Name: 콜라겐 유도 관절염 모델에서 조직 염증의 분자 경로를 평가하기 위한 마우스 발 처리를 위한 저온 분쇄 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: 학습하세요 콜라겐 유도 관절염 모델에서 마우스 발 조직의 저온 분쇄 프로토콜을 통해 고품질 RNA와 단백질을 추출하고 염증 관련 분자 경로를 분석하는 방법을. 이 기술은 전임상 연구에서 질병의 분자 특성을 평가하는 데 필수적입니다.

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저자는 이 원고의 출판을 지지해 준 에디스 얀센과 나빈 라오와 제니퍼 타운에 대한 비판적 검토에 감사를 표하고자 한다.

모든 동물 실험은 얀센 R&D의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 정책에 따라 수행되었습니다.
1. 극저온 냉동고 밀 기반 분쇄 방법
<ol><li>CIA 연구의 종료에, 희생 마우스와 함께 1.5% 이소플루란 다음 자궁 경부 탈구.</li>
	<li>티슈 처리 당일, 모든 기구(주걱, 갈기 바이알 등)를 드라이 아이스에 최소 10분 동안 식히십시오.</li>
	<li>그림 1A에묘사 된 모피 선에서 가위로 뒷발을 잘라 .</li>
	<li>각 발을 1.5 mL 미세 원심 분리튜브로 옮기고 액체 질소에 즉시 얼린 다음 냉동 발을 -80 °C에서 보관하십시오. 샘플을 1주일 이상 냉동 보관하지 마십시오.</li>
	<li>그림 1B에 나타난 바와 같이 액체 질소로 냉동실 밀을 채우고 적어도 10 분 동안 평형화하십시오.</li>
	<li>처리되지 않은 시료를 드라이 아이스에 보관하고 동결 해동 주기를 피하십시오.</li>
	<li>한 뒷발을 바닥 강철 플러그로 미리 냉각된 대형 폴리카보네이트 연삭 바이알에 옮기고, 미리 냉각된 강철 임팩터를 삽입하고 미리 냉각된 상부 강철 플러그로 폴리카보네이트 연삭 바이알을닫습니다(그림 1C).</li>
	<li>샘플과 함께 대형 폴리카보네이트 분쇄 바이알을 액체로 미리 채워진 냉동실 밀에 옮기고 기기 앞쪽에 있는 고무 걸쇠로 뚜껑을 닫습니다.</li>
	<li>샘플을 액체 질소에서 1분 동안 식힙니다.</li>
	<li>냉동고 밀을 초당 10사이클로 1분 프로그램으로 설정하고 시작 버튼을 누릅니다. 냉동고 공장이 주기를 완료할 때까지 기다립니다. 참고: 강철 충격기가 앞뒤로 움직일 때 기계가 드럼 사운드를 냅니다. 청력 손실을 피하기 위해 귀 마개를 사용하십시오.</li>
	<li>냉동실 의 뚜껑을 열고, 큰 폴리 카보네이트 연삭 바이알을 꺼내 도 1D에묘사 된 바와 같이 추출기에 놓습니다. 강철 플러그가 폴리 카보네이트 튜브에서 미끄러 지 때까지 검은 색 핸들에 하향 압력을 가하여 상단 강철 플러그를 제거하십시오.</li>
	<li>열린 대형 폴리카보네이트 연삭 바이알을 드라이 아이스에 옮김을 옮김. 미리 냉각된 집게로 강철 충격기를 제거합니다.</li>
	<li>냉동 분말을 미리 냉각된 50 mL 원추형 튜브로 옮니다.</li>
	<li>RNA 추출을 위한 타르 냉동 1.5 mL 미세 원심 분리튜브에 냉동 분말 30-50 mg과 단백질 추출을 위한 냉동 분말 100-200 mg의 무게. 참고: 동결 된 분말은 그림 1E에묘사 된 흰색 또는 밝은 분홍색 미세 모래처럼 보일 것입니다.</li>
	<li>분쇄된 샘플을 -80°C에서 저장하고 24시간 이내에 RNA 및 단백질 분리를 진행합니다.</li>
</ol>2. RNA 추출
<ol><li>RLT 버퍼의 1 mL 당 β-메르카포에탄올(β-ME)의 10 μL을 첨가합니다.</li>
	<li>조직의 23.3 mL / mg의 비율에 해당하는 RLT 버퍼의 부피를 계산하고 동결 분말튜브에 β-ME와 RLT 버퍼의 적절한 볼륨을 추가합니다. 이 비율은 경험적으로 마우스 발에 이상적이라고 결정되었습니다.</li>
	<li>10초 동안 3,000 RPM에서 샘플을 소용돌이.</li>
	<li>1 mL 파이펫터로 10회 위아래로 활발하게 파이펫팅하여 잘 섞어보시기.</li>
	<li>20초 동안 3,000 RPM에서 다시 샘플을 소용돌이.</li>
	<li>튜브를 13,000 x g에서 2 분 동안 원심 분리합니다.</li>
	<li>700 μL의 초나토네이트를 신선한 튜브로 옮기고 700 μL의 700 μL을 첨가합니다. 참고: <700 μL이 튜브에 있는 경우, 70% 에탄올의 상응하는 부피를 추가하면서 진행할 수 있다.</li>
	<li>시료의 700 μL을 RNA 정제 컬럼에 로드합니다.</li>
	<li>30초 동안 ≥10,000 x g에서 튜브를 원심분리합니다.</li>
	<li>흐름을 삭제하고 샘플의 나머지 부분을 RNeasy 열에 로드합니다.</li>
	<li>30초 동안 ≥10,000 x g에서 튜브를 원심분리합니다.</li>
	<li>흐름을 버리고 30초 동안 ≥10,000 x g의 원심분리로 RW1 버퍼700 μL을 추가하여 컬럼을 세척합니다. 옵션 DNASE 소화를 수행하는 경우, 350 μL의 RW1은 DNASE 치료 전에 첨가된다.  그리고 DNASE 처리 후 RW1의 추가 350 μL이 첨가된다.</li>
	<li>선택 사항) 제조업체의 지침에 따라 DNase 소화 단계를 수행합니다.</li>
	<li>500 μL의 RPE 버퍼를 추가한 다음 30초 동안 ≥10,000 x g의 원심분리를 추가하여 튜브를 두 번 세척합니다.</li>
	<li>2 분 동안 ≥10,000 x g에서 원심 분리에 의해 컬럼을 건조시다.</li>
	<li>2 분 동안 ≥10,000 x g에서 원심분리로 50 μL 물을 첨가하여 RNA를 용출.</li>
	<li>추가 분석 전에 연구원의 선택 방법을 사용하여 RNA의 양을 결정하고 -80 °C에 저장하십시오.</li>
</ol>3. 단백질 추출
<ol><li>세포 배양 등급의 물을 사용하여 10x 셀 용해 스톡 용액을 1x 셀 용해 스톡 용액에 희석합니다.</li>
	<li>프로테아제 억제제 칵테일 세트 I을 1 mL의 물로 재구성하여 100x 프로테아제 억제제 스톡을 만듭니다.</li>
	<li>1x 셀 용해의 9.9 mL에 프로테아제 억제제 100 μL을 추가하여 1x 최종 재고 용액을 만듭니다.</li>
	<li>mg 조직 분말 당 얼음 차가운 1x 세포 용해 완충액 4 μL을 추가하십시오 (예를 들어, 800 μL의 용해 완충액을 200 mg의 조직 분말).</li>
	<li>튜브에 5mm 스테인리스 스틸 비드 1개를 추가합니다.</li>
	<li>60s에 대한 3,000 RPM에서 튜브를 소용돌이.</li>
	<li>모든 샘플 튜브를 상자에 놓고 1,000 RPM, 4 °C에서 1 시간 동안 로커에 원심 분리기 상자를 흔들어 줍니다. 참고: 연구원은 상자를 수직으로 배치하면 비드와 더 잘 혼합할 수 있음을 발견 할 수 있습니다.</li>
	<li>튜브를 10,000 x g 및 4°C에서 15분 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>상급제를 신선한 튜브로 옮기고 상단의 지방 층을 피하십시오.</li>
	<li>총 단백질 농도를 결정합니다. 단백질 용해물의 10-30배 희석은 BCA 검사에 이상적입니다.</li>
	<li>시료를 1.5 mL 마이크로원지 튜브로 Aliquot하고 추가 분석 전에 -80°C에서 보관합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Firestein, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunologic+mechanisms+in+the+pathogenesis+of+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Immunologic mechanisms in the pathogenesis of rheumatoid arthritis.</a> Journal of Clinical Rheumatology. 11, S39-S44 (2005).</li>
<li>McInnes, I. B., Schett, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathogenesis+of+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">The pathogenesis of rheumatoid arthritis.</a> New England Journal of Medicine. 365, 2205-2219 (2011).</li>
<li>Ahlqvist, E., Hultqvist, M., Holmdahl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+value+of+animal+models+in+predicting+genetic+susceptibility+to+complex+diseases+such+as+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Research+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">The value of animal models in predicting genetic susceptibility to complex diseases such as rheumatoid arthritis.</a> Arthritis Research and Therapy. 11, 226(2009).</li>
<li>David, C. S., Taneja, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+major+histocompatibility+complex+genes+in+murine+collagen-induced+arthritis%3A+a+model+for+human+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+the+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Role of major histocompatibility complex genes in murine collagen-induced arthritis: a model for human rheumatoid arthritis.</a> American Journal of the Medical Sciences. 327, 180-187 (2004).</li>
<li>Tarkowski, A., Holmdahl, R., Klareskog, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rheumatoid+factors+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Monographs+in+Allergy%22%5BJournal%5D)">Rheumatoid factors in mice.</a> Monographs in Allergy. 26, 214-229 (1989).</li>
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<li>Shen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+Blockade+of+TNF-alpha+and+IL-17A+Alleviates+Progression+of+Collagen-Induced+Arthritis+without+Causing+Serious+Infections+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Combined Blockade of TNF-alpha and IL-17A Alleviates Progression of Collagen-Induced Arthritis without Causing Serious Infections in Mice.</a> Journal of Immunology. 202, 2017-2026 (2019).</li>
</ol>

저자 BJ, SH, ML, RM, ML, TO 및 FS는 Janssen 연구 및 개발 Inc.의 직원이며 모회사인 Johnson & Johnson, Inc.의 주주입니다.

활액 조직에서 분자 경로를 평가하는 강력한 과학적 근거가 있지만, 뮤린 CIA 모델의 면역 프로파일링에 대한 많은 보고서는 말초 혈액에 초점을 맞춘 반면 염증이있는 발의 단백질 및 RNA 분석 데이터는 다소 제한적입니다. 이 편견에 대한 몇 가지 가능한 이유가 있습니다 : 뮤린 발목 관절은 ~ 2cm보다 크지 않습니다. 영향 받은 지역은 조직 분쇄기, 유봉 및 박격포, 실리카 비드 중단, trituration 또는 효소 소화와 같은 전통적인 방법을 사용하여 균질화하기 어려운 피부, 뼈 및 결합 조직으로 이루어져 있습니다. 이러한 방법은 전형적으로 불완전한 균질화, 낮은 단백질 또는 RNA 수율, 또는 단백질 분해 및 핵산 분해로 인한 일관되지 않은 품질을 초래한다. 본 명세서에 기재된 견고한 방법은 단일 균일한 샘플에서 질병의 분자 시그니처를 확립하기 위한 다운스트림 프로테오믹 및 전사 프로파일링 노력을 가능하게 하는 균질분쇄 된 냉동 분말을 생성하는 상세한 절차를 제공합니다. 소스.
<p class="jove_conte...

류마치스성 관절염 (RA)는 피부, 심혼, 폐 및 눈과 같은 기관의 합동 그리고 추가 관절 에 있는 지속적인 대칭 활막염을 가진 만성 조직 선동적인 질병1. 면역 반응의 전신 발현은 인간 환자에서 분명하지만, RA 병리학의 특징 중 하나는 활액 상 조직내 면역 세포의 침투및 활액 섬유 아세포의증식2.
인간 RA와 유사하게, 마우스 콜라겐 유도 관절염 (CIA) 모델은 활액 조직 및 전신 구획에 있는 활성 면역 반응으로 강한 조직 염증을 이끌어 냅니다. CIA 모델에 대한 상이한 마우스 균주의 감수성은 주요 조직 적합성 복합체(MHC) haplotype 및 항원 특이적 T 세포 및 B 세포 상호작용3,4로연결된다. 또한, 자가 항체 생산, 면역 복합체 침착, 골수성 세포 활성화, 활액 면역 침윤을 통한 다관절 증상 및 판누스 형성을 포함한 인간 RA의 많은 병원성 경로도 이 모델에서 분명하게 드러납니다. 5,6. 수사관은 항 염증 성 사이토 카인 치료의 효과를 조사하기 위해이 잘 설립 된 CIA 모델을채택7. 항-TNFα 및 항-IL-6과 같은 자가면역 또는 염증성 질환에 대해 승인된 많은 생물학적 제제는 CIA 모델8,9에서효과적인 것으로 밝혀졌다.
활액 조직에서 면역 계통의 상호 작용을 프로파일링은 RA의 병인과 관련되었던 분자 기계장치를 해명하기 위하여 결정적이다. 인간 임상 환경에서, 일반적인 관행은 초음파 화상 진찰의 지도의 밑에 바늘 활액 생검을 능력을 발휘하는 것입니다. 전임상 환경에서, 뮤린 관절의 작은 구조는 불가능하지 않을 경우 생검 절차를 훨씬 더 어렵게 만듭니다. 최근에는 이질적인 종점에 영향을 미치고 질병을 해결하는 약물의 조합을 평가하기 위해 뮤린 CIA 모델의 활용도를10으로입증했다. 극저온 냉동고 밀 기반 분쇄 방법은 염증이 있는 뮤린 발을 균일한 미세 분말로 처리하고 RNA와 단백질을 추출하기 위해 하류 공정을 확립하는 데 사용되었습니다. 이 방법은 효소 및 화학 적 탈지 공정으로부터 RNA 및 단백질을 보호하고 단일 균질화 된 샘플 소스에 여러 분석 방법을 적용 할 수 있게합니다.

<table><tbody><tr><td>5mm 스테인리스 스틸 비드</td><td>Qiagen</td><td>69989</td><td></td></tr><tr><td>베타-메르캅토에탄올</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td>RNASE 효소를 억제하는 시료 환원제</td></tr><tr><td>바이오분석기 키트 Agilent</td><td></td><td>5067-1511</td><td>RNA 적격성 평가 키트</td></tr><tr><td>b-메르캅토에탄올</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 등급 Water</td><td>Corning</td><td>25-055-CI</td><td>Water</td></tr><tr><td>Cell lysis stock solution</td><td>, Cell Signaling</td><td>9803</td><td></td></tr>, <tr><td>Eppendorf Tube</td>, <td>Eppendorf</td><td>22363204</td><td>Microfuge tube</td></tr>, <tr><td>Eppendorf tube centrifuge box</td><td>, Nalgene</td><td>5055</td><td>Box, eppendorf tube를 수평 튜브 배열로 고정하기 위한</td></tr><tr><td>Labellast 247, Variable Speed Rocker</td><td>Benchmark Scientific</td><td>BR5000</td><td></td></tr><tr><td>Freezer Mill</td><td>Spex Sample Prep</td><td>6875</td><td>Freezer/Mill 발을 분쇄 분말로 가공하기 위한</td></tr><tr><td></td><td>Spex Sample Prep</td><td>6801</td><td>폴리카보네이트 바이알 발을 분쇄 분말로 가공하기 위한</td></tr><tr><td>Pierce BCA 키트</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td>총 단백질 정량화를 위한 키트</td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 칵테일 세트 1</td><td>Calbiochem</td><td>539131</td><td>프로테아제 억제제</td></tr><tr><td>단백질 BCA 키트</td>, <td>Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Quantigene 키트</td><td>, Thermofisher</td><td>QP1013</td><td>bDNA 분석 키트</td></tr>, <tr><td>냉장 마이크로 원심분리기</td>, <td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td>원심분리</td></tr><tr><td>RLT 완충액,</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td>RNA 추출 완충액</td></tr>, <tr><td>RNeasy 미니 키트, RNeasy</td><td>컬럼, RLT 완충액 및 RW1 완충액을 포함한</td> <td>Qiagen</td><td>74104</td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Benchmark Scientific</td><td>BR5000</td><td>로커/셰이커</td></tr><tr><td>주걱</td><td>VWR</td><td>10806-412</td><td>분말 이송용 주걱</td></tr><tr><td>스테인레스 스틸 비드</td><td>Qiagen</td><td>69989</td><td>단백질 추출 중 혼합용 비드</td></tr><tr><td>튜브 추출기</td><td>Spex Sample Prep</td><td>6884</td><td>분쇄 바이알 상단 제거용 추출기</td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>VWR</td><td>10153-838</td><td>시료 혼합</td></tr></tbody></table>

콜라겐 유도 관절염 모델에서 조직 염증의 분자 경로를 평가하기 위한 마우스 발 처리를 위한 저온 분쇄 프로토콜

A Cryo-pulverization Protocol for Processing Mouse Paws to Evaluate Molecular Pathways of Tissue Inflammation in a Collagen Induced Arthritis Model

국소 조직에서 의 분자 변화를 프로파일링은 생체 내에서 치료 후보의 작용의 메커니즘(들)을 이해하는 데 매우 중요하다. 관절염 연구 분야에서, 많은 연구는 뼈의 복잡한 혼합물로 구성된 염증 관절에 초점을 맞추고, 연골, 근육, 기질 세포와 면역 세포. 여기에서, 우리는 극저온 통제된 환경에서 균일한 분쇄된 견본으로 불을 붙인 마우스 발을 중단하는 믿을 수 있고 강력한 기계적인 방법을 설치했습니다. 단백질 및 RNA 분해제는 국소 조직에서 관련 질병 경로의 단백질 및 전사 종점 및 분자 특성을 가능하게 하기 위해 처리되었습니다.

여기서, 우리는 도 2A에서CIA 마우스의 앞발에서 추출된 RNA의 대표적인 겔 이미지 시각화를 보여준다. 28S rRNA 및 18S rRNA 대역은 모든 샘플이 충분한 양의 손상되지 않은 RNA를 가지고 있음을 나타냅니다. 다음으로, 도 2B에서단백질 BCA 분석을 기반으로 총 단백질 농도의 대표적인 산산도를 보여 준다. 순진한 마우스, CIA 마우스 또는 다양한 치료법하에 CIA 마우스로부터의 총 단백질 농도는 그룹 전반에 걸쳐 비교된다. 단백질 추출물에서 염증성 사이토카인 및 케모카인의 농도를 결정하기 위해 Luminex 분석을 수행했습니다. 우리는 도 2C에서정규화된 사이토카인 및 케모카인(pg/mg 총 단백질)의 ...

액체 질소 냉동고 밀을 사용하여 뮤린 발을 처리하는 극저온 분쇄 방법은 조직에서 추출 된 RNA 또는 단백질의 수율과 품질을 개선하고 염증과 관련된 분자 프로파일의 분석을 가능하게하기 위해 개발되었습니다. 응답.

Profiling molecular changes in local tissues is crucial to understand the mechanism(s) of action of therapeutic candidates in vivo. In the field of ...

국소 조직에서 분자 프로파일의 평가는 질병 관련 전임상 모델에서 평가되는 활성 의약품의 작용 메커니즘을 이해하는 중요한 단계입니다. 관절염 연구의 분야에서, 관심의 국소 조직 환경은 뼈, 연골, 근육 및 면역 세포의 복잡한 혼합물로 구성된 작은 무게 베어링 관절이다. 여기서 우리는 극저온 으로 통제 된 환경에서이 복잡한 조직 환경의 기계적 중단 및 / 또는 분쇄를위한 신뢰할 수있는 견고한 방법을 설명합니다.이 방법은 단일 균일한 샘플 소스에서 질병의 분자 서명을 확립하기위한 다운스트림 프로테오믹 및 전사 프로파일링 노력을 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법은 다른 많은 오래된 기술과 달리 균일 한 분말을 생성합니다. 또한, 기존의 온도 격리 절차는 고품질 RNA의 격리를 허용한다.이 방법은 그 때 관심있는 관련 질병 통로의 분자 특성화를 가능하게 하는 다운스트림 proteomic 및 전사 프로파일링을 생성하는 데 이용될 수 있습니다. 이 방법은 조직에서 분자 서명을 유도하는 모든 연구 분야에 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 이 방법은 성분을 해리하기 어렵고 조밀하고 어려운 복잡한 조직 시스템으로 확장 될 수 있습니다.우리는 이 시점에서 평가하지 않았지만 귀나 뼈와 같은 조밀한 연골 조직에 대한 잠재적 인 응용 프로그램을 볼 수 있었습니다. 계량을 위해 분말을 튜브로 옮기는 데 중요한 특성은 연습하는 것입니다. 너무 많은 시간이 걸린다면 분말이 해동되기 시작하고 무정형이 됩니다.시술에 익숙할 때까지 샘플 수를 10에서 15로 제한하는 것이 중요합니다. 조직 처리 당일, 드라이 아이스에 필요한 모든 기기를 최소 10분 동안 미리 식힙니다. 극심한 추위에 의해 피해를 입지 않도록 열 장갑을 착용하십시오.다음으로, 준비된 마우스 발을 각각 별도의 1.5 밀리리터 미세원심분리기 튜브로 옮기고 즉시 액체 질소로 동결합니다. 냉동 된 발을 음의 섭씨 80도에 저장합니다. 계속 할 준비가되면 냉동고 밀에 액체 질소를 채우고 적어도 10 분 동안 평형하게하십시오.가공되지 않은 샘플을 드라이 아이스에 놓고 동결/해동 주기를 피하기 위해 보관하십시오. 그런 다음 한 힌드 발을 바닥 강철 플러그로 미리 냉각된 대형 폴리카보네이트 연삭 바이알로 옮춥니다. 미리 냉각된 강철 임펙터를 삽입하고 폴리카보네이트 연삭 바이알을 미리 냉각된 상단 스틸 플러그로 닫습니다.시료와 함께 대형 폴리카보네이트 연삭 바이알을 미리 채워진 냉동고 공장으로 옮기고 기기 의 전면에 있는 고무 걸쇠로 뚜껑을 닫습니다. 샘플을 액체 질소에서 1분 동안 식힙니다. 다음으로, 냉동고 밀을 초당 10 사이클로 1분 프로그램으로 설정합니다.실행 버튼을 누르고 냉동실 공장이 주기를 완료할 때까지 기다립니다. 그 후, 냉동고 공장의 뚜껑을 열고 큰 폴리 카보네이트 연삭 유리병을 꺼내. 연삭 바이알을 추출기에 넣고 강철 플러그가 폴리 카보네이트 튜브에서 미끄러질 때까지 검은 손잡이에 하방 압력을 가하여 상단 스틸 플러그를 제거합니다.열린 연삭 바이알을 드라이 아이스에 옮기고 미리 냉각된 포셉을 사용하여 강철 임펙터를 제거합니다. 냉동 분말을 미리 냉각된 50 밀리리터 원추형 튜브로 옮춥니다. 냉동 분말의 30~50밀리그램을 RNA 추출을 위한 1.5 밀리리터 미세센심분리기 튜브와 단백질 추출을 위한 100~200밀리그램 사이의 미세센심분리기 튜브로 계량합니다.분쇄된 샘플을 음의 섭씨 80도에 저장하고 24시간 이내에 RNA 및 단백질 격리로 진행합니다. 먼저 RLT 버퍼의 각 밀리리터에 베타-메르카토에탄올 10마이크로리터를 추가합니다. 조직의 밀리그램 당 23.3 밀리리터의 비율에 해당하는 RLT 버퍼의 부피를 계산하고 냉동 분말을 가진 튜브에 베타-mercaptoethanol을 사용하여 RLT 버퍼의 적절한 부피를 추가합니다.샘플을 3, 000 RPM에서 10초 동안 소용돌이시다. 1밀리리터 파이퍼를 사용하여 10번 위아래로 파이펫을 하고 샘플을 3, 000 RPM에서 20초 동안 다시 소용돌이시다. 원심분리기는 13, 000배 g에서 2분간, 700마이크로리터의 마이크로리터를 신선한 튜브로 옮긴다.이 튜브에 70%에탄올의 700 마이크로리터를 추가하고 RNA 정화 열에 샘플의 700 마이크로리터를 적재한다. 30초 동안 튜브를 최소 10, 000배 의 속도로 원심분리합니다. 흐름을 버리고 샘플의 나머지 부분을 RNeasy 컬럼에 로드하고 30초 동안 최소 10, 000배 의 속도로 튜브를 다시 원심분리합니다.RW1 버퍼 700 마이크로리터를 추가하고 30초 동안 10, 000배 이상의 속도로 원심분리를 추가하여 흐름을 버리고 컬럼을 세척합니다. DNAse 소화를 수행하는 경우 DNAse 치료 전에 RW1의 350 마이크로리터가 추가됩니다. 그리고 DNAse 처리 후에, RW1의 추가 350 마이크로리터가 추가됩니다.그런 다음 RPE 버퍼와 원심분리기 500마이크로리터를 30초 동안 최소 10, 000배 의 속도로 추가하여 매번 흐름을 폐기하여 컬럼을 두 번 세척합니다. 그런 다음 2분 동안 적어도 10, 000배의 속도로 원심분리하여 컬럼을 건조시킵니다. RNA를 10마이크로리터의 물과 원심분리기를 2분 동안 최소 10, 000배의 속도로 첨가하여 RNA를 엘테.흐름을 수집하고 새로운 1.5 밀리리터 튜브로 전송합니다. 연구원의 선택 방법을 사용하여 RNA의 양을 결정하고 추가 분석 전에 부정적인 섭씨 80도에 저장합니다. 10X 셀 리시스 스톡 용액을 세포 배양 등급물로 1X 셀 리시스 스톡 솔루션으로 희석합니다.프로테아제 억제제 칵테일 세트를 1밀리리터의 물로 재구성하여 100배 프로테아제 억제제 스톡을 만듭니다. 1X 세포 용해 버퍼의 9.9 밀리리터에 프로테아제 억제제 100밀리리터를 추가하여 1X 최종 스톡 솔루션을 얻습니다. 티슈 파우더 의 각 밀리그램에 4 개의 마이크로 리터를 추가하고 튜브에 5 밀리미터 스테인레스 스틸 비드 하나를 추가합니다.튜브를 3, 000 RPM에서 60초 동안 소용돌이시다. 튜브를 젖은 얼음으로 옮기고 다음 샘플로 계속 이동합니다. 또한, 연구원은 상자를 수직으로 두면 비드와 더 잘 혼합할 수 있다는 것을 발견 할 수 있습니다.1시간 후, 10, 000배, 섭씨 4도에서 15분간 원심분리합니다. 상부를 신선한 튜브로 옮기면 상단의 지방 층을 피하십시오. 총 단백질 농도를 결정합니다.Aliquot 각 샘플을 1.5 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브로 넣고 추가 분석을 수행 할 준비가 될 때까지 음의 80도섭에 저장합니다. 본 연구에서는, 극저온 분쇄 방법은 조직에서 추출된 RNA 또는 단백질의 수율 과 품질을 개선하고 염증 반응과 관련된 분자 프로파일의 분석을 가능하게 하기 위해 뮤린 발을 처리하는 데 사용된다. 대표적인 젤 영상 시각화는 CIA 마우스의 앞발으로부터 추출된 RNA를 나타낸다.28S rRNA 및 18S rRNA 대역은 모든 시료가 충분한 양의 그대로 RNA를 가지고 있음을 나타냅니다. 단백질 BCA 분석을 기반으로 한 총 단백질 농도의 대표적인 산란 플롯이 여기에 나와 있다. 순진한 마우스에서 총 단백질 농도, CIA 마우스, 또는 다양 한 치료 에서 CIA 마우스 는 그룹 전반에 걸쳐 비교.루미넥스 분석은 단백질 추출물에서 염증성 사이토카인과 케모킨의 농도를 결정하기 위해 실시된다. 정규화된 사이토카인 및 케모킨 농도의 대표적인 산란 줄거리는 순진한 마우스와 비교했을 때, 여러 사이토카인이 CIA 마우스에서 상승하고 항IL17A 항체를 가진 치료가 여러 사이토카인의 생산을 현저히 억제한다는 것을 밝힙니다. 마이크로어레이 분석은 CIA 및 치료 관련 효과의 전사적 변화를 평가하기 위해 수행됩니다.유전자의 대표적인 열지도 플롯은 NAïve 마우스에 비해 CIA 마우스에서 현저하게 증가하여 여기에 도시된다. 이 절차를 수행할 때, 연구원은 튜브와 분말이 드라이 아이스에서 보관되는 시간을 최소화하는 것이 중요합니다. 이것은 저하된 RNA 및 단백질에 분말 및 후속 문제의 해동을 방지하는 것을 돕습니다.이 기술에 의해 생성 된 분자 서명의 높은 품질은 연구원이 치료가 부여 할 독특한 프로필을 심문하고 관절염 조건을 치료하는 데 사용할 수있는 메커니즘의 분화를 더 허용 할 수 있습니다. 이 기술은 관심있는 이 조직에 있는 분자 서명을 추가 평가하기 위하여 귀와 뼈 같이 조밀한 조직의 수를 추출하기 위하여 이용될 수 있었습니다. 치료법이 질병의 분자 서명을 조절하는 방법을 이해하면 특정 신호 경로가 변조되는 것을 더 잘 평가할 수 있습니다.그리고 아마도 더 중요한 것은, 어떤 통로가 평가되는 치료 기계장치로 규제되지 않습니다. 액체 질소와 드라이 아이스로 작업할 때는 제대로 정격된 장갑과 얼굴 방패를 포함한 개인 보호 장비를 사용해야 합니다. 몇 초 이상 피부노출로 인해 심한 화상을 입을 수 있습니다.다량의 드라이 아이스와 함께 작업할 때, 드라이 아이스가 이산화탄소를 방출함에 따라 통풍이 잘 되는 지역에서 일하는 것이 중요합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오는 마우스의 자가면역 관절염에 대한 세포 기반 치료법을 보여줍니다. 오브알부민 특이적 수용체를 발현하는 iPSC 유래 T 조절 세포에 보조제에서 유화된 메틸화된 소 혈청 알부민(mBSA)을 주입합니다. 쥐 항원제시세포(APC)는 mBSA를 처리하여 T세포에 전달하여 T세포가 활성화되고 무릎 관절의 활액막으로 이동하도록 유도합니다. 후속 주사에는 왼쪽 무릎에 mBSA만 투여하고 오른쪽 무릎에 mBSA와 오브알부민을 조합하여 투여합니다. 왼쪽 무릎에서는 mBSA에 대한 면역 반응이 관절염을 유발하는 반면, 오른쪽 무릎에서는 오브알부민과 상호 작용하는 T 조절 세포가 염증을 완화하여 관절염 증상을 개선합니다.

쥐 모델에서 자가면역 관절염에 대한 세포 기반 치료법

우리 관절염 통증의 갖는 측정을 개발 하 고 화학적으로 유발 된 관절염의 다른 murine 모델에 자발적인 통증을 측정 하기 위한 표준화 된 방법으로 그것을 결합. 이러한 측정값은 민감하고 관절 통증의 종류에 대 한 재현입니다.

Murine 모델 Monoarticular 무릎 통증의 통증의 자연과 갖는 측정

여기에서, 우리는 생체외 및 시험관내 둘 다 호중구 이동 및 침투를 평가하는 3개의 방법을 제시합니다. 이 방법은 호중구 이동을 표적으로 하는 유망한 치료법을 발견하기 위하여 이용될 수 있습니다.

마우스에서 호중구의 이동 및 침투 감지

본 프로토콜은 내측 소인대를 절단하여 마우스 무릎을 불안정하게 한 후 관절 연골의 표면에 조절된 마이크로블레이드 스크래치를 기술한다. 이 동물 모델은 골괴사 형성, 골경화증 및 초기 단계 통증을 연구하기에 적합한 가속 형태의 골관절염(OA)을 제시합니다.

내측 반월판 및 연골 스크래치 쥐의 불안정화 가속화된 골관절염의 모델

본 연구는 쥐의 염증성 관절염 조직으로부터 활막 대식세포 및 섬유아세포를 분리하기 위한 수정된 프로토콜을 제공한다.

쥐 관절염 조직에서 Primary Synovial Macrophages and Fibroblasts의 분리 및 배양

우리는 석고로 고정된 무릎 골관절염 쥐에 대해 수행되는 Tuina 조작에 대한 프로토콜을 제시합니다. 예비 결과에 기초하여, 상기 방법의 효능은 염증 및 연골 손실의 감소에 의존한다는 것을 시사하였다.

무릎 골관절염 쥐의 염증과 연골 손실을 줄이기 위한 Tuina 조작

이 연구는 표피(EC) 면역을 통해 생쥐의 면역 반응을 조절하는 피부의 역할을 보여줍니다. 단백질 항원을 사용한 EC 면역은 병원체 관련 분자 패턴과 결합할 때 접촉 과민증 또는 피부 유도 억제에서 면역 반응을 억제할 수 있습니다. EC 면역은 면역 요법에 대한 효과적이고 주사 바늘이 없는 접근 방식으로서 가능성을 보여줍니다.

표피 유도 면역조절의 쥐 모델(Murine Model of Epicutanely-Induced Immunomodulation)

관절의 생체 영상 촬영은 염증이 생긴 관절 내 백혈구의 이동 행동과 분자 역학을 밝히는 데 매우 유용한 기법입니다. 여기서는 제2형 콜라겐 유발 관절염(CIA) 마우스 모델을 사용한 관절의 생체 내 영상 검사에 대한 상세한 프로토콜을 제시합니다.

생체 내 영상 검사는 관절 내 백혈구의 이동 행동을 밝혀냅니다

본 연구에서는 SKG 마우스에서 CD4+ T 세포를 이식하여 류마티스 관절염(RA) 마우스 모델을 확립하는 프로토콜을 보고하며, 이를 통해 RA에 대한 면역학적 기전, 병리학적 진행 및 새로운 치료법 개발을 조사하기 위한 빠르고 신뢰할 수 있는 실험 도구를 제공합니다.

An Adoptive Transfer Model of Rheumatoid Arthritis in Mice

Peyer의 패치를 다루는 전문 뿌리 - 관련 상피의 M 세포는 창자 - 관련 림프 조직에서 점막 immunosurveillance을위한 중요한 역할을한다. 여기 우리는 M 세포에 의해 세균 transcytosis에 대한 평가 방법을...

마우스의 응용은 M 세포에 의해 박테리아 이해를 평가하는 Peyer의 패치 장 루프 분석 출혈도 잡았

학습하세요 콜라겐 유도 관절염 모델에서 마우스 발 조직의 저온 분쇄 프로토콜을 통해 고품질 RNA와 단백질을 추출하고 염증 관련 분자 경로를 분석하는 방법을. 이 기술은 전임상 연구에서 질병의 분자 특성을 평가하는 데 필수적입니다.

콜라겐 유도 관절염 모델에서 조직 염증의 분자 경로를 평가하기 위한 마우스 발 처리를 위한 저온 분쇄 프로토콜

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