Name: 배아 이식을 통해 돌연변이 Haploid 사지를 가진 키메라 색소꽃의 생성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: 배우세요 액솔롯에서 돌연변이 단배체 사지를 생성하는 배아 조직 이식 기법을 통해 유전자 스크리닝을 수행하는 방법을. 이 기법은 양서류 재생 연구와 치명적 표현형 구조에 활용됩니다.

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우리는 축색동 식민지의 그녀의 배려에 대한 캐서린 로버츠에게 감사드립니다. 이 작업에 대한 기금은 코네티컷 혁신 재생 의학 연구 기금 (15RMA-YALE-09 및 15-RMB-YALE-01)과 유니스 케네디 슈리버 국립 아동 건강 및 인간 개발 연구소 (개별 박사 후 박사 과정)에 의해 제공되었습니다. 펠로우십 F32HD086942).

이 프로토콜에 사용된 실험 절차는 예일 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC, 2017-10557)에 의해 승인되었으며 척추 동물의 사용을 규제하는 모든 연방 정책 및 지침에 따라있었습니다. 모든 동물 실험은 예일 대학의 시설에서 암비스토마 멕시카눔(악소로트)에서 수행되었다.
1. 디플로이드 배아 생성
<ol><li>하나 또는 두 개의 gfp 부모24를사용하여 자연 짝짓기를 통해 이식 호스트역할을 하는 GFP+ 디플로이드 배아를 획득한다.</li>
	<li>갓 낳은 디플로이드 계란을 모아 금속 체에 넣습니다.</li>
	<li>40% 홀트프레터용액(20 mM NaCl, 0.2 mM KCl, 0.8 mM NaHCO3,0.2 mM CaCl2,4 mM MgSO4,pH ~ 7.4)으로 계란을 철저히 헹구십시오.</li>
	<li>계란을 신선한 40% 홀트프레터용액에 놓고 12°C에 보관합니다. 참고: 디플로이드 배아는 haploid 배아 생성으로 이동하기 전에 항상 얻어야 합니다.</li>
</ol>2. 하플로이드 배아 생성
<ol><li>여성 게임 기증자 준비<ol>
<li>48 시간 시험관 내 활성화를 수행하기 전에, 40% Holtfreter의 용액25에서1 g/L HEPES 완충MS-222에 침지함으로써 성적으로 성숙한 백색 또는 백색/RFP 암컷 액소를 마취시켰다.</li>
		<li>엄지와 집게 손가락 사이에 꼬리를 단단히 꼬집어 약 30분간 침지한 후 동물이 완전히 마취되었는지 확인합니다. 완전히 마취 된 동물은 물리적으로 어떤 핀치에 반응하지 않습니다.</li>
		<li>멸균 식염수에 10,000 U/mL을 함유한 인간 융모성 생식샘 자극호르몬(HCG)의 용액을 준비하십시오.</li>
		<li>30 G 인슐린 주사기를 사용하여 0.15 CC의 HCG (1,500 단위)를 마취 된 여성의 뒷다리에 0.15 CC (1,500 단위)를 주입하여 척수와의 접촉을 피하기 위해 중간선에 45 ° 각도로 근육 등쪽을 주입하십시오.</li>
		<li>암컷을 신선한 40% 홀트프레터용액으로 되돌려 놓고 8-12°C 냉장고에 놓습니다.</li>
		<li>48 시간 후, 실온으로 여성을 반환합니다. 달걀 누워 표면으로 그녀의 용기에 몇 돌이나 플라스틱 식물을 놓는다. 참고 : HCG로 주입 된 여성은 종종 알을 낳기 전에 몇 시간 동안 빈 젤리 케이스를 입금합니다.</li>
		<li>암컷이 지속적으로 알을 낳기 시작한 후 돌이나 플라스틱 식물을 제거하십시오.</li>
		<li>암컷이 빈 탱크에 30분에서 1시간 동안 앉도록 하십시오. 참고 : 동물이 알을 낳을 수있는 물질을 원천 징수하면 oocyte 수집을 보다 엄격하게 제어 할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>남성 게임 컬렉션<ol>
<li>여성의 알 누워 지연 하는 동안, 성적으로 성숙한 GFP+ 남성 axolotl 정자 기증자 역할을 마 신, 단계에서와 같이 2.1.1.</li>
		<li>완전히 마취 된 남성을 해부 현미경 아래에 젖은 종이 타월에 등을 놓습니다.</li>
		<li>실험자가 오른손잡이인 경우 P1000 파이펫 끝을 오른손으로 cloaca 의 바닥에 놓습니다.</li>
		<li>왼쪽 집게 손가락과 왼손 엄지 손가락을 골반에 2−3cm 로스트랄로 놓습니다. 손가락을 뒷다리쪽으로 움직이면서 동물을 부드럽게 짜서 정자 소변 샘플을 씻어냅니다.</li>
		<li>개별 미세 원심 분리튜브로 cloaca에서 플러시되는 각각을 수집합니다. 이 과정을 반복하여 6~10개의 샘플을 수집합니다.</li>
		<li>각 샘플에서 페트리 접시에 피펫 5.0 μL을 사용하여 정자의 품질을 검사합니다. 참고: 농축된 정자 견본은 유백색, 전형적으로 5 에서 20 μL범위이고, 일반적으로 몇몇, 더 높은 양 정액 소변 견본이 추출된 후에 회수됩니다. 정액은 방해받지 않고 방치될 때 더 높은 양 견본에 있는 관의 바닥에 수집할 것입니다. 건강한 정자의 농축 된 샘플은 매우 운동성이며 집중력이 감소함에 따라 활동을 잃습니다. 건강한 남성은 농축 된 정자의 최대 50 μL을 생성 할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>여성 게임 컬렉션<ol>
<li>건강한 정자 샘플을 획득하고 확인한 후, 2.1.1단계에서와 같이 HCG 주입 된 여성 액소를 마취시.</li>
		<li>완전히 마취 된 여성을 젖은 종이 타월에 등에 놓습니다.</li>
		<li>2.2.4단계에서와 유사한 손 동작을 사용하여 암컷으로부터 수정되지 않은 난자를 추출한다.</li>
		<li>젖은 집게를 사용하여 계란을 수집하고 10cm 페트리 접시에 전송합니다. 수집의 15 분 이내에 조사 된 정자로 계란을 치료하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>남성 게임 테 준비 및 체외 활성화<ol>
<li>P10 또는 P20 피펫을 사용하여 정자를 위아래로 파이펫하고 덩어리를 분해하여 균일한 현탁액을 형성합니다.</li>
		<li>페트리 접시 뚜껑 또는 유리 슬라이드에 희석되지 않은 정자 현탁액의 0.5 μL 드롭을 배치하고 거꾸로 현미경으로 검사하여 운동성 정자의 비율을 근사화.</li>
		<li>9.5 μL의 0.1x 마크의 수정 링거 솔루션 (MMR; 재료 표) 이 샘플에 20 배 정자 희석을 합니다. 위아래로 부드럽게 파이펫을 섞어 주세요.</li>
		<li>반전된 현미경으로, 페트리 접시 덮개 또는 혈세포계에 희석된 20x 의 3개의 1.0 μL 방울에 있는 정액을 계산하여 희석되지 않은 현탁액의 정액 농도를 추정합니다.</li>
		<li>멸균 0.1x MMR에 있는 대략 80,000의 운동성 세포/mL에 원래 정액 견본의 aliquot를 희석하 여 조사를 위한 정액을 준비하십시오.</li>
		<li>지난 15분 이내에 얻은 계란의 수를 계산합니다. 파이펫 팁을 사용하여 이 서스펜션을 1mm 두께의 층으로 펼입니다.</li>
		<li>플라스틱 리프트를 사용하여 254 nm 가교의 전구에서 샘플을 4cm 떨어진 곳에 놓습니다. 800,000 uJ/mm2로견본을 조사하여 정액을 유전으로 비활성화하십시오.</li>
		<li>P10 파이펫을 사용하여, 비수정 계란에 현탁액을 파이펫, 조사 된 정자의 0.25−0.5 μL각 계란코팅. 계란을 실온에서 30 분 동안 앉게하십시오.</li>
		<li>30 분 후, 0.1 x MMR로 계란을 홍수. 즉시 8-10 °C 인큐베이터에 계란을 주사를 위해 다음날 또는 18 °C에서 7 시간 후 활성화 (hpa) 이내에 주사를 하십시오.</li>
		<li>수분 공급 후 30분 동안 날카로운 포셉을 사용하여 데젤리 하플로이드를 사용하소서. 즉시 8-10 °C 인큐베이터에 계란을 주사를 위해 또는 같은 날 주사를 위해 18 °C에서 놓습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 하플로이드 돌연변이 발생 및 유지 보수
<ol><li>CRISPR/Cas9 미세 주사<ol>
<li>CRISPRscan을 사용하여 sgRNAs를 설계하고26,27을합성합니다.</li>
		<li>멀티플렉스 돌연변이 발생의 경우, 5 sgRNAs (각 sgRNA당 10 ng /μL) 및 Cas9 단백질 (1 μg / μL)의 주식을 준비하십시오. 주입을 위해 이 스톡의 100배 희석(sgRNA당 0.1 ng/μL, 10 ng/μL Cas9)을 준비합니다. 단일 유전자의 경우, 높은 돌연변이 주파수 돌연변이 발생, 이전에 설명 된 프로토콜을 따르십시오28.</li>
		<li>18°C에서 저장한 경우 단세포 7hpa에서 하플로이드 배아를 주입하거나 8-10°C에서 보관하는 경우 다음날 2-8 세포 단계에서 배아를 주입한다.</li>
		<li>배아를 20% 폴리수크로오스 400으로 1.0x MMR로 옮김.</li>
		<li>단세포인 경우, 총 질량0.5 pg/sgRNA 및 50 pg Cas9 단백질을 포함하는 주사 액(난자의 약 1/4 반경)을 5 nL 드롭으로 각 배아를 주입합니다. 다세포인 경우, 더 작은 볼륨을 여러 세포에 주입하여 이 질량을 분배하십시오.</li>
		<li>배아가 최소 4시간 및 18°C에서 최대 18시간 동안 다수크로오스 400에서 치유되도록 한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>하플로이드 배아 하우징<ol>
<li>항생제 항균제로 배아를 0.1x MMR로 옮김.</li>
		<li>몇몇은 정지하거나 비정상적으로 발전할 것이기 때문에, 24 우물 격판덮개의 개별 적인 우물에 각 태아를 집. 16-18 °C에서 유지합니다. 필요한 경우 저온을 사용하여 개발을 연장할 수 있습니다.</li>
		<li>미디어를 매일 항생제 항균제로 0.1x MMR로 교체하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 디플로이드 숙주 배아 제제
<ol><li>배아를 12~16°C에서 12~26단계까지 유지한다.</li>
	<li>이식 준비가 된 배아를 수집하고 체(4mm 메쉬 크기)에 놓고 40% Holtfreter용액으로 부드럽게 헹구십시오.</li>
	<li>배아를 최대 2분 동안 1.5% 표백제를 함유한 필터 멸균 0.1x MMR로 옮기고, 배아를 표백액에 완전히 담그고 부드럽게 소용돌이치면 젤리 코팅이 표백제 용액과 완전히 접촉하여 미생물을 죽일 수 있습니다. 배아에 존재합니다.</li>
	<li>2 분 후, 동일한 부피의 필터 살균 0.1x MMR로 배아를 함유하는 표백제를 희석하십시오.</li>
	<li>배아를 표백제 살균 체(4mm 메쉬 크기)에 부드럽게 붓고 필터 멸균 0.1x MMR로 배아를 5회 헹구십시오.</li>
	<li>탈젤리를 위한 항생제와 함께 0.1x MMR로 멸균 된 10cm 페트리 접시에 배아를 놓습니다 (페니실린 100 단위 / mL, 스트렙토 마이신 100 μg / μL, 0.25 μg / mL, gentamicin 25 μg / mL).</li>
	<li>형광 입체 현미경에서 날카로운 집게 (팁 치수 0.05 x 0.01 mm2)를사용하여 GFP + 배아에서 젤리 코트와 비텔린 멤브레인을 제거하십시오.</li>
	<li>GFP+ 배아를 새로운 페트리 접시로 옮긴다. 데젤리가 있는 페트리 접시에서 옮겨지는 액체의 양을 최소화합니다.</li>
	<li>오염 물질을 제거하기 위해 GFP+ 숙주 배아를 항생제로 0.1x MMR로 4~6회 헹구십시오.</li>
	<li>이식하기 전에 깨끗한 배아를 밤새 4°C에 놓습니다. 참고 : 배아를 냉각하면 내배엽에서 중배엽을 보다 단단하고 깨끗하게 분리 할 수 있습니다.</li>
</ol>5. 하플로이드 디플로이드 키메라 세대
<ol><li>수술 접시 및 미디어 준비<ol>
<li>멸균 35mm 이지 그립 페트리 접시에 0.1x MMR에 2% 아가로스를 부어 멸균 수술 용 수술을 준비합니다. 아가로즈로 페트리 접시를 중간에 채웁니다.</li>
		<li>아가로오스가 식은 후 멸균 메스를 사용하여 아가로스에서 25mm 길이의 경사진 트로프를 잘라 배아를 제자리에 고정시십시오.</li>
		<li>멸균 수술 용지(안티 마이코플라즈마 2.5 μg/mL, 암포테리신 B 0.25 μg/mL, 시프로펠록사신 10.0 μg/mL)로 접시를 채우고 4°C에서 냉장 보관하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>배아 이식 절차<ol>
<li>1개의 건강한 하플로이드 공여체를 1~2단계 일치GFP+ 디플로이드 숙주 배아를 수술용 매체를 함유하는 수술용 접시의 트로프 내부에 놓는다(그림3). 참고: 가능하면 냉각 단계(10°C 이하)에서 절차를 수행하십시오.</li>
		<li>두 개의 초미세 오토클레이브 집게(직선 팁, 팁 치수 0.05 x 0.02 mm2)를사용하여 중심 부근의 사지 싹이 있는 호스트에서 이외 및 중배엽 층을 제거합니다(그림4). 참고 : 직사각형 조직 이식 영역은 사지 싹을 포함하고 앞쪽 후방 축을 따라 약 2mm, 아가미 벌지의 후방 절반에 아홉 번째 somite에서 확장합니다. dorsoventral 축을 따라 접목 된 영역은 약 1.5 mm에 걸쳐 있으며, 소미트를 포함하여 아가미 벌지의 복부 가장자리를 넘어서 다릅니다. 접목 된 영역은 기본 내배엽을 방해하지 않고 모든 측면 판 중배엽과 소미트의 측면 절반을 포함합니다. 자세한 내용은 그림 4 및 함께 비디오를 참조하십시오.</li>
		<li>숙주 조직을 제쳐두고 동일한 방법을 사용하여 haploid 공여자로부터 동등한 크기의 조직 시트를 제거하십시오.</li>
		<li>haploid 공여자 조직 시트를 공여자 배아의 해당 영역에 놓습니다.</li>
		<li>분쇄된 현미경 커버 유리에서 오토클레이브된 직사각형 유리 조각으로 조직을 덮고 숙주 배아 몸체로 부드럽게 눌러 조직을 고정시다.</li>
		<li>두 번째 숙주 배아에 대한 사지 싹을 수확하기 위해 다른 쪽에 haploid 공여자 배아를 뒤집습니다. 5.2.2단계부터 5.2.5단계까지 반복합니다.</li>
		<li>나머지 과잉 숙주 조직과 기증자 배아를 접시에서 조심스럽게 제거하십시오.</li>
		<li>유리 조각 앵커가 있는 접목을 60-75분 동안 제자리에 두고 20분마다 유리가 미끄러지지 않았는지 확인합니다.</li>
		<li>조직 접목이 완전히 부착된 후 집게를 사용하여 유리 조각 앵커를 천천히 벗깁니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>키메라 유지 보수<ol>
<li>생착식 배아를 신선한 수술 매체로 옮기고 밤새 8-12°C에서 유지하여 치유합니다. 개별적으로 12 또는 24 웰 플레이트에 생착 배아를 수용.</li>
		<li>36-48 h 후, 생착된 배아를 0.1x MMR 항생제 항균제로 옮김을 옮김시. 외과 매체에 있는 강한 항생제는 3 일 후에 생착한 태아에 있는 독성을 일으키는 원인이 됩니다.</li>
		<li>미디어를 2-3일마다 신선한 0.1x MMR 및 항생제로 교체하십시오.</li>
		<li>생착된 배아는 28°C를 먹일 수 있을 때까지18°C에서유지한다.</li>
		<li>1 ~2 개월의 발달 과 관리 후, haploid 사지는 형광 해부 현미경을 사용하여 이식의 순도를 위해 채점 될 수 있습니다. 참고: 사지에 비 신경 또는 비 혈액 호스트 파생된 GFP 조직의 존재는 불순한 접목의 표시기이고 수시로 이상한 사지 발달과 연관됩니다. 이러한 동물은 추가 분석에서 제외되어야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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저자는 공개 할 것이 없다.

운영 기술자가 일관된 접목 결과를 위해 고려해야 할 haploid-diploid 키메라를 생성하기 위한 프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다.
haploid 생성이 실패하는 가장 가능성이 높은 이유는 시험관 내 활성화 조건이 좋지 기 때문입니다. 운동성 정자의 적당한 양은 계란을 활성화하기 위하여 이용되어야 합니다. 운동성을 연장하기 위해 정자 샘플은 항상 4 °C에서 유지되어야합니다. 계란에 어떤 정자 견본을 적용하기 전에, 반전한 현미경을 사용하여 정액의 생존가능성을 확인하십시오. 완전히 운동성 정자는 결코 사용해서는 안되며, 농도는 80,000 운동세포/mL로 조정되어야 합니다. 활성화 단계에 있는 너무 많은 정액은 또한 일반적인 계란 발달을 방지할 수 있습니다. 정자 구덩이, 계란의 표면에 작은, 어두운 들여 쓰기로 나타나는, 정자 세포가 계란을 관통하고 일반적으로 정자를 적용 한 후 20~60 분 나타나는 물리적 표시입니다. 10 개 이상의 정자 구덩이와 계란 제...

역사적으로, 양서류에 있는 배아 조직 이식은 발달 생물학 및 재생의 근본적인 기계장치를 탐구하기 위한 중요한 기술이었습니다. 도롱뇽 의 종 인 액소로틀은 부상이나 절단 후 사지 및 장기와 같은 조직과 복잡한 구조를 재생하는 인상적인 능력을 가지고 있습니다. 마찬가지로 인상적으로, 그들은 배아, 청소년 및 성인 단계1,2,3에서다른 개인으로부터 거부, 조직 이식을받지 않고받을 수 있습니다. 사지, 꼬리, 눈 및 머리와 같은 전체 구조를 생성하는 배아의 영역, 신경 외피 및 소미트와 같은 보다 구체적인 조직은 키메라 동물을 생산하기 위해 배아 사이에 이식 될 수 있습니다1,2,4,5,6. 거의 한 세기 동안, 이러한 키메라 동물의 연구는 재생에 중요한 통찰력을 제공하고있다, 조직 분화, 크기 제어, 및 패터닝1,7,8.
지난 10 년 동안, 재생 조직의 수많은 전사 연구는 도롱뇽 재생9,10,11,12,13의기본 유전 프로그램에 대한 통찰력을 생산하고있다. 이 연구 결과는, 현재까지, 재생의 맥락에서 크게 특성화되지 않은 후보 유전자의 확장 목록에 추가했습니다. CRISPR/Cas와 같은 표적 돌연변이 유발 기술은 이제 이러한 유전자의 조사를 허용하고, 이러한 유전적 접근법은 최근 큰 액소로틀 게놈14,15,16의시퀀싱 및 조립에 의해 크게 촉진된다.
우리는 재생의 기계장치를 해부하기 위한 목적으로 고전적인 발달 생물학을 새로운 유전 기술과 결합하는 기술을 개발하고자 했습니다. 액소로톨 및 기타 도롱뇽의 하플로이드 배아를 생성하는 방법은 수십 년 동안17년동안 확립되어 왔다. 이러한 기술은 오랫동안 유전 모델유기체18로도롱뇽의 장점으로 지적되었지만, 몇 가지 후속 유전 연구는 haploid 동물을 통합했다. 우리는이식19를위한 조직 기증자역할을 하는 haploid 배아를 생성하기 위하여 axolotl에 있는 시험관 내 활성화를 이용합니다. 형광 유전 마커를 운반하는 배아를 사용하여, 우리는 기증자 조직에서 거의 전적으로 파생된 사지를 생성하기 위한 믿을 수 있는 방법을 고안했습니다(그림 1A). 이 두 기술을 결합해서, 우리는 haploidy와 관련되었던 늦은 배아 치사성을 우회하여, 완전히 개발된, 이식된 haploid 사지의 생산을 허용합니다(그림 1B, 그림 1B'및 그림 2).
돌연변이 haploid 사지를 가진 키메라 axolotls를 만들기 위하여 이식하기 전에 haploid 태아에 있는 CRISPR/Cas 중재한 돌연변이 발생을 수행해서, 우리는 사지 발달 과 재생의 문맥 내의 유전자 기능을 구체적으로 조사할 수 있습니다. 이것은 잠재적으로 배아 치명적인 돌연변이 표현형에서 사지의 구출을 허용합니다. CRISPR/Cas 미세주사는 매우 돌연변이가 높은 동물을 생성할 수 있지만, 이러한 동물은 전형적으로 매우 모자이크이며, 어느 정도의 야생형 대두류및 표적 부위에서의 다양한 뚜렷한돌연변이를가진다.4,20. haploid 세포에 있는 CRISPR 기지를 둔 돌연변이 발생은 유지된 야생형 eeles에 의해 마스크될 수 없기 때문에, 기능의 단 하나 대문자 손실 돌연변이의 침투를 증가합니다. 이러한 이유로, 하플로이드 세포주에서 CRISPR 기반 스크리닝은 많은 세포 과정의 유전적 기초를 조사하기 위해 점점 더 많이 사용되고있다 21,22,23. CRISPR 기반 계보 추적과 우리의 haploid 사지 싹 접목 프로토콜을 결합함으로써, 여기에 설명된 접근법은 살아있는 동물20에서haploid 유전 스크린을 위한 플랫폼으로 작용할 수 있다.

<table><tbody><tr><td>#55 Dumont 집게</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>11295-1</td><td>Dumostar 재료만 사용 (오토클레이브 가능)</td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2942-20ML</td><td>20 mL</td></tr><tr><td>항생제-항진균제 100x</td><td>Thermo Fisher</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Ciprofloxacin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>17850-5G-F</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400 (polysucrose 400)</td><td>bioworld</td><td>40600032-3</td><td>Ficoll 400</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1914-250MG</td><td></td></tr><tr><td>가열/냉각 인큐베이터</td><td>RevSci</td><td>RS-IF-233</td><td></td></tr><tr><td>인간 융모성 성선 자극 호르몬</td><td>Merk</td><td></td><td>Chorulon</td></tr><tr><td>Megascript T7 전사 키트</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM1334</td><td>40 반응</td></tr><tr><td>Miroscope 냉각 단계</td><td>Brook Industries</td><td>맞춤형</td><td></td></tr><tr><td>NLS Cas9 단백질</td><td>PNAbio</td><td>CP01-200</td><td>50 &micro의 4 바이알; g 단백질 각</td></tr><tr><td>Plasmocin</td><td>Invivogen</td><td>ant-mpt-1</td><td>처리 수준</td></tr><tr><td>Recipes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.0x Marc의 변형 Ringer's solution(MMR)</td><td></td><td></td><td>0.1 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 0.1 mM EDTA, 5 mM HEPES(pH 7.8), ph 7.4</td></tr><tr><td>40% Holtfreter's solution</td><td></td><td></td><td>20 mM NaCl, 0.2 mM KCl, 0.8 mM NaHCO3, 0.2 mM CaCl2, 4 mM MgSO4, pH 7.4</td></tr></tbody></table>

배아 이식을 통해 돌연변이 haploid 사지를 가진 키메라 색소꽃의 생성

Generation of Chimeric Axolotls with Mutant Haploid Limbs Through Embryonic Grafting

유전 기술과 자원의 성장 세트는 연구원이 성인으로 전체 사지를 재생하는 축색꽃과 같은 도롱뇽의 일부 종의 능력의 분자 기원을 탐구 할 수 있습니다. 여기에서, 우리는 유전자 기능 및 사지 재생의 충실도를 탐구하기 위하여 이용될 수 있는 Cas9 돌연변이 화한 haploid 앞다리를 가진 키메라 axolotls를 생성하는 데 이용된 기술을 개략적으로 설명합니다. 우리는 시험관 내 활성화, CRISPR/Cas9 돌연변이 발생, 조직 이식을 통해 여러 배아 및 유전 적 기술을 결합하여 재생의 모델 유기체에서 haploid 유전 스크리닝을위한 독특한 시스템을 생산합니다. 이 전략은 사지 재생에서 유전자의 기능 적 분석에 필요한 동물, 공간 및 시간의 수를 감소시킨다. 이것은 또한 유기 발생 조직 형성, 조직 형태 형성 및 그밖 필수 배아 프로세스와 같은 그밖 필수 프로세스를 위해 요구될 수 있는 유전자의 재생 특정 기능의 조사를 허용합니다. 여기에 설명된 방법은 척추동물 모델 시스템에서 haploid 유전자 스크리닝을 수행하기위한 독특한 플랫폼입니다.

발달하는 haploid 배아는 그들의 'haploid 증후군' 표현형29에의해 이형 배아와 구별될 수 있습니다. 이식 단계에서, haploid 배아는 노른자 플러그의 전방 후방 축 및 불완전한 인클로저를 따라 감소 된 곡률을 나타낸다(그림 3A). 형광 현미경은 haploid 배아가 친자 유래 GFP 발현의 자유롭다는 것을 확인하기 위하여 이용될 수 있습니다(그림 3B).
이식편이 깨끗할 때, GFP 표현은 그림 2에서볼 수 있듯이, 호스트의 척수에서 파생된 상아 신경총, 신경망에 주로 제한되어야 합니다...

이 프로토콜의 목적은 배아 조직 이식 기술을 사용하여 Cas9 돌연변이 공여자 조직에서 유래한 haploid 앞다리를 가진 키메라 액록톨을 생산하는 것입니다.

배아 이식을 통해 돌연변이 Haploid 사지를 가진 키메라 색소꽃의 생성

A growing set of genetic techniques and resources enable researchers to probe the molecular origins of the ability of some species of salamanders, such as ...

이 프로토콜은 축소로텔에서 유전 검열에 사용될 수 있는 돌연변이된 haploid 사지의 생산을 허용합니다. haploids에서, 심지어 낮은 수준의 돌연변이 발생은 세포 내의 기능 표현형의 손실을 생성할 수 있습니다. 이 접목 기술은 또한 배아 치명적인 표현형을 구출하기 위하여 이용될 수 있습니다.이 방법은 체외 수정 및 접목에 순종하는 모든 양용 종에서 재생을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. haploid 배아를 기증자로 사용하기 전에 GFP 양성 및 부정적인 디플로이드 배아 사이의 이식의 성공을 연습하고 확인하는 것이 좋습니다. 여성 게이머 기증자 준비를 위해, 성적으로 성숙한 흰색 또는 흰색 RFP 여성 axolotl을 마취하여 gamete 기증자로 봉사합니다.통증 시뮬레이션에 대한 반응의 부족을 확인 한 후, 30 게이지 인슐린 주사기를 사용하여 인간의 융기 생식선 인 성 생식샘을 뒷다리에 근육 에 0.15 밀리리터를 주입하십시오. 척수와의 접촉을 피하기 위해 주사기를 중간라인에 45도 각도로 삽입합니다. 주입된 동물을 신선한 40% Holtfreter용용으로 넣고 액졸로틀을 섭씨 8~12도의 냉장고로 48시간 동안 옮겨놓습니다.그런 다음 여성을 실온으로 되돌려 보입니다. 암컷이 알을 낳는 동안, 해부 현미경 아래 젖은 종이 타월에 완전히 마취 된 남성을 배치하고 지배적 인 손으로 클로카의 기지에 P1000 파이펫의 끝을 배치합니다. 다른 에이핑거와 엄지손가락 2~3센티미터 로스트랄을 골반에 놓고 손가락을 뒷다리쪽으로 움직이면서 동물을 부드럽게 짜서 각 샘플을 새로운 미세원심심분리기 튜브로 채취한 정자 소변 샘플을 씻어냅니다.그런 다음 각 샘플에서 5개의 마이크로리터를 페트리 접시로 옮겨 반전된 현미경을 사용하여 정자의 품질을 검사합니다. 카운트 후, 0.1X 멸균 MMR에서 밀리리터 당 네 번째 세포에 8 배 10의 농도로 정자를 희석하고 새로운 페트리 접시에 계란 당 정자 세포의 0.5 마이크로 리터를 전송. 그런 다음 파이펫 팁을 사용하여 서스펜션을 1mm 두께층으로 확산시키고 플라스틱 리프트를 사용하여 254 나노미터 크로스링커의 전구에서 4센티미터 떨어진 샘플을 밀리미터 제곱당 8회 10번에서 제곱당 5마이크로줄로 조사합니다.건강한 정자 샘플을 수집 한 후, 젖은 종이 타월의 스택에 supine 위치에 여성을 배치하고 여성 axolotl에서 수정되지 않은 계란을 추출하는 유사한 홍조 운동을 사

generation-chimeric-axolotls-with-mutant-haploid-limbs-through

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

blastula 또는 gastrula 단계에서 이식의 대상이 키메라 zebrafish의 배아를 생성하는 단계별 가이드.

이식에 의해 키메라 Zebrafish의 배아를 생성

Zebrafish 세포 이식은 조직 특정 chimeras를 생성하는 유전 발생학의 조합이 가능합니다. 이 비디오는 gastrula 우리 연구실은 forebrain의 접합면의 형성 중에 astroglial 인구와 구체적인지도 단서의 역할을 조사하기 위해 허용해야 세포 transplantations를 개최 보여줍니다.

조직 타겟 배아 Chimeras : Zebrafish Gastrula 세포 이식

하드 chorion 부드러운 배아, medaka의 배아의 조작으로 인해 더 zebrafish에 비해 참여합니다. 이 비디오는 chimeras의 생산을위한 이미징 및 세포 이식에 대한 아가로 오스의 장착 dechorionation 포함한 medaka의 배아를 조작하는 방법에 대한 단계별 절차를 나타냅니다. 이러한 절차는 척추 게놈 기능의 유전자 해부 위해 상호 보완적인 기능을 최대한 활용하기 위해 실험실에서 medaka와 zebrafish를 사용하는 필수적입니다.

Chimeras의 생성에 대한 Medaka의 태아 및 세포 이식의 Dechorionation

성장 인자 또는 신호 전달 경로의 특정 억제제에 적신 구슬을 발달 중인 배아에 접목함으로써 생체 내에서 그 효과를 직접 테스트할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 비드를 사지 싹에 이식하여 이러한 분자가 유전자 발현 및 신호 전달에 미치는 영향을 확인합니다.

유전자 발현에 영향을 미치는 신호 전달 진학을 확인하기 위해 닭 배아 사지 개발에 구슬의 접목

생존을 위해 필수적인 유전자 돌연변이 라인을 만들기 위한 기술 장애물 포즈. Leapfrogging 게놈 야생-타입 동물 생식 변이 들고 만드는 원시 생식 세포 이식으로 편집을 결합 하 여 치 사 율 circumvents. Leapfrogging 또한 F1 세대에서 null homozygous 돌연변이의 효율적인 생성을 허용합니다. 여기, 이식 단계는 보여 줍니다.

Xenopus 에 Leapfrogging CRISPR/Cas9-기반에 대 한 원시 생식 세포 이식

여기 axolotl 도롱뇽 (Ambystoma mexicanum), 심장 재생에 모델 종 뛰는 심장의 2 차원 및 3 차원 이미지 수집을 위한 심장 초음파 프로토콜 선물이. 이러한 메서드는 심장 기능 spatiotemporal 고해상도 경도 평가 대 한 수 있습니다.

Axolotl (Ambystoma Mexicanum)에서 2 차원 및 3 차원 심장 초음파 검사

여기에 제시된 프로토콜은 CAS9-gRNA 복합체를 척수 중앙 운하에 주입하고 전기 포공에 의해 액소로틀 척수에서 시간 및 공간 제한 유전자 녹아웃을 수행하는 프로토콜입니다.

CAS9 단백질-gRNA 복합체의 전기 포출을 통해 악소로틀 척수 신경 줄기 세포의 직접 유전자 녹아웃

이 글에서는 절단면을 통해 전두께의 피부를 즉시 봉합하여 액솔로틀 사지 재생 동안 상처 표피 형성을 억제하는 수술 방법을 수행하는 방법을 설명한다. 이 방법을 통해 연구자들은 사지 재생의 초기 단계에서 상처 표피의 기능적 역할을 조사 할 수 있습니다.

Axolotl 사지 재생 중 전체 피부 플랩 수술을 통한 상처 표피 형성 억제

재조합 팔다리는 배아 신호의 영향으로 세포 분화 과정과 패턴 생성을 연구 할 수있는 강력한 실험 모델입니다. 이 프로토콜은 상이한 유기체로부터 수득된 다른 세포 유형에 적응할 수 있는 닭 사지-중배엽 세포로 재조합 사지를 생성하는 상세한 방법을 제시한다.

치킨 재조합 사지 분석은 모르포겐, 패터닝 및 세포 분화의 초기 단계를 이해하기 위한

성숙한 아홀로틀에서 내부 플레이트 고정을 사용하는 대퇴골 절골술 수술을 위한 프로토콜이 제시됩니다. 이 절차는 수생 양서류의 사지 재생 및 골절 치유에 대한 비교 연구를 수행하는 데 사용할 수 있습니다.

Ambystoma mexicanum에서 플레이트 고정을 통한 대퇴골 절골술 안정화

이 프로토콜에서는 원자력 현미경(AFM)을 위해 아홀로틀 조직을 준비하고 온전하고 재생되는 사지 연골에서 압흔 측정을 수행하는 방법을 보여줍니다.

Atomic Force Microscopy: Intact and Regenerating Axolotl Limbs의 연골 측정

배우세요 액솔롯에서 돌연변이 단배체 사지를 생성하는 배아 조직 이식 기법을 통해 유전자 스크리닝을 수행하는 방법을. 이 기법은 양서류 재생 연구와 치명적 표현형 구조에 활용됩니다.

배아 이식을 통해 돌연변이 Haploid 사지를 가진 키메라 색소꽃의 생성

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