Name: 인간 장 유기체에서 지질 방울 형성의 특성화 및 정량화를 위한 형광 기반 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: 학습하세요 인간 장 유기체에서 형광 염료를 이용한 지질 방울 형성 정량화 방법을. 이 고처리량 스크리닝 플랫폼은 DGAT1 결핍 환자 맞춤형 신약 후보 물질을 선별하는 데 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

LD540을 아낌없이 제공해 주신 B. Spee에게 감사드립니다. 이 작품은 과학 연구 보조금에 대한 네덜란드 조직에 의해 지원되었다 (NWO-ZonMW; VIDI 016.146.353) - S.M.

<ol><li>Yen, C. L. E., Nelson, D. W., Yen, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+triacylglycerol+synthesis+in+fat+absorption+and+systemic+energy+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Intestinal triacylglycerol synthesis in fat absorption and systemic energy metabolism.</a> Journal of Lipid Research. 56 (3), 489-501 (2015).</li>
<li>Yen, C. L. E., Stone, S. J., Koliwad, S., Harris, C., Farese, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thematic+review+series%3A+glycerolipids.+DGAT+enzymes+and+triacylglycerol+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Thematic review series: glycerolipids. DGAT enzymes and triacylglycerol biosynthesis.</a> Journal of Lipid Research. 49 (11), 2283-2301 (2008).</li>
<li>D'Aquila, T., Hung, Y. H., Carreiro, A., Buhman, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+discoveries+on+absorption+of+dietary+fat%3A+Presence%2C+synthesis%2C+and+metabolism+of+cytoplasmic+lipid+droplets+within+enterocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Recent discoveries on absorption of dietary fat: Presence, synthesis, and metabolism of cytoplasmic lipid droplets within enterocytes.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1861 (8 Pt A), 730-747 (2016).</li>
<li>Chavez-Jauregui, R. N., Mattes, R. D., Parks, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+fat+absorption+and+effect+of+sham+feeding+on+postprandial+lipema%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Dynamics of fat absorption and effect of sham feeding on postprandial lipema.</a> Gastroenterology. 139 (5), 1538-1548 (2010).</li>
<li>Chitraju, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triglyceride+Synthesis+by+DGAT1+Protects+Adipocytes+from+Lipid-Induced+ER+Stress+during+Lipolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Triglyceride Synthesis by DGAT1 Protects Adipocytes from Lipid-Induced ER Stress during Lipolysis.</a> Cell Metabolism. 26 (2), 407-418 (2017).</li>
<li>van Rijn, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+failure+and+aberrant+lipid+metabolism+in+patients+with+DGAT1+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Intestinal failure and aberrant lipid metabolism in patients with DGAT1 deficiency.</a> Gastroenterology. 1, 130-143 (2018).</li>
<li>Haas, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DGAT1+mutation+is+linked+to+a+congenital+diarrheal+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">DGAT1 mutation is linked to a congenital diarrheal disorder.</a> Journal of Clinical Investigation. 122 (12), 4680-4684 (2012).</li>
<li>Gluchowski, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+novel+DGAT1+missense+mutation+associated+with+congenital+diarrhea%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a novel DGAT1 missense mutation associated with congenital diarrhea.</a> Journal of Lipid Research. 58 (6), 1230-1237 (2017).</li>
<li>Ratchford, T. L., Kirby, A. J., Pinz, H., Patel, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Congenital+Diarrhea+From+DGAT1+Mutation+Leading+to+Electrolyte+Derangements%2C+Protein-losing+Enteropathy%2C+and+Rickets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Gastroenterology+and+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Congenital Diarrhea From DGAT1 Mutation Leading to Electrolyte Derangements, Protein-losing Enteropathy, and Rickets.</a> Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 66 (3), e82-e83 (2018).</li>
<li>Stephen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Congenital+protein+losing+enteropathy%3A+an+inborn+error+of+lipid+metabolism+due+to+DGAT1+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Congenital protein losing enteropathy: an inborn error of lipid metabolism due to DGAT1 mutations.</a> European Journal of Human Genetics. 24 (9), 1268-1273 (2016).</li>
<li>Schlegel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+deficits+in+apical+transporter+trafficking+associated+with+deficiency+in+diacylglycerol+acyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic+%28Copenhagen%2C+Denmark%29%22%5BJournal%5D)">Reversible deficits in apical transporter trafficking associated with deficiency in diacylglycerol acyltransferase.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 19 (11), 879-892 (2018).</li>
<li>Wilfling, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triacylglycerol+synthesis+enzymes+mediate+lipid+droplet+growth+by+relocalizing+from+the+ER+to+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Triacylglycerol synthesis enzymes mediate lipid droplet growth by relocalizing from the ER to lipid droplets.</a> Developmental Cell. 24 (4), 384-399 (2013).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Middendorp, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+stem+cells+in+the+small+intestine+are+intrinsically+programmed+with+their+location-specific+function%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Adult stem cells in the small intestine are intrinsically programmed with their location-specific function.</a> Stem Cells. 32 (5), 1083-1091 (2014).</li>
<li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forskolin-induced+Swelling+in+Intestinal+Organoids%3A+An+In+Vitro+Assay+for+Assessing+Drug+Response+in+Cystic+Fibrosis+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients.</a> Journal of Visualized Experiments. (120), e55159(2017).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ2%3A+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).</li>
<li>Spandl, J., White, D. J., Peychl, J., Thiele, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+multicolor+imaging+of+lipid+droplets+with+a+new+dye%2C+LD540%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Live cell multicolor imaging of lipid droplets with a new dye, LD540.</a> Traffic. 10 (11), 1579-1584 (2009).</li>
<li>Hung, Y. H., Carreiro, A. L., Buhman, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dgat1+and+Dgat2+regulate+enterocyte+triacylglycerol+distribution+and+alter+proteins+associated+with+cytoplasmic+lipid+droplets+in+response+to+dietary+fat%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Molecular+and+Cell+Biology+of+Lipids%22%5BJournal%5D)">Dgat1 and Dgat2 regulate enterocyte triacylglycerol distribution and alter proteins associated with cytoplasmic lipid droplets in response to dietary fat.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (6), 600-614 (2017).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

여기에서, 우리는 올레산으로 배양시 인간 장 오르가노이드에서 LD 형성을 결정하는 프로토콜을 제공한다. 이 방법은 LD 특이적 형광 염료 LD54018을기반으로 하며, 이는 오르가노이드 배양 내의 지질 방울의 총 부피의 특성화 및 정량화를 가능하게 한다. 인간의 장 내 오르가노이드 문화를 확립하고 유지하는 절차는13이전에 발표되었으며,이 프로토콜의 시각적 가이드도15.
이 프로토콜의 중요한 단계는 인간의 장 오르가노이드의 문화, 그리고 BSA에 OA의 적절한 융합이다. 오르가노이드의 배양은 줄기 세포 집단의 유지가 기능성 Wnt3A-CM에 크게 의존하기 때문에 배양 배지의 정확한 제형을 필요로 한다. Wnt3A-CM이 사내에서 제작되는 경우, 약 2개월의 만료 시간으로 인해 고도로 표준화된 워크플로우와 컨디셔닝 매체의 월별 생산을 권장합니다. 또한, 연...

지질은 인간의 식단의 중요한 구성 요소이며 전신 에너지 저장 및 신진 대사에 중요한 역할을합니다. 섭취 할 때, 식이 지질은 췌장 리파스에 의해 자유 지방산 (FFAs) 및 모노 글리세라이드 (MGs)로 저하됩니다. 이 기질은 그 때 장 상피의 장세포에 의해 채택되고, 여기서 그(것)들은 단글리세라이드 acyltransferases (MGAT) 효소에 의해 diglycerides (DG)에 처음으로 재에스테르화되고 그 후에 diacyglycerol에 의해 트리글리세라이드 (TG)에 아실트랜스퍼라제 1 (DGAT1)1. 마지막으로, 이들 TGs는 세포내 저장을 위한 림프계 또는 세포질 지질 방울(LDs)으로 수출하기 위한 chylomicrons중하나에 통합되어2,3. 다른 장기에 식이 지질을 배포 하는 chylomicrons 필요 하지만, LDs에 세포 내 지방 저장의 중요성은 완전히 명확 하지 않습니다. 그러나, LDs는 식사 후 16 시간까지 순환으로 지질을 천천히 방출하기 때문에 장에서 조절 기능을 수행하는 것으로 나타났습니다4. 더욱이, LDs는지방분해조건5 동안 마우스 지방세포와 같은 독성 지방산 농도로부터 보호하는 것으로 나타났다.
DGAT1 단백질은 내구 성 망막 (ER) 막에 위치하고 장 상피에서 LD 형성에 중요한 역할을한다. DGAT1의 동형접합 돌연변이는 조기 발병 심한 설사 및 구토, 저알부민혈증 및/또는 (치명적인) 단백질 손실 장 부전으로 이어질 수 있으며, 인간의 지질 항상성에서 DGAT1의 중요성을 보여줍니다. 장 상피6,7,8,9,10. 인간에 있는 DGAT1 부족의 발생은 희소하기 때문에, 1 차적인 참을성 있는 파생한 세포에 접근은 부족했습니다. 더욱이, 장 상피 세포의 장기 배양은 정상 생리학을 나타내는 종양 유래 세포주로 오랫동안 제한되어 제한된 연장으로만 제한되어 왔다. 따라서, DGAT1-매개 LD 형성은 주로 섬유아세포 또는 동물 유래 세포주7,10,11,12에서연구되었다. 이와 같이, 최근 DGAT1 결핍 환자 유래 섬유아세포가 올레산(OA)을 사용하여 자극한 후 건강한 대조군 세포에 비해 LDs가 적게 축적되는 것으로 나타났다8.
이전에는 3차원(3D)오르가노이드(13)의형태로 임의의 위장관 기관으로부터 상피 줄기 세포를 배양하는 프로토콜이 확립되었다. 이러한 장내 오르가노이드는13시간동안 배양물에서 유지될 수 있으며, 환자 및 장위치특이적 상피특성(14)의 기능적 연구를 가능하게 한다. 그(것)들은 유전으로 그리고 현상전적으로 안정하고 저장될 수 있고, 장기 확장 및 biobanking13를허용하.
우리는 최근에 LD 대형이 LD 형성 (LDF) 분석실험에서 인간 장 오르가노이드에서쉽게 측정될 수 있다는 것을 입증했습니다. 16 시간 동안 OA에 노출되면, 오르가노이드는 지질 유발 독성으로부터 세포를 보호하기 위해 LDs를 생성합니다. OA 농도가 너무 높으면 카스파제 매개 세포사멸6에의해 세포가 죽습니다. LDF 분석결과는 이전에 DGAT1 돌연변이 환자로부터 유래된 오르가노이드및 DGAT1 특이적억제제6의사용에 의해 지시된 바와 같이 DGAT1에 크게 의존하는 것으로 나타났다.
여기에서 자세히 기술된 LDF 분석의 경우, 3D 오르가노이드는 장 생검에서 배양되며 새로운 오르가노이드를 쉽게 형성하는 단일 세포로의 중단에 의해 매주 통과됩니다. LDF 분석을 실행하기 위해, ~7,500 개의 오르가노이드 유래 단일 세포는 24 웰 플레이트의 각각의 웰에서 도금된다. 오르가노이드는 며칠에 걸쳐 형성되고, 1 mM OA로 밤새 배양되고, 화상 진찰을 용이하게 하는 형광 세포 투과성 LD 특이적 염료인 LD540으로 염색됩니다. LD 형성은 공초점 현미경 검사법, 형광 판 리더, 또는 유세포 측정에 의해 정량화됩니다.
이 LD 형성 분석을 96 웰 형식으로 스케일링함으로써, 분석은 또한 인간의 장 유기 체 형 에서 LD 형성에 영향을 미치는 새로운 약물을 선별하는 LD 형성의 높은 처리량 분석에 사용할 수 있습니다, 또는 연구 (인간 유전) 장애에 영향을 미치는 LD 신진 대사.

<table><tbody><tr><td>고급 DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>12634-028</td><td></td></tr><tr><td>B27 보충&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>기저막 매트릭스 (matrigel)</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-1MG</td><td></td></tr><tr><td>DGAT1 억제제 (AZD 3988)</td><td>Tocris Bioscience</td><td>4837/10</td><td></td></tr><tr><td>지방산 무료 BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드</td><td>Klinipath</td><td>4078-9001</td><td></td></tr><tr><td>글루타민 (GlutaMAX, 100x)</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>레이저 스캐닝 컨포칼 현미경</td><td>Leica</td><td>SP8X</td><td></td></tr><tr><td>LD540</td><td></td><td></td><td>위트레흐트 대학교 B. Spee 박사가 친절하게 제공</td></tr><tr><td>mEGF</td><td>Peprotech</td><td>315-09_500ug</td><td></td></tr><tr><td>N-아세틸 시스테인</td><td>시그마 -알드리치</td><td>A9165-100G</td><td></td></tr><tr><td>니코틴 아미드</td><td>시그마 알드리치</td><td>N0636-500G</td><td></td></tr><tr><td>노긴 생산 세포 (HEK293-mNoggin-Fc 세포)</td><td></td><td></td> <td>J. den Hertog, Hubrecht Institute</td></tr><tr><td>올레산</td><td>시그마 -알드리치</td><td>O1008-5G</td><td></td></tr><tr><td>p38 MAPK 억제제 (p38i) (SB202190)</td> <td>시그마 알드리치</td><td>S7067-25MG</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Ca</td><td></td>2+/Mg2+ 없이 Sigma-Aldrich <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신(5,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>R-스폰딘 생산 세포(Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T 세포)</td><td>R& D 시스템</td><td>3710-001-01</td><td></td></tr><tr><td>TC 처리된 24 웰 플레이트</td><td>Greiner-One</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>TC 처리된 검은색 투명 바닥 96 웰 플레이트</td><td>Corning Life Sciences</td><td>353219</td><td></td></tr><tr><td>TGFb 타입 I 수용체 억제제 (A83-01)&nbsp;</td><td>Tocris Bioscience</td><td>2939/10</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin (TrypLE Express)</td><td>Life Technologies</td><td>12604021</td><td></td></tr><tr><td>Wnt-3A producing cells (L-Wnt-3A cells)</td><td></td><td></td><td>MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute</td></tr><tr><td>Y-27632 dihydrochloride (Rho kinase inhibitor)</td><td>Abcam</td><td>ab120129-10</td><td></td></tr></tbody></table>

인간 장 유기체에서 지질 방울 형성의 특성화 및 정량화를 위한 형광 기반 분석

A Fluorescence-based Assay for Characterization and Quantification of Lipid Droplet Formation in Human Intestinal Organoids

식이 지질은 장 상피에 의해 자유 지방산 (FA)으로 채택됩니다. 이 FA는 세포내 트리글리세라이드(TG) 분자로 전환되며, 림프로 운반하기 위해 chylomicrons로 포장되기 전에 또는 세포내 저장을 위해 세포내 지질 방울(LDs)으로 운반됩니다. LDs의 형성을 위한 결정적인 단계는 TG 합성의 마지막 단계에서 디아실리세롤 아실트랜스퍼라제(DGAT)의 촉매 활성이다. LDs는 독성 지질 종을 버퍼링 하 고 다른 세포 유형에 세포 대사를 조절 하는 것이 중요 하다. 인간의 장 상피는 정기적으로 지질의 높은 농도 직면 하기 때문에, LD 형성항상성을 조절 하는 것이 매우 중요 하다. 여기에서 우리는 인간 장 오르가노이드에서 가장 일반적인 불포화 지방산, 올레산으로 자극시 LD 형성 (LDF)의 특성화 및 정량화에 대한 간단한 분석서를 설명합니다. LDF 분석법은 공초점 현미경, 형광 판 판독기 또는 유세포 측정에 의한 LD의 정량화를 허용하는 LD 특이적 형광 염료 LD540을 기반으로 합니다. LDF 분석실험은 인간 장 상피 세포에서 LD 형성을 특성화하거나 DGAT1 결핍과 같은 LD 대사에 영향을 미치는 인간(유전적) 장애를 연구하는 데 사용될 수 있다. 또한, 이 분석실험은 또한 장 내 또는 다른 유형의 오르가노이드에서 LD 형성의 결함을 복원하는 새로운 치료 화합물을 테스트하기 위해 높은 처리량 파이프 라인에서 사용될 수 있습니다.

LD 형성의 적절 한 분석을 위해, 오르가노이드는 OA와 후속 염색으로 자극 하기 전에 너무 조밀 하 게 파종 해서는 안. 이것은 중첩된 오르가노이드가 형광을 방해할 수 있기 때문에 공초점 및 플레이트 판독기 판독에 특히 중요합니다. 적절한 오르가노이드 시드 밀도의예(도 1A)및 중첩된 오르가노이드를 가진 배양체(도1B)가도시된다. OA를 사용하여 샘플 자극의 가변성을 최소화하려면 하나의 실험 내에서 샘플 간에 유기체 크기 및 시드 밀도를 비교해야 합니다. 이것은 단일 세포의 동일한 수를 시드하여 가장 잘 제어됩니다. 그러나, 특정 organoid 라인이 일관되게 더 높은 재구성 효율성을 보여주고 그러므로 일관되게 더 높은 organoid 수를 보여주는 경우에 몇몇 조정이 필요할 지도 모릅니다.
<...

이 프로토콜은 지방산으로 자극시 인간의 장 유기 체에서 지질 방울 (LD) 형성의 특성에 대한 분석서를 설명합니다. 우리는 이 분석제가 LD 형성의 정량화를 위해 어떻게 이용되는지, 그리고 어떻게 LD 대형에 영향을 미치는 약에 대한 높은 처리량 검열을 위해 사용될 수 있는지 토론합니다.

Dietary lipids are taken up as free fatty acids (FAs) by the intestinal epithelium. These FAs are intracellularly converted into triglyceride (TG) ...

이 프로토콜은 인간 장 가내장에 있는 지질 물방울 대형을 정량화하는 몇몇 방법을 기술합니다. 지질 방울 형성을 조절하는 약물을 테스트하기 위해 고처리량 스크리닝 플랫폼으로 사용할 수 있습니다. 우리가 설명하는 방법은 지질 물방울 특정 염료 및 생검 유래 장 가내장에 근거를 두고 있습니다.이를 통해 지질 방울 형성을 위한 안정적이고 정확하며 생리학적으로 관련된 모델을 제공합니다. 이 프로토콜은 DGAT1 결핍 환자에서 지질 방울 형성을 조절하는 환자 특정 새로운 약물 후보를 선별하는 데 사용할 수 있습니다. 이 지질 액적 형성 분석또한 다른 세포 모형에 있는 지질 대사를 공부하기 위하여 오르가노이드 배양의 그밖 모형에 적용될 수 있습니다.분석은 오르가노이드 배양의 밀도에 크게 의존한다. 샘플 및 실험 전반에 걸쳐 일관된 오르간성 밀도를 확인하십시오. 이 분석법의 시각적 데모는 오르가노이드가 어떻게 배양되어야 하는지, 지질 방울 형성의 적절한 분석을 보장하기 위해 어떻게 처리되어야 하는지 를 보여주는 것이 중요하기 때문에 중요합니다.오가노이드를 준비한 후, 지하 막 매트릭스의 액적을 방해하지 않고 배양 배지를 조심스럽게 흡인한다. 오가노이드의 첫 번째 우물에 차가운 기저 배지 500 마이크로 리터를 추가합니다. P1000 파이펫을 사용하여 오르가노이드로 지하 막 매트릭스 방울을 부드럽게 피펫으로 막습니다.다음 뿐만 아니라 필요에 동일한 배지와 함께이 절차를 반복 하지만 기저 배지의 500 마이크로 리터 당 두 개 이상의 우물을 수확 하지 않습니다. 구속력이 낮은 1.5 밀리리터 미세원심분리기 튜브에서 오르가노이드를 수집하고 15~20초 동안 미니 탁상 원심분리기에서 회전합니다. 스펀 다운 오르가노이드에 트립신 400 마이크로 리터를 추가합니다.섭씨 37도에서 5분간 수조에 배양하세요. 다음으로 P200 파이펫을 사용하여 서스펜션을 위아래로 부드럽게 피펫하여 나머지 셀 응집체를 방해합니다. 섭씨 37도에서 5분간 수조에 배양하세요.단일 셀만 남아 있을 때, 기초 매체의 1 밀리리터를 추가하고, 15~20초 동안 미니 탁상 원심분리기에서 셀을 아래로 회전시합니다. 슈퍼 네티퍼를 완전히 흡인. P200 파이펫을 사용하여 신선한 hSI-EM의 200 마이크로리터에서 단일 세포를 다시 중단하고 hSI-EM의 800 마이크로리터를 추가합니다.그런 다음 현탁액의 세포 수를 계산하고 최종 세포 밀도에 필요한 셀의 부피를 계산합니

a-fluorescence-based-assay-for-characterization-quantification-lipid

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

이 동영상은 GFP 발현 형질전환 마우스에서 얻은 3D 장 오가노이드의 ROS 수준을 정량화하기 위한 유세포 분석 분석을 보여줍니다. 이 방법은 ROS 생산에 대한 테스트 화합물의 효능을 조사하기 위한 체외 실험 모델을 제공합니다.

산화 스트레스를 정량화하기 위한 유세포 분석 분석: 형량 탐침을 사용하여 장 오가노이드의 활성 산소 종을 정량화하기 위한 분석

이 프로토콜 상피 장벽 침투성 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 인간의 창 자 organoids에서 실시간 다음 약리학 적인 치료에서의 측정을 설명 하 고 라이브 셀 현미경 검사 법.

인간의 장 Organoids에 상피 장벽 침투성의 실시간 측정

이 프로토콜은 리포솜의 제조를 설명하고 이들이 어떻게 표면에 고정되고 형광 현미경 검사법을 사용하여 거대한 병렬 방식으로 개별적으로 심상될 수 있는지 설명합니다. 이는 집단의 단일 리포좀 들 사이의 크기 및 조성 불균질의 정량화를 허용한다.

개별 리포좀 간의 조성 불균질성을 검출하기 위한 정량적 형광 현미경 검사법 기반 단일 리포좀 분석

여기에서 우리는 소장 오르가노이드의 장벽 무결성을 정량화하는 기술을 기술합니다. 이 방법이 살아있는 오르가노이드를 기반으로 한다는 사실은 시간 해결 방식으로 상이한 장벽 무결성 변조 물질 또는 이들의 조합에 대한 순차적 조사를 가능하게 한다.

살아있는 오르가노이드의 장 장벽 고장 조사

여기에서 우리는 간 조직의 지질 액적 특성 분석을 위해 최적화된 BODIPY 493/503 형광 기반 프로토콜을 입증합니다. 직교 투영 및 3D 재구성의 사용을 통해 형광단은 미세소포와 대소포성 지방증 사이의 성공적인 구별을 가능하게 하고 간 지방증 평가를 위한 고전적인 조직학적 프로토콜에 대한 보완적인 접근 방식을 나타낼 수 있습니다.

간 지방증 평가를 위한 3D 재구성을 통한 형광 염색 지질 방울 분석

본 연구는 온전한 근육 부피를 통해 근육 내 지방 조직(IMAT) 침착을 시각화 및 정량화하고 IMAT를 구성하는 개별 지방 세포의 메트릭을 정량화하기 위한 탈세포화 기반 방법론을 설명합니다.

골격근 지방 침윤의 탈세포화 기반 정량화

지방파지(Lipophagy)는 지질 방울의 분해를 포함하는 선택적 형태의 자가포식입니다. 이 과정의 기능 장애는 암 발병과 관련이 있습니다. 그러나 정확한 메커니즘은 아직 완전히 이해되지 않았습니다. 이 프로토콜은 자가포식, 지질 대사 및 암 진행 간의 상호 작용을 더 잘 이해하기 위한 정량적 이미징 접근 방식을 설명합니다.

Lipophagy를 통한 지질 방울 이화작용의 조절 탐구

우리는 저간섭 홀로단층촬영을 사용하여 오가노이드의 고해상도, 무표지 및 3차원 이미징을 위한 단계별 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 오가노이드 배양 준비, 이미징 획득 및 전산 이미지 분석을 자세히 설명하여 살아있는 오가노이드의 구조 역학 및 약물 반응을 실시간으로 시각화할 수 있습니다.

저간섭성 홀로토마그래피를 통한 장내 오가노이드의 무표지, 고해상도 3D 이미징 및 머신러닝 분석

이 프로토콜은 동기화된 간종 세포를 이용해 유사분열 중 지질 방울과 소기관 역학을 재현 가능하게 합니다.

간종 세포에서 유사분열 중 지질 방울과 소기관의 역학을 시각화하는 형광 기반 방법

부유 유방구 분석은 현탁 상태에서 생존하고 마우스에 이식했을 때 향상된 종양 형성을 보여주는 줄기 유사 유방암 세포의 하위 집합을 조사할 수 있습니다.  이 프로토콜은 생체 내 종양 형성의 대용물인 구 형성 능력의 편리한 체외 측정을 제공하는 동시에 줄기 관련 전사 환경의 분석을 용이하게 합니다.

인간 유방암 조직과 세포주에서 Mammosphere 형성 분석

학습하세요 인간 장 유기체에서 형광 염료를 이용한 지질 방울 형성 정량화 방법을. 이 고처리량 스크리닝 플랫폼은 DGAT1 결핍 환자 맞춤형 신약 후보 물질을 선별하는 데 활용됩니다.

인간 장 유기체에서 지질 방울 형성의 특성화 및 정량화를 위한 형광 기반 분석

더 많은 동영상 탐색