손 수분, 현미경 검사법 및 유전자 분석을 결합한 살구의 자기 및 간 호환성 관계 결정

이 방법은 다른 종의 수분 요구 사항을 결정하고 품종 간의 비호환성 관계를 확립하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법의 주요 장점은 실험실 조건하에서 여러 비호환성을 평가할 수 있다는 것입니다. 필드 조건에서 수행되는 실험에서 발생할 수 있는 수많은 문제를 방지합니다.

이를 통해 해당 비호환성 그룹에 대한 다수의 품종을 헌납할 수 있습니다. 품종 간의 호환성 간 관계를 결정합니다. 이 방법은 또한 체리 또는 매화 같은 다른 과일 나무 작물에서 자기 비호환성 및 비호환성 관계를 결정하는 데 유용 할 수 있습니다.

필드의 꽃을 샘플링하여 시작합니다. 이전 수분을 피하기 위해 살구에 대한 BBCH 규모의 스테이지 58에 해당하는 풍선 단계에서 꽃을 수집합니다. 실험실에서 꽃의 anthers를 제거하고 실온에서 건조하기 위해 종이 조각에 놓습니다.

24시간 후, 꽃가루 곡물을 26mm 메쉬로 체질합니다. 각 자가 및 교차 수분에 대해 동일한 풍선 개발 단계에서 30 개의 꽃 그룹을 방출하고 방출 후 24 시간 후에 꽃집 거품에 권총을 놓고 같은 품종의 꽃가루가있는 페인트 브러시를 사용하여 권총을 수분으로 수분으로 놓습니다. 대조군으로 호환 되는 꽃가루에서 꽃가루각 품종의 권총의 또 다른 세트를 수분.

72시간 후, 젖은 꽃집 폼에서 권총을 제거하고 3:1 에탄올의 고정 용액으로 권총을 아세트산에 4도에서 적어도 24시간 동안 고정합니다. 그런 다음 고정을 폐기하고 75%에탄올을 추가하여 샘플이 용액에 완전히 침수되도록 합니다. 샘플은 사용 전까지 섭씨 4도에서 에탄올에 저장할 수 있습니다.

응고화 꽃가루 발아 배지에서 대조군 꽃가루에 사용되는 동일한 품종의 꽃가루 곡물을 분산하고 24 시간 후에 현미경으로 관찰하십시오. 세척당 1시간 동안 증류수로 3회 세척하여 권총을 미세 검사용으로 준비합니다. 마지막 세척 후, 24 시간 동안 섭씨 4도에서 5 %의 황산 나트륨에 둡니다.

그런 다음 조직을 부드럽게하기 위해 황산 나트륨에서 10 분 동안 제곱 된 1 킬로그램센티미터에서 자동 복제합니다. 유리 슬라이드 위에 자동 으로 된 권총을 놓고 메스를 사용하여 난소 주변의 삼중집을 제거합니다. 그런 다음 커버글래스로 권총을 찌를 수 있습니다.

꽃가루 튜브 성장 시 황량한 기탁을 더럽게 하고 원고 의 방향에 따라 현미경으로 꽃가루 튜브를 관찰하기 위해 준비 에 걸쳐 애니라인 블루를 바르십시오. 봄에 수집 된 어린 잎에서 유전체 DNA를 추출하는 상업 키트를 사용합니다. 그런 다음 원고 방향에 따라 시약을 결합하여 PCR을 설정합니다.

반응 믹스를 소용돌이시키고 PCR 플레이트의 우물 사이에 분배합니다. 각 우물에 DNA 희석제 1마이크로리터를 추가하고 원고에 설명된 열 순환 프로그램을 사용하여 PCR을 실행합니다. 반응이 완료되면 모세관 전기 포근 또는 아가로즈 젤 전기 포근을 사용하여 결과를 분석하십시오.

모세관 전기 포의 경우 물 증발을 방지하기 위해 1 방울의 미네랄 오일과 함께 PCR 제품의 마이크로 리터 1 개를 독자 플레이트의 우물에 추가합니다. 그런 다음 분리 버퍼를 추가하여 분리 플레이트를 준비합니다. 유전자 분석기용 상용 소프트웨어를 사용하여 새로운 샘플 플레이트를 만들고 플레이트의 모든 우물에 대한 샘플 이름을 저장합니다.

그런 다음 분석 방법을 선택하고 두 판을 유전자 분석기로 삽입합니다. 모세관 배열을 증류수로 채웁니다. 선형 폴리아크릴아미드 젤을 로드하고 실행을 클릭합니다.

젤 전기전구로 PCR 결과를 분석하는 경우 원고 방향에 따라 전광 실행 버퍼에서 아가로즈를 용해하여 1% 아가로즈 젤을 준비한다. 그런 다음 4 마이크로리터의 핵산 얼룩을 젤에 넣고 부드럽게 섞습니다. 빗으로 젤 트레이를 설정하고 거품을 피하기 위해 주의 중간에 젤을 부어 느리게.

젤을 완전히 고화할 때까지 약 30-45분 간 실온에서 둡니다. 그런 다음 전기 전도실에 넣습니다. 빗을 제거하고 1x TAE 버퍼로 덮습니다.

DNA 사다리로 젤을 적재한 다음 PCR 제품을 적재염료와 혼합합니다. 그런 다음 블루 염료 라인이 젤 레인의 약 75 %가 될 때까지 60-90 분 동안 90 볼트에서 젤을 실행합니다. 달리기가 완료되면 트랜틸루미나이터를 사용하여 젤을 시각화합니다.

각 품종에 대한 자기(in) 호환성을 결정하기 위해 형광 현미경 검사법에 의해 자가 및 교차 오염에서 꽃가루 튜브 의 성장을 관찰하였다. 품종은 꽃가루 튜브 성장이 체포되었을 때 자체 호환되지 않는 것으로 간주되었고 적어도 하나의 꽃가루 튜브가 스타일의 기지에 도달했을 때 자체 호환됩니다. 5 프라이머 쌍 조합은 모세관 또는 젤 전기포와 함께 PCR을 사용하여 S-alleles를 식별하는 데 사용되었다.

먼저, S-Alleles는 SRc 프라이머 쌍을 사용하여 최초의 S-RNase 인트론의 증폭에 의해 확인되었다. 그런 다음 RNase의 두 번째 인트론은 S6, S9, S1 및 S7 을 구별하기 위해 세 개의 프라이머 세트로 증폭되었습니다. 그리고 SFB 유전자의 V2 및 HVB 가변 영역은 Sc 및 S8 본인을 확인하기 위해 설정된 AprFBC8 프라이머로 증폭되었다.

S-alleles가 확인되면 상호 호환되지 않는 유전자형을 가진 다른 비호환성 그룹을 확립할 수 있습니다. 모세관 전기 포근에서 제어를 사용하는 것이 중요합니다, 그들은 부정확한 진상 식별을 일으키는 원인이 되는 단편 크기의 더 많은 차이로 보고할 수 있는 자동 단편 분석 시스템을 사용하기 때문에. 현미경 관찰과 유전 분석의 조합은 살구에 있는 자기 비호환성을 결정하고 품종 사이 비호환성 관계를 확립하기 위하여 아주 유용한 접근을 초래했습니다.

자기 비호환성은 이제 살구지역 주민과의 연결고리입니다. 요인의 결정은 관련된 것 같습니다. 미래의 노력은 살구에서이 품종의 유전 적 교화에 초점을 맞추어야한다.

이 다큐멘터리 접근법의 조합은 살구 사육 프로그램에서 상업적 과수원 및 패턴 유전형에서 품종의 적절한 선택에 대한 귀중한 정보를 초래한다. 비슷한 접근은 그밖 우디 다년생 작물에서 이용될 수 있습니다.