Name: 실시간 관찰을 위한 미세 유체 진화 가속기에 암 인구에 걸쳐 이기종 약물 그라데이션의 생성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: 배우세요 미세유체 암 온칩 모델을 활용한 실시간 암 역학 연구 방법입니다. 이 기술은 혼합 종양 집단의 진화와 약물 반응을 단세포 수준에서 정량 분석하여 전임상 약물 개발에 활용됩니다.

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이 작품은 NSF PHY-1659940에 의해 지원되었다.

1. 미세 유체 장치의 제조
<ol><li>레이아웃 설계 소프트웨어를 사용하여 원하는 미세 유체 패턴을 생성합니다(보충 재료참조).</li>
	<li>포토 마스크를 제작합니다. 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.<ol>
<li>레이저 라이터를 활용하여 100 nm의 Cr과 500 nm의 포토 레지스트 AZ1518로 코팅 된 소다 라임 유리 판에 패턴을 작성합니다.</li>
		<li>60s에 대한 개발자 AZ300MIF와 포토 레지스트를 개발합니다.</li>
		<li>Cr-7 크롬 에찬트(Cr-7 크롬 에찬트)를 사용하여 포토레지스트로부터 보호하지 않고 크롬을 에칭합니다.</li>
		<li>70°C에서 포토레지스트 스트리퍼를 사용하여 잔류 포토레지스트를 45분 동안 제거합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>포토레지스트 패턴을 패턴화합니다. 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.<ol>
<li>40s에 대한 4000 rpm에서 실리콘 웨이퍼에 HMDS를 스핀 코트.</li>
		<li>40s에 대한 4000 rpm에서 실리콘 웨이퍼에 스핀 코트 포토 레지던트 AZ4330.</li>
		<li>실리콘 웨이퍼를 95°C에서 60s로 부드럽게 굽습니다.</li>
		<li>마스크 얼라이너를 사용하여 실리콘 웨이퍼에 UV를 노출시다.</li>
		<li>4 분 동안 개발자 AZ300MIF와 포토 레지스트를 개발합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>DRIE 에칭을 수행합니다. 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.<ol>
<li>100 μm 깊이의 실리콘 딥 반응성 이온 에칭(DRIE) 시스템을 사용하여 포토레지스트로 패턴처리된 웨이퍼를 드라이 에칭.</li>
		<li>플라즈마 에칭으로 아세톤과 플라즈마 에칭으로 포토레지스트를 제거합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>웨이퍼 산화 및 실란화. 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.<ol>
<li>1100 °C에서 1시간 동안 용광로에서 에칭된 실리콘 웨이퍼에 열 산화를 수행합니다.</li>
		<li>실리콘 웨이퍼가 식을 때까지 기다린 다음 웨이퍼를 트리클로로-1H,1H,2H,2H-2H-2H-perfluorooctyl-silane(PFOTS) 몇 방울로 웨이퍼 근처의 작은 용기에 떨어뜨리는 데시케이터에 넣습니다.</li>
		<li>건조기의 압력을 실온에서 0.5 atm로 60 분 동안 펌핑합니다. 실리콘 웨이퍼 금형은 적절한 실란화 후 소수성이되어야하며, 웨이퍼에 여러 방울의 물을 추가하여 테스트 할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>부드러운 리소그래피. 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.<ol>
<li>프리 폴리머와 크로스 링커(폴리메틸실록산(PDMS) 키트를 10:1 중량 비율로 혼합합니다.</li>
		<li>혼합 PDMS를 부어 10mm 높이의 필름을 실란화 실리콘 웨이퍼 몰드에 만듭니다.</li>
		<li>생성된 PDMS-실리콘 웨이퍼 시스템을 30분 내지 1시간 동안 건조기에서 탈기한다.</li>
		<li>PDMS-실리콘 웨이퍼를 70°C 인큐베이터에서 밤새 배양하여 PDMS를 경화한다.</li>
		<li>PDMS가 경화되면 PDMS 필름을 실리콘 웨이퍼에서 조심스럽게 벗깁니다.</li>
		<li>생검 바늘을 사용하여 PDMS의 패턴 위치에 따라 입구 포트에서 구멍을 뚫고 원형 펀치를 사용하여 직경 27mm의 칩을 절단합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PDMS 층 접합.<ol>
<li>27mm PDMS 실린더의 두 스택 (패터닝없이)을 가열하여 장치의 저장소 층과 캡핑 층이됩니다.</li>
		<li>저수지 층의 입구 주위에 두 개의 7mm 원을 잘라 내고 생검 바늘을 사용하여 캡핑 층의 입구 포트에서 관통 구멍을 펀치합니다.</li>
		<li>PDMS의 세 스택을 결합 (패턴 스택, 저수지 층, 캡핑 층) 산소 플라즈마 처리와.</li>
		<li>생검 바늘로 콘센트와 장치의 중앙 포트에서 구멍을 뚫습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 미디어 및 세포주 준비
<ol><li>PC3-EMT 및 PC3-EPI를 포함한 PC3 세포주 배양용 배지를 준비합니다: RPMI 1640 배지와 10% 태아 소 혈청(FBS) 및 1x 항생제 항마이코제를 혼합합니다. 앞서 설명한 대로 세포주를생성합니다(14) 참고: PC3 세포주들은 37°C에서 5%CO2로가습된 인큐베이터에서 상기 매질에서 유지된다. 세포와 하위 배양을 분할 3 일, 그들은 에 도달하기 전에 100% 합류.</li>
	<li>종시질 표지형 형광 마커를 가진 트랜스펙트 세포주,앞서12일설명한 바와 같이, PC3-EMT는 세포질 GFP를 표현하고 PC3-EPI는 세포질 mCherry를 표현한다. 이 기술은 또한 모든 형광 표지 세포뿐만 아니라 표지되지 않은 세포의 밝은 필드 이미징과 도 호환됩니다.</li>
</ol>3. 실험 설정
<ol><li>금속 판 홀더 의 제조<ol>
<li>가공 또는 3D 프린팅을 통해 병렬 실험을 위해 동시 가스 투과성 배양 접시를 보관하기에 충분한 플레이트 홀더를 제작합니다. 3D CAD 파일("3웰 플레이트. FCStd")는 GitHub에서 참조(https://github.com/kechihl/3-well-plate)로 찾을 수 있습니다.</li>
		<li>드라이버로 홀더의 구성 요소를 풀습니다(그림2). 자외선 노출을 통해 성분을 최소 1시간 동안 소독하고 멸균 된 환경에 둡니다. 참고: 홀더는 공기 흐름을 허용하는 가스 채널 입구와 함께 열 평형 및 이상적인 가스 조성에 대한 실질적인 조건을 제공하도록 설계되었습니다. 자세한 내용은 전작12에서확인할 수 있습니다.</li>
		<li>세포 배양 막이 상대적으로 유연하다는 3 개의 가스 투과성 배양 접시를 준비합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>세포주 시딩<ol>
<li>실험 시작 24시간 전에, 5분 동안 트립시네이징으로 PC3-EPI 및 PC3-EMT 세포를 수확합니다. </li>
		<li>각 PC3-EPI 및 PC3-EMT의 세포를 혈전계를 사용하여 카운트하고 각 가스 투과성 배양 접시에 대해 각 세포 유형의 총 2.5 x 104를 분리합니다.</li>
		<li>2 mL의 배양 배지에서 두 세포 유형을 혼합하고 재중단하고 각각의 가스 투과성 배양 접시에 세포를 시드한다.</li>
		<li>세포가 부착할 수 있도록 전체 플레이트 홀더를 밤새 인큐베이터에 둡니다.</li>
		<li>적어도 1 시간 동안 UV 노출을 통해 PDMS 장치를 소독하고 멸균 환경에 둡니다.</li>
	</ol></li>
	<li>열 제어 장치 및 가스 공급 시스템 설정<ol>
<li>그림 3에표시된 것처럼CO2 및O2 제어 장치, 가스 펌프, 가스 혼합 챔버, 가습기 또는 버블러, 가스 밸브 및 압력 게이지 3개로 구성된 가스 공급 시스템을 설정합니다. 자세한 내용은 전작12에서확인할 수 있습니다.</li>
		<li>CO 2 및 N 2탱크 및O2 소스로부터 가스의 혼합 속도를 조정하도록 CO2 및O2 제어 유닛을 설정합니다. 또는 노르목시아 조건하에서 가스를 공급하는 모든 가스 공급 시스템이 작동합니다.</li>
		<li>상대 습도가 최대 85%(상대 습도 모니터에서 판독)되도록 혼합 챔버에 결합되어 버블러에 의해 가습되는 가스가 압력 게이지가 있는 3개의 독립적인 가스 밸브로 연결되는지 확인하십시오. 제어 하고 플레이트 홀더의 가스 유량을 모니터링합니다.</li>
		<li>전체 플레이트 홀더를 뚜껑과 바닥 판에 별도의 가열 하위 장치가 있는 단계 의 인큐베이션 열 제어 장치에 놓고 모든 장치를 37°C로 설정합니다. 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>미세 유체 장치의 설치. 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.<ol>
<li>그림 2와같이 3웰 플레이트 홀더의 상세 구성 요소가 순서대로 되어 있는지 확인합니다. 세 개의 우물은 각각 동일하고 독립적이며, 각 우물에 대한 가스 채널 쌍이 있습니다. 모든 우물은 가스 투과성 배양 접시 홀더, PDMS 칩 홀더, 유리 창 홀더 및 35mm 유리 창 쌍을 보유하고 있습니다. 이러한 구성 요소는 장착 된 나사를 사용하여 조립 할 수 있습니다. 참고: 유리 창은 가스 투과성 배양 멤브레인과 웰 사이에 열 절연 공간이 있는지 확인하여 인터페이스의 온도 차이로 인해 물 결로가 발생하지 않도록 합니다. 3개의 웰은 독립적이며 3개의 실험을 별도로 수행할 수 있습니다.</li>
		<li>37°C에서 예온 배양배지를 20분 동안 진공 챔버에서 탈기하였다.</li>
		<li>친수성을 유지하기 위해 30s의 산소 플라즈마 시스템을 사용하여 PDMS 칩을 치료하십시오.</li>
		<li>주사기 시스템을 설정합니다. 성장 매체와 관심의 원하는 시약 (미디어, 약물이있는 매체 등)으로 두 개의 주사기를 천천히로드하십시오. 각 개별 주사기를 50cm 튜브(0.020" x 0.060"OD)에 23G 디스펜싱 바늘로 하나의 중공 스틸 핀에 연결합니다. 튜브의 다른 쪽 끝에 중공 강철 핀을 삽입합니다.</li>
		<li>튜브를 프라이밍하고 강철 핀을 캡핑 층을 통해 각 PDMS 칩에 삽입합니다. 저장소 층을 채우고 PDMS 패턴 레이어 패턴을 용지로 적시다. 저수지 층은 온칩 버블 트랩으로 작동하여 기포가 미세 유체 패턴으로 들어가는 것을 방지합니다.</li>
		<li>배양 배지로 1mL 주사기를 로드합니다. 주사기를 5cm 튜브(0.020" x 0.060"OD)에 23G 디스펜싱 바늘로 하나의 중공 스틸 핀에 연결합니다. 튜브의 다른 쪽 끝에 중공 강철 핀을 삽입하고 튜브를 프라이밍합니다.</li>
		<li>칩 의 중앙 구멍에 중공 강철 핀을 삽입하여 칩 밀봉 공정 중에 나중에 칩에서 과도한 용지를 추출할 수 있습니다.</li>
		<li>각 PDMS 장치에는 주사기 펌프에 적재된 4개의 10mL 주사기가 필요하므로 전방 데크에 칩당 2개의 10mL 주사기를 적재합니다. 다른 두 주사기를 주사기 시스템의 인출 데크에 놓습니다.</li>
		<li>가스 투과성 배양 막 위에 칩을 직접 놓습니다 (세포가 이미 멤브레인에 부착된 경우). 미세 유체 패턴에 마이크로 버블이 갇히지 않도록 하기 위해 조립 전에 35mm 가스 투과성 배양 접시에 미리 따뜻해지고 탈기된 매체 1mL를 분배한 다음 칩이 15도 기울기 각도로 액체 표면에 접근하는지 확인하십시오.</li>
		<li>PDMS 칩 홀더를 아래쪽으로 밀어 내면서 각 칩에 대한 가스 투과성 배양 접시 홀더와 우물의 가스 투과성 배양 접시를 클램프합니다.</li>
		<li>칩이 마르지 않도록 PDMS 장치 위에 실러 시트를 테이프로 고정하고 PDMS 칩 홀더로 클램프합니다.</li>
		<li>어레이 주변의 미디어 유량을 20μL/h로 설정합니다.</li>
		<li>반전 된 현미경의 전동 단계에 무대 인큐베이터에서 전체 플레이트를 설정합니다. 가스 공급 시스템을 가스 채널에 연결하고 설치된 PDMS 칩에 대해 가스 투과성 배양 막을 가압하여 장치의 밀봉을 보장합니다. 0.2 psi (1.4 x 104 Pa)에서 게이지 압력을 유지합니다.</li>
		<li>중앙 구멍에서 1 mL 주사기를 사용하여 칩에서 과도한 매체를 천천히 추출합니다. 매체를 추출하는 동안 현미경 으로 칩을 관찰한 다음 칩이 밀봉되면 추출을 중지합니다. 칩 밀봉은 세포의 일부가 미세 구조에 의해 분쇄될 것이기 때문에 명백해야 한다.</li>
		<li>온스테이지 인큐베이터의 온도 감지 장치를 3웰 플레이트에 연결하고 37°C로 설정합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>4. 단세포 시간 경과 화상 진찰
<ol><li>역현미경을 활용하여 타임랩스 이미지 수집을 위한 이미징 소프트웨어를 설정합니다. EA 실험에는 완전히 전동된 x-y 단계, 초점 노브, 셔터 및 필터 큐브가 있는 반전형광 현미경이 필요합니다.</li>
	<li>자동 초점 한 라운드 후 자동 이미지 스티치와 각 칩에 대한 10배 배율로 두 채널에 걸쳐 이미지를 획득하도록 소프트웨어를 구성합니다. Perfect Focus와 같은 자동 보정 시스템이 만족스러운 이미지 품질을 보장하지는 않습니다. 칩 전체의 자동 초점 또는 수동 포커스를 기반으로 장기적인 이미지 수집을 위해 사용자 지정된 포커스 표면을 생성하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>매시간 이미지를 찍고 실험을 몇 주 단위로 실행합니다. 매일 이미지 품질을 모니터링하고 필요한 경우 초점 표면을 업데이트합니다.</li>
	<li>앞서13일설명한 바와 같이 후속 면역형광 분석을 위해 PDMS 칩 및 가스 투과성 배양 접시를 준비한다.</li>
</ol>5. 이미지 처리 및 분석
<ol><li>실험 후 처리<ol>
<li>피지/ImageJ를 활용하여 이미지 처리 및 측정을 위해 이미지를 TIFF 형식으로 변환합니다.</li>
		<li>TIFF 파일을 압축하여 추가 이미지 처리를 용이하게 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>피지/이미지J 분석<ol>
<li>세포를 식별하려면 배경 빼기 및 입자 분석을 수행하여 세포 위치 감지 및 자동 세포 계수를 위한 형광 밝은 반점을 식별합니다.</li>
		<li>플러그인 (수동 추적, 화학 요법, 마이그레이션 도구, Trackmate)를 활용하여 세포 운동성 및 마이그레이션을 분석합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

이해 상충이 선언되지 않았습니다.

종래의 세포 배양은 거의 100년 전에 개발되었으며, 암17에서임상 결과를 예측하는 능력이 제한적이라는 입증된 능력에도 불구하고 생물의학 연구에서 가장 자주 사용되는 전임상 모델로 남아 있다. 동물 모델은 인간에게 가장 높은 생리학적 관련성 및 합리적인 유전적 유사성을 제공하지만, 인간의 결과를 예측하는 데 상당한 한계가 있다고 오랫동안 인정되어 왔다18. 기존의 모든 전임상 모델 중에서, 미세유체암-온칩 모델은 암 연구에서 충족되지 않은 요구를충족시키는 가장 유망한 후보로 나타났다9,19,20. 그러나 현재 암 온 칩 모델은 종양 미세 환경을 포괄적으로 모방하는 주요 구성 요소 및 상호 작용을 재현할 수 있는 플랫폼을 아직 제공하지 않았지만 신뢰할 수 있고 재현 가능한 정량적 ...

암은 돌연변이 된 세포 집단의 지속적인 dysregulation뿐만 아니라 암세포와 숙주 미세 환경 사이의 중요한 상호 작용에 의존하는 복잡한 생태계로 점점 인식되고 있습니다. 이러한 의미에서, 암은 다양한 숙주 세포와의 이기종 종양 미세 환경 및 누화를 포함한 요인의 조합에 의해 나타나는 적응형 풍경에서 진화하며, 이 모두는 추가 유전적 또는 또는 후성 유전학 변경1,2,3. 고형 종양의 맥락에서, 화학요법 및 그밖 자원 구배의 고르지 않은 분포는 그들의 분자 이질성에 기여하고 약 저항의 발달에 있는 역할을 할 수 있습니다, 특정 종양에 증가한 혈관 신생 하위 인구, 심지어 전이4,5,6. 기존의 시험관 내 2D 세포 배양 연구는 대규모의 편리한 실험 능력을 유지하면서 평균 필드, 균일 및 고정 조건을 제공하며, 종종 진정으로 필요한 정확한 공간 및 시간적 환경 제어가 부족합니다. 생체 내 종양 역학에 에뮬레이트합니다. 따라서, 역학 적 스트레스 내에서 약물에 대한 반응뿐만 아니라 암 진행의 더 나은 예측을 위해 약물 개발 파이프 라인에서 동물 모델 이전에 종양 미세 환경을 재현하는 보다 대표적인 ex vivo 모델에 대한 필요성이 있다. 풍경. 미세유체학은 제어 가능한 정량적연구를지원하지 못할 수 있는 2D 세포 배양 연구와 보다 복잡한 생체내 동물 연구 사이의 격차를 해소하기 위해7,8,9로제안되었다.
암 세포 역학을 특성화하는 이상적인 시험관 내 시스템은 종양에서 일어날 수 있는 적응형 세포 반응을 모방하는 이기종 미세 환경을 생성할 수 있을 뿐만 아니라 이러한 역학의 관찰을 허용해야 합니다. 단일 셀 해상도. 이 기사에서는, 우리는 미세 유체 세포 배양 플랫폼, "진화 가속기"라는 PDMS 기반 장치를 설명 (EA), 즉 세포 해상도에서 암 세포 역학의 병렬 체외 연구를 허용 하는 실시간 데이터 수집 몇 주 동안, 문화 풍경에 걸쳐 스트레스의 그라데이션을 안정적으로 유지하면서. 이 플랫폼의 디자인은 메타 인구에서 유기체의 진화 역학을10,11가속화 할 수있는 우리의 이전 작업을 기반으로합니다. 특히, 공간적으로 분리된 집단의 그룹에서 어느 정도 상호작용하는 이질적인 응력 풍경에 노출될 때, 가장 적합한 종은 큰 균일한 집단에 비해 지역 집단에서 더 빨리 지배할 수 있다. 유리한 종은 자원과 공간을 찾기 위해 이웃 의 미생물 서식지로 이동하고, 결국 전체 인구를 지배. 도 1에도시된 바와 같이, 미세유체 EA 칩의 패턴은 (i) 한 쌍의 서펜타인 채널로 구성되어 신선한 배지 순환을 제공하고 화학적 확산을 위한 고정 경계 조건을 구성하고, (ii) 육각형 세포 배양 영역을 구성한다. 109 개의 상호 연결된 육각형 과 24 개의 반 육각 형 챔버가 중앙에 들어 있으며 벌집 구조를 닮았습니다. 칩의 깊이는 100 μm입니다. 미디어 채널 및 세포 배양 영역은 작은 슬릿 (약 15 μm 폭)과 연결되어 직접 적인 배지 흐름과 세포 배양 영역 전반에 걸친 전단 응을 방지하면서도 화학 물질이 작은 슬릿을 통해 확산되고 영양소를 교환 할 수 있습니다. 신진 대사 폐기물 등 화학 그라데이션의 생성은 한 매체 채널이 플루오레세인의 0.1 mM을 포함하고 다른 채널에는 불소가 없는 경우 그림 1B에서입증됩니다. 세포는 가스 투과성 멤브레인상에서 배양되고, 칩에 대한 멤브레인에 대한 양압을 통해 미세 구조에 의해 캡슐화된다. 장치 홀더의 구성 요소는 그림 2에도시되어 있으며, 실험 설정은 도 3에도시되어 있으며, 여기서 배양은 37 °C의 반전된 현미경상에서 유지되고, 상대 습도가 85% 이상이며, 아래 조건부로 조절됩니다. 노르목시아 가스 조성.
이 시스템은 브라이트필드 및 형광 채널을 통해 국부적인 세포 상호 작용에 대한 상세한 관찰을 제공하며 면역 형광, 웨스턴 블롯 또는 질량 분석과 같은 공간적으로 해결된 하류 분석법을 허용합니다. 우리는 이전에 상피 및 중간엽 PC3 전립선 암 세포(12)의 장기 공동 배양뿐만 아니라 약물 내성 폴리 플로이드 거인의 출현에 대한 이 미세 유체 암 온 칩 모델의 원리 증명으로 입증되었습니다. 상피 PC3세포주(13)를이용한 암세포. 우리는 도세탁셀의 스트레스 구배하에서 상피 PC3 및 중간엽 전립선 암 세포의 시공간 역학을 이해하기 위해이 플랫폼의 응용 프로그램을 제시하는 동안, 미세 유체 시스템은 세포주 조합의 모든 조합에 쉽게 적용 될 수있다 및 자원 (즉, 약물, 영양소, 산소) 그라데이션.

<table><tbody><tr><td>10 mL BD Luer-Lok 팁 주사기</td><td>BD</td><td>14-823-16E</td><td></td></tr><tr><td>항생제-항진균제</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955</td><td>1x 항-항</td></tr>-<tr><td>항 AZ 300 MIF</td><td>Merck KGaA</td><td>18441123163</td><td>감광액 개발자</td></tr><tr><td>AZ1518</td><td>Merck KGaA</td><td>AZ1518</td><td>감광액</td></tr><tr><td>AZ4330</td><td>Merck KGaA</td><td>AZ4330</td><td>감광액</td></tr><tr><td>Cr 크롬 에챠</td>트 <td>시그마-알드리치</td><td>651826</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청 (FBS)</td><td>Life Technologies Corporation</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>하이델베르크 DWL 66+ 레이저 라이터</td><td>하이델베르크 기기</td><td>DWL66+</td><td>라이팅 포토마스크</td></tr><tr><td>헥사메틸디실라잔(HMDS)</td><td>시그마-알드리치</td><td>379212</td><td>포토레지스트 접착력 향상용</td></tr><tr><td>중공 스틸 핀</td><td>New 영국 소형 튜브</td><td>NE-1300-01</td><td>&nbsp;. 025 OD .017 ID x .500 길이 / 유형 304 WD fullhard</td></tr><tr><td>ibidi 난방 시스템, 다중 웰 플레이트, K-Frame</td><td>ibidi</td><td>10929</td><td>무대 위 인큐베이터&nbsp;</td></tr><tr><td>Luer-Lok 23 G 디스펜싱 니들</td><td>McMaster-Carr</td><td>75165A684</td><td>주사기와 튜빙 연결</td></tr><tr><td>Lumox dish 35</td><td>Sarstedt</td><td>94.6077.331</td><td>가스 투과성 세포 배양 접시</td></tr><tr><td>Microposit Remover 1165</td><td>Dow Electronic Materials</td><td>Microposit Remover 1165</td><td>Photoresist stripper</td></tr><tr><td>Microseal B Adhesive Sealer</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>MSB1001</td><td>접착제 실러</td></tr><tr><td>O-링(Lumox 플레이트 씰링용)</td><td>McMaster-Carr</td><td>9452K114</td><td>대시 번호 27; 1-5/16" ID x 1-7/16" OD; Duro 70</td></tr><tr><td>O-링(하단 유리 창 씰링용)</td><td>McMaster-Carr</td><td>9452K74</td><td>Dash No. 20; 7/8" ID x 1" OD; Duro 70</td></tr><tr><td>플라즈마-핀 플라즈마 청소/에칭 시스템</td><td>Plasmatic Systems, Inc</td><td>플라즈마-핀</td><td>산소 플라즈마 시스템</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies Corporation</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Samco RIE800iPB DRIE</td><td>Samco</td><td>RIE800iPB</td><td>Deep reactive-ion 에칭 시스템</td></tr><tr><td>Suss MA6 마스크 정렬기</td><td>SUSS MicroTec</td><td>MA6</td><td>마스크 정렬기&nbsp;</td></tr><tr><td>Sylgard 184 실리콘 엘라스토머</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9285739</td><td>PDMS 엘라스토머</td></tr><tr><td>TePla M4L 플라즈마 에</td>칭<td>기 PVA TePla</td><td>M4L</td><td>플라즈마 에처</td></tr><tr><td>Trichloro-1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl-silane (PFOTS)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>448931</td><td>실리콘 웨이퍼 실란화</td></tr><tr><td>용 Tygon 마이크로 보어 튜브 (0.020 "x 0.060"OD)</td> <td>Cole-Parmer</td><td>EW-06419-01</td><td>튜빙 미디어 전송용</td></tr></tbody></table>

실시간 관찰을 위한 미세 유체 진화 가속기에 암 인구에 걸쳐 이기종 약물 그라데이션의 생성

Generation of Heterogeneous Drug Gradients Across Cancer Populations on a Microfluidic Evolution Accelerator for Real-Time Observation

기존의 세포 배양은 암에서 임상 결과를 예측하는 입증된 제한된 능력에도 불구하고 가장 자주 사용되는 전임상 모델로 남아 있습니다. 미세 유체 암 온 칩 모델은 지나치게 단순화된 기존의 2D 배양과 보다 복잡한 동물 모델 사이의 격차를 해소하기 위해 제안되었으며, 이는 신뢰할 수 있고 재현 가능한 정량적 결과를 생성하는 능력이 제한적입니다. 여기에서, 우리는 포괄적인 방식으로 복잡한 종양 미세 환경의 중요한 분대를 재현하는 microfluidic 암 온 칩 모형을 제시하고, 그러나 암 역학의 강력한 양적 설명을 제공하기 위하여 충분히 간단합니다. 이 미세 유체 암 온 칩 모델, "진화 가속기," 이질적인 화학 요법 스트레스 풍경을 생성 하는 동안 종양 미세 환경의 상호 연결 된 배열으로 암 세포의 큰 인구를 분해. 약물 구배에 반응하는 암의 진행 및 진화 역학은 몇 주 동안 실시간으로 모니터링할 수 있으며, 수많은 다운스트림 실험은 실험 과정을 통해 촬영된 시간 경과 이미지에 상보적으로 수행될 수 있다.

칩에서 최적의 세포 성장 검증 실험 플랫폼의 주요 목표는 복잡한 종양 미세 환경에서 중요한 구성 요소 와 상호 작용을 포괄적으로 재현하면서도 정량적이고 신뢰할 수 있고 재현 가능한 데이터를 제공하기에 충분합니다. 이 목표는 우리가 물리적 및 생화학적 환경 요인을 완전히 통제할 수 있는 경우에만 달성할 수 있습니다. 우리는 원하지 않는 요인을 배제하거나 모집단 행동을 올바르게 해석하기 위해 통제할 수 없는 요소를 정량적 모델에 통합하는 방법을 찾아야 합니다.
첫 번째 테스트는 장치에서 최적의 세포 성장을 보장하는 것입니다. 장치에 대한 세포 증식 속도는 종래의 세포 배양에서 그들의 성장 프로필과 동일하거나 비교할 필요가 있다. 원리의 증거로서, 인간 전립선암 세포주 PC3 세포는 외부 스트레스의 존재 없이 PDMS 칩에서 배양하였...

우리는 단일 세포에서 잘 정의 된 환경 조건 내에서 암 역학의 장기 실시간 정량 적 연구를위한 제어 가능한 플랫폼을 제공하는 미세 유체 암 온 칩 모델인 "Evolution Accelerator" 기술을 제시합니다. 수준. 이 기술은 근본적인 연구 또는 전임상 신약 개발을 위한 시험관 내 모델로 작동할 것으로 예상됩니다.

Conventional cell culture remains the most frequently used preclinical model, despite its proven limited ability to predict clinical results in cancer. ...

우리가 진화 가속기를 호출이 미세 유체 암 온 칩 모델은 단일 세포 수준에서 잘 정의 된 환경 조건 내에서 암 역학의 장기, 실시간 정량적 연구를위한 제어 가능한 플랫폼을 제공합니다. 이 기술은 우리가 종양과 같은 스트레스 풍경 하에서 암의 진화역학을 탐구할 수 있게 합니다. 형태, 인구, 운동성 및 셀룰러 수준에서 시간이 지남에 따라 마이그레이션을 포함한 정보를 제공합니다.잘 통제된 응력 그라데이션 하에서 혼합 종양 집단의 행동을 통제하고 감시하는 기능을 통해 우리의 기술은 전임상 약물 개발을 위한 생리학적으로 관련된 모델을 제시할 수 있습니다. 제시된 압력 밀봉 포장 방법은 또한 주변 가스 조성및 다운스트림 실험 용량의 정교한 조정을 요구하는 다른 미세 유체 시스템에서 구현될 수 있다. 장기적인 실험을 성공적으로 수행하는 열쇠는 신체적, 생화학적으로 안정적인 환경을 확보하는 것입니다.온도, 습도 및 가스 구성을 포함한 요인을 항상 모니터링해야 합니다. 먼저 3D 프린팅 머신에서 동시 가스 투과성 배양 접시를 보관하기에 충분한 플레이트 홀더를 제작합니다. 스크류 드라이버로 사용자 정의 세 개의 잘 샘플 플레이트의 구성 요소를 풀수 있습니다.적어도 1 시간 동안 UV 노출을 통해 성분을 소독하고 멸균 환경에 둡니다. 셀주 파종을 시작하려면 10센티미터 배양 접시에 각 PC3-Epi 또는 PC3-EMT 세포 배양에 5밀리리터의 트립신을 추가하고 섭씨 37도에서 인큐베이터에서 5분 동안 트립시니화를 실행한다. 배양 접시에서 세포를 15 밀리리터 원심분리기 튜브로 옮긴 다음 원심분리기를 150배 g에서 3분간 전달합니다.상부체를 폐기합니다. 15 밀리리터 원심분리기 튜브에서 각 세포 펠릿을 다시 중단하고 혈전계를 사용하여 각 PC3-MP 또는 PC3-EMT의 세포를 계산합니다. 각 세포 유형의 4개에 총 2.5배 10배를 분리한다.두 개의 분리된 세포 유형을 혼합하고 배양 매체의 2밀리리터에 추가합니다. 세포 배양의 2밀리리터를 각각 3개의 가스 투과성 배양 접시에 넣습니다. 세포가 부착할 수 있도록 밤에 37도섭씨에서 인큐베이터에 투과성 가스를 남깁니다.적어도 1시간 동안 자외선 노출을 통해 PDMS 장치를 소독하고 멸균 환경에 둡니다. 이제 이산화탄소와 산소 제어 장치, 가스 펌프, 가스 혼합 챔버, 가습기 또는 버블러, 가스 밸브 3세트 및 압력 게이지로 구성된 가스 공급 시스템을 구축했습니다. 또는 노목시아

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

우리는 잘 정의된 microenvironment의 공간 및 시간적 그라디언트를 생성할 수있는 그라디언트 생성 microfluidic 장치의 microfabrication을위한 프로토콜을 설명합니다. 이 방법에서는, 그라디언트 생성 microfluidic 장치가 감독 셀 마이 그 레이션, embryogenesis, 상처 치유, 및 암 전이를 공부하는 데 사용할 수 있습니다.

세포 생물학을위한 그라디언트 생성 Microfluidic 장치

우리는 이기종 종양 microenvironments를 재현 마이크로 유체 장치의 제조 및 운영을위한 절차를...

종양 Microenvironment를 재현을위한 마이크로 유체 장치<em&gt; 체외에서</em

원발성 다발성 골수종 세포에 대한 고처리량 약물 감수성 분석을 설명합니다. 이는 멀티웰 플레이트에서 골수 미세환경(세포외 기질 및 기질 포함)을 재구성하는 것과 세포 생존율의 종적 정량화를 위한 비침습적 방법으로 구성됩니다.

차 다발성 골수종 세포의 약물 민감도의 특성에 대한의 Organotypic 높은 처리량 시스템

화학적 및 산소 구배의 제어는 세포 배양에 필수적입니다. 이 논문은 세포 이동 연구를 위한 화학적 및 산소 구배의 조합을 안정적으로 생성할 수 있는 폴리디메틸실록산-폴리카보네이트(PDMS-PC) 미세유체 장치를 보고하며, 이는 정교한 기기 없이 생물학 실험실에서 실용적으로 활용할 수 있습니다.

셀 마이그레이션 연구에서 수직 화학 산소 그라디언트에 대한 폴리 디메틸 실록산 - 폴리 카보네이트 미세 유체 장치

다양 한 질병의 표시 더 순수 관련 모델 개발 및 구현에 약물 발견 프로그램 되. 여기에 설명 된 새로운 모델 시스템 spheroids를 경작 하 고 종양학 신약에 대 한 검색 하는 높은 처리량 1536-잘 접시 기반 시스템에서 상영 될 수 방법을 3 차원 종양을 보여 줍니다.

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우리는 셀과 다중 세포 소기관으로 3D 문화와 실험을 위한 장치를 구성 하는 방법을 설명 합니다. 이 장치는 정의 된 화학 유인 구배가 있는 3D 미세 환경에서 가용성 신호에 대 한 셀룰러 응답을 분석 할 수 있습니다. 유기 체는 약한 시끄러운 입력의 검출에 단일 세포 보다 낫다.

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암 줄기 세포를 표적으로 하는 반대로 신 생물 성 약 검열을 위한 생리학 환자 파생된 3D Spheroids

이 보고서는 여러 단일 세포의 고효율 페어링 및 현미경 분석을 달성할 수 있는 단일 세포 배양 실험을 설정하는 미세 유체 칩 기반 방법을 설명합니다.

미세 유체 칩으로 결정적인 방식으로 단일 셀 기반 공동 배양 구축

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고처리량 미세 유체 장치를 사용하여 동적 환경 조건의 생성

면역 요법 및 단일 세포 게놈 프로파일링 시대에 암 생물학은 적절한 시공간 맥락에서 종양-면역 인터페이스를 조사하기 위한 새로운 시험관 내 및 전산 도구를 필요로 합니다. 우리는 2D 및 3D 설정에서 종양 면역 미세유체 공동 배양을 활용하기 위한 프로토콜을 설명하며, 세포 기능의 동적 다중 매개변수 모니터링과 호환됩니다.

in vitro 종양 미세환경에서 면역 반응을 해부하기 위한 미세유체 공동 배양 모델

저산소증은 종양 미세 환경의 특징이며 암 진행에 중요한 역할을합니다. 이 문서에서는 3D 세포 인쇄 기술을 기반으로 저산소 암 온 어 칩의 제조 과정을 설명하여 저산소증 관련 암 병리학을 재구성합니다.

고형암의 병리학적 진행을 재구성하기 위한 3D 세포 인쇄 저산소암-온-어칩

배우세요 미세유체 암 온칩 모델을 활용한 실시간 암 역학 연구 방법입니다. 이 기술은 혼합 종양 집단의 진화와 약물 반응을 단세포 수준에서 정량 분석하여 전임상 약물 개발에 활용됩니다.

실시간 관찰을 위한 미세 유체 진화 가속기에 암 인구에 걸쳐 이기종 약물 그라데이션의 생성

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