Name: 손 수분, 현미경 검사법 및 유전자 분석을 결합한 살구의 자기 및 간 호환성 관계 결정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: 학습하세요 살구 품종의 자가 및 상호 호환성 관계를 형광 현미경과 PCR 분석으로 결정하는 방법을. 이 실험실 기반 접근법은 수분 생물학 연구와 육종 프로그램에 유용합니다.

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이 연구는 장관 드 시엔시아에 의해 투자되었다, 혁신시온 y Universidades-유럽 지역 개발 기금, 유럽 연합 (AGL2016-77267-R, AGL2015-74071-JIN); Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y 알리멘타리아 (RFP2015-00015-00, RTA2017-00003-00); 고비에르노 데 아라곤-유럽 사회 기금, 유럽 연합 (그루포 콘솔리다 A12_17R), 펀다시온 바이오 다이버 시다드, 그리고 아로즈구로 S.A.

1. 자체(in) 호환성 결정
<ol><li>필드에 있는 꽃을 샘플링합니다. 원치 않는 이전 수분을 피하기 위해, 살구28에대한 BBCH 규모에 스테이지 58에 해당하는 풍선 단계(그림 1A)에서꽃을 수집 할 필요가있다.</li>
	<li>
실험실에서 자체 및 교차 pollinations
	<ol>
<li>풍선 단계에서 꽃의 anthers를 제거하고 실험실 온도에서 건조 종이 조각에 배치합니다.</li>
		<li>24시간 후, 미세 메쉬(0.26 mm)를 사용하여 꽃가루 곡물을 체질(도1B).</li>
		<li>각 자가 수분 및 교차 수분에 대해 동일한 풍선 단계에서 30개의 꽃그룹을 방출하고 실험실 온도에서 꽃집 폼에 피스틸을 배치합니다(도1C).</li>
		<li>손으로 는 방출 후 같은 품종 24 h의 꽃가루로 페인트 브러시의 도움으로 피슬을 수분합니다. 또한, 대조군으로 호환되는 꽃가루에서 꽃가루로 각 품종의 또 다른 피스틸 세트를 수분(도1D).</li>
		<li>72h 후, 4°C29에서적어도 24시간 동안 에탄올/아세트산(3:1)의 고정용액으로 미스틸을 수정한다. 그런 다음 고정을 폐기하고 75% 에탄올을 추가하여 샘플이 용액에 완전히 침수되도록 합니다. ,샘플은8,17,,30,31, 32를사용할 때까지 4 °C에서이 용액에서 보존 될 수있습니다.,,</li>
	</ol>
</li>
	<li>
체외 꽃가루 발아를 통해 꽃가루 생존 가능성 평가
	<ol>
<li>발아 배지를 준비하려면 자당 25g, 붕산 0.075 g(H3BO3)및 질산 칼슘 0.075 g(Ca(NO3)2)33을준비한다.</li>
		<li>250mL의 증류수에 매체의 성분을 넣고 완전히 녹입니다.</li>
		<li>아가로즈 2 g를 첨가하여 배지를 고형화하고 소용돌이에 섞습니다.</li>
		<li>pH 미터를 사용하여 매체의 pH를 확인하고 NaOH 또는 HCl 용액을 사용하여 값을 7.0으로 조정합니다.</li>
		<li>배지를 살균하기 위해 혼합물을 자동 클로 처리합니다.</li>
		<li>오토클레이브 후, 매체를 식히고 멸균 라미나르 플로우 후드에 페트리 접시에 분배합니다.</li>
		<li>고화화 꽃가루 발아 배지에서 제어 된 꽃가루에 사용되는 동일한 품종의 꽃가루 곡물을 분산하고 24 h6후 현미경으로 관찰한다. 참고: 라미나르 플로우 후드를 살균하려면 표면에 70% 에탄올로 청소하고 10분 동안 UV 램프를 켭분으로 전환합니다.</li>
		<li>페트리 요리를 4°C의 냉장고에 보관하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
현미경 관찰
	<ol>
<li>증류수로 1시간 동안 3회 소염제를 세척하고 4°C에서 5% 설파이트 나트륨에 넣습니다. 24시간 후, 설파이트 나트륨에서 10분 동안 1kg/cm2로 오토클레이브하여 조직을 부드럽게한다(34).</li>
		<li>유리 슬라이드 위에 오토클레이브 피슬을 놓고 메스의 도움으로 난소 주변의 삼각집을 제거하여 꽃가루 튜브의 더 나은 시각화를 얻습니다. 그런 다음 피슬을 커버 유리로 분쇄합니다.</li>
		<li>준비 0.1% (v/v) 애니라인 블루 스테인: 0.1 mL의 애니라인 블루를 0.1mL의 100mL에서 0.1N 칼륨 인산염 삼각염(K3PO4)으로혼합한다. 꽃가루 튜브 성장 중 칼로스 증세를 얼룩지게하기 위해 준비 에일린 블루 한 방울을 적용하십시오.</li>
		<li>340-380 밴드패스와 425개의 롱패스 필터를 사용하여 UV 에피플루오렌스를 사용하여 현미경으로 스타일을 따라 꽃가루 튜브를 관찰하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. DNA 추출
<ol><li>봄에 필드에 2-3 잎을 샘플링합니다. DNA가 얻은 것은 오래된 잎에 비해 페놀 화합물의 높은 품질과 낮은 수준이기 때문에 젊은 단계에서 잎을 샘플링하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>시판되는 키트에 기재된 단계를 따라 유전체 DNA를 추출합니다(재료표참조).</li>
	<li>UV-비스 분광광미터(260nm)를 사용하여 DNA 농도의 양과 품질을 분석합니다.</li>
</ol>3. S-알레알렐 식별
<ol><li>
PCR 반응 설정
	<ol>
<li>각 DNA 추출 샘플의 증류수에 50 ng/μL 희석을 준비합니다.</li>
		<li>PCR 시약을 천천히 해동하고 얼음 위에 보관하십시오. 필요할 때까지 DNA 폴리머라아제를 냉동실에 둡니다.</li>
		<li>프라이머의 다른 조합을 사용하여 증폭 반응을 준비합니다. 표 1의구성 요소를 결합하여 PCR 반응 믹스를 만듭니다. PCR 반응이 잘 섞여 서 프라이머의 상이한 조합에 대해 표시된 부피를 PCR 플레이트의 각 웰에 분배한다. 그런 다음 각 우물에 DNA 희석의 1 μL을 추가합니다.</li>
		<li>PCR 플레이트를 열순환기에 놓고 표 1에표시된 해당 PCR 프로그램을 실행합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>증폭된 조각을 분석합니다. PCR 증폭 된 단편을 분석하는 두 가지 방법이 주로 있습니다 : 형광 라벨 프라이머를 가진 모세관 전기 포근 (CE) 또는 표기되지 않은 프라이머와 아가로즈 젤 전기 포의 앰프슨을 시각화.<ol>
<li>
모세관 전기 포레시스
		<ol>
<li>로딩 버퍼를 준비하려면 35 μL의 탈이온화된 포름아미드를 라벨이 붙은 크기 조정 표준의 0.45 μL을 혼합합니다. 시약이 잘 섞인 다음 35.5 μL을 판독판의 우물에 분배합니다.</li>
			<li>PCR 제품의 1 μL을 우물에 넣습니다. 또한, 물 증발을 방지하기 위해 미네랄 오일 한 방울을 추가합니다.</li>
			<li>분리 버퍼를 추가하는 분리 플레이트를 준비합니다.</li>
			<li>유전자 분석기와 함께 포함된 상용 소프트웨어를 사용합니다(재료표참조). 새 샘플 플레이트를 만들고 플레이트의 모든 우물에 대한 샘플 이름을 저장합니다.</li>
			<li>분석 방법을 선택합니다. 이 경우, 120s에 대해 90°C에서 샘플을 분해하고, 30초 동안 2.0kV에서 주입하고, 35분 동안 6.0kV로 분리한다.</li>
			<li>유전자 분석기에 두 개의 플레이트를 삽입합니다. 모세관 배열을 증류수로 채웁니다.</li>
			<li>특허받은 선형 폴리아크라이아미드(LPA) 젤을 적재한다. 마지막으로 실행을 클릭합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
젤 전기전증
		<ol>
<li>1.5g의 분자생물학급 아가로즈를 1xTAE(Tris-아세테이트-EDTA) 전기포고리(40m Tris, 20mM 아세트산, 1mM EDTA pH 8.0)로 첨가하여 1%의 아가로즈 젤을 준비한다. 2-3 분 동안 전자 레인지 가열에 의해 아가로즈를 녹입니다.</li>
			<li>DNA를 시각화하려면 핵산 얼룩의 4 μL을 추가하고(재료 표 참조) 부드럽게 섞습니다.</li>
			<li>사다리, 컨트롤 및 샘플을 위한 충분한 우물이 있는 젤 빗을 젤 트레이에 넣습니다. 그런 다음 젤 트레이 의 중간에 천천히 믹스를 붓고 거품을 피하십시오.</li>
			<li>젤이 완전히 고화될 때까지 실온에서 30-45분 동안 젤을 식힙니다. 전기 전광 챔버에 젤을 소개하고, 젤 빗을 제거하고 젤을 덮을 충분한 1x TAE 버퍼로 챔버를 채웁니다. 참고: 젤의 배치를 확인합니다. 우물은 음극쪽으로 부정적인 충전 된 DNA가 이동하기 때문에 부정적인 극에 가깝게 배치해야합니다.</li>
			<li>PCR 제품에 로딩 버퍼 5μL(0.1% (v/v) 브로모페놀 블루를 추가하고 잘 섞는다.</li>
			<li>대역의 크기를 추정하려면 DNA 분자량 사다리의 5 μL을 적재합니다(재료 표참조).</li>
			<li>샘플을 젤의 추가 우물에 적재합니다.</li>
			<li>모든 샘플과 DNA 분자량 사다리가 로드되면, 블루 염료 라인이 젤의 길이약 75%가 될 때까지 90 V에서 1-1.5h로 젤을 실행합니다.</li>
			<li>핵산에 대한 일루미에이터에서 밴드를 시각화합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

전통적으로, 대부분의 상업 살구 유럽 품종은 자기 호환36이었다. 그럼에도 불구하고, 지난 수십 년 동안 번식 프로그램에서 부모로서 북미 자가 호환되지 않는 품종의 사용은 알 수없는 수분 요구 사항7,,8,,37새로운자기 호환 품종의 증가의 출시 결과. 따라서 살구 품종에서 의외의 호환성 관계의 결정은 점점 더 중요해지고 있다. 이것은 겨울 냉각이 감소하는 지역에서 강조된다, 꽃의 시간에 높은 년마다 변화는 많은 경우에 품종과 꽃가루의 꽃에 우연의 일치를 방지하기 때문에, 특히 높은 냉각 요구 사항과 품종38. 본 원에 기술된 방법론, 수분, 현미경 및 유전 분석을 결합하여 각 품종의 자체(in) 호환성을 결정하고 잠재적인 수분화 품종을 확립하는 데 매우 유용하였다.
<p...

자기 비호환성은 식물을 꽃피는 전략으로 자가 수분을 방지하고 횡단 을 촉진하는1을촉진합니다. Rosaceae에서, 이 기계장치는 주로 다발성 궤적 S2에의해 제어되는 게임토피틱 자기 비호환성 시스템 (GSI)에 의해 결정됩니다. 스타일에서, RNase 유전자는 S-s타이라 결정제, RNase3을인코딩하고, S-꽃가루결정제를 결정하는 F 박스 단백질은 SFB 유전자4에의해 명문화된다. 자가비호환성 상호작용은 배란5,,6의수정을 방지하는 스타일을 따라 꽃가루 관 성장의 억제를 통해 일어난다.
살구에서, 품종 갱신은 지난 2 년 동안 전 세계적으로 일어났다7,,8. 이러한 새로운 품종의 중요한 수의 도입, 다른 공공 및 민간 사육 프로그램에서, 알 수없는 수분 요구 사항8살구 품종의 증가를 초래했다.
살구의 수분 요구 사항을 결정하는 데 다른 방법론이 사용되었습니다. 현장에서, 자체(in)호환성은 케이지 나무 또는 에뮬레이트된 꽃에서 제어된 오염에 의해 확립되고, 이후에 과일 세트9,,10,,11,12의백분율을기록할 수 있다. 또한, 대조된 오염은 꽃의 반 생체 배양에 의해 실험실에서 수행되었으며 형광 현미경검사법 8,13,,,14, 15,,16,,17하에서꽃가루 튜브 거동을 분석한다.15, 최근에는 PCR 분석 및 시퀀싱과 같은 분자 기법은 RNase 및 SFB 유전자18,,19의연구에 기초하여 비호환성 관계의 특성화를 허용하고 있다. 살구에서, 33 S-alleles(S1 ~ S20, S22 ~ S30,S52, S53,Sv, S S Sx)자가 호환성(SSc)12,18,,20,,,21,21,,22,,23,,24. 지금까지, 26 비호환성 그룹은 S-유전자형8,9,,17,25,,,,26,,27에따라 이 종에서 찌르고 있다. 동일한 S-대립구를 S가진 품종은 상호 호환되지 않는 반면, 적어도 하나의 다른 S-대립구를 가진 품종및 결과적으로, 다른 호환되지 않는 그룹에 할당, 상호 호환됩니다. S
살구 품종의 수분 요구 사항을 정의하기 위해, 우리는 살구 품종에서 PCR 분석에 의한 S-유전자형의식별과 형광 현미경 검사법에 의한 자기(in) 호환성의 측정을 결합하는 방법론을 설명합니다. 이 방법을 사용하면 비호환성 그룹을 설정하고 품종 간의 비호환성 관계를 설명할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Agarose D1 Low EEO</td><td>Conda</td><td>8010.22</td><td></td></tr><tr><td>BIOTAQ DNA 중합효소 키트</td><td>Bioline</td><td>BIO-21060</td><td></td></tr><tr><td>명시야 현미경</td><td>Leica Microsystems</td><td>DM2500</td><td></td></tr><tr><td>CEQ 시스템 소프트웨어</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNeasy Plant Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>69106</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Set, 4 x 25 &micro; mol</td><td>Bioline</td><td>BIO-39025</td><td></td></tr><tr><td>GenomeLab DNA 크기 표준 키트 - 400</td><td>Beckman Coulter</td><td>608098</td><td></td></tr><tr><td>GenomeLab GeXP 유전자 분석 시스템</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GenomeLab 분리 버퍼</td><td>Beckman Coulter</td><td>608012</td><td></td></tr><tr><td>GenomeLab 분리 젤 LPA-1</td><td>Beckman Coulter</td><td>391438</td><td></td></tr><tr><td>HyperLadder 100bp</td><td>Bioline</td><td>BIO-33029</td><td></td></tr><tr><td>HyperLadder 1kb</td><td>Bioline</td><td>BIO-33025</td><td></td></tr><tr><td>이미지 분석 시스템</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>분자 이미저 VersaDoc MP 4000 시스템&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8640</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop One 분광광도계</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-400-518</td><td></td></tr><tr><td>pH-meter BASIC 20</td><td>Crison</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phusion&nbsp; 고충실도 PCR 키트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F553S</td><td></td></tr><tr><td>파워 팩 P 25 T</td><td>Biometra</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer Forward</td><td>Isogen Life Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer Reverse</td><td>Isogen Life Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quantity One Software</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>입체 현미경</td><td>Leica Microsystems</td><td>MZ-16</td><td></td></tr><tr><td>Sub-Cell GT</td>, <td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>SYBR, Safe DNA Gel, Stain, Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>S33102</td><td></td></tr>, <tr><td>T100 Thermal Cycler,</td><td>Bio-Rad</td>, <td>1861096</td><td></td></tr>, <tr><td>Taq, DNA, 중합효소</td>, <td>QIAGEN</td><td>, 201203</td><td></td></tr><tr><td>수직 스탠드, 오토클레이브</td>, <td>JP Selecta</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

손 수분, 현미경 검사법 및 유전자 분석을 결합한 살구의 자기 및 간 호환성 관계 결정

Determination of Self- and Inter-(in)compatibility Relationships in Apricot Combining Hand-Pollination, Microscopy and Genetic Analyses

Rosaceae의 자기 비호환성은 주로 다골 궤적 S에 의해 제어되는 게임토피틱 자기 비호환성 시스템(GSI)에 의해 결정됩니다. 살구에서, 새로운 품종의 중요한 수의 방출이 알려지지 않은 수분 요구 사항을 가진 품종의 증가를 초래했기 때문에 자기 및 인터 -(in) 호환성 관계의 결정은 점점 더 중요해지고 있습니다. 여기서는 PCR 분석에 의한 S-유전자형식별과 손-오염 및 현미경 검사법에 의한 자기(in)호환성의 측정을 결합한 방법론을 설명한다. S- 자기(in)호환성 측정을 위해 각 품종의 풍선 스테이지에서의 꽃은 현장에서 수집되고, 실험실에서 수분, 고정 및 형광 현미경 검사하에 꽃가루 튜브 거동을 관찰하기 위해 애니라인 블루로 염색하였다. 품종 간의 비호환성 관계의 설립을 위해, 각 품종에서 DNA는 젊은 잎에서 추출되었고 S-alleles는 PCR에 의해 확인되었다. S 이 접근 법은 비호환성 그룹을 수립하고 품종 사이의 비호환성 관계를 해명 할 수 있으며, 이는 새로운 과수원 설계에 적합한 수분제를 선택하고 번식 프로그램에서 적절한 부모를 선택하는 귀중한 정보를 제공합니다.

살구의 수분 연구는마취(그림 1A)가발생하기 하루 전에 늦은 풍선 단계에서 꽃을 사용해야 합니다. 이 단계는 꽃가루와 피스티트 컬렉션 모두에 가장 유리한 것으로 간주됩니다, 꽃 무늬 구조는 거의 성숙하기 때문에, 하지만 anther dehiscence는 아직 발생하지 않았습니다. 이는 폐쇄된 꽃잎이 외부 꽃가루를 운반하는 곤충의 도착을 방해하기 때문에 같은 꽃가루뿐만 아니라 다른 꽃가루의 간섭을 방지합니다. 꽃가루 곡물은 이전에 실온에서 24 시간 동안 종이에 놓인 데시드 마취제에서 미세 메쉬(그림 1B)를통해 쉽게 체질되거나 약간의 여분의 열을 가합니다. 마찬가지로, 피스틸은 핀셋이나 손톱의 도움으로 꽃잎, 세팔 및 stamens를 제거 한 후 풍선 단계에서 꽃에서 얻을 수 있습니다(그림 1C)...

PCR 분석에 의한 S-유전자형의 식별과 형광 현미경 검사법에 의한 자기(in)호환성을 결합한살구(Prunus armeniaca L.) 품종의 수분 요건을 확립하는 방법론을 제시한다.

Self-incompatibility in Rosaceae is determined by a Gametophytic Self-Incompatibility System (GSI) that is mainly controlled by the multiallelic locus S. ...

이 방법은 다른 종의 수분 요구 사항을 결정하고 품종 간의 비호환성 관계를 확립하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법의 주요 장점은 실험실 조건하에서 여러 비호환성을 평가할 수 있다는 것입니다. 필드 조건에서 수행되는 실험에서 발생할 수 있는 수많은 문제를 방지합니다.이를 통해 해당 비호환성 그룹에 대한 다수의 품종을 헌납할 수 있습니다. 품종 간의 호환성 간 관계를 결정합니다. 이 방법은 또한 체리 또는 매화 같은 다른 과일 나무 작물에서 자기 비호환성 및 비호환성 관계를 결정하는 데 유용 할 수 있습니다.필드의 꽃을 샘플링하여 시작합니다. 이전 수분을 피하기 위해 살구에 대한 BBCH 규모의 스테이지 58에 해당하는 풍선 단계에서 꽃을 수집합니다. 실험실에서 꽃의 anthers를 제거하고 실온에서 건조하기 위해 종이 조각에 놓습니다.24시간 후, 꽃가루 곡물을 26mm 메쉬로 체질합니다. 각 자가 및 교차 수분에 대해 동일한 풍선 개발 단계에서 30 개의 꽃 그룹을 방출하고 방출 후 24 시간 후에 꽃집 거품에 권총을 놓고 같은 품종의 꽃가루가있는 페인트 브러시를 사용하여 권총을 수분으로 수분으로 놓습니다. 대조군으로 호환 되는 꽃가루에서 꽃가루각 품종의 권총의 또 다른 세트를 수분.72시간 후, 젖은 꽃집 폼에서 권총을 제거하고 3:1 에탄올의 고정 용액으로 권총을 아세트산에 4도에서 적어도 24시간 동안 고정합니다. 그런 다음 고정을 폐기하고 75%에탄올을 추가하여 샘플이 용액에 완전히 침수되도록 합니다. 샘플은 사용 전까지 섭씨 4도에서 에탄올에 저장할 수 있습니다.응고화 꽃가루 발아 배지에서 대조군 꽃가루에 사용되는 동일한 품종의 꽃가루 곡물을 분산하고 24 시간 후에 현미경으로 관찰하십시오. 세척당 1시간 동안 증류수로 3회 세척하여 권총을 미세 검사용으로 준비합니다. 마지막 세척 후, 24 시간 동안 섭씨 4도에서 5 %의 황산 나트륨에 둡니다.그런 다음 조직을 부드럽게하기 위해 황산 나트륨에서 10 분 동안 제곱 된 1 킬로그램센티미터에서 자동 복제합니다. 유리 슬라이드 위에 자동 으로 된 권총을 놓고 메스를 사용하여 난소 주변의 삼중집을 제거합니다. 그런 다음 커버글래스로 권총을 찌를 수 있습니다.꽃가루 튜브 성장 시 황량한 기탁을 더럽게 하고 원고 의 방향에 따라 현미경으로 꽃가루 튜브를 관찰하기 위해 준비 에 걸쳐 애니라인 블루를 바르십시오. 봄에 수집 된 어린 잎에서 유전체 DNA를 추출하는 상업 키트를 사용합니다. 그런 다음 원고 방향에 따라 시약을 결합하여 PCR을 설정합니다.반응 믹스를 소용돌이시키고 PCR 플레이트의 우물 사이에 분배합니다. 각 우물에 DNA 희석제 1마이크로리터를 추가하고 원고에 설명된 열 순환 프로그램을 사용하여 PCR을 실행합니다. 반응이 완료되면 모세관 전기 포근 또는 아가로즈 젤 전기 포근을 사용하여 결과를 분석하십시오.모세관 전기 포의 경우 물 증발을 방지하기 위해 1 방울의 미네랄 오일과 함께 PCR 제품의 마이크로 리터 1 개를 독자 플레이트의 우물에 추가합니다. 그런 다음 분리 버퍼를 추가하여 분리 플레이트를 준비합니다. 유전자 분석기용 상용 소프트웨어를 사용하여 새로운 샘플 플레이트를 만들고 플레이트의 모든 우물에 대한 샘플 이름을 저장합니다.그런 다음 분석 방법을 선택하고 두 판을 유전자 분석기로 삽입합니다. 모세관 배열을 증류수로 채웁니다. 선형 폴리아크릴아미드 젤을 로드하고 실행을 클릭합니다.젤 전기전구로 PCR 결과를 분석하는 경우 원고 방향에 따라 전광 실행 버퍼에서 아가로즈를 용해하여 1% 아가로즈 젤을 준비한다. 그런 다음 4 마이크로리터의 핵산 얼룩을 젤에 넣고 부드럽게 섞습니다. 빗으로 젤 트레이를 설정하고 거품을 피하기 위해 주의 중간에 젤을 부어 느리게.젤을 완전히 고화할 때까지 약 30-45분 간 실온에서 둡니다. 그런 다음 전기 전도실에 넣습니다. 빗을 제거하고 1x TAE 버퍼로 덮습니다.DNA 사다리로 젤을 적재한 다음 PCR 제품을 적재염료와 혼합합니다. 그런 다음 블루 염료 라인이 젤 레인의 약 75 %가 될 때까지 60-90 분 동안 90 볼트에서 젤을 실행합니다. 달리기가 완료되면 트랜틸루미나이터를 사용하여 젤을 시각화합니다.각 품종에 대한 자기(in) 호환성을 결정하기 위해 형광 현미경 검사법에 의해 자가 및 교차 오염에서 꽃가루 튜브 의 성장을 관찰하였다. 품종은 꽃가루 튜브 성장이 체포되었을 때 자체 호환되지 않는 것으로 간주되었고 적어도 하나의 꽃가루 튜브가 스타일의 기지에 도달했을 때 자체 호환됩니다. 5 프라이머 쌍 조합은 모세관 또는 젤 전기포와 함께 PCR을 사용하여 S-alleles를 식별하는 데 사용되었다.먼저, S-Alleles는 SRc 프라이머 쌍을 사용하여 최초의 S-RNase 인트론의 증폭에 의해 확인되었다. 그런 다음 RNase의 두 번째 인트론은 S6, S9, S1 및 S7 을 구별하기 위해 세 개의 프라이머 세트로 증폭되었습니다. 그리고 SFB 유전자의 V2 및 HVB 가변 영역은 Sc 및 S8 본인을 확인하기 위해 설정된 AprFBC8 프라이머로 증폭되었다.S-alleles가 확인되면 상호 호환되지 않는 유전자형을 가진 다른 비호환성 그룹을 확립할 수 있습니다. 모세관 전기 포근에서 제어를 사용하는 것이 중요합니다, 그들은 부정확한 진상 식별을 일으키는 원인이 되는 단편 크기의 더 많은 차이로 보고할 수 있는 자동 단편 분석 시스템을 사용하기 때문에. 현미경 관찰과 유전 분석의 조합은 살구에 있는 자기 비호환성을 결정하고 품종 사이 비호환성 관계를 확립하기 위하여 아주 유용한 접근을 초래했습니다.자기 비호환성은 이제 살구지역 주민과의 연결고리입니다. 요인의 결정은 관련된 것 같습니다. 미래의 노력은 살구에서이 품종의 유전 적 교화에 초점을 맞추어야한다.이 다큐멘터리 접근법의 조합은 살구 사육 프로그램에서 상업적 과수원 및 패턴 유전형에서 품종의 적절한 선택에 대한 귀중한 정보를 초래한다. 비슷한 접근은 그밖 우디 다년생 작물에서 이용될 수 있습니다.

determination-self-inter-compatibility-relationships-apricot

Research

연구

JoVE Journal

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Saccharomyces cerevisiae에서 반수체의 짝짓기 효율 측정

이 프로토콜은 감귤류 품종의 꽃가루 호환성과 비호환성을 결정하는 빠른 방법을 제공합니다.

수동 수분, 현미경 및 S-유전자형 분석을 사용한 감귤류의 자체 (in)호환성 및 inter-(in)compatibility 관계 결정

Arabidopsis thaliana에서 꽃가루 수화 프로필을 측정하는 개선된 방법이 여기에 설명되어 있습니다. 새로운 방법은 더 높은 분해능을 제공하고 비침습적이며 재현성이 높습니다. 이 프로토콜은 수분의 초기 단계를 조절하는 과정을 보다 세밀하게 해부하기 위한 새로운 도구를 나타냅니다.

Arabidopsis thaliana에 대한 고분해능, 단일 입자, 생체 내 꽃가루 수화 생물학적 분석

여기에서 우리는 P. blakesleeanus 짝짓기의 유도를 위한 기본 프로토콜을 제시합니다.

Mucoromycete Phycomyces blakesleeanus를 가진 성적 십자가

감수 분열 전기 동안의 염색체 이동은 포자 형성의 기본이 되는 잘 이해되지 않는 현상입니다. 이 프로토콜은 애기장대 탈리아나 수컷 감수 모수세포에서 감수 분열 전기 동안 중심체 움직임을 획득, 분석 및 정량화하는 방법을 설명합니다.

애기장대 의 수컷 감수 분열 전기 동안 중심체 움직임의 라이브 이미징 특성화

심근세포 회전율의 정량화는 어렵습니다. 여기에 설명된 프로토콜은 신심근세포 핵 생성 및 핵 ploidy의 정확하고 민감한 정량화를 가능하게 함으로써 이러한 과제에 중요한 기여를 합니다.

심근 DNA 합성 및 배수성의 동시 평가 : Method는 심근 재생 및 회전율의 정량을 지원합니다

Intravital 형광 현미경 검사 법 (IVFM)는 calvarium의 유도 및 조 혈 모 세포의 골 수 (BM) 틈새로 engraftment 연구 유전 동물 모델에 적용 됩니다.

Intravital 형광 현미경 검사 법 (IVFM)를 결합 하 여 유전자 모델 골 틈새에 조 혈 모 세포의 Engraftment 역학을 공부 하

학습하세요 살구 품종의 자가 및 상호 호환성 관계를 형광 현미경과 PCR 분석으로 결정하는 방법을. 이 실험실 기반 접근법은 수분 생물학 연구와 육종 프로그램에 유용합니다.

손 수분, 현미경 검사법 및 유전자 분석을 결합한 살구의 자기 및 간 호환성 관계 결정

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