콜라겐 유도 관절염 모델에서 조직 염증의 분자 경로를 평가하기 위한 마우스 발 처리를 위한 저온 분쇄 프로토콜

국소 조직에서 분자 프로파일의 평가는 질병 관련 전임상 모델에서 평가되는 활성 의약품의 작용 메커니즘을 이해하는 중요한 단계입니다. 관절염 연구의 분야에서, 관심의 국소 조직 환경은 뼈, 연골, 근육 및 면역 세포의 복잡한 혼합물로 구성된 작은 무게 베어링 관절이다. 여기서 우리는 극저온 으로 통제 된 환경에서이 복잡한 조직 환경의 기계적 중단 및 / 또는 분쇄를위한 신뢰할 수있는 견고한 방법을 설명합니다.

이 방법은 단일 균일한 샘플 소스에서 질병의 분자 서명을 확립하기위한 다운스트림 프로테오믹 및 전사 프로파일링 노력을 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법은 다른 많은 오래된 기술과 달리 균일 한 분말을 생성합니다. 또한, 기존의 온도 격리 절차는 고품질 RNA의 격리를 허용한다.

이 방법은 그 때 관심있는 관련 질병 통로의 분자 특성화를 가능하게 하는 다운스트림 proteomic 및 전사 프로파일링을 생성하는 데 이용될 수 있습니다. 이 방법은 조직에서 분자 서명을 유도하는 모든 연구 분야에 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 이 방법은 성분을 해리하기 어렵고 조밀하고 어려운 복잡한 조직 시스템으로 확장 될 수 있습니다.

우리는 이 시점에서 평가하지 않았지만 귀나 뼈와 같은 조밀한 연골 조직에 대한 잠재적 인 응용 프로그램을 볼 수 있었습니다. 계량을 위해 분말을 튜브로 옮기는 데 중요한 특성은 연습하는 것입니다. 너무 많은 시간이 걸린다면 분말이 해동되기 시작하고 무정형이 됩니다.

시술에 익숙할 때까지 샘플 수를 10에서 15로 제한하는 것이 중요합니다. 조직 처리 당일, 드라이 아이스에 필요한 모든 기기를 최소 10분 동안 미리 식힙니다. 극심한 추위에 의해 피해를 입지 않도록 열 장갑을 착용하십시오.

다음으로, 준비된 마우스 발을 각각 별도의 1.5 밀리리터 미세원심분리기 튜브로 옮기고 즉시 액체 질소로 동결합니다. 냉동 된 발을 음의 섭씨 80도에 저장합니다. 계속 할 준비가되면 냉동고 밀에 액체 질소를 채우고 적어도 10 분 동안 평형하게하십시오.

가공되지 않은 샘플을 드라이 아이스에 놓고 동결/해동 주기를 피하기 위해 보관하십시오. 그런 다음 한 힌드 발을 바닥 강철 플러그로 미리 냉각된 대형 폴리카보네이트 연삭 바이알로 옮춥니다. 미리 냉각된 강철 임펙터를 삽입하고 폴리카보네이트 연삭 바이알을 미리 냉각된 상단 스틸 플러그로 닫습니다.

시료와 함께 대형 폴리카보네이트 연삭 바이알을 미리 채워진 냉동고 공장으로 옮기고 기기 의 전면에 있는 고무 걸쇠로 뚜껑을 닫습니다. 샘플을 액체 질소에서 1분 동안 식힙니다. 다음으로, 냉동고 밀을 초당 10 사이클로 1분 프로그램으로 설정합니다.

실행 버튼을 누르고 냉동실 공장이 주기를 완료할 때까지 기다립니다. 그 후, 냉동고 공장의 뚜껑을 열고 큰 폴리 카보네이트 연삭 유리병을 꺼내. 연삭 바이알을 추출기에 넣고 강철 플러그가 폴리 카보네이트 튜브에서 미끄러질 때까지 검은 손잡이에 하방 압력을 가하여 상단 스틸 플러그를 제거합니다.

열린 연삭 바이알을 드라이 아이스에 옮기고 미리 냉각된 포셉을 사용하여 강철 임펙터를 제거합니다. 냉동 분말을 미리 냉각된 50 밀리리터 원추형 튜브로 옮춥니다. 냉동 분말의 30~50밀리그램을 RNA 추출을 위한 1.5 밀리리터 미세센심분리기 튜브와 단백질 추출을 위한 100~200밀리그램 사이의 미세센심분리기 튜브로 계량합니다.

분쇄된 샘플을 음의 섭씨 80도에 저장하고 24시간 이내에 RNA 및 단백질 격리로 진행합니다. 먼저 RLT 버퍼의 각 밀리리터에 베타-메르카토에탄올 10마이크로리터를 추가합니다. 조직의 밀리그램 당 23.3 밀리리터의 비율에 해당하는 RLT 버퍼의 부피를 계산하고 냉동 분말을 가진 튜브에 베타-mercaptoethanol을 사용하여 RLT 버퍼의 적절한 부피를 추가합니다.

샘플을 3, 000 RPM에서 10초 동안 소용돌이시다. 1밀리리터 파이퍼를 사용하여 10번 위아래로 파이펫을 하고 샘플을 3, 000 RPM에서 20초 동안 다시 소용돌이시다. 원심분리기는 13, 000배 g에서 2분간, 700마이크로리터의 마이크로리터를 신선한 튜브로 옮긴다.

이 튜브에 70%에탄올의 700 마이크로리터를 추가하고 RNA 정화 열에 샘플의 700 마이크로리터를 적재한다. 30초 동안 튜브를 최소 10, 000배 의 속도로 원심분리합니다. 흐름을 버리고 샘플의 나머지 부분을 RNeasy 컬럼에 로드하고 30초 동안 최소 10, 000배 의 속도로 튜브를 다시 원심분리합니다.

RW1 버퍼 700 마이크로리터를 추가하고 30초 동안 10, 000배 이상의 속도로 원심분리를 추가하여 흐름을 버리고 컬럼을 세척합니다. DNAse 소화를 수행하는 경우 DNAse 치료 전에 RW1의 350 마이크로리터가 추가됩니다. 그리고 DNAse 처리 후에, RW1의 추가 350 마이크로리터가 추가됩니다.

그런 다음 RPE 버퍼와 원심분리기 500마이크로리터를 30초 동안 최소 10, 000배 의 속도로 추가하여 매번 흐름을 폐기하여 컬럼을 두 번 세척합니다. 그런 다음 2분 동안 적어도 10, 000배의 속도로 원심분리하여 컬럼을 건조시킵니다. RNA를 10마이크로리터의 물과 원심분리기를 2분 동안 최소 10, 000배의 속도로 첨가하여 RNA를 엘테.

흐름을 수집하고 새로운 1.5 밀리리터 튜브로 전송합니다. 연구원의 선택 방법을 사용하여 RNA의 양을 결정하고 추가 분석 전에 부정적인 섭씨 80도에 저장합니다. 10X 셀 리시스 스톡 용액을 세포 배양 등급물로 1X 셀 리시스 스톡 솔루션으로 희석합니다.

프로테아제 억제제 칵테일 세트를 1밀리리터의 물로 재구성하여 100배 프로테아제 억제제 스톡을 만듭니다. 1X 세포 용해 버퍼의 9.9 밀리리터에 프로테아제 억제제 100밀리리터를 추가하여 1X 최종 스톡 솔루션을 얻습니다. 티슈 파우더 의 각 밀리그램에 4 개의 마이크로 리터를 추가하고 튜브에 5 밀리미터 스테인레스 스틸 비드 하나를 추가합니다.

튜브를 3, 000 RPM에서 60초 동안 소용돌이시다. 튜브를 젖은 얼음으로 옮기고 다음 샘플로 계속 이동합니다. 또한, 연구원은 상자를 수직으로 두면 비드와 더 잘 혼합할 수 있다는 것을 발견 할 수 있습니다.

1시간 후, 10, 000배, 섭씨 4도에서 15분간 원심분리합니다. 상부를 신선한 튜브로 옮기면 상단의 지방 층을 피하십시오. 총 단백질 농도를 결정합니다.

Aliquot 각 샘플을 1.5 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브로 넣고 추가 분석을 수행 할 준비가 될 때까지 음의 80도섭에 저장합니다. 본 연구에서는, 극저온 분쇄 방법은 조직에서 추출된 RNA 또는 단백질의 수율 과 품질을 개선하고 염증 반응과 관련된 분자 프로파일의 분석을 가능하게 하기 위해 뮤린 발을 처리하는 데 사용된다. 대표적인 젤 영상 시각화는 CIA 마우스의 앞발으로부터 추출된 RNA를 나타낸다.

28S rRNA 및 18S rRNA 대역은 모든 시료가 충분한 양의 그대로 RNA를 가지고 있음을 나타냅니다. 단백질 BCA 분석을 기반으로 한 총 단백질 농도의 대표적인 산란 플롯이 여기에 나와 있다. 순진한 마우스에서 총 단백질 농도, CIA 마우스, 또는 다양 한 치료 에서 CIA 마우스 는 그룹 전반에 걸쳐 비교.

루미넥스 분석은 단백질 추출물에서 염증성 사이토카인과 케모킨의 농도를 결정하기 위해 실시된다. 정규화된 사이토카인 및 케모킨 농도의 대표적인 산란 줄거리는 순진한 마우스와 비교했을 때, 여러 사이토카인이 CIA 마우스에서 상승하고 항IL17A 항체를 가진 치료가 여러 사이토카인의 생산을 현저히 억제한다는 것을 밝힙니다. 마이크로어레이 분석은 CIA 및 치료 관련 효과의 전사적 변화를 평가하기 위해 수행됩니다.

유전자의 대표적인 열지도 플롯은 NAïve 마우스에 비해 CIA 마우스에서 현저하게 증가하여 여기에 도시된다. 이 절차를 수행할 때, 연구원은 튜브와 분말이 드라이 아이스에서 보관되는 시간을 최소화하는 것이 중요합니다. 이것은 저하된 RNA 및 단백질에 분말 및 후속 문제의 해동을 방지하는 것을 돕습니다.

이 기술에 의해 생성 된 분자 서명의 높은 품질은 연구원이 치료가 부여 할 독특한 프로필을 심문하고 관절염 조건을 치료하는 데 사용할 수있는 메커니즘의 분화를 더 허용 할 수 있습니다. 이 기술은 관심있는 이 조직에 있는 분자 서명을 추가 평가하기 위하여 귀와 뼈 같이 조밀한 조직의 수를 추출하기 위하여 이용될 수 있었습니다. 치료법이 질병의 분자 서명을 조절하는 방법을 이해하면 특정 신호 경로가 변조되는 것을 더 잘 평가할 수 있습니다.

그리고 아마도 더 중요한 것은, 어떤 통로가 평가되는 치료 기계장치로 규제되지 않습니다. 액체 질소와 드라이 아이스로 작업할 때는 제대로 정격된 장갑과 얼굴 방패를 포함한 개인 보호 장비를 사용해야 합니다. 몇 초 이상 피부노출로 인해 심한 화상을 입을 수 있습니다.

다량의 드라이 아이스와 함께 작업할 때, 드라이 아이스가 이산화탄소를 방출함에 따라 통풍이 잘 되는 지역에서 일하는 것이 중요합니다.