Name: 조혈 줄기 선조 세포 대사 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 20 s
Description: 배우세요 조혈 줄기 선조 세포의 미토콘드리아 호흡과 당분해 분석 방법을 최적화된 프로토콜로 익히세요. 이 기술은 희소하고 섬세한 세포의 대사 조절을 정확히 측정하여 혈액 형성과 관련 질환 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 부분적으로 국립 보건원 (HL131645, CA016058), 세인트 볼드릭 재단 및 펠로토니아 재단의 자금 지원에 의해 지원됩니다.

이 프로토콜은 전국 어린이 병원 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.
참고: 프로토콜은 2 일의 기간에 걸쳐 연대순으로 설명된다. 아래 프로토콜에 설명된 대로 신선한 시약을 사용하십시오.
1. 분석 전날 시약 준비
<ol><li>
센서 카트리지에 수분을 공급합니다.
	<ol>
<li>비CO2 37°C 인큐베이터에서 교정제(재료표)의 5 mL을 밤새 인큐베이터한다.</li>
		<li>플럭스 분석키트(재료 표)를열고 센서 카트리지(녹색; 위쪽)를 유틸리티 플레이트(투명; 하단)에서 분리합니다. 다음으로 센서 카트리지를 거꾸로 놓고 유틸리티 플레이트에 인접시됩니다.</li>
		<li>멸균수를 사용하여 유틸리티 플레이트(200 μL)의 웰과 웰 주변의 챔버(400 μL)를 채웁니다.</li>
		<li>센서 카트리지를 유틸리티 플레이트에 담그면 센서가 물로 완전히 덮여 있는지 확인합니다. 거품의 형성을 피하기 위해 3x를 누릅니다.</li>
		<li>유틸리티 플레이트에 잠긴 카트리지를 비CO2 37°C 인큐베이터에 하룻밤 동안 놓습니다. 물의 증발을 방지하려면 인큐베이터가 제대로 가습되었는지 확인하십시오. 특히 일반 오븐을 사용하는 경우 카트리지 유틸리티 플레이트 옆에H2O가들어 있는 오픈 비커를 추가 예방 조치로 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
분석 판을 준비합니다.
	<ol>
<li>70% 에탄올을 사용하여 생물 안전 성 캐비닛 클래스 2의 표면을 살균하십시오. 후드 아래에 분석 판을 엽니다.</li>
		<li>후드 아래의 분석 판의 각각의 웰에 시판되는 0.01% (w/v) 폴리-L-리신(PLL) 용액의 40 μL을 추가합니다.</li>
		<li>키트에 제공된 뚜껑으로 분석 판을 덮습니다. 1 시간 동안 후드 아래실온 (RT)에서 폐쇄 된 분석 판을 배양합니다. 참고: 인큐베이션의 목적은 PLL이 분석판의 표면에 현탁액 세포의 부착을 용이하게 하기 위해 분석판의 표면을 코팅하게 하는 것이다.</li>
		<li>분석판의 1시간 배양 후, 멸균 진공 계 아스피레이터로 과잉 용액을 제거하고 후드 아래에 잘 건조시다. 참고: 흡인기를 사용하여 과도한 PLL 제거 후 분석 판의 우물을 공기 건조하려면 ~ 30-60 분이 소요됩니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 분석의 날
<ol><li>카트리지를 준비합니다.
	<ol>
<li>센서 카트리지를 들어 올립니다. 조직 배양 후드에 거꾸로 놓고 유틸리티 플레이트에서 물을 버립니다.</li>
		<li>사전 데온 교정기의 200 μL로 유틸리티 플레이트 웰을 채웁니다.</li>
		<li>교정제의 400 μL로 우물 주위의 챔버를 채웁니다.</li>
		<li>센서 카트리지를 유틸리티 플레이트에 담그고 센서가 교정장치로 완전히 덮여 있는지 확인합니다. 거품의 형성을 피하기 위해 3x를 누릅니다.</li>
		<li>45-60 분 동안 비 CO2 37 °C 인큐베이터에서 유틸리티 플레이트에 잠긴 센서 카트리지를 평형화하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>수확 뮤린 골수 유래 LSK HSPC.
	<ol>
<li>충분한 생물학적 복제를 수용하기 위해, 분석 판의 웰 당 하나의 마우스에서 파생 된 HSPC를 사용할 계획. 참고: 이 골수 수확 방법은 각 마우스로부터 ~50,000-80,000 LSK HSPC를 제공합니다. 세포외 플럭스를 측정하는 이 프로토콜은 96개의 웰 플레이트당 ~70,000 LSK HSPC에 최적화되어 있습니다.</li>
		<li>CO2 과다 복용 및 자궁 경부 탈구를 사용하여 마우스를 안락사시키고, 국소 IACUC 승인 방법에 따라.</li>
		<li>70% 에탄올을 사용하여 해부 도구와 벤치의 표면을 살균합니다.</li>
		<li>각 마우스에 대해, RT에서 2% 열 불활성화 태아 소 혈청(FBS)을 함유한 1x 인산완충 식염수(PBS)로 페트리 접시 1개를 미리 채웁니다. 참고: 다음 단계에서 덩어리를 생성하기 때문에 미리 냉각된 PBS를 사용하지 마십시오.</li>
		<li>안락사된 마우스 전체에 70% 에탄올(v/v)을 뿌린다. 마우스17,18에서상지와 하반신, 엉덩이 뼈, 흉골, 흉골, 흉골 및 척추를 포함한 모든 뼈를 분리합니다. LSK 세포를 오염시킬 수 있으므로 마우스척수에서 흰 물질을 꺼냅니다. 모든 뼈를 1x PBS(+ 2% FBS)에 넣으세요, 수집되는 대로 페트리 접시에 추가 로 사용할 때까지 넣으세요.</li>
		<li>50 mL 원추형 튜브를 반전 (매번 새로운) 페트리 접시에 1 x PBS (+ 2 % FBS)에 잠긴 뼈를 삼중화하는 데 사용합니다.</li>
		<li>10 mL 혈청학적 파이펫을 사용하여, 피펫을 위아래로 (~10x) 뼈를 분쇄 한 후 뼈에서 세포를 균일하게 플러시합니다.</li>
		<li>50 mL 원엽 튜브에 40 μm 세포 스트레이너를 놓습니다. 1x PBS (+ 2 % FBS)의 1 mL을 통과하여 스트레이너의 표면을 미리 적시십시오.</li>
		<li>2.2.7단계에서 골수 유래 세포 현탁액을 수확하고 세포 스트레이너의 젖은 표면을 통과하여 뼈 찌꺼기를 제거한다.</li>
		<li>모든 골재료가 50 mL 원추형 튜브에서 수집되는 마커로서 흰색으로 변할 때까지 2.2.6단계부터 2.2.9단계를 반복합니다. 참고: 그것은 수시로 모든 골수 파생한 세포를 모으기 위하여 마우스 당 2개의 50 mL 원추형 관이 걸립니다.</li>
		<li>원심분리기 50 mL 원추형 튜브는 500 x g 및 RT에서 5분 동안 골수 유래 세포를 함유한다.</li>
		<li>상급체를 제거합니다. 골수 유래 세포(50 mL 튜브의 내용물 결합)를 최종 부피로 1x PBS(+ 2% FBS)의 5mL에 다시 중단하고 RT에서 세포를 유지합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>수확 단핵구 뮤린 골수 세포.
	<ol>
<li>15mL 원엽 튜브에 밀도 그라데이션 매질(즉, Ficoll)의 5mL를 추가합니다. 그런 다음 골수 세포 현탁액의 5 mL를 천천히 추가하십시오. 셀이 밀도 그라데이션 매체 위의 레이어로 유지되는지 확인합니다.</li>
		<li>500 x g 및 RT에서 30 분 동안 원심 분리기. 원심분리기에서 브레이크를 사용하지 마십시오. 원심분리기가 가능한 가장 낮은 가속도(예: 가속 1및 감속)에 있는지 확인합니다.</li>
		<li>원심분리 후 단핵구 세포(백색색)의 중간 계면을 신선한 15 mL 원추형 튜브로 수확합니다.</li>
		<li>1x PBS (+ 2 % FBS)의 5 mL로 밀도 그라데이션 배지에서 수확 한 세척 셀. 500 x g 및 4 °C에서 5 분 동안 원심 분리기. 상급체를 제거합니다.</li>
		<li>2.3.4단계를 반복합니다.</li>
		<li>1x PBS (+ 2 % FBS)의 300 μL에서 튜브의 세포 내용체를 다시 중단하십시오. FACS 튜브에서 얼룩이 없거나 단색 제어를 위한 세포 현탁액의 Aliquot 10 μL.</li>
	</ol></li>
	<li>단핵구 뮤린 골수 세포에서 LSK HSPC를 수확.
	<ol>
<li>Gr1, Cd8a, Cd5, B220, Ter119 : 다음 항체의 샘플 당 3 μL을 혼합하여 비오틴 항체의 칵테일을 확인합니다. 단핵구 골수 세포의 300 μL에 비오틴 항체 칵테일 15 μL을 추가합니다. 참고: 각 항체는 1:100 희석에서 사용된다.</li>
		<li>4°C에서 30분 동안 비오틴 항체 칵테일을 배양하여 튜브 바닥에 세포가 응집되는 것을 피한다.</li>
		<li>비오틴 항체 칵테일과 혼합된 세포에 미리 냉장된 1x PBS(+ 2% FBS)의 10 mL를 추가합니다.</li>
		<li>500 x g 및 4 °C에서 5 분 동안 튜브를 원심 분리합니다. 상급체를 버리고 1 x PBS (+ 2 % FBS)의 400 μL에서 세포 펠릿을 다시 중단하십시오. 스트렙타비딘 단일 색상 제어를 위한 Aliquot 10 μL.</li>
		<li>사용하기 전에 간략하게 소용돌이 안티 비오틴 마이크로 비드(재료표). 각 세포 샘플에 80 μL의 마이크로비드를 추가합니다(400 μL). 잘 섞고 교반과 함께 4 °C에서 추가로 20 분 동안 배양하십시오.</li>
		<li>세포에 미리 냉각된 1x PBS(+ 2% FBS)의 10mL를 추가합니다. 500 x g 및 4 °C에서 5 분 동안 튜브를 원심 분리합니다.</li>
		<li>상급체를 버리고 1 x PBS (+ 2 % FBS)의 1 mL에서 세포 펠릿을 다시 중단하십시오. 자기 분리 장치를 설정하는 동안 4 °C에서 보관하십시오.</li>
		<li>4°C에서 자기 보조 세포 선별(MACS) 분리기의 자기장에 컬럼(재료표)을놓습니다. 4 °C에서 중력 흐름 하에서 1x PBS (+ 2 % FBS)의 3 mL로 헹구어 자기 분리를위한 컬럼을 준비하십시오.</li>
		<li>2.4.7단계에서 4°C에서 젖은 전열에 셀 현탁액을 추가합니다. 세포가 4°C에서 컬럼을 통과하고 15 mL 원엽 튜브에서 유출물을 수집하도록 한다. 참고: 이러한 유출물에 표지되지 않은 세포를 가진 분율은 농축된 계보 음성 세포를 나타낸다.</li>
		<li>4 °C에서 1x PBS (+ 2 % FBS)의 3 mL로 열을 세척하십시오. 3회 반복합니다. 흐름을 수집하고 4 °C에서 유지합니다. 혈세포계를 사용하여 트라이판 블루 배제에 의해 용출 된 생존 세포를 계산합니다.</li>
		<li>원심분리기 500 x g 및 4°C에서 5분 동안 유동을 포함하는 15 mL 원원튜브. 상급제는 버리십시오. 1x PBS (+ 2 % FBS)의 0.5 mL에서 세포를 다시 중단하고 내용물체를 FACS 튜브로 옮김을 옮김.</li>
		<li>LSK 항체 칵테일 24 μL을 각 10개의 7 세포에 추가합니다. 항체 칵테일은 450-스트렙타비딘 항체, PE-CY7-Sca1 항체 및 APC-c-Kit 항체의 동일한 농도를 함유한다.</li>
		<li>어두운 아래 교반과 함께 4 °C에서 1 시간 동안 배양하십시오 (주석 호일로 덮여 있음).</li>
		<li>FACS 튜브에 1x PBS(+ 2% FBS)의 3mL를 추가합니다. 500 x g 및 4 °C에서 5 분 동안 원심 분리기. 상급제는 버리십시오.</li>
		<li>1x PBS (+ 2 % FBS)의 1 mL에서 항체 라벨 세포를 다시 중단하십시오. 1 μL의 1 mg/mL 프로피듐 요오드화물을 분류 직전에 세포 현탁액에 넣으세요.</li>
		<li>LSK 세포를 분류하기 전에 바로 40 μm 스트레이너를 사용하여 FACS 튜브의 내용물.</li>
		<li>FACS 선별을 통해 LSK 세포를 수집하여 2 mM 글루타민, 3 mg/mL 글루타민, 1 mMPruvate, 1x 혈전세포 인자(SCF), 0.5x 페니실린/스트렙토마이신(P/7)으로 보충된 완전한 매체의 0.5 mL을 포함하는 1.5 mL 튜브로 수집합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. LSK HSPC의 미토콘드리아 호흡 및 글리콜리시스 어설션
<ol><li>
분석 판에 LSK 시드
	<ol>
<li>원심 분리기 LSK 세포는 500 x g및 RT에서 5 분 동안 2.4.17 단계에서 상급을 폐기한다.</li>
		<li>적어도 70,000 세포/40 μL의 최종 농도로 완전한 매체에 세포를 다시 중단.</li>
		<li>1.2.4단계로부터 PLL 코팅된 8웰 플레이트에서 40 μL 매질(70,000 셀 함유)의 종자 함량. 모든 코너 웰을 비워 둡니다.</li>
		<li>450 x g 및 RT에서 1 분 동안 원심 분리기. 브레이크를 걸지 마십시오. 세포가 반전 된 현미경을 사용하여 잘 바닥에 부착되어 있는지 확인하십시오.</li>
		<li>175 μL의 최종 부피에 대해 각 웰의 셀에 135 μL의 완전한 용지를 추가하십시오.</li>
		<li>37°C에서 2시간 동안비CO2 인큐베이터에서 세포를 배양한다.</li>
		<li>표 2(미토콘드리아 스트레스 테스트) 및 표 3(glycolysis 스트레스 테스트)에 기재된 메트릭을 사용하여 분석기내의 웰 플레이트의 각각의 웰에 약물을 추가하는 프로그램을 설정한다. 참고: 세포가 인큐베이션하는 동안 기기를 켜고 37°C에 있는지 확인합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
미토콘드리아 스트레스 테스트
	<ol>
<li>올리고마이신, 50 μM 카보닐 시안화물 4-(트리플루로메톡시) 페닐히드라존(FCCP) 및 로테네/항마이신 A의 25 μM 스톡 솔루션을 준비합니다. 45 μM 올리고마이신 스톡 용액을 준비하려면, 시판되는 파우치의 내용물280 μL을 완전 용지의 용해한다. 50 μM FCCP 스톡 용액을 준비하려면, 시판되는 파우치의 내용물28μL을 전체 용지의 용해한다. 25 μM 로테네/항마이신 A 스톡 용액을 준비하려면, 시판되는 파우치의 내용물216 μL을 전체 용지의 용해한다.</li>
		<li>센서 카트리지를 인큐베이터에서 꺼내서 각 웰이 최종 농도2 μM 올리고마이신, 1.5 μM FCCP 및 0.5 μM의 로테톤/안티마이신 A의 최종 농도를 갖도록 포트(A, B 및 C)를 적재하고 표 4에 설명된 희석 메트릭(산소 소비율)에 따라 필요에 따라.</li>
		<li>유틸리티 플레이트에 조립된 센서 카트리지에서 뚜껑을 분리하고 계측기 트레이에 놓습니다. 20분 정도 걸리는 교정을 시작합니다.</li>
		<li>교정 후, 유틸리티 플레이트를 제거하고 LSK 세포를 함유 한 분석 판으로 대체하여 이제 웰의 바닥에 부착됩니다.</li>
		<li>계속 누르면 표 2에설명된 프로그램을 시작합니다. 프로그램이 완료되면 Wave Desktop 소프트웨어를 사용하여 데이터를 검색하고 분석합니다. 참고: 세포외 플럭스 분석에서 생성된 데이터는 Wave Desktop 소프트웨어의 도트 플롯을 사용하여 플롯하거나 웹 기반 통계 프로그램으로 내보낼 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
글리콜리시스 스트레스 테스트
	<ol>
<li>시판되는 파우치로부터 300 μL(100 mM), 올리고마이신 288 μL(50 μM), 2-D 포도당(2-DG)에서 300 μL(500 mM)의 완전한 매질로 포도당을 재구성한다.</li>
		<li>화합물을 용해시키기 위해 상하(~10x)를 부드럽게 피펫합니다. 2-DG를 약 1분 동안 소용돌이로 하여 적절한 용해를 보장한다.</li>
		<li>인큐베이터에서 센서 카트리지를 꺼낸다. 로드 포트 A~C는 표 5에 기재된 희석 메트릭들을 따라 10 mM 포도당, 2 μM 올리고마이신, 및 50 mM 2-DG의 최종 농도를 얻었다.</li>
		<li>3.2.3 단계와 3.2.4 단계를 반복합니다.</li>
		<li>계속 누르면 표 3에설명된 프로그램을 시작합니다. 프로그램이 완료되면 Wave Desktop 소프트웨어를 사용하여 데이터를 검색하고 분석합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Dharampuriya, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+origin%2C+development%2C+and+differentiation+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tracking the origin, development, and differentiation of hematopoietic stem cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 49, 108-115 (2017).</li>
<li>Wilkinson, A. C., Yamazaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hematopoietic+stem+cell+diet%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">The hematopoietic stem cell diet.</a> International Journal of Hematology. 107, 634-641 (2018).</li>
<li>Kohli, L., Passegue, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surviving+change%3A+the+metabolic+journey+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Surviving change: the metabolic journey of hematopoietic stem cells.</a> Trends in Cell Biology. 24, 479-487 (2014).</li>
<li>Abdel-Wahab, O., Levine, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+and+the+leukemic+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Metabolism and the leukemic stem cell.</a> The Journal of Experimental Medicine. 207, 677-680 (2010).</li>
<li>Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Role+in+Stemness+and+Differentiation+of+Hematopoietic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Role in Stemness and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells.</a> Stem Cells International. 2019, 4067162(2019).</li>
<li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+haematopoietic+stem+cell+fate+via+modulation+of+mitochondrial+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity.</a> Nature Communication. 7, 13125(2016).</li>
<li>Anso, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+respiratory+chain+is+essential+for+haematopoietic+stem+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial respiratory chain is essential for haematopoietic stem cell function.</a> Nature Cell Biology. 19, 614-625 (2017).</li>
<li>Wanet, A., Arnould, T., Najimi, M., Renard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connecting+Mitochondria%2C+Metabolism%2C+and+Stem+Cell+Fate%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Connecting Mitochondria, Metabolism, and Stem Cell Fate.</a> Stem Cells and Development. 24, 1957-1971 (2015).</li>
<li>Maryanovich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+MTCH2+pathway+repressing+mitochondria+metabolism+regulates+haematopoietic+stem+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">An MTCH2 pathway repressing mitochondria metabolism regulates haematopoietic stem cell fate.</a> Nature Communication. 6, 7901(2015).</li>
<li>Suda, T., Takubo, K., Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+regulation+of+hematopoietic+stem+cells+in+the+hypoxic+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Metabolic regulation of hematopoietic stem cells in the hypoxic niche.</a> Cell Stem Cell. 9, 298-310 (2011).</li>
<li>Zhang, C. C., Sadek, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+and+metabolic+properties+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Hypoxia and metabolic properties of hematopoietic stem cells.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 20, 1891-1901 (2014).</li>
<li>Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+regulation+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial regulation of hematopoietic stem cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 49, 91-98 (2017).</li>
<li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+metabolic+analysis+reveals+a+close+link+between+attenuated+mitochondrial+bioenergetic+function+and+enhanced+glycolysis+dependency+in+human+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292, 125-136 (2007).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+hematopoietic+stem+cells+with+SLAM+and+LSK+markers+for+the+detection+of+hematopoietic+stem+cell+function+in+normal+and+Trp53+null+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Enrichment of hematopoietic stem cells with SLAM and LSK markers for the detection of hematopoietic stem cell function in normal and Trp53 null mice.</a> Experimental Hematology. 36, 1236-1243 (2008).</li>
<li>Jung, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cells+regulate+mesenchymal+stromal+cell+induction+into+osteoblasts+thereby+participating+in+the+formation+of+the+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cells regulate mesenchymal stromal cell induction into osteoblasts thereby participating in the formation of the stem cell niche.</a> Stem Cells. 26, 2042-2051 (2008).</li>
<li>Masuda, S., Li, M., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Niche-less+maintenance+of+HSCs+by+2i%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Niche-less maintenance of HSCs by 2i.</a> Cell Research. 23, 458-459 (2013).</li>
<li>Anderson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cells+develop+in+the+absence+of+endothelial+cadherin+5+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cells develop in the absence of endothelial cadherin 5 expression.</a> Blood. 126, 2811-2820 (2015).</li>
<li>Lo Celso, C., Scadden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+transplantation+of+hematopoietic+stem+cells+%28HSCs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs).</a> Journal of Visualized Experiment. (157), (2007).</li>
<li>Van Wyngene, L., Vandewalle, J., Libert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+basic+metabolic+pathways+in+microbial+sepsis%3A+therapeutic+targets+at+last%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of basic metabolic pathways in microbial sepsis: therapeutic targets at last.</a> EMBO Molecular Medicine. 10, (2018).</li>
<li>Olson, K. A., Schell, J. C., Rutter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyruvate+and+Metabolic+Flexibility%3A+Illuminating+a+Path+Toward+Selective+Cancer+Therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Pyruvate and Metabolic Flexibility: Illuminating a Path Toward Selective Cancer Therapies.</a> Trends in Biochemical Sciences. 41, 219-230 (2016).</li>
<li>Halestrap, A. P., Wilson, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+monocarboxylate+transporter+family--role+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">The monocarboxylate transporter family--role and regulation.</a> IUBMB Life. 64, 109-119 (2012).</li>
<li>Kim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+in+Cancer+Energy+Metabolism%3A+Culprits+or+Bystanders%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Research%22%5BJournal%5D)">Mitochondria in Cancer Energy Metabolism: Culprits or Bystanders.</a> Toxicological Research. 31, 323-330 (2015).</li>
<li>Fosslien, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+medicine--molecular+pathology+of+defective+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Clinical+%26+Laboratory+Science%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial medicine--molecular pathology of defective oxidative phosphorylation.</a> Annals of Clinical & Laboratory Science. 31 (1), 25-67 (2001).</li>
<li>Wick, A. N., Nakada, H. I., Wolfe, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+the+primary+metabolic+block+produced+by+2-deoxyglucose%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Localization of the primary metabolic block produced by 2-deoxyglucose.</a> The Journal of Biological Chemistry. 224 (2), 963-969 (1957).</li>
<li>Linnett, P. E., Beechey, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+of+the+ATP+synthetase+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Inhibitors of the ATP synthetase systems.</a> Methods in Enzymology. 55, 472-518 (1979).</li>
<li>Rimmele, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+metabolism+in+hematopoietic+stem+cells+requires+functional+FOXO3%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial metabolism in hematopoietic stem cells requires functional FOXO3.</a> EMBO Reports. 16, 1164-1176 (2015).</li>
<li>Riviere, I., Dunbar, C. E., Sadelain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+engineering+at+a+crossroads%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell engineering at a crossroads.</a> Blood. 119, 1107-1116 (2012).</li>
<li>Ito, K., Suda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+requirements+for+the+maintenance+of+self-renewing+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Metabolic requirements for the maintenance of self-renewing stem cells.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 243-256 (2014).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

여기에서, 우리는 세포외 플럭스 분석기를 사용하여 순수하고 실행 가능한 뮤린 LSK HSPC 집단의 최대 양뿐만 아니라 그들의 당해 및 미토콘드리아 호흡의 측정의 격리를 보여줍니다. 구체적으로, 이 프로토콜은 LSK HSPC의 사용에 대한 다음과 같은 기술적 문제를 극복한다 : i) murine 골수14에서LSK HSPC의 낮은 빈도, ii) LSK HSPC26의낮은 기저 대사 활성, iii) LSK HSPC27의취약성, iv) 배양혈관에LSK HSPC의 비 준수를 극복한다. 또한, 세포외 플럭스 어설법의 최적 성능을 위해 약물 농도 및 배지 조성을 최적화하였다.
골수 유래 HSPC는 저산소 틈새 에 상주하고 그들의 줄기의 유지보수에 중요한 당해 표현형을표시합니다 28.</sup...

대부분의 성숙한 혈액 세포의 수명이 짧기 때문에, 혈액의 항상성은 조혈 줄기 세포 (HSPC)의 장수하지만 희귀 한 집단의 자기 갱신 및 분화에 의존합니다1. HSPC는 정지, 하지만 그들은 증식 하 고 혈액 시스템의 요구를 유지 하기 위해 자극에 차별화를 겪고 신속. 각 HSPC 세포 상태는 독특한 생체 에너지 수요를 필요로하기 때문에, 신진 대사 변화는 HSPC 운명 결정의 주요 드라이버입니다. 따라서, 대사 가소성의 손실은, 정지, 자기 갱신 및 HSPC의 분화 사이의 평형을 변경함으로써, 종종 골수- 또는 림프증증성 장애로 이어집니다. 함께, HSPC 개발의 대사 조절의 이해는 혈액 학적 악성2,3,4,5의 근본적인 메커니즘을 발견하는 데 중요합니다.
미토콘드리아 호흡과 당해는 ATP를 생성하여 세포내 반응을 유도하고 거대분자 합성에 필요한 빌딩 블록을 생성합니다. HSPC는 분화 된 세포에 비해 낮은 미토콘드리아질량을 가지고 있기 때문에 6 그들은 저산소 골수 틈새 에 정지를 유지, HSPC는 주로 당해에 의존. HSPC의 활성화는 정지의 손실과 세포 주기로의 후속 항목으로 이어지는 미토콘드리아 대사를 향상시킵니다. HSPC의 이러한 대사 가소성은 성인 생활6,7,8,9,10,11,12에 걸쳐 HSPC 풀의 유지 보수를 허용합니다. 따라서, HSPC 활성화 및 건강 상태를 분석하기 위해 산소 소비율(OCR; 산화 인산화 지수) 및 세포외 산성화 율(ECAR; glycolysis 의 지수)과 같은 그들의 대사 활동을 조사하는 것이 중요하다. OCR과 ECAR는 세포외 플럭스 분석기를 사용하여 실시간으로 동시에 측정할 수 있습니다. 그러나, 현재의 방법은 많은 수의 셀을 필요로 하며 부착셀(13)에최적화되어 있다. HSPC는마우스(14)로부터대량으로 분리될 수 없기 때문에, 순수한 집단을 얻기 위해 선별이 필요하고, 비부착세포(15)이며,분화를피하지 않고 하룻밤 배양될 수 없고, HSP의 OCR 및 ECAR를 측정하는 것이 어려웠다. 여기에서는 수천 개의 뮤린 골수-리니지negSca1+c-Kit+ (LSK) HSPC의 대사 호흡 및 당해 를 측정하는 방법에 대한 비디오 기반 자습서를 동반하는 명확한 단계별 지침 세트를 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>0.01% (w/v) 폴리-L-라이신 용액</td><td>Sigma</td><td>P8920</td><td>LSK 첨부</td></tr><tr><td>파일 40 &micro에 사용; m 세포 여과기</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-547</td><td>뼈 분쇄 후 세포 여과에 사용</td></tr><tr><td>Anti-Biotin MicroBeads</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-485</td><td>Lin-separation</td></tr><tr><td>Biotin Rat Anti-Mouse CD45R/B220 Clone RA3-6B2</td><td>BD Biosciences</td><td>553086</td><td>Lin-separation</td></tr><tr><td>Biotin Rat Anti-Mouse CD5 Clone 53-7.3</td><td>BD Biosciences</td><td>553019</td><td>Lin-에 사용됩니다. 분리</td></tr><tr><td>비오틴 쥐 안티 마우스 CD8a 클론 53-6.7</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>553029 린 분리에 사용</td></tr> 비<tr><td>오틴 쥐 안티 마우스 Ly-6G 및 Ly-6C 클론 RB6-8C5</td><td>BD Biosciences</td><td>553125</td><td>린 분리에 사용</td></tr> 비<tr><td>오틴 쥐 안티 마우스 TER-119 / 에리트로이드 세포 클론 TER-119</td><td>BD Biosciences</td><td>553672</td><td>린 분리에 사용</td></tr><tr><td>CD117 (c-Kit) 단클론 항체 (2B8), APC</td><td>eBioscience</td><td>17-1171-83</td><td>LSK 분류에 사용</td></tr><tr><td>Falcon 15mL 원추형 원심분리기 튜브</td><td>Falcon-Fischer Scientific</td><td>14-959-53A</td><td>세포 분리에 사용</td></tr><tr><td>Falcon 50mL 원추형 원심분리기 튜브</td><td>Falcon-Fischer Scientific</td><td>14-432-22</td><td>세포 분리에 사용</td></tr><tr><td>Falcon 둥근 바닥 폴리프로필렌 튜브</td><td>Falcon-Fischer Scientific</td><td>14-959-11A</td><td>에 사용 LSK sorting</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Neuromics</td><td>FBS001-HI</td><td>FACS 완충액에 사용됨</td></tr><tr><td>Histopaque-1083</td><td>Sigma</td><td>10831</td><td>ficoll gradient 분리에 사용됨</td></tr><tr><td>L-glutamine 100x</td><td>Fisher Scientific</td><td>25-030-081</td><td>분석 매체에 사용됨</td></tr><tr><td>LS Column</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-401</td><td>Lin-separation</td></tr><tr><td>Ly-6A/E(Sca-1) 단클론성에 사용됨 항체 (D7), PE-Cyanine7</td><td>eBioscience</td><td>25-5981-82</td><td>LSK 분류에 사용</td></tr> 쥐 <tr><td>줄기 세포 인자 (SCF)</td><td>PeproTech</td><td>250-03-100UG</td><td>분석 매체에 사용</td></tr><tr><td>쥐 트롬보포이에틴 (TPO)</td><td>PeproTech</td><td>315-14-100UG</td><td>분석 매체</td></tr><tr><td>PBS 1%</td><td>에 사용됨 Fisher Scientific</td><td>SH3002802</td><td>FACS 완충액에 사용됨</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신( 10,000 U/mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>분석 매체</td></tr><tr><td>Propidium Iodide</td><td>Fisher Scientific</td><td>P1304MP</td><td>LSK 분류에 사용됨</td></tr><tr><td>Seahorse XFp 세포 배양 Miniplate Agilent</td><td>Technologies</td><td>103025-100</td><td>LSK 파종에 사용됨</td></tr><tr><td>피루브산 나트륨(100mM)</td><td>ThermoFisher</td><td>11360070</td><td>분석 매체</td></tr><tr><td>Streptavidin eFluor 450에 사용됨 Conjugate</td><td>eBioscience</td><td>48-4317-82</td><td>LSK 분류에 사용</td></tr><tr><td>XF Calibrant</td><td>Agilent Technologies</td><td>100840-000</td><td>카트리지 평형에 사용</td></tr><tr><td>XF 매체 Agilent</td><td>Technologies</td><td>103575-100</td><td>분석 매체에 사용</td></tr><tr><td>XFp 해당작용 스트레스 테스트 키트</td><td>Agilent Technologies</td><td>103017100</td><td>해당작용 스트레스 테스트</td></tr><tr><td>XFp 미토콘드리아 약물 스트레스 테스트 키트</td><td>Agilent Technologies</td><td>103010100</td><td>미토콘드리아 스트레스 테스트용 약물</td></tr><tr><td>XFp 센서 카트리지</td><td>Agilent Technologies</td><td>103022-100</td><td>해당과정 및 미토콘드리아 스트레스 테스트에 사용</td></tr></tbody></table>

조혈 줄기 선조 세포 대사 분석

Analysis of Hematopoietic Stem Progenitor Cell Metabolism

조혈 줄기 전구 세포 (HSPC)는 혈액 형성의 요구를 유지하기 위해 그들의 정지 상태에서 분화 상태로 전환 할 수 있습니다 뚜렷한 대사 가소성을 가지고있다. 그러나 HSPC의 대사 상태(미토콘드리아 호흡 및 당해 용해)는 제한된 수와 비부착성, 깨지기 쉬운 HSPC에 대한 최적화된 프로토콜의 부족으로 인해 분석하기가 어려웠습니다. 여기에서, 우리는 신진 대사 호흡을 측정하기 위하여 명확한, 단계별 지침의 세트를 제공합니다 (산소 소비 비율; OCR) 및 당해(세포외 산성화 속도; Murine 골수-리니지negSca1+c-Kit+ (LSK) HSPC의 ECAR) 이 프로토콜은 뮤린 골수에서 LSK HSPC의 높은 양을 제공하고, 배양 중 HSPC의 생존력을 향상시키고, 비 부착 HSPC의 세포 외 플럭스 분석을 용이하게 하며, 산화 인산화 및 당해 경로를 표적으로 하는 약물에 최적화된 주사 프로토콜(농도 및 시간)을 제공합니다. 이 방법은 혈액 발달 및 질병 도중 HSPC의 신진 대사 상태 그리고 건강의 예측가능하게 합니다.

우리의 추출 방법은 우리가 마우스 당 ~ 80,000 LSK HSPC까지 수확 할 수 있었습니다. LSK 세포의 생존력과 수는 우리의 방법으로 향상되었다, 우리는 때문에: (1) 상지와 하부 사지에서 결합 된 골수, 엉덩이 뼈, 흉골, 늑골 케이지, 및 척추, (2) 세포 사멸과 응집 증가 했을 붉은 세포 용해 버퍼를 사용하여 피, (3) 단핵세포의 밀도 구배 배지 분리를 사용하고, (4) 덩어리에서 세포의 손실을 야기했을 사전 냉각 버퍼를 사용하여 피하였다.
세포 외 플럭스 분석은 전통적으로 부착 세포에 사용되었지만, 우물의 PLL 코팅의 우리의 사용, 그것에 세포의 원심 분리 에 이어, 우물의 표면에 LSK HSPC의 준수를 촉진. 이를 통해 우리는 세포외 플럭스를 측정할 수 있었고, 따라서 LSK HSPC의 대사 건강도를 측정할 수 있었습니다. 마우스로부터 수확할 수 있는 세포의 수가 제한되어 있고, 그들의 격리를 위한 프로토콜의 긴 기간을 고려할 때, 8개의 잘 포맷을 가...

조혈 줄기 전구 세포 (HSPC) 혈액 형성 동안 그들의 신진 대사 가소성으로 인해 분화 상태로 정지 상태에서 전환. 여기에서는 HSPC의 미토콘드리아 호흡 및 당화 분석을 측정하기 위한 최적화된 방법을 제시합니다.

Hematopoietic stem progenitor cells (HSPCs) have distinct metabolic plasticity, which allows them to transition from their quiescent state to a ...

조혈 줄기와 전구 세포의 대사 변화는 혈액 형성의 요구를 유지하기 위해 그들의 정지 상태에서 분화 상태로 전환 할 수 있습니다. 조혈 줄기와 선조 세포의 대사 가소성에 있는 변경은 혈액학 무질서로 이끌어 냅니다. 우리의 프로토콜은 혈액 발달 과 질병 도중 조혈 줄기 및 전구 세포의 신진 대사 규칙 그리고 건강을 측정하는 것을 도울 것입니다.조혈 줄기 및 전구 세포의 미토콘드리아 호흡 및 글리코리시스의 분석은 연약하고 희소한 인구이기 때문에 어렵습니다. 당사의 최적화된 프로토콜은 골린 골수로부터 더 많은 양의 조혈 줄기 및 전구세포를 분리하고, 잠복 시 생존력을 향상시키고, 비부착 HSPC의 세포외 플럭스 분석을 용이하게 하며, 산화 인산화뿐만 아니라 글리코리스틱 경로를 대상으로 하는 약물에 최적화된 사출 파라미터를 제공합니다. 이 절차를 시작하려면 유틸리티 플레이트의 우물과 우물 주변의 챔버를 멸균 물로 채웁니다.센서 카트리지를 유틸리티 플레이트에 잠그면 센서가 완전히 물로 덮여 있는지 확인합니다. 그런 다음 유틸리티 플레이트에 잠긴 카트리지를 섭씨 37도의 비 CO2 인큐베이터에 넣고 하룻밤 동안 배양합니다. 클래스 II 생물 안전 캐비닛에서, 분석 플레이트의 각 웰에 시판 되는 0.1%PLL 솔루션의 40 마이크로 리터를 추가합니다.키트에 제공된 뚜껑으로 분석 판을 덮고 후드 아래실온도에서 1시간 동안 닫힌 플레이트를 배양합니다. 그 후, 멸균 진공 기반 의 흡인기를 사용하여 과도한 용액을 제거하고 후드 아래 플레이트를 건조시합니다. 단핵골골골수 세포를 수확하려면 밀도 그라데이션 배지 5밀리리터를 15밀리리터 원추형 튜브에 추가합니다.천천히 골수 세포 현탁액의 5 밀리리터를 추가하여 세포가 밀도 그라데이션 배지 위의 층으로 남아 있는지 확인합니다. 원심분리기는 500배 g, 실온에서 30분 동안 원심분리기가 가능한 가장 낮은 가속을 보장합니다. 모노뉴클레아드 세포의 중간 인터페이스를 신선한 15 밀리리터 튜브로 수확하십시오.그런 다음 2 %의 FBS를 포함하는 1X PBS의 5 밀리리터로 세포를 씻으시다. 원심분리기는 500배, 섭씨 4도에서 5분간. 2%의 FBS를 포함하는 1X PBS의 300 마이크로리터에서 상체를 제거하고 세포를 다시 중단합니다.다음으로, FACS 튜브에서 염색되지 않은 또는 단일 색 제어를 위한 세포 현탁액의 10 마이크로리터를 aliquot. 단핵골골골수 세포에서 LSK HSPC를

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

셀 (CFC) 분석을 형성 식민지는 조혈 progenitors은 세미 솔리드 매체 식민지를 형성하는에서 시험 관내 분석이다. 콜로니 형태, 세포 형태학 및 유동세포계측법의 조합은 다른 조혈 lineages 따라 분아 따위에 의해 번식하고 차별 progenitors의 능력을 평가하는 데 사용됩니다.

인간 조혈 세포 콜로니 형성 세포 (CFC) 어세이

유동세포계측법의 골수 조혈 progenitors의 유통뿐만 아니라 효율적으로 분리 고도 정화 조혈 줄기 세포 (HSCs)를 분석하는 방법을 설명합니다. 분리 절차는 본질적으로 세포 및 분자 연구를위한 HSCs를 정화 정렬 C-키트 + 세포와 세포의 자성 농축에 근거한다.

Murine 조혈 줄기 세포와 리니지 - 헌신 Progenitors의 Phenotypic 분석 및 절연

여기서 우리는 LACI 유전자 변형 마우스 모델을 사용하여 정제 조혈 세포의 작은 숫자에 대한 생체 내 돌연변이 분석에 대해 설명합니다. LACI 유전자는 DNA의 돌연변이의 빈도, 위치 및 유형 자발적으로 일어 나 genotoxins에 노출 된 후를 결정하기 위해 분리 할 수있다.

정제 된 조혈 줄기 / 전구 세포에 DNA 돌연변이를 확인

이 프로토콜은 세포 분류에 의한 줄기세포의 사전 정제 없이 조혈 줄기세포/전구 세포 기능을 연구하기 위해 경쟁력 있는 마우스 골수 이식 실험을 설정하기 위한 단계별 지침을 제공합니다.

경쟁 이식은 조혈 줄기 세포의 체력을 평가하는

우리는 급성 골수성 백혈병 (AML)의 마우스 모델에서 뮤린 건강한 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC) 및 백혈병 세포에서 미토콘드리아 반응성 산소 종 (ROS)을 검출하기 위해 다매개 변수 흐름 세포측정법을 사용하는 방법을 설명합니다. MLL-AF9.

뮤린 조혈 줄기 및 선조 세포 및 MLL-AF9 구동 백혈병에서 미토콘드리아 반응성 산소 종의 유동 세포 분석

Xenobiotic efflux 펌프는 조혈 줄기와 전구 세포 (HSPC)에서 매우 활성화되어 미토콘드리아 막 잠재적 형광 염료인 TMRM의 압출을 유발합니다. 여기서, 우리는 유출 펌프 억제제인 Verapamil의 존재 에 있는 TMRM에 의하여 HSPC에 있는 미토콘드리아 막 전위를 정확하게 측정하는 프로토콜을 제시합니다.

에플로프 펌프 억제를 통해 조혈 줄기 및 전조 세포에서 미토콘드리아 막 전위성 유동 세포 측정 평가의 정확도 향상

여기서 우리는 생체배양조 조혈줄기세포 및 T세포에서 미토콘드리아 질량 및 막 전위를 측정하는 신뢰할 수 있는 방법을 설명한다.

유세포측정에 의한 조혈줄기세포 및 T세포의 미토콘드리아 질량 및 막 전위 측정

여기에 제시된 방법은 HSPC의 세포외 산성화 속도 (ECAR) 및 산소 소비 속도 (OCR)를 실시간으로 측정하기 위해 세포외 플럭스 분석기를 사용하여 비 부착성 마우스 조혈 줄기 및 원시 전구 세포 (HSPCs)에서 세포 생물 에너지를 평가하기위한 최적화 된 프로토콜을 요약합니다.

세포외 플럭스 분석기를 사용한 마우스 조혈 줄기 및 원시 전구 세포의 세포 생체 에너지 평가

여기에서 우리는 쥐 골수 세포를 표현형 조혈 줄기 및 전구 세포와 함께 지지하는 틈새 내피 및 중간엽 줄기 세포로 분리 및 염색하기 위한 간단한 프로토콜을 설명합니다. 내골 및 중앙 골수 영역에 위치한 세포를 풍부하게 하는 방법도 포함됩니다.

쥐 골수, 조혈 줄기 및 전구 세포, 기질 틈새 세포의 유세포 분석

여기에 제시된 것은 세포 분열 수, 표면 세포 표현형 및 세포 친족 관계를 동시에 측정할 수 있는 유세포 분석 기반 기술입니다. 이러한 속성은 순열 기반 프레임워크를 사용하여 통계적으로 테스트할 수 있습니다.

조혈 줄기 및 전구 세포에 대한 유세포 분석을 통한 친족, 분열 수 및 표현형의 동시 평가

여기에서는 희귀 세포 유형의 대사 산물을 정확하고 안정적으로 측정하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 세포 분류를 위한 변형된 sheath 유체 및 관련 blank 샘플 생성을 포함한 기술 개선을 통해 샘플당 5000개의 세포만 입력하여 대사 산물을 포괄적으로 정량화할 수 있습니다.

희귀 일차 세포에 대한 표적 대사체학

배우세요 조혈 줄기 선조 세포의 미토콘드리아 호흡과 당분해 분석 방법을 최적화된 프로토콜로 익히세요. 이 기술은 희소하고 섬세한 세포의 대사 조절을 정확히 측정하여 혈액 형성과 관련 질환 연구에 활용됩니다.

조혈 줄기 선조 세포 대사 분석

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