Name: HIV 표적의 항체 의존적 세포 식세포 분석에서 사용하기 위해 인간 모유에서 백혈구의 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: 배우세요 인간 모유에서 백혈구를 분리하여 HIV 표적에 대한 항체 의존적 세포 식세포 분석을 수행하는 방법을. 이 기법은 면역학 및 바이러스학 연구에 활용됩니다.

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우리는 원고 검토를 위해 마운트 시나이의 아이칸 의과 대학의 의학 및 미생물학과에서 수잔 졸라 - 파즈너 박사에게 감사드립니다. NIH/NICHD는 보조금 번호 R21 HD095772-01A1에 따라 이 프로젝트에 대한 자금을 제공했습니다. 또한, R. 파월은 시나이 산의 이칸 의과 대학, 감염증 학과의 기금으로 지원되었습니다.

이 연구의 각 참가자는 IRB 승인을 사용하여 시나이 산의 인간 피험자 보호 프로그램 (PPHS)의 지침 및 승인과 함께 윤리적 및 제도적 검토 위원회 (IRB) 승인에 따라 모집및 인터뷰되었습니다. 모유 샘플을 얻기위한 프로토콜.
1. 표적 마이크로스피어 준비
<ol><li>관련 표적 항원을 선택합니다. 참고: 이 예에서는, 재조합 단백질 V1V2-2F5K가 사용되었고, 이는 네이티브 HIV 봉투30의삼각정 정점을 모방하도록 설계되었다.</li>
	<li>제조업체의 프로토콜에 따라 상용키트(재료 표)를사용하여 생체 이식을 수행합니다.<ol>
<li>제큐를 사용하여 5배 어금니 과잉에 대한 반응에 첨가하는 비오틴 시약의 mmol을 계산한다: mmol 비오틴 = mL 단백질 x (mg 단백질/mL 단백질) x (mmol 비오틴/mg 단백질) x (5 mmol 비오틴/mmol 단백질)30,31. 이어서 제식을 사용하여 첨가할 비오틴 시약의 μL을 계산한다: μL 비오틴 = mmol 비오틴 x (1,000,000 μL/L) x (L/10 mmol).</li>
		<li>개봉 전에 비오틴을 실온에 평형화하십시오. 위의 계산에 따라 인산완충식염수(PBS)의 0.5-2.0 mL에 단백질을 용해시.</li>
		<li>디메틸설폭사이드(DMSO)에서 10 mM의 비오틴 시약용액을 준비하고 단백질 용액에 10 mM의 적절한 부피를 첨가하고, 얼음상에서 2시간 또는 실온에서 30분 동안 배양반응을 한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>단백질 농축기 (polyethersulfone [PES] 멤브레인, 3 kDa 분자량 컷 오프 [MWCO], 0.5 mL를 사용하여 과잉 비오틴을 제거; 재료 표) 제조업체의 지침에 따라.<ol>
<li>샘플을 스핀 컬럼의 상부 챔버에 증착하고 최대 400 μL. Cap까지 PBS를 추가한 다음 이 샘플 챔버를 수집 튜브에 삽입합니다. 실온에서 12,000 x g에서 30 분 동안 원심 분리기.</li>
		<li>흐름을 통해 버리고 PBS를 400 μL에 추가합니다. 흐름을 버리고 PBS를 100 μL에 추가합니다. 분광광도계별로 단백질 농도를 측정합니다. 참고: 단백질은 사용할 때까지 -80°C에서 알리인용및 냉동될 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 항체 의존세포 식세포증 (ADCP) 분석판 제제
<ol><li>1 μm 마이크로스피어에 생체 구성 단백질을 공액화 ('구슬'; 재료 표) 제조업체의 지침에 따라.<ol>
<li>접합된 비드 의 플레이트 당, 200 μL의 소 혈청 알부민 (BSA)-PBS에서 200 μL의 스톡 비드 12 μl로 단백질 6 μg을 배양하고, 20 분마다 부드럽게 소용돌이치게 한다.</li>
		<li>원심분리기는 5분 동안 13,000 x g에서 경상, 소용돌이를 부드럽게 버리고 0.1% BSA-PBS의 1200 μL에서 다시 중단합니다. 스핀을 반복하고 2 x를 씻으세요. 0.1% BSA-PBS의 1200 μL에서 다시 중단하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>둥근 바닥 96 웰 플레이트에서 웰 당 비드 용액의 10 μL. 일반적으로 항체의 50 μg/mL 또는 1/100 혈청 희석에서 시작하여 2% HSA HBSS의 12 μL에서 관심 있는 항체 또는 면역 혈청의 희석을 준비합니다. 참고: 샘플 데이터에서, 단일클론 항체(mAb) 830A를 사용하였다.</li>
	<li>비드 플레이트에 적정 항체/세라 10 μL을 넣고 37°C에서 2시간 동안 배양합니다. 각 우물에 2% HSA HBSS의 200 μL을 추가하고 10 분 동안 2,000 x g에서 원심 분리기 플레이트를 추가하십시오.</li>
	<li>눈에 보이지 않는 비드 펠릿을 방해하지 않도록 플레이트 우물에서 액체를 빠르게 전복하고 싱크대에 디캔팅하여 상판을 조심스럽게 제거하십시오.</li>
</ol>3. 모유 세포 격리
<ol><li>이중 전자 또는 수동 펌프를 사용하여 표현 된 건강한 수유 여성에게서 인간의 모유를 얻으실 수 있습니다. 발현의 ~ 4 시간 내에서 세포를 분리, 실온에서 우유를 유지.</li>
	<li>50 mL 튜브를 사용하여, 원심 분리기 50 mL 우유 800 x g에서 15 분. 조심스럽게 세포 펠릿을 방해하지 않고 두고있는 동안 탈지 우유와 지방을 부어. 튜브 벽에서 모든 지방을 제거하기 위해 보풀이없는 닦아 튜브의 내부를 닦으십시오.</li>
	<li>행크의 균형 잡힌 소금 용액에 2% 인간 혈청 알부민 10 mL을 추가하십시오 (2% HSA HBSS [Ca2+ 또는 Mg++]가 없습니다). 세포 활성화 및 세포 자멸을 피하기 위해 부드러운 파이펫팅으로 펠릿을 다시 일시 중단하십시오. 15 mL 튜브와 원심분리기로 10 분 동안 450 x g으로 옮긴다.</li>
	<li>상급을 붓고 1.3 단계를 반복하십시오. 이어서, 예상 된 세포 수에 따라 2 % HSA HBSS의 1-2 mL에서 세포를 부드럽게 재중단하고, 혈세포 계측기 또는 자동화 된 세포 카운터에 의해 세포를 카운트하고, 또한 세포 생존가능성을 주목한다.</li>
</ol>4. ADCP 분석
참고 : 여기에 설명 된 방법은 아커만 외32에서적응 .
<ol><li>각 ADCP 분석 판에 50,000개의 갓 단리된 BM 세포를 2% HSA-HBSS의 200 μL에서 잘 추가합니다. 37 °C에서 2 시간 동안 배양하십시오.<ol>
<li>대조군 실험의 경우, 37°C에서 세포를 10 μg/mL 액틴 억제제(cytochalasin-D), 50 μg/mL FcR 차단제(FcBlock) 또는 플레이트에 첨가하기 전에 둘 다의 조합을 배양한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>원심분리기 플레이트는 930 x g에서 10분 동안. 2% HSA HBSS의 200 μL을 추가하고 원심분리를 반복합니다. 2.7 단계에서와 같이 상급제를 조심스럽게 제거하고 세탁을 반복하십시오.</li>
	<li>0.5 μg/mL(최종 농도)을 사용하여 생존을 위해 상수 및 얼룩 세포를 조심스럽게 제거하여 2% HSA HBSS의 50 μL에서 잘 당 450의 고칠 수 있는 생존 가능한 얼룩을 제거합니다. 어둠 속에서 실온에서 20 분 배양하십시오. 원심 분리기 플레이트는 930 x g에서 10 분 동안 2.7 단계에서와 같이 상판을 제거합니다. 2% HSA HBSS 및 원심 분리판의 200 μL을 다시 넣고 2.7단계에서와 같이 상판을 제거합니다.</li>
	<li>생존성 염색 후, 관심 있는 백혈구 마커에 대한 얼룩 세포는, 예상 데이터에서 최적화된 농도에서 PE-마우스 항인간 CD45(클론 HI30)와 같은 CD45 특이적 얼룩을 최소한으로 포함한다(50 μL에서 1 μl/μL). 참고: 관심 있는 모든 계보별 마커를 포함할 수 있습니다.</li>
	<li>어둠 속에서 실온에서 20 분 배양하십시오. 원심 분리기 플레이트는 930 x g에서 10 분 동안 2.7 단계에서와 같이 상판을 제거합니다. 1% BSA HBSS의 200 μL을 추가하고 원심분리를 반복합니다. 상급을 제거합니다. 실온에서 30분 또는 4°C에서 하룻밤 동안 암흑에서 0.5% 포름알데히드의 200 μL에서 세포를 고정시다. 분석이 있을 때까지 어둠 속에서 냉장 보관하십시오.</li>
</ol>5. 유세포분석에 의한 분석
<ol><li>초기 게이팅을 수행하여 전방 산란(FSC) 대 측면 산란(SSC) 플롯 및 파편(FSC = 5000보다 작은 재료)에서 이중을 제거합니다(그림 1참조). SSC 대 생존 력 얼룩(이 경우 V450) 플롯을 사용하여 죽은 세포(생존 성 얼룩에 대해 양수인 셀)를 제거합니다.</li>
	<li>SSC 대 CD45 플롯을 사용하여 광범위하게 설명된33,34와같이 주요 백혈구 클래스(과립구, 단핵구, 림프구)를 구별합니다. 참고: 이 분류는 암시적이며 세포 유형을 확인하기 위해 계보별 마커가 필요합니다.</li>
	<li>모든 CD45+ 세포에 대해, 또는 관심있는 각 백혈구 하위 집합에 대해, 형광 비드가 검출되는 플루오레세인 이소티옥시아네이트(FITC) 채널의 히스토그램에서 비드 양성 세포에 마커를 사용하여 ADCP 활성을 측정합니다. 참고: 비드가 추가되지 않은 음의 제어 웰은 비드 양성 세포가 히스토그램에서 명백한 위치와 따라서 게이팅 마커를 배치할 위치를 나타냅니다.</li>
	<li>ADCP 점수를 (비드 양성 세포의 중간 형광 강도 [MFI])로 계산합니다( 양수 집단에서 총 CD45 + 세포의 %). 그래픽 소프트웨어를 사용하여 각 Ab/혈청 농도에서 점수를 플롯하고 AUC(언더 커브) 분석을 수행합니다. 참고: AUC가 비특이적 음성 대조군 mAb의 ADCP 점수 AUC의 3배 표준 편차보다 큰 경우 ADCP는 양수로 간주됩니다(이 경우, 3865).</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

본원에 기재된 ADCP 활성을 측정하기 위한 유세포 분석 기반 기술은 2011년30년에 처음 기술되었으며, 이후 80개 이상의 연구에서 견고하게 입증되고 인용되었다. 여기에 설명된 프로토콜은 이 기술을 1차 BM 세포와 처음으로 사용하기 위해 적응합니다. BM 세포에 의한 Fc 매개 기능의 이전 연구는 초유로부터 분리된 세포를 사용하여 산화 파열 또는 장기학 기반 식세포 분석법의 측정에 크게 제한되었습니다(출생 후 0-4일). 사실상 아무 연구도 초유 단계를 지나 인간 BM에 있는 세포를 검토하지 않았습니다. 초유 세포를 이용한 연구는 일반적으로 초유의 과립구가 혈액에서 분리된 것보다 덜 활동적이라는 결론을 내렸으며, 이는 '삼출자 세포'로서 의외의공간(35)으로옮겨진 것으로, 충돌하는 연구가 있지만 보고 유사한 식세포 및 살균 능력36.
수십 년 동안...

인간 모유 (BM)는 >90% 실행 가능한1모계 세포로 구성됩니다. 세포 조성은 수유의 단계, 어머니와 유아의 건강 상태 및 개인 변화에 의해 강하게영향을 받는데, 이는1,2,3,4. BM이 ~ 103-105 백혈구 / mL을 함유하고 있음을 감안할 때, 모유 수유 된 유아가매일~ 105-108 모계 백혈구를 섭취한다고 추정 할 수 있습니다. 생체 내 다양한 연구는 모계 백혈구가 유아에게 중요한 면역력을 제공하고 초기섭취5, 6,7,8의 이러한 부위를 훨씬 넘어서 는 기능성을 입증했습니다. ,9,10,11. 유아에 의해 섭취된 모든 모계 유래 세포는 유아의 백혈구12와함께 면역 기능을 수행하거나 보상할 가능성이 있다.
인간 면역 결핍 바이러스 (HIV)의 어머니 -투 - 아이 전송 (MTCT)는 자원 제한 국가에서 위기 남아있다. 설사와 호흡기 질환이 자원 제한 국가에서 유아 중 사망률의 상당한 비율에 대한 책임이 있기 때문에, 이러한 질병은 독점적 인 모유 수유에 의해 크게 감소, HIV에 감염된 어머니에게 혜택 모유 수유는 위험13,14,15보다훨씬 큽니다. 깨끗한 물과 적절한 유아용 분유에 대한 접근이 신뢰할 수 없다면, WHO는 HIV에 감염된산모16에대한 모유 수유를 중단할 것을 권장하지 않습니다. BM을 통해 대략 100,000 선교사 훈련원은 매년 발생합니다; 아직, HIV에 감염된 산모에 의해 모유수유를 한 유아의 ~15%만이 감염되어 BM17,18,19,20,21의강력한 보호 효과를 시사한다. 수많은 요인이 전송을 방지하기 위해 함께 작동 할 가능성이 높습니다. 중요한 것은, BM에 있는 HIV 특정 항체 (Abs)는 HIV 감염22,23에서감소된 MTCT 및/또는 감소된 유아 죽음과 상관되었습니다. 크게 불분명 남아 있는 것은 그것의 항 바이러스 자질에 BM의 세포 분획의 기여.
많은 Abs는 면역 글로불린 분자의 '일정한' 영역에 의해 매개되는 다양한 항 바이러스 활동을 촉진하며, 결정화 가능한 단편(Fc)은 사실상 모든 선천성 면역 세포에서 발견되는 Fc 수용체(FcRs)와의 상호작용을 통해 사실상 모든 항바이러스 작용을 촉진합니다. 인간 BM24에서발견된다. 항체 의존성 세포 식세포증(ADCP)은 바이러스 감염의 허가를 위해 필요에 따라입증되었으며 HIV25,26,27의MTCT 예방의 경우 과소 연구되어왔다. 28세 , 29. HIV의 MTCT 예방에 BM 식세포에 의한 ADCP 활동의 잠재적 기여에 대한 지식의 빈약함을 감안할 때, 우리는 세포에 의해 매개 된 ADCP의 연구를 수행하기 위해 인간 BM에서 세포를 분리하는 엄격한 방법을 개발하는 것을 목표로했습니다. BM은 수유의 다양한 단계에서 얻은.

<table><tbody><tr><td>1 &마이크로; m FluoSpheres NeutrAvidin-Labeled Microspheres&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>F8776</td><td></td></tr><tr><td>BD Pharmingen PE 마우스 안티-휴먼 CD45</td><td>BD</td><td>560975</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>MP Biomedicals</td><td>8810025</td><td></td></tr><tr><td>Corning V-바닥 폴리스티렌 96-웰 플레이트&nbsp;</td><td>코닝&nbsp;</td><td>3894</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalasin D</td><td>Sigma</td><td>22144-77-0</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link NHS-LC-LC-Biotin 키트&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>21338</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15 mL 원추형 원심분리기 튜브</td><td>Corning&nbsp;</td><td></td><td></td>352196</tr><tr><td>Falcon 50 mL 원뿔형 원심분리기 튜브</td><td>Corning&nbsp;</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>정착 가능한 생존력 얼룩 450&nbsp;</td><td>BD</td><td>562247</td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드 용액</td><td>시그마</td><td>252549&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>칼슘, 마그네슘 또는 페놀이 없는 HBSS Red</td><td>Life Technologies</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>인간 BD Fc 블록</td><td>BD</td><td>564219</td><td></td></tr><tr><td>인간 혈청 알부민</td><td>MP Biomedicals</td><td>2191349</td><td></td></tr><tr><td>Kimtech Science Kimwipes 섬세한 작업 와이퍼</td><td>Kimberly-Clark Professional&nbsp;</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x pH 7.4</td><td>Thermo Fisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>폴리스티렌 10 mL 혈청학적 피펫&nbsp;</td><td>코닝&nbsp;</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>단백질 농축기 PES, 3K MWCO, 0.5mL</td><td>피어싱</td><td>88512</td><td></td></tr></tbody></table>

hiv 표적의 항체 의존적 세포 식세포 분석에서 사용하기 위해 인간 모유에서 백혈구의 분리

Isolation of Leukocytes from Human Breast Milk for Use in an Antibody-dependent Cellular Phagocytosis Assay of HIV Targets

항 레트로 바이러스 약물이없는 경우에도 HIV에 감염된 어머니가 모유를 수유한 유아의 ~ 15 %만이 감염되어 모유 (BM)의 강력한 보호 효과를 시사합니다. 깨끗한 물과 적절한 유아용 분유에 대한 접근이 신뢰할 수 없다면, WHO는 HIV에 감염된 산모에게 모유 수유를 중단할 것을 권장하지 않습니다. BM 전송을 줄이기 위해 여러 가지 요인이 함께 작동할 가능성이 높습니다. 모유로 기르는 유아는 매일 ~ 105-108 모계 백혈구를 섭취하지만, 크게 불분명남아있는 것은 BM의 항 바이러스 특성에 대한 이러한 세포의 기여입니다. 항체 의존성 세포 식세포증 (ADCP), HIV 표적에 대하여 BM 식세포에 의해 가장 필수적이고 보편적인 선천적인 선천적인 면역 반응의 한개. 세포는 수유의 다양한 단계에서 수득된 5개의 인간 BM 샘플로부터 분리되었다. 격리는 부드러운 원심분리를 통해 수행되었고, 그 다음에 우유 지방을 주의 깊게 제거하고 세포 펠릿을 반복적으로 세척시켰다. HIV 봉투(Env) 에피토프로 코팅된 형광 비드는 ADCP의 분석을 위한 표적으로 사용하였다. 세포는 백혈구를 확인하기 위해 CD45 표면 마커로 염색하였다. ADCP 활성이 HIV 특이적 항체 830A를 사용하여 대조군 실험 및 재현 가능한 측정가능한 위 유의한 것으로 나타났다.

우유는 실온이나 쿨러에서 보관 할 수 있습니다 (냉동되지는 않지만); 그러나 우유가 매우 차갑게 유지되었을 때 생존 가능성이 감소(데이터가 표시되지 않음)를 관찰하고 주변 온도에서 간단하게 수집, 보관 및 운반이 더 간단하다는 점을 감안할 때, 시료를 줄이기 위해 냉장보관하지 않는 것이 좋습니다. 샘플 간 가변성. 산후 7-183일 동안 얻은 우유에서, 자동화된 세포 카운터에 의해 결정된 세포 농도는 16,083-222,857 세포/mL에서 구역 수색했습니다. 그림 1은 이중, 파편 및 죽은 세포를 제거하는 게이팅 전략을 보여 줍니다. 생존율 ~90-99%였다. 총 라이브 셀의 약 1.6-12.3%는CD45+ 백혈구(표1)였다. 대부분의 의도적인된 단핵구는 암시적인 SSC 대 CD45 게이팅34에기초하여, 앞서 설명한 바와 같...

모유는 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV)를 전송하지만 HIV에 감염된 어머니가 모유로 기르는 유아의 15 %만이 감염됩니다. 모유로 기르는 유아는 ~ 105-10 8 이 세포가 understudyed 하더라도 매일8 개의 모계 백혈구를 섭취합니다. 여기에서 우리는 모유 백혈구의 격리및 그들의 식세포 용량의 분석을 기술합니다.

HIV 표적의 항체 의존적 세포 식세포 분석에서 사용하기 위해 인간 모유에서 백혈구의 분리

Even in the absence of antiretroviral drugs, only ~15% of infants breastfed by HIV-infected mothers become infected, suggesting a strong protective effect ...

우리는 HIV 표적에 대하여 모유 phagocytes에 의하여 항체 의존적인 세포 phagocytosis, 또는 ADCP를 공부하기 위하여 인간 적인 모유에서 세포를 격리하는 엄격한 방법을 개발했습니다. 이 기술은 ADCP를 수행하기 위해 백혈구 집단의 용량을 평가하기 위해 모유 세포의 비교적 빠르고 쉬운 격리를 용이하게합니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 기술자 인 알리사 폭스 (Alisa Fox)가 될 것입니다.관련 표적 항원을 선택한 후, 제조업체의 프로토콜에 따라 관심 있는 단백질을 생체화하기 위해 상용 키트를 사용합니다. 그리고 바이오티니드 샘플을 스핀 컬럼의 상부 챔버에 증착한다. PBS를 최대 400마이크로리터를 추가하고 원심분리를 위해 컬럼을 수집 튜브에 삽입하기 전에 챔버를 캡합니다.흐름을 폐기한 후 PBS를 400마이크로리터에 추가하여 두 번째 원심분리를 합니다. 흐름을 버리고, 400 마이크로리터에 PBS를 추가하고, 분광계에 의한 단백질 농도를 측정하여 생체화 단백질을 마이크로미터 마이크로스피어에 수렴한다. 20분마다 부드러운 소용돌이와 함께 2시간 동안 실온에서 컨쥬게이트 구슬 당 PBS 200 마이크로리터200 마이크로리터에 12 마이크로리터의 스톡 비드를 장착한 6마이크로그램의 단백질을 배양합니다.인큐베이션의 끝에서, 단백질은 원심분리에 의해 구슬을 컨쥬게이징하고 상퍼를 버린다. 부드러운 소용돌이 후, PBS에서 0.1 %의 BSA의 1200 마이크로 리터에서 단백질을 다시 중단하고, 단지 입증된 바와 같이 원심 분리에 의해 튜브를 두 번 더 세척합니다. 마지막 세척 후, PBS 플러스 BSA에서 1200 마이크로 리터에서 펠릿을 다시 중단.ADCP 분석판을 설정하려면 먼저 12개의 마이크로리터 희석제 또는 관심있는 면역 혈청을 PBS에서 2%BSA로 라운드 하단 96 웰 플레이트로 준비한다. 37°C에서 2시간 동안 접시에 잘 섞인 단백질 구슬 10마이크로리터를 첨가합니다. 인큐베이션이 끝나면 PBS 플러스 BSA의 200 마이크로리터를 추가합니다.펌프를 사용하여 표현하는 건강한 수유 여성으로부터 인간의 모유를 얻은 후, 발현 4 시간 이내에 원심 분리에 의해 우유 내용을 분리하고 조심스럽게 탈지 우유와 지방을 부어 세포 펠릿을 방해받지 않고 둡시. 튜브 벽을 완전히 제거하고 PBS 플러스 HSA의 10 밀리리터를 추가하기 위해 보풀이없는 와이프로 튜브 내부를 닦으십시오. 팔버토시스에서 세포 활성화를 피하기 위해 부드러운 파이펫팅으로 펠릿을 다시 중단하고, 세포 현탁액을 원심분리를 위한 15 밀리리터 튜브로 옮긴다.방금 입증 된 바와 같이 PBS 플러스 HSA에서 두 번째 세척 후, 부드럽게 계산에 대한 신선한 PBS 플러스 HSA의 1 ~ 2 밀리리터에 세포를 다시 중단. ADCP 분석의 경우, 준비된 ADCP 플레이트를 신속하게 반전하여 최종 원심분리 후 상체를 감소시키고 PBS 의 200 마이크로리터에 4번째로 새로 분리된 모유 세포에 5회 10번을 추가하여 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양합니다. 인큐베이션의 끝에서, 세포를 원심분리하고 입증된 바와 같이 신선한 PBS의 200 마이크로리터에서 두 번 펠릿을 세척한다.마지막 세척 후, 실온에서 30 분 동안 PBS의 50 마이크로 리터에 잘 당 450 고정 생존성 스테인의 밀리리터 당 0.5 마이크로 그램으로 세포를 얼룩, 빛으로부터 보호. 인큐베이션의 끝에서, 입증된 바와 같이 신선한 PBS에서 두 개의 세척세포를 펠렛하고, 실온에서 30분 동안 관심 있는 백혈구 마커에 대한 세포를 얼룩지게 하여 빛으로부터 보호한다. 인큐베이션의 끝에서, 세포 원심분리를 수집하고, 세척당 1%BSA 플러스 PBS의 200 마이크로리터에서 세포를 두 번 세척한다.마지막 세척 후, 200 마이크로리터의 0.5% 포름알데히드의 200 마이크로리터에 체온으로부터 30분 동안 고정하여 빛으로부터 보호합니다. 세포 샘플의 유동 세포 측정 분석을 위해, 고처리량 플레이트 판독기가 장착된 유동 세포계를 설정하여 175마이크로리터의 시료를 인출하고 우물당 5000세포를 수집한다. 측면 분산 플롯대 전방 산란에 이중및 이물질을 제거하기 위해 초기 게이팅을 수행합니다.죽은 세포를 제거하기 위해 생존 성 얼룩 플롯 대 측면 산란을 사용합니다. 그리고 주요 백혈구 클래스를 구별하기 위해 CD45 플롯 대 측면 산란을 사용합니다. 모든 CD45 양성 세포또는 각 백혈구 하위 집합에 대해, 공주비에 대한 적절한 플루오로포어 채널의 히스토그램에서 비드 양성 세포에 마커로 게이팅하여 항체 의존성 세포 식세포 활성을 측정한다.그런 다음 항체 의존성 세포 phagocytosis 점수를 비드 양성 세포의 형광 강도의 중앙값으로 총 CD45의 백분율로 계산하고 양성 집단의 세포를 더하였다. 여기서는 이중, 파편 및 죽은 세포를 제거하기위한 게이팅 전략이 표시됩니다. 총 살아있는 세포의 1~12%는 전형적으로 CD45 양성 백혈구이며, 대부분의 의도적인 측면은 구체체로 나타나는 낮은 CD45 낮은 단백세포또는 CD45 개팅 대 측면 산란에 기초하여 미숙한 세포로 산란된다.의도적인 과립구는 측면 산란 높은, CD45 중간 셀로 정의된다. 한 달 산후에서 HIV 특정 인간 단일 클론 항체를 사용하여 갓 분리 된 모유 세포의 ADCP 활성을 측정하면 항체 바운드 항원 결합 비드가 있는 배양 전에 액틴 억제제 Cytochalasin D 및 또는 Fc 수용체차단 항체를 사용한 치료가 대조항체의 존재에서 관찰된 ADCP 활성을 초래한다는 것을 알 수 있습니다. 총 CD45 양성 세포를 위해 결정된 ADCP 점수는 일반적으로 배경 수준 보다 25~35배 사이이며, 음의 대조군, 항탄트락스 단일클론 항체를 사용하여 정의된다.모든 모유 샘플은 고유하며 일부 펠릿은 보기 어려울 수 있습니다. 또한 백혈구 인구, 따라서 ADCP 점수는 샘플에서 샘플마다 엄청나게 다를 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 동영상에서는 non-B 세포 및 스트렙타비딘 접합 자성 마이크로비드에 특이적인 비오틴화 항체를 사용하여 인간 말초 혈액에서 B 세포를 분리하는 방법을 보여줍니다.

인간 말초 혈액에서 B 세포의 분리 및 정제

이 비디오는 모유 식세포에 의한 항체 의존성 세포 식세포작용(ADCP)을 측정하는 분석을 보여줍니다. 항원-항체 복합체에 접합된 형광 표지된 미세구는 모유에서 분리된 세포 현탁액과 결합되어 식세포 백혈구에 의한 항체 의존성 세포 식세포작용을 유도합니다. 세포를 일반 백혈구 항원(CD45)에 대한 항체로 라벨링할 때, 유세포 분석법을 사용하여 미세구 양성 생존 가능한 식세포 백혈구의 형광 강도를 측정하여 ADCP 활성 수준을 나타냅니다.

식세포에 의한 항체 의존성 세포 식세포작용을 측정하기 위한 시험관 분석

여기 탯줄 혈액에서 전구체의 하위 집합 B-세포를 분리에 대한 프로토콜을 설명합니다. 핵산의 충분한 수량과 품질은 세포에서 추출되어 DNA 또는 RNA를 이용 후속 assays에 사용 될 수 있습니다.

탯줄 혈액에서 전구체 B-세포 하위 집합의 절연

본원에 설명된 것은 인간 모체-태아 계면(human maternal-fetal interface)인 decidua basalis와 decidua parietalis의 침투 백혈구를 분리하고 추가로 연구하기 위한 프로토콜입니다. 이 프로토콜은 세포 표면 마커의 무결성을 유지하고 유세포 분석 분석으로 입증된 바와 같이 다운스트림 응용 분야에 충분한 생존 세포를 생성합니다.

인간의 산모 - 태아 인터페이스에서 백혈구의 분리

인간 면역결핍 바이러스(HIV) 입자에서 엑소좀을 분리하는 그래디언트 절차를 설명하는 기술을 설명합니다. 이 절차는 HIV에 감염된 사람의 인간 혈장에 있는 HIV 입자로부터 엑소좀을 분리하는 데 사용되었습니다. 분리된 엑소좀은 사이토카인/케모카인 함량을 분석했습니다.

HIV-1 양성 개인의 플라즈마에서 엑소 좀의 분리

우리는 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 1형에 감염되거나 감염되지 않은 살아있는 세포에서 세포 중심을 향해 이동하는 식체체의 속도를 측정하는 방법을 설명하며, 회전 디스크 컨포칼 형광 현미경을 사용하여 형광 감염 세포를 식별하고 명시야 현미경을 사용하여 식체를 검출합니다.

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인간의 말초 혈액은 일반적으로 체액성 면역 반응의 평가에 사용됩니다. 여기에서는 말초 혈액에서 인간 B 세포를 분리하고, 배양에서 인간 B 세포를 항체(Ab) 분비 B 세포(ASC)로 분화하고, ELISpot 분석을 통해 총 IgM- 및 IgG-ASC를 열거하는 방법에 대해 설명합니다.

분리는 차별화 및 정량화 인간의 혈액에서 B 세포를 항체가 분비 : ELISPOT을 체액 면역의 기능 판독으로

우리는 폐 HIV 저수지를 평가하기 위하여 항레트로바이러스 치료에 만성 HIV 에 감염된 개별에게서 기관지 정맥 세척 액 및 일치한 말초 혈액을 처리하는 방법을 기술합니다. 이러한 방법은 초과민성 중합효소 연쇄 반응에 의한 면역phenotyping 및 HIV DNA/RNA 정량화에 사용될 수 있는 고순도 CD4 T 세포 및 폐포 대식세포의 획득을 초래한다.

기관지 충혈 유체 및 폐포 대식세포 및 CD4+ T 세포 면역체노티핑 및 HIV 저수지 평가를 위한 일치하는 혈액 처리

여기에 제시된 것은 HIV에 감염된 개인과 건강한 대조군으로부터 인간의 1차 단핵구를 분리, 배양, 트랜스펙팅 및 분화하기 위한 최적화된 프로토콜입니다.

1차 인간 단핵구의 고립, 형질전환 및 문화

이 프로토콜은 바이오뱅킹 및 기타 목적을 위해 인간 말초 혈액 단핵 세포를 분리하는 고처리량 자동화 호환 방법에 대해 자세히 설명합니다.

High Throughput Immunomagnetic Bead Separation을 통해 Buffy Coats에서 인간 말초 혈액 단핵 세포 분리

이 프로토콜은 고순도의 인간 모유에서 세포외 소포를 신속하게 분리하고 효과적으로 분리할 수 있도록 설계되었습니다.

인간 모유 유래 세포외 소포의 신속한 분리

배우세요 인간 모유에서 백혈구를 분리하여 HIV 표적에 대한 항체 의존적 세포 식세포 분석을 수행하는 방법을. 이 기법은 면역학 및 바이러스학 연구에 활용됩니다.

HIV 표적의 항체 의존적 세포 식세포 분석에서 사용하기 위해 인간 모유에서 백혈구의 분리

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