Name: 마우스 유방 상피 HC11 및 EpH4 세포의 분화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: 학습하세요 마우스 유방 상피 HC11 및 EpH4 세포의 분화 유도 기법을 통해 신호전달 경로와 암 치료 표적을 탐구하는 방법을. 이 기법은 세포 분화와 종양 형성의 상호관계 연구에 활용됩니다.

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HC11 세포주들은 D. 메디나 박사(휴스턴, 텍사스 주)에 의해 친절하게 제공되었습니다. 저자는 많은 시약과 가치있는 제안에 대한 퀸즈 대학의 박사 앤드류 크레이그에 감사드립니다. EpH4 세포는 C. Roskelley 박사 (UBC, 밴쿠버)의 선물이었습니다. Colleen Schick은 3D 문화 연구를 위한 우수한 기술 지원을 제공했습니다.
캐나다 자연 과학 및 공학 연구 위원회 (NSERC), 캐나다 보건 연구 기관 (CIHR), 캐나다 유방암 재단 (CBCF, 온타리오 지부), 캐나다 유방암 연구 연합의 재정 지원 , 우수의 온타리오 센터, 유방암 액션 킹스턴 (BCAK) 및 LR에 보조금을 통해 클레어 넬슨 유증 기금은 감사하게 인정된다. CIHR, CBCF, BCAK 및 암 연구 학회 Inc.의 보조금 지원을 받은 PTG는 캐나다 연구 위원장, 캐나다 혁신 재단, CIHR, NSERC 및 캐나다 암 학회가 후원합니다. MN은 NCIC에서 학제 암 연구에서 테리 폭스 교육 프로그램에서 학생, 대학원 상 (QGA), 그리고 여왕의 대학에서 학장상에 의해 지원되었다. MG는 미국 육군 유방암 프로그램, 온타리오 주 연구 혁신부 및 퀸즈 대학의 자문 연구위원회에서 박사 후 펠로우십을 지원받았습니다. VH는 CIHR과 협력하여 테리 폭스 재단 교육 프로그램에서 CBCF 박사 펠로우십과 박사 후 펠로우십에 의해 지원되었습니다. 하나드 아단은 NSERC 여름 학생의 수혜자였다. BS는 퀸즈 대학 대학원 상에 의해 지원되었다.

1. 도금 HC11 셀
<ol><li>멸균 기술을 사용하는 층류 후드에서 HC11 세포 배지의 50 mL로 병을 제조합니다: RPMI-1640 과 10% 태아 소 혈청 (FBS), 5 μg/mL 인슐린, 및 10 ng/mL EGF (재료 표참조).</li>
	<li>접시 3 cm 페트리 접시 당 약 400,000 세포 : HC11 매체에 20 3cm 접시에 두 개의 10cm, 50 % confluent 페트리 접시를 전달합니다. 세포는 잘 퍼져 있어야하지만 건조는 피해야합니다.<ol>
<li>진공 펌프를 사용하여 배지를 플라스크에 흡인합니다.</li>
		<li>10cm 플레이트당 트립신 250 μL(재료 표참조)을 추가합니다. 트립신을 확산하고 부착 된 세포를 빼내기 위해 수평으로 유지하면서 접시를 양쪽에서 소용돌이치고 충돌하십시오.</li>
		<li>4x 목적을 가진 위상 대조 현미경 검사법에서 관찰하기 위하여 세포가 파이펫팅의 앞에 가장자리에서 분리하기 시작했는지 확인합니다.</li>
		<li>멸균 된 9 인치 파스퇴르 피펫에서 HC11 배지의 약 1.5 mL을 흡인하고 세포에 수직으로 분출합니다. 모든 세포를 빼내기 위해 분출하면서 페트리 접시를 돌이키십시오. 당신은 세포의 건조를 피하기 위해 빠르게 작동해야합니다.</li>
		<li>HC11 배지로 모든 세포를 병에 옮기고 소용돌이치세요.</li>
		<li>각 3cm 페트리 접시에 셀 서스펜션의 피펫 2 mL. 페트리 접시를 교차하여 흔들어 고르게 펴발라보릅니다. 세포를 37°C, 5%CO2 인큐베이터에 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>다음날, 또는 세포가 ~90-100% 부유할 때, 배지를 흡인하고, FBS 및 인슐린으로 배지로 대체하지만 EGF가 결여된다.</li>
</ol>2. HC11 셀의 분화 유도, 모니터링 및 정량화
<ol><li>24 시간 동안 EGF가 결여된 배지에서 세포를 성장시키고, 10 3 cm 플레이트에 분화 배지(HIP medium)를 추가합니다: RPMI-1640은 10% FBS, 1 μg/mL Hydrocortisone(재료 표참조), 5 μg/mL Insulin 및 5 μg/mL P롤락틴(재료 표참조)으로 보충하였다.</li>
	<li>다른 10개의 3cm 플레이트를 대조군으로 유지하십시오: 10% FBS와 5 μg/mL 인슐린이 결여된 배지로 변경하십시오.</li>
	<li>배지를 2-3일마다 HIP 처리 된 세포와 대조군 둘 다로 변경합니다. 세포가 분리되지 않도록 조심스럽게 배지를 피펫.</li>
	<li>분화를 모니터링하려면 (즉, "돔"의 형성), 위상 대조 현미경 검사법하에 세포를 관찰(그림 1A,왼쪽 패널). 세포가 녹색 형광 단백질 (GFP)을 발현하는 경우, 형광 현미경 검사법 (여기 = 485 /20; 방출 = 530/25; 배율 240x; 20x 목표)(그림 1A,오른쪽 패널)에서 관찰하십시오.</li>
	<li>분화 정도를 양량화하기 위해, 한 페트리 접시에서 단백질을 추출하여 각각 HIP 처리 된 세포 및 대조군, 총 10 일 동안 하루에 한 번, β-카제인에 대한 웨스턴 블롯을 프로브 (재료 표참조)(그림 1B).<ol>
<li>1.5 mL 얼음 차가운 인산완식염수 (PBS)로 얼음에 세포를 1.8 ml 플라스틱 원심 분리튜브로 긁어 냅니다.</li>
		<li>350 x g,1 분, 4 °C에서 세포를 펠렛.</li>
		<li>얼음으로 차가운 PBS로 펠릿 2x를 빠르게 씻으십시오. 잔여물을 빼내십시오.</li>
		<li>라시스 버퍼 만들기: 50 mM HEPES (pH = 7.4), 150 mM NaCl, 10 mM EdTA, 10 mM Na4P2O7,1% NP-40, 100 mM NaF, 2 mM Na3VO4,0.5 mM 페닐메틸설포닐 불소 (PMSF), 10 μg/mL 아프로틴, 10 μg/mL leupeptin16. 페트리 접시 3cm당 100 μL을 넣습니다.</li>
		<li>추위에 10 분 동안 10,000 x g에서 원심 분리로 용해를 명확히하십시오.</li>
		<li>단백질 농도를 결정하고(재료 표참조) 각 샘플에서 10-20 μg의 단백질을 10% 폴리아크릴아미드-SDS 젤에 로드합니다.</li>
		<li>45V에서 15 시간, 또는 ~ 2-2.5 h에 대한 100V에서 전기 포어.</li>
		<li>전기 블로팅 전달 장치를 사용하여 니트로 셀룰로오스 또는 PVDF 멤브레인상으로 전달하십시오 (재료 표참조).</li>
		<li>0.1% 트웬-20 (TBST)와 트리스 버퍼링 식염수에 5 % 소 혈청 알부민 (BSA)와 블록.</li>
		<li>1차 항체를 첨가하고, 염소 항-β-카제인을 희석1:2,000 또는 마우스 항β 액틴을 1:1,000 희석하였다(재료표참조).</li>
		<li>TBST로 3x, 매번 5분씩 씻으소서.</li>
		<li>이차 항체, 고추냉이 과산화증(HRP) 연결된 당나귀 항염소 희석 1:2,500, 또는 HRP 연계 말 항마우스 항체를 1:10,000 희석하였다.</li>
		<li>TBST로 3x, 매번 5분씩 씻으소서.</li>
		<li>제조업체의 지침에 따라 멤브레인에 ECL 시약을 추가합니다(재료 표참조).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. EHS 매트릭스에서 EpH4 세포의 도금 및 3D 성장
참고 : 매트릭스는 온도 및 lt;10 ° C에서 액체이며 위의 온도에서 고체입니다. -80 °C에서 보관하십시오. 사용하기 전날 밤 4°C에서 해동합니다. 티슈 배양 플레이트와 파이펫 팁을 취급 하기 전에 -20 °C에서 냉각 하 고 매트릭스, 플레이트 및 파이펫 팁을 얼음에 유지 하 고 응고하지 않도록 합니다.
<ol><li>10% FBS 및 5 μg/mL 인슐린을 가진 RPMI-1640 배지에서 2D에서 EpH4 세포를 성장시다 (EGF는 필요하지 않습니다).</li>
	<li>2개의 50 mL 원추형 튜브에 10%(v/v, 3,500 μL) 또는 20%(v/v 2,000 μL) 매트릭스로 보충된 EpH4 성장 배지를 준비합니다. 사용할 준비가 될 때까지 얼음을 유지하십시오.</li>
	<li>원액 매트릭스 150 μL24 웰 플레이트의 10 웰 (각 1cm2)을 코팅합니다. 파이펫 팁을 사용하여 매트릭스를 펼지. 거품을 만들지 마십시오. 매트릭스가 우물의 바닥에 고르게 분포되어 있는지 확인하기 위해 수평으로 유지하면서 부드럽게 플레이트의 측면을 누릅니다.</li>
	<li>매트릭스가 고화될 수 있도록 1시간 동안 37°C에서 24웰 플레이트를 배양한다.</li>
	<li>HC11 세포에 대해 위에서 설명한 바와 같이 EpH4 세포를 트립시니화하고 혈세포계로 계산합니다. 잘 당 5 x 104 세포를 1.5 mL 멸균 원유 원심 분리튜브로 옮기고 250 x g에서 5 분 동안 회전하십시오.</li>
	<li>조심스럽게 매체를 흡인하고 얼음에 튜브를 놓습니다.</li>
	<li>1 mL 파이펫 팁을 사용하여 20% 매트릭스로 보충된 EpH4 성장 배지의 350 μL에서 세포를 재중단시키면서 원추형 튜브를 얼음 위에 유지하였다. 거품을 피하십시오. 단일 세포 현탁액을 보장하는 것이 중요합니다.</li>
	<li>바닥 층 매트릭스가 고화되면 (매트릭스는 웰의 초기 코팅에 비해 반투명하고 밝은 색상으로 나타나야함), 각 코팅된 각 코팅에 350 μL의 셀 현탁액을 추가하고 CO2 인큐베이터에 37°C에 놓고 ~1시간 동안 20% 매트릭스 층이 고화될 수 있도록 합니다.<ol>
<li>4x 목표와 위상 대조하에서 현미경으로 세포를 관찰하십시오. 단일 셀이 표시되어야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>20% 매트릭스에서 부유한 350 μL 의 위에 10% 매트릭스를 함유하는 EpH4 배지의 200 μL을 첨가한다. 37 °C에서 배양하십시오.</li>
</ol>4. 3D로 자란 EpH4 세포의 분화 유도(그림 2)
참고: 분화 외에도, EpH4 세포는 3D 배양에서 HGF (간세포 성장 인자)로 자극 될 때 수관 발생을 겪을 수 있습니다. 관내 외성장은 HIP 및 HGF 자극의 10일 후에 볼 수 있다.
<ol><li>매트릭스에서 도금 후 1일 EpH4 세포의 분화 유도를 시작한다. 플라스틱 파이펫 팁을 사용하여 우물에서 10 % 매트릭스를 포함하는 상단 매체의 150 μL을 조심스럽게 제거하십시오. HIP 및 10% 매트릭스를 함유한 EpH4 배지 200 μL을 첨가합니다.</li>
	<li>최대 10일 동안 2일마다 10% 매트릭스-HIP 배지를 교체합니다. HIP 없이 동일한 10% 매트릭스 배지에서 대조군 세포를 성장시다.</li>
	<li>위상 대비 하에서 유방구 형성을 모니터링합니다(그림3A,하부 패널).</li>
</ol>5. 3D로 자란 EpH4 세포의 튜불로제네시스 유도(그림 3A 및 3C)
<ol><li>3.1-3.9단계에서 상세히 설명된 바와 같이 매트릭스에서 성장을 위해 24개의 웰 플레이트 및 EpH4 세포를 준비한다. 매트릭스에서 세포를 도금한 다음 날, 플라스틱 파이펫 팁을 사용하여 웰에서 10% 매트릭스를 함유하는 EpH4 배지의 150 μL을 제거한다. 10% 매트릭스, HIP 및 20 ng/mL HGF를 포함하는 EpH4 배지 200 μL을 추가합니다(재료 표참조).</li>
	<li>최대 12-14일 동안 2일마다 10% 매트릭스/HIP/HGF 배지를 교체하십시오.</li>
	<li>20x 또는 40x 대물렌즈(그림3A,우측 패널)를 사용하여 관 형성을 현미경으로 모니터링합니다.</li>
</ol>6. 분화의 정량 : β 카제인을위한 웨스턴 블로팅
<ol><li>조심스럽게 우물에서 10 % 매트릭스 - HIP 매체 떨어져 파이펫. 20% 매트릭스 층을 350 μL의 얼음 차가운 PBS로 2x 헹구어 내보소서. 스페로이드는 여전히 매트릭스 층에 있어야합니다.</li>
	<li>700-1,000 μL의 얼음 차가운 PBS를 1 mM에 에틸렌디아미네테트라아세트산(EDTA)을 우물에 직접 넣습니다. 파이펫 팁으로 우물에서 100% 매트릭스의 바닥 층을 부드럽게 분리하여 해당 층에 존재하는 스페로이드를 회수합니다. 4°C에서 30분간 부드럽게 흔들어 주세요.</li>
	<li>조심스럽게 원유관에 스페로이드 현탁액을 옮김을 옮김을 옮김. PBS-EDTA의 ~ 500 μL로 우물을 헹구어 우물에 남아있는 스페로이드를 회수하고 원유 관에 추가하십시오.</li>
	<li>추가로 30 분 동안 얼음에 바위. 매트릭스가 완전히 용해되었는지 확인하십시오. 보이는 매트릭스 덩어리가 보이면 PBS-EDTA를 더 추가하거나 더 오래 흔들어 주세요.</li>
	<li>5 분 동안 350 x g에서 스페로이드를 펠렛하는 용액을 원심 분리기.</li>
	<li>상월체를 흡인하고, 얼음-차가운 용해 완충액에서 스페로이드를 용해시키고, β-카제인, 사이클린 D1 및 p120RasGAP에 대한 프로브는16단계의 2.5단계에서와 같이 서양 블로팅에 의해. 1차 항체로서, 염소 항-β-카제인을 1:2,000, 토끼 항사이클린 D1희석 1:2,000, 마우스 항-p120 희석 1:2,000을 사용한다. 이차 항체의 경우, HRP 연동 당나귀 항염소 희석 1:2,500, HRP 링크 당나귀 안티 토끼 희석 1:2,500, HRP 링크 말 항 마우스 희석 1:10,000을 사용합니다.</li>
</ol>

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</ol>

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HC11 세포는 신생물 형형과 함께 분화 연구에 이상적입니다. 추가적인 이점은 HC11 세포가 다양한 유전자를 발현하기 위해 Mo-MLV 기반 레트로바이러스 벡터로 쉽게 감염될 수 있다는 것입니다. 우리의 손에, EpH4 세포는 HC112보다는 동일 retroviral 벡터로 감염하는 것을 더 어려웠습니다.
세포 대 세포 접촉 및 성장 체포는 HC11 세포 분화를 위한 중요한 전제 조건입니다. 따라서, 세포층을 통해 균일한 분화를 달성하기 위해서는, 파종시에 페트리 접시 내의 세포의 균일한 분포를 달성하는 것이 중요하다. 이는 분화의 정량이 필요한 경우에 특히 중요합니다. 트립시니화는 단일 세포 현탁액이 달성되고 세포가 조작으로 인해 생존력을 잃지 않도록 최적화되어야 합니다.
트립시니화되는 세포는 높은 밀도로 성장한 세포가 서로 강하게 부착되는 경향이 있기 때문에 하위 (50-70%)이어...

일반적인 조직 또는 종양에서, 세포는 3차원 조직에서 그들의 이웃에 접착을 위한 광대한 기회를 가지고 있고, 이것은 고밀도 세포 성장에 의해 배양에서 모방됩니다. 세포 대 세포 접착은 주로 세포 및 조직 구조를 정의하는 카데린 수용체를 통해 매개됩니다. 흥미롭게도, 최근에 는 카데린이 특히 생존 신호1에서신호 변환에 강력한 역할을한다는 것을 입증되었습니다. 역설적으로, 카데린으로부터 방출되는 이들 세포 간 접착 신호 중 일부는 최근 분화 및 신생물2둘 다에 의해 공유되는 것으로 밝혀졌다. 여기서, 우리는 마우스 유방 상피 세포주, HC11 및 EpH4의 두 가지 대표적인 유형에서 분화의 유도 및 평가 방법을 기술한다.
HC11 마우스 유방 상피 세포주는 상피 세포 분화의 연구에 유용한 모델을 제공할 수 있다. HC11 세포는 COMMA-1D 유래 세포주이며, 임신 중발/c 마우스3의유선에서 유래한다. 다른 COMMA-1D 유도체 클론과 달리, HC11 클론은 유생 호르몬에 의한 내인성 β-카제인 유전자의 체외 유도에 대한 다른 세포 유형과의 외인성 세포 간 매트릭스 또는 동조를 위한 요건이 없다3. 이러한 세포주는 정상 유방 상피의 중요한 특성을 유지했기 때문에 분화 연구에서 광범위하게 사용되어 왔다: HC11 세포는 클리어된 유방 지방 패드4에서덕트 상피를 부분적으로 재구성할 수 있다. 더욱이, 그들은 H이드로코르티손 또는 덱사메타손과 같은 스테로이드의 존재에서 플라스틱 페트리 접시 표면에 부착된 합류로 성장하면 2차원(2D) 배양물에서 분화할 수 있으며, 이외에도I은술린과 P롤락틴(HIP 배지)이 결여되어 표피 성장 인자(EGF), 분화 억제제5,6,7. 이러한 조건하에서 HC11 세포는 β-카제인 및 WAP와 같은 우유 단백질을 생성하며, 이는 유도 후 4일 이내에 서양 블로팅에 의해 검출됩니다. 동시에, HC11 세포의 부분은 초보적인 유방 선과 같은 구조를 형성하여 "돔"이라고 불리는 지형적 방식으로. 돔은 유도 후 4-5일 동안 볼 수 있으며 점차 적으로 크기가 10일까지 증가하고, β-카제인 생산량의 증가와 함께8. 흥미롭게도, HC11 세포는 돌연변이 p539를소유하고, 따라서 전뇌성 상태를 나타낸다. 이러한 이유로, HC11 모델은 동일한 세포 시스템에서 신생물과 함께 분화의 신호 네트워크를 연구하는 데 이상적입니다.
EPH4 세포, IM-2 세포의 유도체는, 원래 임신 중 발브/c마우스(10)로부터분리된 자발적으로 불멸의 마우스 유방 선 상피 세포로부터 유래된 비종양성 세포주이다. EpH4 세포는 2D 배양에서 연속상피 단층을 형성하지만 선형구조(10,11)로분화하지 는 않는다. 그러나, EHS 마우스 육종세포(12)에 의해 생성된 세포외 매트릭스 단백질의 혼합물로 이루어진 물질의 3D 성장에 이어(EHS 매트릭스, 매트릭스, 또는 마트리겔, 물질표참조), HIP를 가진 자극 이외에, EpH4 세포는 유방선 분화의 초기 단계를 재차화할 수 있다. 이러한 조건하에서 EpH4 세포는 심근 기저 극성과 중공 루멘을 나타내는 스페로이드 (유방 골격이라고도 함)를 형성하며, 수유 유방 상피 세포와 유사한 우유 단백질 β-카제인 및 WAP를 생성 할 수 있습니다. 미분화되는 HC11 세포와는 달리, 일부 발현 중간엽마커(13)EpH4 세포는 순수한 발광형태(14)를나타낸다. EpH4 세포는 또한 덱사메타손, 인슐린 및 프롤락틴15를통한 자극을 통해 2D 배양에서 우유 단백질을 생산하는 것으로 보고되었다. 그러나, 이 접근은 3D 문화에서 유방 동맥 미세 환경을 모방하는 규정 효력의 연구 결과 배제합니다.

<table><tbody><tr><td>30% 아크릴아미드/0.8% 비스 솔루션</td><td>Bio Rad</td><td>1610154</td><td>웨스턴 블로팅</td></tr><tr><td>안티 사이클린 D1 항체</td><td>토끼, 산타크루즈</td><td>sc-717</td><td>웨스턴 블로팅</td></tr><tr><td>안티-p120 항체</td><td>마우스, 산타크루즈</td><td>sc-373751</td><td>웨스턴 블로팅</td></tr><tr><td>안티-&베타; 액틴 항체</td><td>마우스, 세포 신호 전달 기술</td><td>3700</td><td>웨스턴 블로팅</td></tr><tr><td>안티-&베타; 카제인 항체</td><td>염소, 산타 크루즈 생명 공학</td><td>sc-17971</td><td>웨스턴 블로팅</td></tr><tr><td>아프로티닌</td><td>바이오 샵</td><td>APR600</td><td>용해 버퍼</td></tr><tr><td>Bicinchonic Acid Solution</td><td>Sigma</td><td>B9643-1L-KC</td><td>단백질 측정</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Bio Shop</td><td>ALB007.500</td><td>단백질 측정</td></tr><tr><td>투명도 Western ECL 기질</td><td>Bio Rad</td><td>170-5061</td><td>웨스턴 블로팅</td></tr><tr><td>구리(II) 황산염</td><td>시그마</td><td>C2284-25ML</td><td>단백질 측정</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>D1306</td><td>염색</td></tr><tr><td>디지토닌</td><td>Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd</td><td>14952-500</td><td>염색</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Bio Shop</td><td>EDT001.500</td><td></td></tr><tr><td>표피 성장 인자</td><td>시그마</td><td></td><td>HC11 세포용 E9644 배지</td></tr><tr><td>태아 송아지 혈청</td><td>PAA</td><td>A15-751</td><td>세포 배양 배지</td></tr><tr><td>염소-안티 토끼-HRP</td><td>산타크루즈</td><td>SC-2004</td><td>웨스턴 블로팅</td></tr><tr><td>간세포 성장 인자 재조합</td><td>Gibco</td><td>PHG0321</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma</td><td>7365-45-9</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>말 안티 마우스 HRP</td><td>세포 신호 전달 기술</td><td>7076</td><td>웨스턴 블로팅</td></tr><tr><td>하이드로코르티손</td><td>시그마</td><td>H0888</td><td>HIP 매체</td></tr><tr><td>인슐린</td><td>시그마</td><td>I6634</td><td>HIP</td></tr><tr><td>매체 층류 후드</td><td>BioGard 후드</td><td></td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>류펩틴</td><td>Bio Shop</td><td>LEU001.10</td><td>용해 완충액</td></tr><tr><td>매트릭스 (Engelbreth-Holm-Swarm 매트릭스, Matrigel)</td><td>Corning</td><td>CACB 354230</td><td></td></tr><tr><td>마우스 안티 염소 HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-8360</td><td>웨스턴 블로팅</td></tr><tr><td>Mowiol 4-88 시약</td><td>Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd</td><td>475904-100GM</td><td>염색</td></tr><tr><td>다광자 컨포칼 현미경</td><td>Leica TCS SP2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na3VO4</td><td>Bio Shop</td><td>SOV850</td><td>용해 버퍼</td></tr><tr><td>Na4P207</td><td>시그마</td><td>125F-0262</td><td>용해 버퍼</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Bio Shop</td><td>SOD001.1</td><td>웨스턴 블로팅</td></tr><tr><td>NaF</td><td>Fisher Scientific</td><td>7681-49-4</td><td>리시스 버퍼</td></tr><tr><td>니콘 디지털 카메라</td><td>Coolpix 995</td><td></td><td></td></tr><tr><td>니트로셀룰로오스</td><td>바이오 라드</td><td>1620112</td><td>웨스턴 블로팅</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>시그마</td><td>9016-45-9</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히</td><td>드 피셔 Scientific</td><td>30525-89-4</td><td>염색</td></tr><tr><td>위상차 현미경</td><td>Olympus IX70</td><td></td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>Phenylmethylsuphonyl fluoride</td><td>Sigma</td><td>329-98-6</td><td>lysis buffer</td></tr><tr><td>pMX GFP Rac G12V</td><td>Addgene</td><td>14567</td><td></td></tr><tr><td>Prolactin</td><td>Sigma</td><td>L6520</td><td>HIP Medium</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td>Cell 배양 매체</td></tr><tr><td>조직 배양 접시 35</td><td>Sarstedt</td><td>83.3900.</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>조직 배양 플레이트-24 웰</td><td>Sarstedt</td><td>83.1836.300</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>전달 장치</td><td>CBS Scientific Co</td><td>EBU-302</td><td>웨스턴 블로팅</td></tr><tr><td>트리스 아세테이트</td><td>바이오 샵</td><td>TRA222.500</td><td>웨스턴 블로팅</td></tr><tr><td>트립신</td><td>시그마</td><td>9002-07-7.</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Bio Shop</td><td>TWN510.500</td><td>웨스턴 블로팅</td></tr><tr><td>Veritical Gel 전기영동 시스템</td><td>CBS Scientific Co</td><td>MGV-202-33</td><td>웨스턴 블로팅</td></tr></tbody></table>

마우스 유방 상피 hc11 및 eph4 세포의 분화

Differentiation of Mouse Breast Epithelial HC11 and EpH4 Cells

Cadherins는 신생물뿐만 아니라 세포 분화의 조절에 중요한 역할을합니다. 여기에서 우리는 2개의 마우스 유방 상피 세포주, HC11 및 EpH4의 분화의 유도의 기원 그리고 방법 및 유방 선 발달 및 신생물 변환의 상호 보완적인 단계를 공부하기 위하여 그들의 사용을 기술합니다.
HC11 마우스 유방 상피 세포주는 임신 한 Balb / c 마우스의 유선에서 유래. 태아 송아지 혈청 및 H이드로코르티손, I은린및 P롤락틴(HIP 배지)을 함유하는 배지에서 플라스틱 페트리 접시 표면에 부착된 합류로 성장하면 차별화된다. 이러한 조건하에서 HC11 세포는 모유 단백질 β-카제인과 유청 산성 단백질(WAP)을 생산하며, 수유 유방 상피 세포와 유사하며, "돔"이라고 불리는 초보적인 유선 구조를 형성합니다.
EpH4 세포주는 임신한 Balb/c 마우스로부터 분리된 자발적으로 불멸의 마우스 유방 선 상피 세포로부터 유래되었다. HC11과 달리 EpH4 세포는 HIP 배지에서 3차원(3D) 성장 조건하에서 배양할 때 스페로이드(맘모스피어라고도 함)로 완전히 분화할 수 있습니다. 세포는 트립시네화되고, 엥겔브레스-홀름-스웜(EHS) 마우스 육종 세포에 의해 생성된 세포외 매트릭스 단백질의 혼합물로 구성된 20% 매트릭스에서 부유하고, 플라스틱 페트리 접시 또는 멀티웰 플레이트를 코팅하는 농축 매트릭스 층 위에 도금되고, 10% 매트릭스 함유 HIP 배지의 층으로 덮여 있다. 이러한 조건하에서 EpH4 세포는 정점 기저 극성, 중공 루멘을 나타내는 중공 스페로이드를 형성하고 β-카제인 및 WAP를 생성합니다.
이러한 기술을 사용하여, 우리의 결과는 카데린 / Rac 신호의 강도가 HC11 세포의 분화에 중요하다는 것을 입증했다. Rac1은 분화에 필요하고 활성 RacV12의 낮은 수준은 분화를 증가시키는 반면, 높은 RacV12 레벨은 신생물을 유도하면서 분화를 차단한다. 대조적으로, EpH4 세포는 RacV12의낮은 수준에 의해 억제되는 유방 상피 분화에 있는 초기 단계를 나타냅니다.

상피 세포와 지방세포의 분화가 카데린2의합류와 결합을 필요로 한다는 것은 오랫동안 알려져 왔다. 당사와 다른 사람들은 세포 간 부착 및 E-또는 N-카데린 및 카데린-11의 결합을 입증했습니다. 배양 된 세포의 합류와 함께 발생, 작은 GTPases Rac 및 세포 분열 제어 단백질 (Cdc42)의 활성의 극적인 증가를 트리거,이 과정은 인터류킨 -6 (IL6) 가족 사이토 카인 및 Stat3의 활성화로 이어진다 (전사-3의 신호 트랜스듀서 및 활성제16,17)18, 18. 18. 18. cadherin/Rac/IL6/Stat3 통로의 많은 분대가 분화 및 신생물 변환에 모두 참여할 수 있기 때문에, 그들은 이 두 정...

우리는 2개의 유방 상피 선, HC11 및 EpH4의 분화 유도를 위한 기술을 기술합니다. 둘 다 우유 단백질을 생성하기 위하여 태아 송아지 송아지 혈청, 인슐린 및 prolactin를 요구하는 동안, EpH4 세포는 3 차원 문화에서 유방구로 완전히 분화할 수 있습니다. 이러한 상보적인 모델은 분화 및 신생물의 신호 환전 연구에 유용하다.

마우스 유방 상피 HC11 및 EpH4 세포의 분화

Cadherins play an important role in the regulation of cell differentiation as well as neoplasia. Here we describe the origins and methods of the induction ...

HC11 및 EpH4 세포는 배양에서 분화할 수 있는 마우스 유방 상피 세포주입니다. 동시에, 이 세포는 다수의 종양 유전자에 의해 변형될 수 있다. 이 세포는 분화와 신생물 성 변환 사이의 상호 관계에 대한 연구에 이상적입니다.이 기술은 암 치료를 위한 표적을 찾아내기 위하여 신호 변환 연구 결과에서 이용될 수 있습니다. 예를 들어, 작은 GTPase Rac 및 기타 분자는 높은 수준으로 발현될 때 유방 상피 세포의 변환을 시작할 수 있지만, 놀랍게도 낮은 수준에서, 그들은 차별화를 유도할 수 있습니다. 다른 신호 변환기도 유사한 방식으로 작동할 수 있습니다.원리는 세포 합류가 백분세포 또는 근구의 분화와 같은 중요한 역할을 하는 다른 유형의 분화에도 적용될 수 있습니다. 처음으로이 기술을 수행하는 사람은 HC11 세포의 도금이 중요하다는 것을 명심해야합니다. 이는 세포 간 접촉이 분화에 중요하기 때문입니다.주의해야 할 또 다른 점은 매트릭스에서 EpH4 세포를 적절히 추출하는 것이 단백질 수량에 매우 중요하다는 것입니다. 이 메서드의 시각적 데모는 프로토콜의 일부 세부 사항을 종이에 설명하기 어렵기 때문에 유용합니다. 원고 방향에 따라 HC11 세포 배지의 50 밀리리터 병을 준비하는 것으로 시작합니다.세포를 접시에 담기 위해, 5 6 센티미터 50 %의 컨물 페트리 접시에서 배지를 흡인하고 멸균 9 인치 면이 파전소 파이펫을 사용하여 트립신의 약 1.8 밀리리터로 세포를 세척합니다. 그런 다음 플레이트 당 트립신 200 마이크로 리터를 추가하고 부착 된 세포를 제거하기 위해 접시를 소용돌이. 그들이 빠지기 시작했는지 확인하기 위해 4X 목표를 가진 상 대비 현미경 검사법의 밑에 세포를 관찰하십시오.그런 다음 멸균 된 9 인치 파스퇴르 파이펫으로 HC11 배지의 약 1.5 밀리리터를 흡인하고 접시를 회전시키면서 세포에 수직으로 분출하여 튀는 것을 방지합니다. 모든 셀을 HC11 배지로 병에 옮기고 소용돌이를 통해 병에 고르게 분산시십시오. 그런 다음 요리 당 세포의 두 밀리리터를 파이프하여 20 3 센티미터 페트리 접시에 세포 현탁액을 알리쿼팅합니다.페트리 접시를 흔들어 세포를 퍼뜨리고 하룻밤 사이에 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 배양합니다. 다음 날에 세포가 90 ~ 100 %의 컨실수인 다음 날에 매체를 흡인하고 FBS로 매체로 대체하지만 EGF없이 교체하십시오. 24시간 동안 EGF 없이 배지에서 세포를 성장한 후, 분화 매체를 10개의 접시에 추가하고 다른 10가지 요리를 대조군으로 유지하여 최대 10일 동안 세포를 성장시다.HIP 처리 및 제어 셀로 2~3일마다 배지를 변경합니다. 분화를 모니터링하려면 위상 대비 현미경으로 세포를 관찰하십시오. 세포가 녹색 형광 성 단백질을 표현하는 경우 형광 현미경 검사를 사용합니다.또한, HIP 치료 및 대조세포로부터 단백질을 추출하고 하루에 한 번 조절하여 분화 정도를 정량화하고 서양 블롯 분석을 수행한다. EpH4 성장 매체, EHS 매트릭스 및 두 개의 원물 50 밀리리터 튜브를 얼음 위에 모으고 놓습니다. 영하 20도의 파이펫 팁으로 조직 배양 판을 미리 식히고 2개의 50밀리리터 원추형 튜브에 10 또는 20% 매트릭스로 보충된 EpH4 성장 매체를 준비하고 사용할 준비가 될 때까지 얼음에 보관하십시오.영하 20도에서 미리 냉각된 조직 배양 판을 검색한 후, 파이펫으로 매트릭스를 퍼뜨리면 희석되지 않은 매트릭스 150 마이크로리터로 24웰 플레이트의 10개의 우물을 코팅합니다. 행렬을 퍼뜨릴 때 거품을 만들지 마십시오. 그런 다음 접시의 측면을 부드럽게 탭하고 매트릭스가 고화될 수 있도록 1시간 동안 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다.한편, 이전에 설명된 바와 같이 EpH4 세포를 시험화하고 트립시화 세포의 재발 후 단일 세포 현탁액을 보장함으로써 분화를 준비한다. 다음으로, 혈전계로 현탁액의 세포를 계산합니다. 잘 1.5 밀리리터 멸균 원심분리기 튜브로 잘 10개 세포로 5회 10번 옮기고 5분 동안 250배 g로 회전한다.조심스럽게 슈퍼 나탄 매체를 흡인하고 얼음에 튜브를 배치합니다. 1 밀리리터 파이펫 팁을 사용하여 1밀리리터 파이펫 팁을 사용하여 20% 매트릭스로 보충된 EpH4 성장 매체의 350 마이크로리터에서 세포를 재보습하는 동시에 얼음에 튜브를 유지하여 거품을 피하십시오. 바닥층이 고화되면, 잘 코팅된 각 세포 현탁액에 350 마이크로리터를 추가하고 20% 매트릭스 층이 고화될 수 있도록 1시간 동안 섭씨 37도의 이산화탄소 인큐베이터에 넣습니다.단 하나 세포가 보이는지 확인하기 위하여 상 대비 현미경 검사법을 가진 세포를 관찰하십시오. 그런 다음 상단에 10 %의 매트릭스와 EpH4 매체의 200 마이크로 리터를 추가하고 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다. 매트릭스에서 세포를 도금 한 후 하루 분화 유도를 시작합니다.상위 10% 매트릭스 매체의 150 마이크로리터를 조심스럽게 제거하고 HIP및 10% 매트릭스를 포함하는 EpH4 배지 200 마이크로리터를 추가하고 HIP 없이 10% 매트릭스 매체를 추가합니다. 유방 구체 형성을 위상 대비 현미경으로 최대 10 일 동안 매질을 2 일마다 교체하십시오. 차별화를 정량화하기 위해 우물에서 10% 매트릭스 HIP 배지를 조심스럽게 피펫하고 얼음 차가운 PBS 350 마이크로리터로 20%매트릭스 층을 헹구는 다.그런 다음 70~100마이크로리터의 얼음 차가운 PBS를 1밀리머 EDTA를 우물에 직접 넣고 파이펫 팁으로 100% 매트릭스의 바닥층을 부드럽게 분리합니다. 접시를 섭씨 4도에서 30분간 부드럽게 흔들어 줍니다. 스페로이드 서스펜션을 원피스 튜브로 조심스럽게 옮기고 500마이크로리터의 PBS EDTA로 우물을 헹구어 남은 스페로이드를 회수합니다.매트릭스가 완전히 용해되도록 추가로 30 분 동안 얼음에 튜브를 바위. 보이는 매트릭스 덩어리가 표시되면 PBS EDTA를 더 추가하거나 더 길게 흔들어 줍니다. 350배 g의 원심분리제로 스페로이드를 펠릿합니다.그런 다음 슈퍼나탄을 흡인시키고, 스페로이드를 용해시키고, 서양 블로팅에 의해 베타 카제인, 사이클린 D1 및 p120RasGAP세포를 조사한다. HC11 세포에서 Rac 신호의 강도에 대한 분화의 눈에 띄는 의존도가 있습니다. 내인성 CRAC1은 분화에 필요하고 돌연변이 활성화 된 RacV12의 낮은 수준은 분화 능력의 증가를 야기하지만, 높은 RacV12 수준은 분화의 블록을 트리거하고 신동을 유도한다.EpH4 세포의 분화 특성이 3D 매트릭스 배양에서 탐구되었을 때, 베타 카제인 생성이 8~10일에서 정점에 이르렀고 사이클린 D1 발현은 HIP 자극 후 4~6일 에서 최대화된 것으로 나타났다. 개별 세포의 위치를 결정하기 위하여는, 그(것)들은 DAPI로 염색되고 공초점 현미경으로 심화되었습니다. HGF를 첨가하면서 유방스피어에서 중공 루멘의 내부 세포 사멸 및 형성이 관찰되어 관 구조의 형성을 초래하였다.처음으로이 기술을 수행하는 사람은 HC11 세포의 도금이 중요하다는 것을 명심해야합니다. 또한 매트릭스에서 EpH4 세포의 적절한 추출은 어떤 잔류물이 단백질 결정에 영향을 미치기 때문에 단백질 수량에 매우 중요합니다. 이 기술은 유사한 방식으로 동작할 수 있는 다른 신호 변환기를 조사하는 데 사용할 수 있습니다.암에 있는 드라이버 돌연변이가 있는 경우에, 그 때 그들의 완전한 억제는 낮은 수준이 실제로 분화를 유도할 것이기 때문에 필요하지 않을 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

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마우스 유방 상피 HC11 및 EpH4 세포의 분화

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