Name: 마이크로 파이펫 포부로 전기 형성 및 기계적 특성 측정에 의한 거대한 Unilamellar 하이브리드 소포의 Obtention (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: 배우세요 마이크로 파이펫 포부 기법을 이용하여 거대한 단층 하이브리드 소포의 전기 형성 및 막 기계적 특성을 측정하는 방법을. 이 프로토콜은 생물물리학 및 세포생물학 연구에서 막 유연성과 안정성을 정밀하게 평가하는 데 필수적입니다.

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저자는 감사하게 금융 지원 (ANR Sysa)에 대한 ANR을 인정합니다.

1. 마이크로 파이펫 제조
참고: 여기에서는 내경이 6~12μm이고 테이퍼 길이가 3-4mm인 마이크로파이펫이 필요합니다. 마이크로파이펫 제조의 상세한 방법은 다음과 같은 것으로 설명되어 있다.
<ol><li>보로실리케이트 유리 모세관을 풀러의 드로바에 넣고 손잡이를 조여 끝부분 중 하나를 고정시다.</li>
	<li>조심스럽게 히터 챔버의 측면에있는 구멍을 통해 유리를 밀어.</li>
	<li>다른 쪽 끝에 있는 클램핑 노브를 아래로 조입니다.</li>
	<li>원하는 사양을 달성하기 위해 팁의 크기와 테이퍼 길이를 제어합니다. 이를 위해 가열 온도, 당김, 속도, 지연 및 압력과 같은 기술적 파라미터를 최적화합니다. 다음은 사용되는 프로그램의 예입니다. 열: 550 °C 당기기: 10 (기계 범위: 임의 의 단위에서 0-255) 속도: 30 (범위: 0-255 임의의 단위) 지연: 1 (범위: 0-255 임의의 단위) 압력: 500 (범위: 0-999 임의 의 단위)</li>
	<li>PUL L을 클릭하여 프로그램에서 정의한 이벤트를 실행합니다. 모세관은 두 개의 마이크로 파이펫으로 분리되어 마이크로 포지를 사용하여 치수를 조정해야합니다.</li>
	<li>마이크로포지의 금속 파이펫 홀더에 마이크로파이펫을 삽입합니다(그림 1참조). 10x 대물렌즈를 사용하여 파이펫 팁이 유리 비드 표면에 가까워질 때까지 현미경 스테이지와 파이펫 조작기(수직 및 수평 이동)를 조정합니다.</li>
	<li>발 스위치를 눌러 유리 비드를 녹입니다. 팁을 내리고 용융 유리 비드와 접촉합니다. 용융 유리는 모세관 작용에 의해 파이펫으로 흐를 것입니다. 도 1의삽입과 같이 용융 유리의 레벨이 특정 높이에 도달할 때까지 몇 초 정도 기다립니다.</li>
	<li>발 스위치의 압력을 제거하여 가열을 중지하고 수직 파이펫 조작기를 사용하여 팁을 신속하게 당겨 날카로운 파손을 일으킵니다.</li>
	<li>원하는 직경이 얻어지도록 1.7 및 1.8 단계를 반복합니다(6~12 μm). 참고: 직경 측정의 정확도를 향상시키기 위해 마지막 단계에서 는 레티클이 장착된 32x 대물렌즈를 사용하십시오.</li>
</ol>2. BSA (소 혈청 알부민)와 코팅 파이펫 팁
<ol><li>순수한 물에 1% wt. BSA를 함유하는 포도당의 0.1 M 용액을 준비한다.<ol>
<li>180 mg의 포도당 분말을 계량하고 15 mL 폴리 프로필렌 원두 튜브에 놓고 10 mL의 순수한 물로 완성하십시오.</li>
		<li>0.1 g의 BSA 파우더를 넣고 시험관 회전 믹서를 사용하여 완전히 용해될 때까지 부드럽게 흔들어 줍니다(약 4시간).</li>
	</ol>
</li>
	<li>바늘이 장착 된 10 mL 일회용 Luer 주사기로 용액을 가져 가라. 일단 충전되면, 바늘을 제거하고 0.22 μm 아세테이트 셀룰로오스 필터를 설치한다. 팁을 담그는 데 사용되는 여러 폴리 프로필렌 마이크로 원심 분리튜브 (1.5 mL)를 채웁니다.</li>
	<li>모세혈관을 홀더에 수직으로 놓습니다. 홀더를 내리고 팁을 밤새 포도당/BSA 용액에 담급전시. 용액은 모세관 작용에 의해 약 1cm 높이로 상승해야합니다.</li>
	<li>포도당/BSA 용액에서 파이펫 팁을 제거합니다. 0.1 M 포도당 용액 5 mL (순수한 물 5 mL에서 포도당 분말 90 mg 희석)을 준비하고 0.22 μm 아세테이트 셀룰로오스 필터를 통해 여과하십시오.</li>
	<li>유연한 융합 실리카 모세관이 장착된 500 μL 유리 주사기를 사용하여 포도당 용액으로 파이펫을 채웁니다. 그런 다음 모든 포도당 용액을 다시 빨아서 제거하고 폐기하십시오(그림 2). 이 단계를 여러 번 반복하여 무한BSA를 제거합니다.</li>
</ol>3. 전기형성에 의한 ROV 및 GUV 형성
참고 : 전기 형성은 안젤로바9에의해 개발 된 일반적으로 사용되는 기술이다. 전기 형성 챔버를 획득하고, 지질 또는 폴리머 필름(또는 GHUVs(자이언트 하이브리드 Unilamellar Vesicles)에 대해 둘 다)를 증착하고 대체 전기장 하에서 필름을 수화하는 절차는 다음과 같습니다. 얻어진 GUV를 수집하는 절차도 설명된다.
<ol><li>양과필, 자당 및 포도당 용액 준비<ol>
<li>1 mg /mL의 농도로 양서류 용액을 준비하십시오. 10 mg의 양서류의 무게를 측정하고 10 mL의 클로로포름에 용해하십시오. 용매 증발을 방지하기 위해 밀봉 된 바이알에 용액을 보관하십시오.</li>
		<li>클로로포름에서 1 mg/mL에서1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올라민-N-(리사민 로다민 B 설포닐)(DOPE-Rhod)의 스톡 용액을 준비합니다.</li>
		<li>양서류 용액에 10 μL의 형광 지질 용액을 추가하십시오. 용매 증발을 방지하기 위해 밀봉 된 바이알에 용액을 보관하십시오.</li>
		<li>자당과 포도당 용액을 0.1 M. 무게 342 mg과 180 mg의 자당과 포도당을 각각 준비하고 순수한 물 10 mL에 녹입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>전기 형성 챔버의 준비 참고 : 다른 전도성 재료는 전기 성형 장치를 만들기 위해 사용될 수있다 (예를 들어, 백금 와이어10,스테인레스 바늘11). 전기 형성 챔버는 조리개를 만들기 위해 한쪽에 절단 된 O 링 고무 스페이서로 분리 된 두 개의 ITO 슬라이드로 구성됩니다. 슬라이드는 두 개의 전선을 통해 전압 발생기에 연결됩니다(그림3 및 그림 4A).<ol>
<li>유기 용매 (예 : 클로로포름)로 ITO 슬라이드를 청소하십시오. 옴미터를 사용하여 전도성 표면을 식별합니다.</li>
		<li>접착제 테이프를 사용하여 전도성 측에 전선을 부착합니다.</li>
		<li>양서류 용액 증착<ol>
<li>모세관 작용에 의해 레벨이 증가할 때까지 용액에 모세관을 담그고 용액의 약 5 μL을 수집합니다.</li>
			<li>모세관을 ITO 유리 판의 중앙과 접촉시키고 용액을 부드럽게 펴십시오. 완전한 용매 증발을 보장하기 위해 10 초 동안 기다립니다(그림 4A).</li>
			<li>이 절차를 각 면에 대해 3번 반복합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>열린 O-링 스페이서의 양쪽에 실리콘 프리 그리스 레이어를 추가합니다. 증착 부위에 두어 두어 두어 두어 두어 두어 두는다. 스페이서 의 상단에 두 번째 ITO 유리 판의 도전성 면을 놓습니다.</li>
		<li>유기 용매의 흔적을 제거하기 위해 3 시간 동안 진공 아래에 전기 형성 챔버를 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>전기 형성 절차<ol>
<li>전선을 발전기에 연결합니다.</li>
		<li>생성기의 다음 설정을 사용합니다. 대체 정현파 장력 주파수: 10 Hz 진폭: 2V피크-피크 참고: 각 시스템에 대해 최적의 전압 주파수와 지속 시간을 찾아야 합니다.</li>
		<li>챔버에 용액을 주입하기 전에 전압이 가해지도록 하십시오.</li>
		<li>챔버를 채우기 위해 0.8 mm 내경 바늘이있는 주사기를 사용하여 용액 1 mL을 주입하십시오. 최종 거품을 제거합니다.</li>
		<li>챔버를 75분 동안 인가된 전압/주파수 아래에 놓습니다(그림4B).</li>
	</ol>
</li>
	<li>굽스 수확<ol>
<li>발전기를 끕지.</li>
		<li>0.8 mm 내경 바늘로 1 mL 주사기를 사용하여 챔버 내부에 기포를 생성하기 위해 용액의 작은 부분을 빨아. 이 거품이 챔버 내부로 이동하기 위해 챔버를 약간 기울입니다. 이렇게 하면 GUV가 ITO 표면에서 분리하는 데 도움이 될 수있습니다(그림4C).</li>
		<li>모든 용액을 빨아 1mL 플라스틱 튜브로 옮김하십시오.</li>
		<li>와이어를 제거하고 유기 용매 (톨루엔 다음 클로로포름)로 ITO 슬라이드를 청소하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 마이크로 조작 설정
참고 : 마이크로 파이펫 포부의 원리는 우울증을 적용하여 유리 마이크로 파이펫을 통해 단일 소포를 빨아하는 것입니다. 파이펫 내부의 혀 길이는 흡입 압력의 함수로 측정됩니다. 앞서 설명한 BSA의 피펫 코팅은 소포 막과 파이펫 사이의 접착을 방지하거나 최소화하는 데 필수적입니다.
프로토콜은 아래에 설명되어 있습니다.
<ol><li>파이펫 및 물 충전 저수지 연결 참고 : 물 채워진 탱크와 마이크로 미터는 슬라이딩 플레이트에 고정되어 있습니다. 마이크로미터 헤드가 있는 디지털 카운터는 0~2.5cm 범위의 장치의 수직 변위를 허용하고 알루미늄 광학 레일을 따라 1μm의 정확도를 제공합니다. 실리콘 튜브는 저수지와 모세관 홀더를 연결합니다(그림5A).<ol>
<li>탱크에 순수한 물을 채웁니다. 일회용 5mL 주사기를 실리콘 튜브를 통해 모세관 금속 홀더에 연결하고 흡인하여 탱크에서 홀더로의 물 흐름을 만듭니다.</li>
		<li>튜브를 약간 터치하여 기포를 제거합니다. 동시에 물 탱크를 올려 양압을 만듭니다. 5mL 주사기는 여전히 홀더에 부착되어 있습니다.</li>
		<li>앞서 설명한 코팅 및 세척 단계(2단계 참조)를 마친 후, 모세관을 포도당 용액으로 채우고, 마지막에 방울이 형성될 때까지 채웁니다. 금속 홀더에서 주사기 튜브를 제거하여 끝에 약간의 물 흐름을 만듭니다.</li>
		<li>모세관을 거꾸로 뒤집고 홀더의 물 흐름과 포도당 강하를 연결합니다. 모세관과 홀더를 함께 나사로 고정시고 고정합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>파이펫 배치 참고 : 이 작업 동안 물 탱크는 여전히 양압을 유지하기 위해 알루미늄 레일에 배치됩니다.<ol>
<li>두 개의 유리 슬라이드 (이전에 에탄올로 청소)가 장착 된 수제 알루미늄 무대를 가지고 양쪽에 진공 그리스로 접착제. 현미경 단계에 설치하고 도 5B,C에도시된 바와 같이 0.1 M의 포도당을 함유하는 1 mL 주사기를 사용하여 두 슬라이드 사이에 반월상 연골을 형성한다.</li>
		<li>파이펫과 홀더를 마이크로 매니더의 모터 유닛에 놓고 클램핑 노브를 조입니다.</li>
		<li>거친 모드에서 제어판 조이스틱을 사용하여 포도당 반월 상 연골 근처의 마이크로 파이펫을 낮춥시됩니다. 미세 모드를 사용하여 팁의 위치를 반월 상 연골의 중심으로 조정합니다.</li>
		<li>포도당에 침지된 팁을 몇 분 간 유지하여 외부 및 내부 표면을 청소합니다(양압이 유지됨에 따라 물의 흐름이 피펫의 내부 표면을 헹구어 코팅되지 않은 BSA를 제거합니다).</li>
		<li>마이크로 매니더키보드에 팁의 위치를 저장하고 반월 상 연골에서 철회.</li>
		<li>포도당 반월 상 연골을 제거하고 신선한 것으로 대체하십시오. 20 μL 마이크로파이펫을 사용하여 0.1 M 자당에서 GUV 2 μL을 빨아 신선한 포도당 반월 상 연골에 넣습니다. DIC 모드 (차동 간섭 대비)에서 자당 (주로 GUV 내부)과 포도당 (주로 GUV 외부)의 밀도 차이로 인해 하단에위치한 GUV를 관찰하십시오.</li>
		<li>소포가 약간 수축되면 흡입 파이펫을 다시 삽입하고 팁에 초점을 맞춥니다. 압력이 거의 0인 물 탱크의 높이 H0을 설정합니다. 이를 위해 용액에 자연적으로 존재하는 작은 소포 또는 입자를 활용하고 이러한 입자의 움직임이 멈출 때까지 물 탱크 높이를 조정하십시오.</li>
		<li>이 시점에서 반월 상 연골을 미네랄 오일로 둘러싸서 물 증발을 방지하고 그림 5D를참조하십시오. 참고: 에어컨을 사용하여 실온을 20-22°C 사이에서 조절해야 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>마이크로파이펫 흡인 실험<ol>
<li>파이펫 팁(직경 6-12 μm)을 낮추고 작은 흡입(-1cm)을 만들어 소포(직경 15-30 μm)를 흡인합니다. 선택한 소포의 멤브레인은 약간 변동되어야하며 눈에 보이는 결함 (싹이나 필라멘트가 없음)을 제시해서는 안됩니다(그림 6).</li>
		<li>마이크로 조작기를 사용하여 다른 소포에서 흡인 된 소포를 분리하고 전체 실험 중에이 위치를 유지하기 위해 더 높은 수준으로 파이펫을 올립니다.</li>
		<li>물을 채워진 탱크를 약 -10cm로 낮추어 소포를 미리 응력한 다음 압력을 줄여 초기 값(-1cm)으로 되돌릴 수 있습니다. 이 단계를 여러 번 반복하여 막에서 막 과잉 및 작은 결함을 제거하십시오.</li>
		<li>물 탱크의 위치에 의해 정의 된 -0.5 cm의 높이에서, 천천히 멤브레인이 변동하는 정권에 도달하기 위해 마이크로 미터와 흡입 압력을 감소. 그런 다음 상당한 투영 길이 (몇 미크론)로 팁의 혀를 명확하게 시각화하는 압력을 증가시다. 참고: 가장 작은 멤브레인 프로젝션 길이(L0)를빨아 낼 수 있는 가장 낮은 인가 압력(P0)은 기준점 α0(도 7A)을정의합니다. 곡선의 모든 점은 이 기준에 따라 측정됩니다(ΔL = L-L0 및 ΔP = P-P0).</li>
		<li>0.5 -0.8 mN/m에 도달할 때까지 마이크로미터로 흡입 압력을 단계적으로 증가시다. 각 단계에서 5s를 기다렸다가 혀의 스냅 샷을 찍습니다. 낮은 장력에서이 절차는 굽힘 계수의 결정을 가능하게한다.</li>
		<li>레일에 채워진 물의 높이를 조정하여 0.5 mN/m에서 파열 장력까지 흡입 압력을 계속 증가시키십시오(-2에서 -50cm까지)(그림 7B-D). 높은 장력 정권에서이 실험에서, 영역 압축성 계수, 용해 긴장 및 용해 변형이 측정됩니다.</li>
		<li>중요한 통계를 얻기 위해 약 15-20 개의 소포를 늘입니다. 각 마이크로파이펫 흡인 실험은 7~10분 정도 소요됩니다. 혀의 투영 길이, 소포의 직경 및 모세관의 반경을 측정하기 위한 LASAF 소프트웨어를 사용하여 이미지 분석을 수행합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>벤딩 계수, 면적 압축성 계수, 용해 장력 및 용해 변형 측정<ol>
<li>이러한 매개 변수에 액세스하려면 E. Evans12가정한 형식주의를 사용하십시오. 방정식 1에서 멤브레인 위에 가해지는 흡입 압력을 계산합니다. Δ P =θ wg (h−h0) (1) 여기서 g는 중력 가속도(9.8m∙s-2)이고,θw는 물의 밀도(θ = 1 g∙cm-3),h는물탱크의 위치이고h0은 압력이 0과 같은 초기 위치이다.</li>
		<li>Laplace 방정식에서 멤브레인 장력을 계산합니다. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60199/60199eq1.jpg">(2) ΔP는 마이크로파이펫에 대한 흡입 압력, Rp 및 Rv는 각각 마이크로파이펫 및 소포 반경(마이크로파이펫 외부)이다. 멤브레인의 표면적 변형률(α)은 다음과 같이 정의됩니다. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/60199/60199eq2.jpg">(3) <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/60199/60199eq3.jpg">낮은 흡입 압력에서 소포의 막 영역이되는.</li>
		<li>방정식 412에따라 모세관 팁 내부의 소포의 투영 길이 ΔL 증가에서 α를 계산합니다. <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/60199/60199eq4.jpg">(4)</li>
		<li>매우 낮은 장력 체제하에서, 열 굽힘 기복의 평활화는 명백한 확장을 지배한다. 플롯 ln(σ) 대 α. 낮은 σ 값 (일반적으로 0.001-0.5 mN.m-13)에서,이것은 그 경사가 굽힘 계수, Kb (방정식 5의 첫 번째 용어)에 연결되는 직선을 제공합니다14: <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/60199/60199eq5.jpg">(5) 참고: 높은 장력(&gt; 0.5mN.m-1)에서는분자 간의 간격이 증가하여 멤브레인 기복이 완전히 억제되고 멤브레인 영역이 증가합니다. 이 정권에서, 수학식 5의 두 번째 용어는 영역 압축성 계수 Ka (그림 8 및 그림 9)에대한 액세스를 지배하고 제공합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

마이크로파이펫 코팅은 신뢰할 수 있는 측정을 얻기 위한 핵심 포인트 중 하나입니다. 마이크로파이펫에 소포의 부착을 방지해야 하며, 코팅은 BSA, β-카제인 또는 서파실과 함께 문헌17,18,19,20,21에서일반적으로 사용된다. 코팅 절차의 세부 사항은 거의 언급되지 않습니다.
BSA의 용해는 좋은 용해화를 달성하기 위해 교반 하에서 적어도 4 시간 동안 수행되어야한다. 그럼에도 불구하고, 여과 단계는 여전히 마이크로파이펫 팁을 방해할 수 있는 임의의 응집체를 제거하기 위해 요구된다. BSA가 잘 용해되지 않은 경우, 그것의 대부분은 여과에 의해 제거되며, 코팅은 효과가없을 것입니다. 이상...

인지질(liposomes)으로부터 얻은 거대 소포는 1970년대부터 기본 세포막 모델1로서널리 사용되어 왔다. 1990 년대 후반에, 그들의 지질 유사체2,3에관하여 명명된 폴리머의 자기 조립에서 얻은 포식어는, 급속하게 약한 기계적 안정성 및 가난한 모듈형 화학 기능을 가진 리포좀에 대한 흥미로운 대안으로 나타났습니다. 그러나, 그들의 세포 생모방 특성은 세포막의 주성분인 인지질로 구성되어 있기 때문에 리포좀에 비해 다소 제한적이다. 더욱이, 그들의 낮은 막 투과성은 막을 통해 종의 통제된 확산이 요구되는 약 납품 같이 몇몇 응용에서 문제가 될 수 있습니다. 최근, 하이브리드 폴리머-지질 소포 및 멤브레인을 설계하는 블록 공중합체와 인지질의 연관성이4,5연구의증가의 대상이 되고 있다. 주요 아이디어는 각 구성 요소의 이점 (지질 이중층의 생체 기능 및 투과성 및 폴리머 멤브레인의 기계적 안정성 및 화학적 다양성)을 시너지 효과로 결합하는 법인을 설계하는 것입니다: 제어 및 표적 약물 전달, 진단을위한 바이오 센서 내의 생체 분자 인식, 인공 세포를위한 기능성 멤브레인, 바이오 영감 마이크로 / 나노 반응기 의 개발.
요즘, 다른 과학 공동체 (생화학자, 화학자, 생물 물리학자, 물리 학자, 생물학자)는 더 진보 된 세포막 모델의 개발에 대한 관심이 증가하고있다. 여기서, 우리의 목표는 가능한 한 상세히, 기존의 방법론(전기형성, 마이크로파이펫 흡인)을 획득하고 거대 소포의 기계적 특성을 특성화하는 것 및 하이브리드 폴리머 지질 거대소포인최근 "고급" 세포막 모델을 제시하는것이다.
이러한 방법의 목적은 용해 응력 및 변형뿐만 아니라 멤브레인의 영역 압축성 및 굽힘 계수의 신뢰할 수있는 측정을 얻는 것입니다. 거대 소포의 굽힘 강성을 측정하기 위해 존재하는 가장 일반적인 기술 중 하나는 직접 비디오 현미경 관찰에 기초한 변동 분석6,7입니다. 그러나 이것은 큰 가시적인 막 변동을 요구하고, 두꺼운 막 (예를 들면 폴리머 섬)에 체계적으로 장악되지 않습니다. 면적 압축성 계수는 Langmuir Blodgett 기술을 사용하여 실험적으로 결정될 수 있지만 대부분의 경우 단층8에서결정됩니다. 마이크로파이펫 흡인 기술은 한 실험에서 거대한 unilamellar 소포 (GUV)를 형성하는 이중층에서 둘 다 moduli의 측정을 허용합니다.
다음 방법은 이중층을 형성할 수 있는 모든 양과성 분자 또는 거대 분자에 적합하며, 결과적으로 전기 형성에 의한 소포에 적합합니다. 이를 위해서는 전기 형성 온도에서 이중층의 유체 특성이 필요합니다.

<table><tbody><tr><td>마이크로피펫 설계에 필요한 장비 및 재료</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>borosilicate Glass Capillaries</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-4</td><td>외경 및 내경 각각 1mm 및 0.58mm.</td></tr><tr>필라멘트는 <td>Sutter Instrument Co.를</td> <td>설치했습니다</td>.<td>FB255B</td><td>2.5mm*2.5mm 상자 필라멘트</td></tr><tr><td>화염/갈색 마이크로피펫 풀러</td><td>셔터 계기 Co.</td><td>모델 P-97</td><td></td></tr><tr><td>Microforge</td><td>NARISHGE Co.</td><td>MF-900</td><td>2개의 대물렌즈(10x 및 32x)가 장착된</td></tr> <tr><td>BSA로 피펫 팁을 코팅하기 위한 재료</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 분획 V(BSA)</td><td>시그마-알드리치</td><td>10735078001</td><td></td></tr><tr><td>일회용 1ml 주사기 Luer Tip</td><td>Codan</td><td>62.1612</td><td></td></tr><tr><td>일회용 10ml 주사기 Luer Tip</td><td>Codan</td><td>626616</td><td></td></tr><tr><td>일회용 5 ml 주사기 Luer Tip</td><td>Codan</td><td>62.5607</td><td></td></tr><tr><td>일회용 아세테이트 셀룰로오스 필터</td><td>Cluzeau Info Labo</td><td>L5003SPA</td><td>Pore size: 0.22&micro; m, 직경 : 25mm</td></tr><tr><td>유연한 용융 실리카 모세관 튜브</td><td>Polymicro 기술.</td><td>TSP530660</td><td>내경 536&micro; m, 외경 660&마이크로; m,</td></tr> <tr><td>포도당</td><td>시그마 - Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>주사기 500 &마이크로; L luer Lock GASTIGHT</td><td>Hamilton Syringe Company</td><td>1750</td><td></td></tr><tr><td>시험관 회전 믹서</td><td>Labinco</td><td>28210109</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulation 설정</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>알루미늄 광학 레일, 1000mm 길이, M4 나사, X48 시리즈</td><td>Newport</td><td></td><td></td></tr><tr><td>감쇠 광학 테이블</td><td>Newport</td><td></td><td>외부 진동을 방지하기 위해 현미경의 지지대로 사용됩니다.</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Eppendorf</td><td>Patchman NP 2</td><td>모듈 유닛(X, Y 및 Z 이동을 위한 모터 유닛)은 어댑터를 통해 도립 현미경에 장착됩니다.</td></tr><tr><td>마이크로미터</td><td>Mitutoyo Corporation</td><td>350-354-10</td><td>Digimatic LCD 마이크로미터 헤드 25,4mm 범위 0,001mm</td></tr><tr><td>플렉시글라스 물통(100ml)</td><td>집에서 만든</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TCS SP5 도립 컨포칼 현미경(DMI6000)에는 공진 스캐너와 침수 대물렌즈(HCX APO L 40x/0.80 WU-V-I)가 장착되어 있습니다.</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>X48 레일 캐리어 80 mm 길이, 1/4-20, 8-32 및 4-40 스레드</td><td>포함 Newport</td><td></td><td></td></tr><tr><td>자당 및 양서류 용액 준비용 재료</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><a href="https://www.sigmaaldrich.com/catalog/substance/2oleoyl1palmitoylsnglycero3phosphocholine760082685331611" target="_blank"> 2-Oleoyl-1-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</a></td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>VWR</td><td>22711.244</td><td></td></tr><tr><td>L-&알파;-포스파티딜에탄올아민-N-(리사민 로다민 B 설포닐)</td><td>시그마-알드리치</td><td>810146C</td><td>로다민 태그 지질</td></tr><tr><td>자당 시</td><td>그마-알드리치</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Electroformation 설정</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 &micro; L 유리 모세관 링 캡</td><td>Hirschmann</td><td>9600110</td><td></td></tr><tr><td>일회용 1ml 주사기 Luer Tip</td><td>Codan</td><td>62.1612</td><td></td></tr><tr><td>H 그리스</td><td>Apiezon Apiezon</td><td>H 그리스</td><td>실리콘 프리 그리스</td></tr><tr><td>인듐 주석 산화물 코팅 유리 슬라이드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>703184</td><td></td></tr><tr><td>Needle</td><td>Terumo</td><td>AN2138R1</td><td>0.8 x 38mm</td></tr><tr><td>저항계(멀티미터)</td><td>Voltcraft</td><td>VC140</td><td></td></tr><tr><td>톨루엔</td><td>VWR</td><td>28676.297</td><td></td></tr><tr><td>전압 발생기</td><td>Keysight</td><td>33210A</td><td></td></tr></tbody></table>

마이크로 파이펫 포부로 전기 형성 및 기계적 특성 측정에 의한 거대한 unilamellar 하이브리드 소포의 obtention

Obtention of Giant Unilamellar Hybrid Vesicles by Electroformation and Measurement of their Mechanical Properties by Micropipette Aspiration

인지질및공중합체에서 얻은 거대 소포는 제어 및 표적 약물 전달, 진단을 위한 바이오센서 내 생체 분자 인식, 인공 세포를 위한 기능성 멤브레인, 바이오영감 마이크로/나노 반응기 개발 등 다양한 응용 분야에서 이용될 수 있습니다. 이러한 모든 응용 분야에서 멤브레인 특성의 특성화는 근본적으로 중요합니다. E. Evans가 개척한 기존 특성화 기술 중 에는 면적 압축성 계수, 굴곡 계수 및 용해 응력 및 변형과 같은 멤브레인의 기계적 특성을 측정할 수 있습니다. 여기서, 우리는 지질 또는 공중합체 (또는 둘 다)의 박막에서 거대한 소포를 얻기 위한 모든 방법론 및 상세한 절차, 마이크로파이펫의 제조 및 표면 처리, 및 이전에 언급한 모든 파라미터의 측정으로 이어지는 흡인 절차를 제시한다.

앞서 언급한 프로토콜을 통해 우리는 인지질에서 얻은 다른 합성 거대 단일 라멜라 소포 (GUV)를 연구했습니다 : 2-oleoyl-1-팔미토일 -sn-glycero-3-phophocholine (POPC), 삼중합체: 폴리 (에틸렌 옥사이드)-b-Poly (디메틸실록산)-b-폴리(에틸렌옥사이드) (PEO12-b-PDMS43-b-PEO12)이전 연구에서 합성된13,및 디블록 공중합체 폴리(디메틸실록산)-b-폴리( 에틸렌옥사이드) (PDMS27-b-PEO17). 인지질 POPC를 가진 삼중블록 공중합체 PEO8-b-PDMS22-b-PEO8의 협회가 생성된 GHUV(Gia...

이 프로토콜의 목표는 마이크로파이펫 흡인에 의해 거대 소포의 막 기계적 특성을 안정적으로 측정하는 것입니다.

마이크로 파이펫 포부로 전기 형성 및 기계적 특성 측정에 의한 거대한 Unilamellar 하이브리드 소포의 Obtention

Giant vesicles obtained from phospholipids and copolymers can be exploited in different applications: controlled and targeted drug delivery, biomolecular ...

이 프로토콜은 마이크로 피펫 포부 기술을 사용하여 합성 및 실제 폴리머 지질 소포의 멤브레인 기계적 특성을 신뢰할 수 있는 측정을 용이하게 합니다. 이것은 멤브레인 유연성과 불안정을 단일 실험에서 평가 할 수있는 유일한 기술입니다. 이 프로토콜에는 소포 준비부터 기계적 평가에 이르는 일련의 절차가 포함됩니다.인내심을 갖고 기술적 문제를 해결하는 것이 매우 중요합니다. 이러한 기술의 시각화는 모세관 표면을 올바르게 치료하는 방법과 필수 예비 단계를 수행하는 방법을 이해하는 데 중요합니다. 결함없이 소포를 표시합니다.시연 절차는 하이브리드 폴리머 지질 소포의 개발에 종사하는 실험실에서 박사 과정 학생 인 Martin Fauquignon이 될 것입니다. 절차를 시작하기 전에 차가운 유리 마이크로 피펫 모세 혈관을 홀더에 수직으로 배치합니다. 그리고 팁이 하룻밤 갓 준비 된 포도당 소 세럼 알부민 용액에 몰입 될 때까지 홀더를 낮춥다.다음날 아침까지 모세관 작용에 의해 약 1센티미터 정도 상승하여 팁으로 들어와야 합니다. 유연한 융합 실리카 모세관이 장착된 500 마이크로리터 유리 주사기를 사용하여 각 파이펫을 포도당 용액으로 채웁니다. 그런 다음 각 파이펫에서 용액을 흡인한 다음, 모든 혈청이 제거될 때까지 신선한 포도당 용액으로 파이펫을 여러 번 보충합니다.전기 형성 챔버를 준비하기 위해 먼저 ITO를 적절한 유기 용매로 밀어 내고 오미터로 전도성 표면을 식별합니다. 접착제 테이프로 각 슬라이드의 전도성 측면에 전선을 부착합니다. 용액의 약 5 마이크로 리터가 모세관 작용에 의해 수집 될 때까지 용액에 하나의 모세관을 찍어.로드된 모세관을 하나의 유리 ITO 플레이트의 중앙과 접촉하고 용액을 슬라이드 전체에 부드럽게 분산시십시오. 용매가 완전히 증발하면 방금 설명한 대로 용액을 두 번 더 적용하십시오. 증착 영역 주변에 열린 O-링 스페이서의 양쪽에 실리콘 프리 그리스 층을 추가하기 전에.다음으로, 제2 ITO 유리 판의 전도성 면을 스페이서 위에 놓고, 유기 용매의 흔적을 제거하기 위해 3시간 동안 감전 챔버를 진공 아래에 놓는다. 거대한 Unilamellar Vesicles의 전기 형성을 위해 전기 와이어를 발전기에 연결합니다. 발전기 주파수를 10 헤르츠로 설정하고 진폭을 2 볼트로 설정하여 피크에서 피크로 설정합니다.전압이 설정된 경우 0.8mm 내경 바늘이 장착된 주사기를 사용하여 0.1 개의 어금니 자당 용액1 밀리리터를 챔버에 주입하고 75 분 동안 적용 된 전압 및 주파수 아래에 챔버를 둡니다. 전기 형성의 끝에서 발전기를 끕니다. 그리고 공기 거품이 챔버 내부에 생성 될 때까지 용액의 작은 볼륨을 흡인하는 하나의 밀리리터 주사기를 사용합니다.챔버를 약간 기울여 거품을 챔버로 이동하고 소포가 슬라이드 표면에서 분리하는 데 도움이됩니다. 그리고 주사기에 용액의 전체 볼륨을 흡인. 그런 다음 소포 용액을 1 밀리리터 플라스틱 튜브로 옮킨다.마이크로 조작을 위한 재료를 설정하려면, 흡인을 생성하여 순수한 물 탱크인 한 홀더에게 물을 만듭니다. 그리고 탱크를 들어 올리면서 가볍게 탭하여 기포를 제거하고 양압을 만듭니다. 끝에 드롭 형태가 될 때까지 신선한 포도당 용액으로 혈청 코팅 모세관을 채웁니다.금속 홀더에서 주사기 튜브를 제거하여 홀더 끝에 약간의 물 흐름을 만들고 모세관을 거꾸로 뒤집어 포도당 강하를 물 흐름에 연결합니다. 그런 다음 모세관과 홀더를 함께 나사로 묶습니다. 파이펫을 배치하려면 맞춤형 알루미늄 스테이지에서 진공 그리스와 함께 두 개의 유리 슬라이드를 붙입니다.그리고 현미경 단계에 슬라이드를 설치합니다. 1 밀리 리터 파이펫을 사용 하 여 0.1 어금니 포도 당 두 슬라이드 사이 반 월 상 연 골을 형성. 피펫과 홀더를 마이크로 조작기의 모터 장치에 놓습니다.클램핑 노브를 조이고 컨트롤 패널 조이스틱을 거친 모드로 사용합니다. 포도당 반월 상 연골 근처 마이크로 피펫을 낮춥다. 미세 모드를 사용하여 팁의 위치를 반월 상 연골의 중심으로 조정합니다.포도당에 팁을 담그고 외부 표면과 내부 표면을 청소하십시오. 몇 분 후, 반월 상 연골에서 모세관을 철회하고 신선한 반월 상 연골으로 포도당을 대체. 0.1 어금니 자당에 자이언트 유니라멜라 채소의 마이크로리터 2개를 20밀리리터 마이크로피펫 팁으로 흡입합니다.반월 상 연골에 소포를 소개합니다. 현미경을 사용하여 슬라이드 챔버 의 바닥에있는 소포를 관찰하십시오. 소포가 약간 수축되면 흡입 파이펫을 다시 삽입하고 파이펫 끝에 집중하십시오.그런 다음 물 탱크의 기준높이를 입자의 움직임이 중지되는 압력으로 설정합니다. 반월 상 연골을 미네랄 오일로 둘러싸서 증발을 방지합니다. 마이크로파이펫 흡부 실험을 수행하려면 파이펫 팁을 반월 상 연골으로 낮춥춥시다.소량의 흡입 압력을 만들어 소포를 흡인시합니다. 선택한 소포의 멤브레인은 약간 변동해야하며 눈에 보이는 결함을 제시해서는 안됩니다. 마이크로 조작기를 사용하여 파이펫을 더 높은 수준으로 올려 다른 소포로부터 흡인 된 소포를 격리하십시오.물 탱크를 약 10센티미터로 낮추어 탱크를 들어 올리기 전에 소포를 미리 주조하여 압력을 초기 값으로 되돌립니다. 0.5센티미터의 높이에서 멤브레인이 변동하는 압력이 도달할 때까지 흡입 압력을 천천히 줄입니다. 그런 다음 몇 미크론의 투영 길이인 끝에 혀를 명확하게 시각화하는 압력을 증가시다.굽힘 계수를 결정하려면, 흡입 압력을 증가, 단계적 방식으로 한 번에 하나의 마이크로 미터. 미터당 0.5 ~0.8 밀리까지뉴턴에 도달합니다. 5초 를 기다린 후 각 단계 후에 혀의 스냅샷을 찍습니다.영역 압축성 변성을 결정하기 위해, 용해장력과 균주는 파열 장력에 도달할 때까지 미터당 0.5밀리에서 흡입 압력을 계속 증가시키고 있다. 이 대표적인 실험에서 POPC에 대한 영역 압축성 변조기 및 용해 변형은 문헌에서 기대하는 것과 완벽하게 일치하였다. 이 표에서 얻어진 중합체에 대한 전형적인 값을 관찰할 수 있다.디블록 중합체로부터 얻은 멤브레인의 인성은 삼중공합체로부터 얻은 멤브레인보다 훨씬 큽하다. 흥미롭게도, 디블록 중합체를 사용하여, 리포솜에 대해 측정된 것보다 더 강력한 인성을 보여주는 거대한 하이브리드 유니라미라 지질 폴리머 소포를 얻을 수 있다. 이 프로토콜은 예를 들어, 아스매틱 쇼크를 통해 멤브레인의 투과성을 측정하는 파이펫으로 소포를 측정하는 데 도움이 될 수 있다.특히 트리뷴 연결을 설정할 때 엄격하고 정밀하게 각 단계를 완료해야합니다. 이 기술은 수정 된 소포의 주요 경계에서 라인 장력의 측정을 통해 멤브레인 분열의 물리적 기원을 이해하기 위해 악용되었습니다.

obtention-giant-unilamellar-hybrid-vesicles-electroformation

Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

패치 클램프 전기 생리학과 결합 될 때 정의 된 구성의 거대한 리포좀으로 기능 막 단백질을 재구성하는 강력한 방법입니다. 그러나 기존의 거대한 리포좀 생산 단백질의 안정성과 호환되지 않을 수 있습니다. 우리는 순수 지질이나 이온 채널을 포함하는 작은 리포좀의 거대한 리포좀 생산을위한 프로토콜을 설명합니다.

이미징 및 패치 클램프 전기 생리학에 대한 거대한 리포좀 준비

물방울 인터페이스 지질 이중층에 대한 미세 유체 분사는 막 비대칭, 횡단 단백질의 결합, 재료의 캡슐화 제어와 소포를 생성 할 수있는 신뢰할 수있는 방법을 제공합니다. 이 기술은 구획화 된 생체 분자가 소망되는 생물학적 시스템의 다양한 연구에 적용 할 수있다.

미세 유체 제트를 사용하여 지질 이중층 소포 세대

전기 주조, 젤 이용한 붓기 - 거대한 단일 층 소포 (GUVs)에 횡단 단백질, KvAP의 재구성은 두 탈수 수분 보충 방법에 대한 설명된다. 두 방법 모두에서, 상기 단백질을 포함하는 작은 소포 단층이어서 형광 현미경 및 패치 클램프 전기 생리학에 의해 연구 할 수 GUVs을 형성하기 위하여 함께 융합된다.

횡단 단백질의 재구성, 현미경 및 패치 클램프 연구 거대한 단일 층 소포에 전압 게이트 이온 채널, KvAP,

원자력 현미경 및 힘 분광법을 사용하여 지원되는 지질 이중층의 준비 및 특성화를 위한 프로토콜을 설명합니다.

원자 힘 현미경 이미징 및 지원 지질 이중층의 힘 분광학

단계 구분 된 거 대 한 unilamellar 소포 (GUVs)에 대 한 실험은 자주 생리 솔루션 조건 게을리. 이 작품 횡단 막 솔루션 비대칭 및 온도 기능으로 충전된 multicomponent GUVs에서 액체-액체 상 분리에 높은 염 분 버퍼의 효과 연구에 접근을 제공 합니다.

형광 현미경 검사 법으로 모니터링 하는 대칭 및 비대칭 솔루션 조건에서 충전된 Vesicles의 위상 동작

셀에 많은 단백질을 감지 하 고 막 곡률을 유도. 곡선된 막 체 외단백질 또는 어떤 곡률 활성 분자의 상호작용을 연구 하는 지질 소포에서 막 나노튜브를 당겨 하는 방법을 설명 합니다.

거 대 한 Unilamellar 소포에서 막 나노튜브를 당기

우리는 지역화 된 칼슘 이온 기울기를 사용 하 여 소포의 비접촉 식 micromanipulation 위한 기술 제시. 주변에 거 대 한 지질 기 칼슘 이온 솔루션의 microinjection는 막 관 돌출의 생산의 결과로 지질 막 개장 하기 위하여 이용 된다.

막 거 대 한 소포 지역화 된 칼슘 이온 기울기에 대 한 응답에서의 개장

이 프로토콜은 유니 지질 및 다중 지질 소포, 지원지질 이중층 및 일시 중단 된 지질 이중 층을 모방 하는 세포의 형성을 설명 합니다. 이러한 체외 모델은 다양한 지질 유형을 통합하도록 조정할 수 있으며 다양한 분자 및 거대 분자 상호 작용을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

분자 상호 작용 연구를 위한 세포 모방 지원 및 중단된 지질 이중층 모델의 조립

이 기사에서는 내부, 환형 및 외부 영역에서 맞춤형 전기 전도성을 가진 소포 내 소포 구조를 가진 화합물 cGUV(Giant Unilamellar Vesicles)를 준비하는 방법을 제시합니다. 전기형성은 삼투압 충격을 통해 구강세포와 cGUV로 변형되는 간단한 GUV를 합성하여 핵이 있는 세포의 생물물리학을 연구하기 위한 귀중한 모델을 제공합니다.

Synthesis of Compound Giant Unilamellar Vesicles: A Biomimetic Model of Nucleate Cells(복합 거대 단층소포의 합성: 핵세포의 생체 모방 모델)

이 초보자 가이드는 액적 전달 방법을 통해 GIV(Giant Unilamellar Vesicles)를 준비하기 위한 일반적인 프로토콜을 제시하고, 중요한 단계를 논의하고, 합성 생물학 및 마이크로로보틱스를 포함한 다양한 응용 분야에 필요한 가능한 조정에 도움이 되는 통찰력을 제공합니다.

액적 전달 방법을 사용하여 거대한 단층 소포를 안정적으로 준비

배우세요 마이크로 파이펫 포부 기법을 이용하여 거대한 단층 하이브리드 소포의 전기 형성 및 막 기계적 특성을 측정하는 방법을. 이 프로토콜은 생물물리학 및 세포생물학 연구에서 막 유연성과 안정성을 정밀하게 평가하는 데 필수적입니다.

마이크로 파이펫 포부로 전기 형성 및 기계적 특성 측정에 의한 거대한 Unilamellar 하이브리드 소포의 Obtention

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