교모세포종에서 기능적으로 연관된 miRNAs의 특성화 및 유전자 치료를 위한 인공 클러스터로의 엔지니어링

이 프로토콜은 진핵 세포에서 많은 마이크로 RNA의 동시 변조를 허용하고 분자 복제 단계를 최소화하는 매우 간단하고 유연한 방법을 기반으로합니다. 이 기술은 시험관내 마이크로 RNA 기능성 상호 작용의 연구를 위한 연루가 있습니다, 그러나 더 중요한 것은 치료에 있는 마이크로 RNA의 더 효과적인 사용을 위한 플랫폼을 제공합니다. 우리는 주로 뇌암의 맥락에서 개발하고 사용했지만 유전자 발현의 여러 변경이 관련된 모든 질병에 적용됩니다.

우리는 이 기술의 재현성을 보여주는 유방 과 갑상선 선과 같은 그밖 모형에 있는 우리의 인공 적인 트랜스 유전자를 시험했습니다. 생물 정보학 및 마이크로 RNA 생물학의 기본 지식은이 프로토콜에 도움이 되지만 필수 불가결하지는 않습니다. 생물정보학 접근법은 관련 마이크로 RNA 조합과 TRK-11을 정의하는 것이 중요하며, 마이크로 RNA 처리에 대한 친숙함은 이러한 상이한 마이크로 RNA가 특정 세포에 한 번 안정적으로 성공적으로 처리될 수 있는 인공 DNA 클러스터로 조립될 수 있는 방법을 이해하는 것이 중요하다.

접시를 코팅하려면 먼저 밀리리터 당 100 마이크로 그램의 농도로 물에 폴리 D-lysine을 녹입니다. 25 평방 센티미터 표면 당 용액의 1 밀리리터의 양으로 접시에 용액을 붓습니다. 전체 요리의 커버리지를 확인하기 위해 접시를 소용돌이.

6시간 후에 폴리-D-리신 용액을 흡인시키고 PBS로 두 번 헹구세요. 플레이트 인간 신경 줄기 세포의 양에 100, 000 배지의 5 밀리리터 당 세포, 줄기 세포 매체, 성상 세포 분화 배지 또는 신경 분화 배지. 세포 도금 후, 1주일 동안 인큐베이터에 접시를 37도, 이산화탄소 5%로 배치하고 원고에 따라 마이크로 RNA 발현 분석을 진행한다.

GBM-34 교모세포종 줄기와 같은 세포를 배양하기 위해, 25 평방 센티미터 낮은 부착 플라스크에서 다섯 번째 세포에 10 번 신경 병배지의 5 밀리리터로 시작합니다. 플라스크를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에 인큐베이터에 넣습니다. 도금 후 48시간, 7일마다 DNA 알키라팅 제테모졸로미드의 두 배 농도를 추가한다.

5 일 동안 5 밀리 리터 배지에서 보충 5 마이크로 몰러 TMZ의 추가로 시작. 5 일 후, 배지를 제거하고 살아남은 세포가 회복 할 수 있도록 테모졸로미드없이 신선한 배지로 교체하십시오. 48시간 후, 10개의 마이크로몰라 테모졸로미드를 추가하고 5일 동안 배양합니다.

적어도 100 마이크로몰러의 농도가 도달하고 세포가 약물에 저항하게 될 때까지 두 배테모졸로미드 처리를 반복합니다. 저항의 유도 후, 리시스 시약의 1 밀리리터를 사용하여 세포를 거짓말. 총 RNA를 추출하고 원고에 따라 특정 마이크로 RNA의 발현을 분석한다.

이전에 정의된 각 마이크로 RNA의 예측 대상을 얻으려면 마이크로 RNA 표적 예측 도구를 사용하십시오. TargetScan의 첫 페이지에서 미리 채워진 드롭 다운 메뉴에서 관심있는 마이크로 RNA를 선택합니다. 제출 버튼을 클릭합니다.

다운로드 테이블 링크를 사용하여 결과 대상 목록을 스프레드시트로 다운로드합니다. 거짓 긍정 예측의 가능성을 줄이려면 보존된 사이트 열 및 다운스트림 분석 내에 대상만 포함합니다. 추가 마이크로 RNA 예측 프로그램은 추가 문자열을 얻고 모든 알고리즘에 공통되는 표적만 포함합니다.

그런 다음 ToppGene 제품군 20을 엽니다. 각 마이크로 RNA에 일반적인 통로의 농축을 위해 평가하기 위하여는, 훈련 유전자 세트 창에서 얻은 표적의 목록을 붙여 넣습니다. HGNC 기호를 항목 유형으로 클릭합니다.

제출을 클릭하고 시작합니다. 이 프로그램은 입력된 유전자 목록에 대해 가장 중요한 GO 범주를 보여주는 출력 테이블을 제공합니다. 마지막으로 일반적인 통로 또는 세포 과정의 규칙에 각 마이크로 RNA의 기여를 확립하기 위하여는, 생물정보학 및 진화 유전체학 웹사이트에 제공된 벤 다이어그램 기능을 엽니다.

특정 세포 과정에 관여하는 유전자의 전체 목록에 대해 각 획득 대상을 확인하십시오. 관심 있는 각 마이크로 RNA에 대한 대상 메신저 RNA가 각 창에 있는 경우, 복사 붙여넣기 목록을 업로드합니다. 각 목록의 이름을 고유 식별자로 지정합니다.

제출을 클릭합니다. 이 프로그램은 각 섹터의 유전자 수와 각 하위 집합 및 교차 조합에 대한 메신저 RNA의 전체 목록을 가진 벤 다이어그램의 시각적 출력을 제공합니다. 선택된 마이크로 RNA를 기능성 트랜스 유전자로 그룹화하려면 miR-17-92 클러스터 궤적에 기초하여 형질전환 비계를 얻습니다.

앙상블게놈 브라우저로부터 뉴클레오티드 서열을 획득한다. 메큐의 6개의 인코딩된 마이크로 RNA 헤어핀과 코어 서열의 상류 및 하류 둘 다 200개의 뉴클레오티드 측면 서열을 모두 포함하는 약 800개의 염기 쌍 코어 서열을 선택한다. 시퀀스를 단어 편집 프로그램에 붙여 넣습니다.

miR 베이스에서 6개의 네이티브 헤어 핀 각각의 시퀀스를 정의합니다. 이전에 확인된 코어 시퀀스의 범위 내에서 이러한 시퀀스의 각 순서를 표시합니다. 각 헤어핀 사이의 모든 시퀀스는 스페이서 시퀀스를 나타냅니다.

다음으로, miR 염기로부터 트랜스 유전자에서 과도하게 발현될 것을 의도한 마이크로 RNA의 헤어핀 서열을 얻을 수 있다. 마이크로 프로세서 분열 부위에 있는 특정 뉴클레오티드에 주의하십시오. 새로운 헤어핀에 대한 수용자로 작용할 각 헤어핀의 5개 및 끝 모두에서 3~5개의 뉴클레오티드를 제외하고 코어 서열에서 네이티브 헤어핀 서열을 삭제한다.

이전에 삭제된 헤어핀을 대체하기 위해 원하는 마이크로 RNA의 헤어핀 시퀀스를 붙여 넣습니다. 선택의 전달 벡터로 서브 복제를 용이하게하기 위해 트랜스 유전자의 양쪽 측면 영역에 원하는 제한 서열을 추가합니다. 선택한 제한 시퀀스가 시퀀스 자체에 존재하지 않는지 확인합니다.

트랜스 유전자의 2차원 구조를 확인하기 위해, 전체 형질전환 서열을 RNA 구조 예측 소프트웨어 프로그램 RNA Webfold로 복사한다. 표준 프로그램 설정을 선택하고 진행을 클릭합니다. 그래픽 출력을 분석하여, 특히 마이크로 프로세서 분열 부위에 근접한 11개의 뉴클레오티드 이상의 이중 가닥 줄기 구조가 있는 잘 정의된 헤어핀의 존재를 분석한다.

또한, 헤어핀 시퀀스 내에서 분기점이 없는지 찾아본다. 이 시점에서, 트랜스 유전자는 유전자 합성에 의해 생성되고 원하는 전달 벡터로 복제될 준비가 되어 있다. 이 방법은 신경 분화 중에 구체적으로 공동 발현되는 뇌종양에서 일관되게 조절되는 3개의 마이크로 RNA의 모듈의 특성화를 허용했습니다.

유전자 독성 스트레스 중 마이크로 RNA 모듈의 공동 발현 패턴을 확인하고 이들 3개의 마이크로 RNA 중강력한 시너지 활성을 제안하였다. 디자인된 트랜스 유전자는 동시에 아교모세포종 세포에 있는 3개의 마이크로 RNA의 발현을, 시험관 내 및 생체 내, 종양 생물학에 있는 중요한 간섭 및 유망한 번역 적용성을 가진 회수할 수 있었습니다. 또한, 형질전환 클러스터는 유방암 모델에서도 기능성이었다.

이 프로토콜의 중요한 요구 사항은 트랜스 유전자에서 프로세서 분열의 원래 크기를 유지하는 것입니다. 그리고 키메라 마이크로 RNA 헤어핀의 줄기 루프 구조가 보존되어 있는지 확인하십시오. 이 방법을 통해, 우리는 말 그대로 유전자 치료 사용을 위한 임의의 전달 벡터에 체질될 수 있는 아주 짧은 DNA 서열에 다중 생물학적활성 마이크로 RNA 유전자를 집중할 수 있습니다.

이 방법은 다른 마이크로 RNA 간의 기능적 상호 작용을 연구하고 그렇지 않으면 여러 약물 조합을 필요로 복잡한 다자간 세포 경로를 방해하는 것이 이상적입니다.