Name: 체미애 남성 액세서리 땀샘의 이차 세포에서 RNA를 분리하는 FACS 기반 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: 배우세요 Drosophila 체미애 남성 액세서리 땀샘의 이차 세포에서 FACS를 이용한 RNA 분리 프로토콜입니다. 희귀 세포 집단의 전사체 분석을 통해 생식 성공에 중요한 유전자를 밝히는 방법을 익힐 수 있습니다.

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우리는 Karch 연구소의 구성원, iGE3 게놈 판형, 제네바 대학의 유동 세포 분석 핵심 시설, FACS 프로토콜을 설정한 장 피에르 오브리-라체인예 박사에게 감사드립니다. 우리는 IGV에 읽기를 시각화에 그의 도움 루카 Stickley 감사합니다. 우리는 인물을 재사용할 수 있는 부드러운 허락을 주신 것에 대해 감사드리며, 글을 쓰는 창의력을 발휘하라는 메시지를 전해주신 편집자분들께 감사드립니다.
이 연구는 제네바 주(CI, RKM, FK), 스위스 국립 연구 기금(www.snf.ch)과 클라라즈 재단(FK)의 기부금에 의해 지원되었습니다.

1. 초파리 라인 사용 및 남성의 컬렉션
<ol><li>이 프로토콜의 경우 주 세포가 아닌 SC에서 GFP를 발현하는 남성을 사용하십시오. 여기서, AbdB-GAL4 드라이버(참고18에기재됨)가 UAS-GFP(염색체 2상)와 재결합되어 사용된다. 다른 적절한 드라이버도 사용할 수 있습니다. 상이한 돌연변이 조건 하에서 SC의 분리를 위해, SC 특이적 GFP 라인을 포함하는 선으로 돌연변이를 교차한다.</li>
	<li>각 유전자형에 대해 약 25개의 건강한 처녀 남성을 2회 분량으로 수집하고, 신선하게 만든 Drosophila 식품을 곁들인 바이알에서 3-4일 동안 25°C에서 나이를 먹습니다. 참고: 나이, 짝짓기 상태, 영양 및 사회 환경이 각각 생식 생물학에 영향을 미치기 때문에 이러한 매개 변수를 제어하기 위해 엄격한 프로토콜을 따라야합니다. 처녀 남성은 25 °C에서 pupal eclosion 후 3-4 일 동안 숙성되고 12 h /12 h의 빛 / 어두운 주기로, 표준 옥수수 식사 - 한천 - 효모 음식에, 유리병 당 20-25 남성의 그룹에서.</li>
</ol>2. 솔루션 및 재료 준비
<ol><li>
다음 솔루션을 준비합니다.
	<ol>
<li>세럼 보충 매체(SSM): 슈나이더의 초파리 배지에 10% 열 불활성화 태아 소 혈청과 1% 페니실린-스트렙토마이신을 보충합니다.</li>
		<li>1x 트립신 효소(예: 트립플레 익스프레스 효소)의 알리쿼트를 준비하고 실온에서 보관하십시오.</li>
		<li>파파인 [50 U/mL]의 알리쿼트(-20°C에 저장되고 한 번만 해동)를 준비합니다.</li>
		<li>1x 인산완충식염수(PBS, 실온에서 보관)를 준비한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
액세서리 땀샘의 물리적 해리를 위해 여러 개의 화염 둥근 파이펫 팁을 준비하십시오. 참고: 처리되지 않은 플라스틱을 고수하는 경향이 있기 때문에 액세서리 땀샘을 취급하기 위해 낮은 고정 팁을 사용하십시오. 화염 반올림 공정은 팁 개구부를 줄이고 팁의 가장자리를 부드럽게 합니다. 이것은 세포막을 깎지 않고 펩티다아제 소화 후 효율적인 해리를 보장합니다.<ol>
<li>날카로운 블레이드로 200 μL 팁 하나를 자르고 부드럽게 불꽃을 통과하여 끝을 둥글게 하여 개구부가 넓지만 3.7 단계에서 취급이 용이하도록 합니다.</li>
		<li>1,000 μL 팁의 개구부를 1초 미만 동안 화염 근처의 팁 개구부를 통과하여 좁혀줍니다. 과도하게 녹거나 막히는 것을 방지하기 위해 팁을 약간 회전시면 됩니다. 좁은 에서 넓은 팁으로 정렬합니다. 이것은 포부의 속도를 타이밍에 의해 수행 할 수 있습니다. 가장 좁은 팁의 효율성을 테스트하기 위해 AG의 작은 규모의 샘플을 해리해 보십시오. 참고: 이러한 팁은 기계적 교반에 매우 중요합니다(5.2단계 및 5.3단계). 양질의 화염 둥근 파이펫 팁은 셀 생존가능성을 유지하면서 완전한 해리를 가능하게 합니다. 따라서 이러한 팁은 재사용 절차가 끝날 때 물로 철저히 세척됩니다. 이것은 매일 재현 가능한 해리를 허용합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 액세서리 땀샘의 해부
<ol><li>얼음에 유리 접시에 20~25남성 초파리를 넣습니다.</li>
	<li>SSM에서 1 명의 남성을 해부하십시오. 그것의 생식 기관을 벗고 사정 덕트 떨어져 다른 모든 조직에서 액세서리 선 쌍을 취소. 참고: 풀어 놓인 정액이 덩어리를 만들고 해리 과정을 방해할 수 있기 때문에 고환을 제거하십시오. 사정 전구를 제거하여 수레가 뜨면 취급이 어려워집니다.</li>
	<li>집게를 사용하여 실온에서 SSM으로 채워진 유리 판으로 액세서리 땀샘을 옮김을 옮김을 옮긴다. SSM에서 20 쌍의 땀샘을 일괄 처리하려면 3.2-3.3 20 번 단계를 반복하십시오. 참고: 이 단계는 15 에서 20 분안에 달성될 것입니다. AGs는 건강하게 보일 것이고, 땀샘 주위의 근육 층의 연동 운동이 보일 것입니다. GFP는 형광 현미경을 사용하여 모니터링 할 수 있습니다.</li>
	<li>실온에서 1-2 분 동안 1 x PBS로 액세서리 땀샘을 옮김을 옮김하십시오. 참고: 더 나은 해리를 위해, PBS로 땀샘을 헹구는 것이 필수적입니다. 이 단계의 기간, 그러나, 세포PBS에 스트레스의 흔적을 표시 로 제한 해야; PBS에 있는 해리된 이차 세포는 급속하게 팽창하고 정지합니다.</li>
	<li>20 μL 파파인 [50 U/mL]을 1x 트립신 효소의 180 μL로 희석하여 해리 액을 얻습니다(각 남성에 대해 트립신 효소 9 μL과 1 μL의 파파인을 유지하십시오). 집게를 사용하여 액세서리 땀샘을이 솔루션으로 옮김을 옮김으로 옮긴다.</li>
	<li>근위 부분에서 액세서리 땀샘 (보조 세포 포함)의 끝을 분리하십시오. 미세 한 집게를 사용하여 선 엽의 중간을 단단히 꼬집고 두 번째 집게의 날카로운 끝으로 잘라냅니다. 해리를 개선하고 세포 선별 시간을 줄이기 위해 액세서리 땀샘과 사정 덕트의 근위 부분을 제거합니다. 참고: 20 쌍의 땀샘에서 말단 부분을 해부하는 것은 15 ~20 분이 걸리며 펩티다제에 의한 소화는 실온에서 시작됩니다.</li>
	<li>모든 선 팁이 해부된 후, 2.2.1 단계에서 준비된 특수 200 μL 파이펫 팁을 사용하여 1.5 mL 튜브로 옮김을 옮김을 전달합니다. 땀샘을 처리하기 전에 넓고 둥글고 젖어야합니다. 참고: 파이펫 액세서리 선 조직에, 팁은 항상 적절한 용액 (트립신 효소 또는 SSM, 이 목적을 위해 각각의 하나의 튜브를 유지)와 사전 젖은해야합니다. 오염을 방지하기 위해 시료 사이에 조심스럽게 팁을 헹시다.</li>
</ol>4. 조직 소화
<ol><li>마이크로튜브를 37°C 셰이커에 60분 동안 놓고 1,000rpm으로 흔들립니다. 참고: 교반 및 소화 시간은 모두 성공적인 해리에 대 한 중요 한. 짧거나 움직이지 않는 소화는 외부 근육 층과 내부 점성 정액이 펩티다제로부터 액세서리 동맥 세포를 보호하기 때문에 아마도 가난한 해리를 줄 것입니다.</li>
	<li>실온에서 1 mL의 SSM을 추가하여 소화를 멈추고 즉시 5 단계로 진행하십시오.</li>
</ol>5. 세포의 기계적 해리
<ol><li>SSM으로 미리 젖은 넓은 둥근 1,000 μL 팁을 사용하여 샘플을 24웰 플레이트로 옮김을 합니다. 현미경의 밑에 GFP 형광을 감시하십시오: 대부분의 동맥 끝은 손상되지 않는 보아야 하고 몇몇 SC는 분리되어야 합니다.</li>
	<li>2.2.2단계에서 생성된 둥근 좁은 파이펫 팁을 사용하여 3~5회 위아래로 피펫을 하여 부속물 조직을 방해합니다. 참고: 형광을 모니터링하여 큰 조직 패치가 분해되었는지 확인합니다. 그렇지 않은 경우 5.2 단계를 반복합니다.</li>
	<li>매우 좁은 둥근 파이펫 팁(2.2.2단계에서 생성됨)을 사용하여 1-2회 위아래로 파이펫을 생성합니다. 참고: 5.3단계 이후에는 개별 셀만 표시되어야 합니다. 24웰 플레이트를 사용하면 공정을 쉽게 모니터링할 수 있으므로 권장됩니다. 몇 개의 샘플을 처리하고 만족스러운 결과 (건강한 이차 세포가 완벽하게 해리됨)를 주었을 때, 파이펫팅 단계는 마이크로 튜브에서 수행됩니다.</li>
	<li>적어도 15 분 동안 기다렸다가 세포가 우물 의 바닥에 정착하고 과잉 SSM을 제거하여 정렬 시간을 줄입니다. 참고: 세포가 정착시키는 것은 원심 분리와 같은 대체 방법보다 우수하다는 것이 입증되었으며 FACS 직전에 세포의 마지막 육안 검사를 허용합니다.</li>
	<li>깨끗한 1.5 mL 튜브로 세포를 피펫과 풀 동일한 샘플 (각 조건에 대한 20 남성의 두 배치). 마지막 세포를 복구하기 위해 SSM으로 우물을 헹구고 튜브에 피펫하십시오 (소량 사용).</li>
	<li>1.5 mL 마이크로튜브에서 300 μL의 세포 용해 액과 1 μL의 단백질아제 K [50 μg/μL]를 추가하십시오(RNA 정제 키트에 제공된 용액, 7단계 참조). 각 샘플에 대해 두 개의 튜브를 준비합니다(MC용 및 SC용 튜브 하나).</li>
</ol>6. FACS (형광 활성화 세포 선별)
<ol><li>정렬하기 몇 분 전에 정렬할 각 샘플에 생존 가능성 마커를 추가합니다(0.3 mM Draq7). 주의 사항: Draq7은 주의해서 다루어야 합니다.</li>
	<li>
살아있는 이차 세포의 동질적인 집단을 정렬합니다 (GFP 양성, Draq7 음성 세포). 다른 마이크로 튜브에서, 주요 세포의 인구를 정렬 (작은, GFP 음성, Draq7 음성 세포). 다음 FACS 게이팅 전략을 사용하십시오. 참고: 셀 선별기 압력을 25 PSI로 설정하고 100 μm 노즐을 통해 셀을 통과합니다. 정렬 속도는 약 2,000 셀 / s입니다.<ol>
<li>파편을 제외하고 파편을 제외하려면 FSC-SSC(그림2E)를기준으로 총 셀을 선택합니다.</li>
		<li>죽은 셀을 제외합니다. 640 nm 레이저로 Draq7을 자극하고 795/70 밴드 패스 필터로 방출된 형광을 수집합니다. 게이트 Draq7 양성 세포 아웃(그림 2F).</li>
		<li>SSC-H 대 SSC-W 및 FSC-A 대 FSC-H(그림 2H)에서이중 게이팅을 사용하여 더블릿을 제거합니다. 참고: 주요 세포 오염을 줄이기 위해 이중 게이팅을 사용하여 셀 더블을 엄격하게 배제하십시오.</li>
		<li>~ 550 GFP 양성 세포를 용해 완충액 및 프로틴라제 K를 가진 1.5 mL 마이크로튜브로 정렬합니다. 이러한 집단은 이차 세포로 간주된다(SC, 도 2G). 488 nm에서 GFP를 자극하고 526/52 밴드 패스 필터로 방출 된 형광을 수집합니다.</li>
		<li>~ 1,000 GFP 음성 세포를 균일하고 작은 크기로 정렬하여 용해 완충제 및 Proteinase K가있는 1.5 mL 마이크로 튜브로 정렬합니다. 이러한 집단은 주세포로 간주된다(MC, 도 2G).</li>
		<li>모든 샘플을 소용돌이. 참고: 40 명의 남성 (~40 x 80 SC = 3,200 보조 세포)에서 600 ~ 800 개의 살아있는 단일 이차 세포가 수득됩니다 (약 20-25 % 검색). 샘플을 정규화하기 위해 약 550 SC 및 1,000 MC 정렬을 중지합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. RNA 추출
참고: 우리는 진원지 MasterPure RNA 정제 키트를 RNA 추출에 사용했으며, 다음과 같은 적응을 했습니다. 다른 키트는 수율이 ~500 셀로부터 시퀀싱을 위한 라이브러리를 준비할 만큼 충분히 높으면 사용될 수 있다(2 ng RNA가 여기에서 사용되었다).
<ol><li>65°C에서 15분 동안 샘플을 가열하고 5분마다 소용돌이를 가열하여 세포 용해를 완료합니다.</li>
	<li>5 분 동안 얼음에 샘플을 놓습니다. 핵산 침전 (부분 "총 핵산침전"과 "총 핵산 제제에서 DNA 오염 제거")에 대한 제조업체의 권장 사항을 따르십시오.</li>
	<li>Rna 펠릿을 RNase-free TE 완충제의 10 μL에 일시 중단합니다.</li>
	<li>RNase 억제제 (선택 사항)를 추가합니다.</li>
	<li>샘플을 -80°C에서 보관합니다.</li>
</ol>8. RNA 수량, 품질 및 특이성의 품질 관리
<ol><li>RNA 품질과 농도를 추정합니다. 소량과 농도로 인해 RNA 6000 피코 칩을 사용하십시오. 양질의 RNA는 rRNA에 해당하는 날카로운 피크를 가진 낮은 기준선으로 보이는 비 분해로 정의됩니다.</li>
	<li>
정렬된 셀의 ID를 제어하는 RT-qPCR
	<ol>
<li>프라이머로 무작위 hexamers를 사용하여 총 RNA의 2 ng로 역 전사를 수행합니다. 이차 세포 RNA 및 주요 세포 RNA에 RT를 수행합니다. 참고: cDNA는 희석, aliquoted, 나중에 사용하기 위해 냉동 보관할 수 있습니다.</li>
		<li>적절한 프라이머 쌍을 이용하여 실시간 정량적 PCR을 수행하여 하우스키핑유전자(알파-투불린, 18S rRNA),이차 세포 특이적유전자(MSA, Rab19, Abd-B)및 주 세포 특이적유전자(성 펩티드)를정량화한다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>9. 시퀀싱 (cDNA 라이브러리 준비, 시퀀싱 및 데이터 분석)
<ol><li>총 RNA 2 ng를 사용하여 cDNA를 폴리T 프라이머로 합성합니다. SMARTer 기술을 사용하여 증폭을 위해 증폭합니다.</li>
	<li>Nextera XT 키트를 사용하여 라이브러리를 준비합니다.</li>
	<li>다중화, 100 개의 뉴클레오티드 단일 읽기 시퀀싱을 사용하여 서열화 (50 개의 뉴클레오티드 판독이 대부분의 목적에 적합하더라도) 각 샘플에 대해 약 3천만 개의 읽기를 산출합니다.</li>
</ol>10. 데이터 분석
<ol><li>FastQC를 실행합니다.</li>
	<li>STAR 얼라이너를 사용하여 UCSC dm6 Drosophila 참조 게놈의 판독을 매핑하고 .bam 파일을 생성합니다. 통합 유전체학 뷰어(IGV)를 사용하여 게놈 브라우저에서 읽기를 시각화합니다.</li>
	<li>HTSeq를 사용하여 유전자 수를 수행합니다.</li>
	<li>유전자 카운트22를정규화하기 위해 M 값 (TMM) 방법의 트리밍 된 평균을 사용합니다. edgeR을 사용하여 차동 식, MA 플롯 및 PCA에 대한 통계 분석을 수행합니다.</li>
	<li>유전자 발현 분석 및 통계의 경우 일반 선형 모델, 거짓 검출률(FDR) 및 벤자니 & 호크버그 보정(BH)이 있는 준우도 F 검정을 사용합니다.</li>
</ol>

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가상 디스크와 같은 초파리 조직에서 세포 해리를 위한 방법은 이미23에기재되어 있다. 단순히 액세서리 땀샘에 이러한 절차를 사용 하려는 우리의 시도 실패, 이 새로운 프로토콜을 개발 하는 우리를 격려. 프로테아제 소화와 기계적 삼각화는 시술의 성공을 위해 우리가 고민하는 중요한 단계였으며, 따라서 실험자가 만족스러운 결과를 얻을 수 있도록 섹션 2에서 5절에 많은 메모를 배치했습니다. 해리가 성공하기 위해서는 펩티다아제는 내강내 의 점성 정액과 동맥 주위의 근육 층에 의해 보호되는 액세서리 선 세포에 도달해야합니다. 땀샘의 원위 부분을 해부하는 것은 따라서 중요했다 (단계 3.6). 또한, 격렬한 흔들림(단계 4.1)으로 적어도 60분 동안 소화가 필요하였다. 트립신 용액(예: 트립플)을 가진 부드러운 해리는 기계적 해리가 될 때까지 선 무결성과 세포 생존가능성을 보존했습니다. 트립신 용액과 관련하여 파파인 또는 콜라게나아제의 첨가는 해리를 개선시켰습니다(완벽한 해리는 ...

기관은 여러 세포 유형으로 구성되어 있으며, 각각 은산 기능을 가지고 있으며 때로는 매우 다른 유전자 세트를 발현합니다. 기관이 어떻게 기능하는지 에 대한 정확한 이해를 얻으려면 이 기관을 구성하는 각 별개의 세포 유형을 연구하는 것이 종종 중요합니다. 가능한 기능을 탐구하는 데 사용되는 주요 방법 중 하나는 전사체 분석입니다. 이 강력한 방법은 활성 프로세스 및 경로를 밝히기 위해 세포에서 유전자 발현의 스냅 샷을 제공합니다. 그러나, 분석의 이 모형은 수시로 훨씬 더 풍부한 이웃 세포에서 정제되어야 하는 희소한 세포 인구를 위해 어렵습니다. 예를 들면, Drosophila 남성 부속동맥은 2개의 분비 세포 모형의 1 차적으로 위로 위로 한 기관입니다. 2개의 세포 모형의 희소한 이 선의 세포의 단지 4%를 포함하는 것과 같이, 세포 모형 특정 전사체 분석의 사용은 이 세포의 기능을 결정하는 것을 돕기 위하여 이용되지 않았습니다.
부속동맥(AGs)은 곤충의 남성 생식기관의 기관입니다. 그(것)들은 정액 액체의 단백질의 대부분의 생산에 책임 있습니다 (정액 액체 단백질 (SFPs) 및 부속 동맥 단백질 (Acps)). 이들 SFPs 중 일부는 짝짓기 후 반응(PMR)이라고 불리는 짝짓기 여성의 생리적 및 행동 반응을 유도하는 것으로 알려져 있다. PMR의 일부는 다음을 포함: 증가 배란 및 계란 누워 속도, 저장 및 정자의 릴리스, 여성 다이어트의 변화, 그리고 보조 구애 남성에 여성 수용성의 감소1,2. 곤충이 인간의 건강(치명적인 질병의 벡터)에서 농업(곤충은 해충일 수 있지만 수분 및 토양 품질에 매우 중요함)에 이르기까지 많은 주요 사회 문제에 영향을 미치기 때문에 곤충 번식을 이해하는 것은 중요한 연구 분야입니다. AGs 및 APS의 연구는 모델 유기체 인 Drosophila melanogaster로 상당히 진행되었습니다. 이러한 연구는 AGS와 그들이 PMR을 만드는 과정에서 생산하는 개별 단백질의 일부의 역할을 강조, 질병 벡터 Aedes aegypti같은 다른 종에서 작업에 영향을 미치는3,4,및 기타 곤충1 ,5. 더욱이, AGs가정액액1,6의 성분을 분비함에 따라 그들은 종종 포유류 전립선 및 정액 소포의 기능적 유사체로 생각된다. 이 기능 유사성은 두 조직 유형 사이의 분자 유사성과 결합되어, AGs를 파리7에서전립선에 대한 모델로 만들었습니다.
Drosophila 수컷 안에는, 부속 동맥의 2개의 엽이 있습니다. 각 로브는 중앙 루멘을 둘러싸는 분비 세포의 단층으로 구성되고 평활근으로 감싸는 주머니 와 같은 구조로 볼 수 있습니다. 위에서 언급 한 바와 같이, 이 선을 구성하는 두 가지 형태학적으로, 발달및 기능적으로 뚜렷한 분비 세포 유형이 있습니다 : 다각형 모양의 주 세포 (세포의 ~ 96 %를 구성), 그리고 더 큰, 둥근 이차 세포 (SC)(를 구성 세포의 나머지 4%, 또는 로브 당 약 40 세포). 두 세포 유형 모두 PMR을 유도하고 유지하기 위해 뚜렷한 APS 세트를 생성하는 것으로 나타났습니다. 현재까지 얻어진 대부분의 데이터는 PMR의 특징적인 행동의 대부분을 트리거링하는 단 하나 단백질의 역할을 강조합니다. 이 단백질, 성 펩티드는, 주 세포8,9,10에의해 분비되는 작은, 36 아미노산 펩티드이다. 성 펩티드가 PMR에서 중요한 역할을 하는 것처럼 보이지만, 주 및 이차 세포 모두에 의해 생성된 다른 APS는 PMR11,12,13,14의 다양한 양상에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다. ,15,16,17. 예를 들어, 우리의 현재 지식에 기초하여, SC는, 그들이 생산하는 단백질을 통해, 첫날18후 SP 신호의 영속을 위해 요구되는 것처럼 보입니다.
SC의 희미함을 감안할 때 (남성 당 단지 80 세포), 이 세포와 그(것)들이 생성하는 단백질에 관하여 우리의 모든 지식은 유전학과 후보 접근에서 옵니다. 지금까지, 유전자의 상대적으로 작은 목록만이 SC 특이적인 것으로 나타났다. 이 목록에는 동균 단백질 결함 입증(Dve)19,lncRNA MSA20, Rab6, 7, 11 및 1921, CG1656 및 CG17575 11, 15,21 및 동종상자 전사인 복부-B(Abd-B)18. 이전에는 이차 세포에서 Abd-B와 lncRNA MSA의 발현 모두에 대한 돌연변이결핍이 PMR의 길이를 ~10일에서 1일1일로 단축시키는 것으로 나타났습니다. , 18세 , 20. 이 표현형은 여성 생식 기관12,18,20에서SP의 부적절한 저장에 기인하는 것으로 보입니다. 세포 수준에서, 이 돌연변이의 이차 세포는 그들의 특징적인 환액 같이 구조물18,20,21를분실하는 이상한 형태를 보여줍니다. 이 돌연변이 선을 사용하여, 우리는 이전에 야생 모형 또는 돌연변이 부속 동맥12에서전체 AGs의 전사 단면도를 비교해서 SC 기능에 관련시킨 유전자를 확인하기 위하여 시도했습니다. 또한, 다른 실험실에서는 SC 수, 형태학 및 백신 함량이 남성 식단, 짝짓기 상태 및 연령21,25,26에따라 달라지는 것으로 나타났다.
이러한 접근법을 사용하여 긍정적인 진전이 이루어졌지만 전체 SC 전사체는 달성되지 않았습니다. 이 기관에 있는 이 세포의 희소성은 야생 모형 세포에서 조차 더 점진하는 것을 어렵게 했습니다. 유전자 발현을 테스트하기 위해, 특정 환경 자극 후이 세포의 변화는 더 어려울 것입니다. 따라서, 상이한 유전적 배경 및 환경 조건 하에서 수행하기에 충분히 빠르고 간단한 SC RNA를 분리하고 정화하는 방법이 필요하였다.
Abd-B 및 MSA 유전자 둘 다 SCs18,20에서그들의 발현을 위한 초파리 비트토락스 컴플렉스(D1 증강제라고 함)로부터 특이적인 1.1 kb 증강을 요구한다. 이 증강은 이전에 UAS-GFP와연관될 때 SC에서 특히 강력한 GFP 표현을 구동할 수 있는 GAL4 드라이버를 만드는 데 사용되었습니다. 따라서, 우리는 야생 형과 iab-6cocuD1 AGs 둘 다에서 이 세포를 격리하는 FACS 프로토콜을 위한 기초로 이 선을 이용했습니다. iab-6cocuD1 돌연변이 체가 다른 세포 형태를 표시함에 따라, 우리는 이 프로토콜이 매우 다른 조건하에서 이 희소한 세포 유형으로부터 그들의 전사체의 결정을 위해 세포를 분리하는 데 사용될 수 있음을 보여준다.

<table><tbody><tr><td>24웰 조직 배양 플레이트</td><td>VWR</td><td>734-2325</td><td></td></tr><tr><td>해부</td><td></td><td></td><td></td>용 쌍안 현미경</tr><tr>GFP <td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bunsen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Draq7 0.3 mM</td><td>BioStatus</td><td>DR71000</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 마이크로튜브 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr>용 광원이 있는 쌍안 현미경<td>FACS</td><td>Beckman Coulter</td><td>MoFlo Astrios</td><td></td></tr><tr><td>미세 해부 겸자</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>사용 전 열 비활성화</td></tr> 해<tr><td>부</td><td></td><td></td><td></td>용 유리 접시</tr><tr><td>얼음 양동이</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImProm-II 역 전사 시스템</td><td>Promega</td><td>A3800</td><td></td></tr><tr><td>MasterPure RNA 정제 키트</td><td>진원지</td><td>MCR85102</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT 키트</td><td>illumina</td><td></td><td><a href="https://emea.illumina.com/products/by-type/sequencing-kits/library-prep-kits/nextera-xt-dna.html">https://emea.illumina.com/products/by-type/sequencing-kits/library-prep-kits/nextera-xt-dna.html</a></td></tr><tr><td>P1000</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P20</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P200</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td></td><td></td><td>50U/mL 재고</td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td>집에서 만든</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>PolydT 프라이머</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>랜덤 헥사머 프라이머</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNA 6000 피코 키트</td><td>애질런트</td><td></td><td></td></tr><tr><td>슈나이더' s Drosophila medium</td><td>Gibco</td><td>21720-001</td><td></td></tr><tr><td>SMARTer cDNA 합성 키트</td><td>Takara</td><td></td><td><a href="https://www.takarabio.com/products/cdna-synthesis/cdna-synthesis-kits/smarter-cdna-synthesis-kits">https://www.takarabio.com/products/cdna-synthesis/cdna-synthesis-kits/smarter-cdna-synthesis-kits</a></td></tr><tr><td>SYBR CFX 적용용 마스터 믹스 선택</td><td> biosystems</td><td>4472942</td><td></td></tr><tr><td>써모 셰이커</td><td>항저우 Allsheng intruments</td><td>MS-100</td><td></td></tr><tr><td>Tipone 1250 &mu; L 눈금 팁</td><td>Starlab</td><td>S1161-1820</td><td></td></tr><tr><td>Tipone 200 &mu; L 베벨 팁</td><td>Starlab</td><td>S1161-1800</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme</td><td>Gibco</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

체미애 남성 액세서리 땀샘의 이차 세포에서 rna를 분리하는 facs 기반 프로토콜

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

기관의 기능을 이해하려면 종종 구성 세포 집단의 역할을 이해하는 것이 유용합니다. 불행히도, 개별 적인 세포 인구의 희미함은 수시로 분자 연구 결과를 위한 충분한 물자를 얻기 위하여 어렵게 만듭니다. 예를 들어, Drosophila 남성 생식 시스템의 부속동맥에는 두 가지 뚜렷한 분비 세포 유형이 포함되어 있습니다. 주요 세포는 선의 분비 세포의 96 %를 구성하고, 보조 세포 (SC)는 세포의 나머지 4 %를 구성하는 동안 (남성 당 약 80 세포). 두 세포 모형이 정액 액체의 중요한 분대를 생성하더라도, 단지 몇몇 유전자는 SCs에 특정하기 위하여 알려집니다. SCs의 희소성은, 지금까지, 이 중요한 세포 모형의 전사성 분석 연구 결과 방해했습니다. 여기서, RNA 추출 및 시퀀싱을 위한 SC의 정제를 허용하는 방법이 제시된다. 프로토콜은 SC 특정 GFP 리포터를 표현하는 파리에서 먼저 땀샘을 해부한 다음 개별 세포를 얻기 위해 프로테아제 소화 및 기계적 해리를 이 땀샘을 복종시키는 것으로 구성됩니다. 이러한 단계에 따라, 개별, 살아있는, GFP 표시 세포는 RNA 정제를 위한 형광 활성화 세포 선별기 (FACS)를 사용하여 분류된다. 이 절차는 다운스트림 RT-qPCR 및/또는 RNA 시퀀싱을 위한 조건당 ~40남성으로부터 SC 특이적 RNA를 하루 동안 산출합니다. 절차의 신속성과 단순성은 다른 유전자형 또는 환경 조건에서 많은 다른 파리의 전사체가 단기간에 결정될 수 있게 합니다.

여기에 제시된 프로토콜은 한 실험자가 Drosophila 남성 액세서리 땀샘으로부터 이차 세포를 분리하고 하루 동안 RNA를 추출할 수 있게합니다(그림 1).
우리는 Abd-B-GAL4 구문(18)을 사용하여 이차 세포(SC)를 라벨을 붙이지만 주세포(MC)는 GFP(그림2A)로표시하지 않습니다. 이 절차의 한 가지 목적은 SC의 야생형 전사체를 얻는 것입니다(야생형은 GFP 및 GAL4를 발현하는 형질전환 파리에서 얻어지므로 반전된 쉼표로 작성됩니다). 또 다른 목적은 다른 조건에서 그들의 유전자 발현을 공부할 수 있는 빠르고 쉬운 절차를 통해 SC R...

여기에서, 우리는 RNA 염기서열 분석 및 RT-qPCR를 위한 Drosophila 남성 부속부전 (이차 세포)에서 특정 세포 집단을 해리하고 분류하는 프로토콜을 제시합니다. 세포 분리는 해부, 프로테아제 소화 및 기계적 분산을 요구하는 다단계 해리 과정 후 GFP 발현 이차 세포의 FACS 정제를 통해 달성된다.

체미애 남성 액세서리 땀샘의 이차 세포에서 RNA를 분리하는 FACS 기반 프로토콜

To understand the function of an organ, it is often useful to understand the role of its constituent cell populations. Unfortunately, the rarity of ...

이 방법은 이차 세포에게 불린 Drosophila 남성 부속선에서 희소한 세포 인구의 전사 분석을 허용하고, 생식 성공을 위해 그(것)들을 중요하게 하는 유전자를 발견합니다. 하루의 과정에서, 이 기술은 후속 qPCR 또는 RNA 염기서열에 대한 상이한 유전자형으로부터 이차 세포의 분류 및 총 RNA의 추출을 허용한다. 때로는 시작 자료의 희귀성에 의해 프로젝트가 제한됩니다.이 방법은 희귀 한 세포 인구와 함께 작업의 도전에 직면 하는 다른 그룹에 대 한 기초를 제공할 수 있습니다. 절차는 40 땀샘을 축적해야하기 때문에 해부를 연습하는 것이 중요합니다. 수제 파이펫 팁을 준비하는 것도 중요하므로 비디오에 시각화하여 미리 준비하고 준비해야합니다.시술을 시작하기 전에, 발란, 와이드, 200 마이크로 리터 팁, 그리고 개구부를 좁히기 위해 1 초 이내에 불꽃 근처 여러 1, 000 마이크로 리터 팁의 팁 개구부를 전달합니다. 그런 다음 수정된 팁을 포부 속도에 따라 더 좁아두면 더 넓게 정렬합니다. 접근 선 절제술의 경우 20~25명의 수컷 Drosophila를 얼음에 유리 접시에 넣고 집게와 해부 현미경을 사용하여 한 남성 비행의 생식 기관을 제거하십시오.고환및 사정전구를 포함한 다른 모든 조직에서 액세서리 선동맥을 지우고, 실온에서 혈청 보충 매체를 함유한 유리 판으로 액세서리 땀샘을 옮긴다. 20쌍의 부속신이 수집되면 실온에서 1~2분 동안 PBS 접시에 땀샘을 씻으실 수 있습니다. 세척이 끝나면 땀샘을 갓 준비된 해리 용액으로 옮기고 해부 현미경으로 날카로운 집게를 사용하여 선 로브의 중간을 단단히 꼬집습니다.두 번째 쌍의 집게를 사용하여, 날카로운 끝으로 조직을 잘라 액세서리 선과 이차 세포를 포함하는 동맥의 부분에서 사정 덕트의 근접 영역을 분리합니다. 펩티다스가 외부 근육 층과 동맥의 루멘내점 정액에 의해 보호되는 세포에 도달할 수 있도록 땀샘을 잘라냅니다. 그런 다음 미리 습식, 화염 둥근, 넓은 200 마이크로 리터 파이펫 팁을 사용하여 땀샘을 1.5 밀리리터 튜브로 옮긴다.조직 소화의 경우 분당 1, 000 회전에서 60 분 동안 37도 섭씨 셰이커에 튜브를 놓습니다. 인큐베이션의 끝에서, 혈청 보충 매체의 1 밀리리터로 소화를 중지하고, 미리 습식, 화염 둥근, 넓은, 1, 000 마이크로 리터 파이펫 팁을 사용하여 샘플을 24 웰 플레이트로 전송합니다. 형광 현미경의 밑에 그들의 GFP 발현을 위해 세포를 확인하십시오.선 팁의 대부분은 그대로 보아야하며 몇 가지 보조 세포를 분리해야합니다. 둥근, 좁은, 1, 000 마이크로 리터 파이펫 팁을 사용하여 부드럽게 액세서리 선 조직을 방해하기 위해 세포를 3 ~ 5 번 세리세팅합니다. 그런 다음 매우 좁은 둥근 1, 000 마이크로 리터 파이펫 팁을 1 ~ 2 번 사용하여 세포를 개별화하십시오.세포가 15분 동안 정착하도록 허용합니다. 세포가 현미경의 밑에 건강하게 나타나는지 확인하고, 과잉 매체를 제거합니다. 그런 다음 세포를 새로운 1.5 밀리리터 튜브로 옮기고, 남은 세포를 복구하기 위해 신선한 배지로 우물을 헹구십시오.Abd-B-GAL4 구조는 이러한 실험에서 GFP를 사용하여 이차하지만 주요 세포에 레이블을 지정하는 데 사용할 수 있습니다. 이 연구에서는, 두 세포 유형 야생 유형및 iab-6cocuD1 돌연변이 액세서리 땀샘에서 분류되었다. 이 D1 돌연변이는 이차 세포 발달, 형태학 및 기능에 영향을 미치는 Abd-B 및 MSA 전사체의 발현이 부족합니다.세포 해리 후, FACS는 DRAQ7에 기초하여 살아있는 세포를 선택하는 데 사용되며, GFP 형광 수준은 이차 세포 및 주요 세포를 분리하는 데 사용된다. RNA는 각 세포 집단에서 추출되고 후속 RT-qPCR 및 시퀀싱을 위해 샘플 당 2 나노그램으로 조정됩니다. 야생형 메인 및 이차세포 추출물에 대한 실시간 정량성 PCR에 의한 특정 유전자의 발현을 정량화하면 이차 세포 유전자Rab19 및 MSA가 이차 세포 추출물에서만 검출되는 반면, 주세포 유전자 성 펩타이드는 주 세포 샘플에서만 검출된다.3개의 야생 모형 및 3개의 돌연변이 복제의 RNA 시퀀싱 데이터에 대한 주요 성분 분석은 야생 모형이 돌연변이 견본에서 멀리 서로 가까이 그리고 멀리 둘 다 클러스터를 복제한다는 것을 보여줍니다. 특정 유전자에 정렬된 시각적 판독은 actin 5C와 같은 가사 유전자와 이차 세포 특이적 유전자Rab19 및 Dve가 모두 유전자형으로 표현된다는 것을 보여줍니다. 그러나 MSA의 경우, 야생형 파리에서 관찰되는 유전자의 강한 발현은 돌연변이 균주에서 손실된다.충분한 살아있는 해리된 이차 세포를 얻는 것은 성공적인 절차에 중요합니다. 따라서 소규모 실험에서 해부 및 해실 프로토콜을 확인합니다. 이 방법은 소수의 파리로부터 두 세포 유형의 액세서리 선으로 분류할 수 있게 하여, 그 세포가 여러 유전 또는 환경 조건에 전사적으로 반응하는 방법의 연구를 가능하게 합니다.남성 생식 성공은 유전자형, 나이 및 짝짓기 상태를 포함하여 많은 것들에 의해 영향을 받는 것으로 알려져 있습니다. 이 방법의 용이성은 우리가 이 요인이 액세서리 선 전사에 어떻게 영향을 미치는지 조사할 수 있게 해주어야 합니다.

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연구

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의 분리 및 정제 Drosophila</em마그네틱 비드별로 정렬> 주변 뉴런

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의 레이저 캡처 Microdissection Drosophila 주변 뉴런

Drosophila melanogaster의 testes 신속하게하고 효율적으로 해부 바늘을 사용하여 성인 남성에서 격리 수 있습니다. 연습, 하나는 쉽게 하나 또는 두 일 이내에 항체 또는 효소 기반 assays 높은 처리량 시퀀싱 이상의 전통적인 분자 생물학의 방법으로 DNA 또는 RNA의 분석 또는 단백질의 충분한 testes의 양을 분리 수 있습니다.

의 분리 Drosophila melanogaster Testes

이 비디오는 수컷 파리의 부속샘을 해부하는 방법을 설명하고 고립된 분비샘이 단일 세포 현탁액으로 해리되는 예를 보여줍니다.

초파리 남성 부속샘 박리: 2차 세포를 분리하는 방법

여기 우리는 전체 마운트 형광을...

전체 마운트 RNA 형광<em&gt; 현장에서</em의&gt; 하이브리드<em&gt; Drosophila</em&gt; 태아

중후반 초파리 여포의 단계 별 분리는 다양한 목적에 유용합니다. 이러한 모낭이 체외 개발 분석 및 라이브 영상과 결합하는 유전자 및 / 또는 약물 조작이 가능 문화, 발전. 또한, 모낭은 mRNA와 단백질을 단리 같은 분자 연구에 사용될 수있다.

의 유틸리티 스테이지 별 중후반<em&gt; 초파리</em&gt; 난포 격리

분리 및 위상 콘트라스트와 형광 현미경으로 이미징 초파리 고환 샘플 (생활하고 고정)을 제조하는 방법이 설명된다.

정자의 세포 학적 분석 : 라이브와 고정 준비<em&gt; 초파리</em&gt; 고환

초파리의 조직은 종종 세포 유형의 이종 혼합물을 포함한다. 특정 조직으로부터 특정 세포 유형에서의 유전자 발현을 조사하기 위해, 핵 유전자 태그이어서 궁합 기반 접근 방식을 사용하여 단리 할 수​​있다. 격리 핵은 유전자 발현 분석 및 면역 침전과 같은 염색질 하류 애플리케이션에 사용될 수있다.

에서 태그가 핵의 선호도 기반 격리<em&gt; 초파리</em유전자 발현 분석을위한&gt; 조직

Translating Ribosome Affinity Purification(TRAP)은 mRNA의 세포 유형별 번역을 캡처할 수 있습니다. 여기에서 우리는 초파리 배아의 희귀 세포 집단에서 mRNA를 분리하는 데 전념하는 최초의 TRAP 프로토콜을 보고합니다.

희귀 세포 집단에서 TRAP-RC, 번역 리보솜 선호도 정화<em&gt; 초파리</em&gt; 배아

이 프로토콜의 목표는 중형 규모 (0.5-1g)에서 초파리 ( Drosophila) 배아를 수집하고 친화도 정화 - 질량 분광 분석 (AP-MS)과 같은 하류의 단백질 응용 분야에서 사용할 수있는 단백질 추출물을 제조하는 간단하고 저렴한 접근법을 제공하는 것입니다 ).

중간 규모의<em&gt; Drosophila</em&gt; 프로테옴 실험을위한 배아 추출물

이 프로토콜은 다른 종의 조직이나 세포 유형에 쉽게 적응할 수 있는 초파리 신경계의 관심 유전자의 폴리(A) 길이를 정량화하기 위한 효율적이고 신뢰할 수 있는 방법을 설명합니다.

Drosophila Larva Brain and Cell Line의 Poly A 꼬리 길이 측정

배우세요 Drosophila 체미애 남성 액세서리 땀샘의 이차 세포에서 FACS를 이용한 RNA 분리 프로토콜입니다. 희귀 세포 집단의 전사체 분석을 통해 생식 성공에 중요한 유전자를 밝히는 방법을 익힐 수 있습니다.

체미애 남성 액세서리 땀샘의 이차 세포에서 RNA를 분리하는 FACS 기반 프로토콜

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