 1밀리리터100 마이크로리터가 장착된 멸균 1 밀리리터 주사기를 채우습니다. 이어서, 각성 복막 경로를 사용하여 케타민과 자일라진을 가진 6~8주 된 CD 1명의 암컷 마우스를 마취한다. 마우스가 다른 물리적 자극에 대한 근육 반응과 반응을 표시하는지 평가합니다.심장 구멍을 수행합니다. 그런 다음 마우스에서 마이크로 튜브로 혈액을 수집하고 수조에서 섭씨 37도에서 혈액을 유지합니다. 다음으로, 흡구를 사용하여 스톡 케이지에서 약 30마리의 암컷 모기를 수집합니다.암컷 모기를 500 밀리리터 종이 컵으로 옮기고 미세한 모기장 메쉬로 덮어 탈출할 수 없습니다. 식사를 포함 하기 위해 유리 피더의 입에 걸쳐 파라 필름 멤브레인스트레칭. 각 컵의 상단에 플라스틱 튜브에 연결된 유리 종 인공 공급 장치를 적용합니다.원통형 튜브 및 피더에 일정한 물 흐름을 제공하여 내 온도를 섭씨 37.5도 에 유지합니다. 섭씨 37도또는 신선한 마우스 혈액에서 예열된 액체 식단 1밀리리터를 유리 피더에 넣습니다. 26섭씨에서 어둠 속에서 60분 동안 모기를 먹이세요.인공 먹이 후, 감기는 30 초 동안 섭씨 20도에서 모기를 마취시합니다. 그런 다음, 냉장 페트리 접시에 모기를 배치합니다. 완전히 유혹 된 여성 모기의 수를 기록합니다.30 명의 완전히 입회한 암컷을 분리하고 새로운 케이지에 넣습니다. 이제 각 케이지 의 하단에 가습 필터 용지를 놓습니다. 모기를 섭씨 26도, 습도 75%, 10%의 포도당 광고 리비툼으로 12시간에서 12시간 에서 12시간 정도의 가벼운 암흑 주기 이하로 유지하십시오.96 시간 및 120 시간 후 먹이에서, 휴대용 돋보기의 도움으로 계란을 계산합니다. 필터 용지에 증류수로 홍수를 통해 계란을 증류수로 가득 찬 트레이에 넣습니다. 트레이 당 약 13 밀리그램의 생선 음식으로 매일 유충을 먹이.매일 플라스틱 파이펫으로 죽은 강아지와 애벌레를 제거합니다. 모든 강아지가 성인으로 발전했을 때, 성인 남성과 여성의 수를 계산, 부화와 죽음의 날짜를 등록, 사망률을 계산. 장수를 테스트하려면 각 다이어트 그룹의 F1 세대에서 성인 남성 15 명과 성인 여성 15 명을 종이 컵으로 수집하십시오.10%의 포도당 용액 광고 로 성인에게 먹이를 주시면 됩니다. 핀셋이나 브러쉬를 사용하여 매일 죽은 성인을 제거하십시오. 동일한 온도, 습도, 가벼운 주기 조건 및 설탕 공급 정권에서 모기를 유지합니다.사망 날짜를 등록하고 장수를 계산합니다. 날개 길이를 측정하기 위해, 감기는 90 초 동안 20섭씨20도에서 각 규정식 단에서 5 일 오래된 F1 남성과 여성 성인 모기를 마취합니다. 스테레오스코프 아래에서 각 모기의 흉부에 집게를 부드럽게 잡고 복부 쪽을 위로 놓습니다.메스를 사용하여 두 날개를 수집하고, 졸업 한 접피스를 사용하여 추가 측정을위해 장착 매체의 말린 방울을 포함하는 깨끗한 현미경 슬라이드에 배치합니다. 마이크로미터를 사용하여 스테레오스코프로 날개 길이를 측정합니다. 이 연구에서는, 공식화된 풍부한 인공 식사와 모기가 초기 액체 식단에 공급하거나 신선한 혈액 식사를 먹는 여성 식욕 부진 모기의 성능을 비교했습니다.89%에서 풍부한 인공 식사로 먹인 여성 모기의 수는 56%에서 혈액에 공급된 여성의 수보다 현저히 높았으며, F1 세대의 모기는 혈액이나 풍부한 인공 식사에 먹이를 주었으며 사망률과 생존율이 비슷했습니다. 풍부한 인공 식사로 먹이는 모기에 비해 혈액 먹이 모기에서 가변성이 더 높았습니다. 성인 신체 크기면에서, 풍부한 인공 식사로 공급되는 F1 아나플 모기는 예상 범위 내에 있었고, 혈액 공급 부속 모기와 유사했다.내 의견으로는, 파열을 피하기 위해 파라 필름과 함께 피더를 제대로 조립하는 것이 매우 중요합니다. 막이 유리 공급에 잘 부착되지 않은 경우, 당신은 식사를 잃고 아마 그들이 식사에 의해 덮여 죽을 수 있기 때문에 모기의 일부를 잃을 수 있습니다. 우리는 이중 선택 매력 분석, 예를 들어 olfactometer를 사용하여 우리가 실제로 우리의 여성이 인공 식단이나 혈액에 더 끌리는 경우 평가 할 수 있도록하고 싶습니다.또한, 우리는 지금 인공 식단을 lyophilizing 하 고 오랜 시간 다른 온도 중 안정성 공부. 안정성과 저장에 명백한 개선 이외에 우리가 일 했습니다., 모기 피트 니스와 생리학에 다이어트의 장기 사용 조사 해야. 혈액없이 anopheles를 생성하는 것은 엄청난 벡터 연구와 모기의 많은 수의 의존 제어 도구의 구현을 용이하게 할 것이라고 생각합니다.

a-blood-free-diet-to-rear-anopheline-mosquitoes

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

유전자가 뎅그열 바이러스에 대한 잠재적 내화물로 식별되면, 그것은 모기 내에서 바이러스 감염을 방지에의 역할에 대해 평가해야합니다. 이 프로토콜은 모기의 뎅그열 감염의 범위가 assayed 수있는 방법을 보여줍니다. 문화, 멤브레인 수유 모기 인간의 혈액에있는 바이러스를 성장하고, 모기 midgut에서 바이러스 titers을 시금에 대한 기술은 증명됩니다.

모기 (A. aegypti)와 감염 표현형 결정에 뎅그열 감염 프로토콜

이 동영상은 실험실에서 뒤쪽 아노 펠 레스 gambiae하는 데 사용되는 일반적인 기법을 보여줍니다. 실험실 모기를 돌보는위한 방법은 혈액 먹이 어른 pupae에 애벌레에서 유기체의 생명주기의 모든 단계를 통해 증명하고 있습니다.

모스키토 리어링 (A. gambiae)에 대한 프로토콜

RIDL ®(지배적인 치명적인 곤충을 운반하는 곤충의 방출) 시스템을 사용하여 Aedes aegypti의 인구 억제를 달성하기 위해 많은 수컷 모기를 풀어야 합니다. 이를 위해서는 대량 사육 기술과 기술을 사용하여 고품질의 남성 모기의 최대 수를 얻기 위해 신뢰할 수 있는 시스템을 제공해야 합니다.

브라질에서 필드 릴리스에 대 한 유전자 변형 Aedes aegypti의 대량 생산

출처: Liu, X. 외. 항생제 처리된 모기를 이용한 박테리아 경구 먹이 검사. J. Vis. 경험 (2020)이 영상은 항생제 함유 자당 용액을 사용해 모기에서 토종 장내 미생물군이 고갈되는 과정을 보여줍니다. 이후 막 영양 시스템을 통해 박테리아 현탁물을 투여하여 모기 장 내에 정의된 박테리아 집단을 확립하는 통제된 재정착이 이루어집니다.

성체 모기에서 정의된 장내 세균 집단 확립

이 비디오는 암컷 모기에 대한 새로운 작용 모드를 가진 테스트 화합물의 폐사율과 번식력을 평가하기 위한 혈액 공급 분석을 보여줍니다. 이 기술은 새로운 종류의 살충제를 스크리닝하여 모기의 저항성 개체군을 죽이고 질병 확산을 통제하는 데 도움이 됩니다.

모기 먹이 분석: 성체 암컷 모기의 폐사율 및 생식력에 대한 테스트 복합 효과를 평가하는 방법

RNA-Seq 분석은 비모델 유기체에서 적응 형질의 분자 토대를 식별하는 데 점점 더 중요해지고 있습니다. 여기에서는 모기 사육에서 RNA 염기서열 분석 및 RNA-Seq 데이터의 생물정보학 분석에 이르기까지 diapause와 non-diapause Aedes albopictus 모기 사이에 차등적으로 발현된 유전자를 식별하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

아시아 타이거 모기에 Photoperiodic 휴면의 RNA-서열 분석을위한 실험 및 생물 정보학 프로토콜, Aedes albopictus

모기의 발달, 번식력 및 생존에 대한 후성유전학적 약물 DZNep의 효과를 조사하기 위한 프로토콜이 개발되었습니다.  여기에서는 SAH 가수분해효소 억제를 측정하는 것 외에도 미성숙 모기에 대한 DZNep의 수성 노출 및 성체 모기에 대한 DZNep의 혈액 기반 노출 절차를 설명합니다.

말라리아 모기의 개발, 다산과 생존자에 성적인 의약품의 시험 효과에 대한 독성 시험 법

Aedes aegypti 모기 Wolbachia 감염 arboviruses의 전송을 억제 하는 자연적인 인구에 발표 되는. 우리 실험실 적응 및 선택 최소화 하기 위해 예방 조치를 복용 실험 및 필드 릴리스, 후면 Ae aegypti Wolbachia 감염 실험실에서 하는 방법을 설명 합니다.

Aedes aegypti 모기 감염 Wolbachia 유지

제시된 프로토콜은 봉쇄 환경에서 Zika와 같은 주어진 바이러스에 대한 Aedes aegypti 모기 집단의 벡터 역량을 결정할 수 있다.

지카 바이러스를 사용하여 Aedes aegypti 모기에 벡터 역량 분석

이 프로토콜의 목표는 인공 막 피더를 통해 Aedes aegypti 모기에 동물 유래 및 인공 혈액 식사를 제공하고 섭취한 식사의 양을 정확하게 정량화하는 것입니다.

Aedes aegypti 모기에서 동물 유래 혈액 및 인공 식사 먹이주기 및 정량화

세균에 의해 생산된 dsRNA의 경구 투여는, 예쁜꼬 마선충에서 일상적으로 사용되는 RNA 간섭(RNAi)에 대한 전달 방법으로서, 성인 모기에 성공적으로 적용되었다. 우리의 방법은 주사를 사용하지 않고도 강력한 역 유전학 연구 및 전송 차단 벡터 연구를 가능하게합니다.

성인 Anopheles 감비아 모기에 효과적인 경구 RNA 간섭 (RNAi) 투여

배우세요 Anopheles 모기를 무혈 인공 식단으로 사육하는 방법을. 이 기술은 산란과 난자 성숙을 지원하며 윤리적 제약을 해결하고 말라리아 연구를 혁신합니다.

무혈 식단으로 무혈 모기를 후두

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