X선 특이적 염색 방법 및 나노스코픽 컴퓨터 단층 촬영을 사용한 연조직 시료의 3D 이미징

우리의 새로운 프로토콜은 실제로 엑스레이 컴퓨터 단층 촬영을 사용하여 3D로 셀룰러 구조를 시각화 할 수 있습니다. 그리고 우리는 eosin로 조직을 염색해서 이렇게 하고 그런 식으로 세포질이 보이게 합니다. 의학 응용 프로그램 및 연구 이외에, 우리는 또한 우리의 방법은 예를 들면, 동물학 연구 또는 발달 생물학 과 같은 생물학에서 적용될 수 있다고 생각합니다.

이 기술은 비교적 간단하고 매우 빠르며 더 큰 조직 샘플에도 적합합니다. 우리는 엑스레이 마이크로 컴퓨터 단층 촬영과 결합된 우리의 접근이 임상 워크플로우에 통합될 수 있고 실제로 병리학자가 더 나은 결정을 내리는 것을 도울 수 있다고 생각합니다. 연조직 샘플을 고정하여 시작합니다.

50 밀리리터 원심분리기 튜브를 4%포름알데히드의 9.5 밀리리터와 빙하 아세트산 0.5 밀리리터를 함유한 고정 용액으로 채웁니다. 원심분리기 튜브에 연조직 샘플을 추가하고 24~72시간 동안 냉장 보관하십시오. 냉장 후 1 시간 동안 DPBS 용액으로 연조직 샘플을 세척하십시오.

그런 다음 에오신 Y 염색 용액의 2 밀리리터에 배치하여 샘플을 염색하고 24 시간 동안 수평 흔들림 판에 배양합니다. 다음 날에는 시료 용기에서 연조직 샘플을 조심스럽게 꺼내 셀룰로오스 티슈 페이퍼로 과도한 염색제를 제거합니다. 저장 및 추가 사용을 위해 에탄올 증기 상 위의 원적 용기에 놓습니다.

적절한 샘플 홀더를 준비하여 원고 방향에 따라 연조직 샘플을 장착하고 X-ray CT 측정 중에 샘플이 이동하는 것을 방지하기 위해 단단한 착용감을 보장합니다. 접착제가 경화되고 샘플 홀더가 사용할 준비가 되면 마우스 신장을 하단에 70% 에탄올 몇 방울을 보관하는 그대로 원심분리기 튜브로 옮기습니다. 장착된 샘플을 X선 CT 스캐너에 넣습니다.

샘플을 신중하게 정렬한 후 최상의 이미지 품질을 위해 획득 매개 변수를 선택합니다. 제시된 마이크로 CT 데이터의 경우, 360도 이상 동등하게 분포된 1601프로젝션을 사용하여 50킬로볼트의 피크 전압과 3.5와트의 전류로 스캔을 획득한다. 그런 다음 개요 스캔에서 마이크로 CT 데이터를 사용하여 고해상도 CT 스캔에 대한 관심 영역을 선택합니다.

메스와 스테레오 현미경을 사용하여 약 0.5 밀리미터 의 가장자리 길이의 매우 작은 조각으로 절단하여 연조직 샘플의 관심의 볼륨을 준비합니다. 마우스 신장을 사용하는 경우 가장 긴 축을 따라 두 개의 반으로 자른다. 반쪽을 가지고 신장 피질과 신장 수질과 같은 다른 해부학 적 영역을 준비합니다.

작은 조각을 탈수에 대한 새로운 페트리 접시에 전송합니다. 원고 방향에 따라 일련의 에탄올 용액을 사용하여 샘플을 탈수하고 각 탈수 단계를 1 시간 동안 수행합니다. 탈수된 샘플을 미세 다공성 캡슐로 옮기고 닫습니다.

시료를 항상 100% 에탄올과 접촉하게 하십시오. 그런 다음 임계 점은 작은 조직 조각을 건조. 조직 샘플이 준비되면 추가 사용 전에 건조기에 저장된 새로운 페트리 접시에 보관하십시오.

티슈 조각을 적절한 샘플 홀더에 장착하여 단단히 맞습니다. 마우스 신장의 경우 스테레오 현미경을 사용하여 샘플 홀더에 조각을 초접착제. 시료를 신중하게 정렬한 후 최상의 이미징 품질을 위해 획득 매개 변수를 선택합니다.

제시된 나노 CT 데이터의 경우, 360도 이상 동등하게 분포된 1599개의 프로젝션과 약 400나노미터의 복셀 크기로 60킬로볼트의 피크 전압에서 프로젝션을 획득한다. 이 프로토콜은 마우스 신장의 미세한 조직 구조의 3D 시각화를 위해 사용되었다. 저해상도 마이크로 CT 측정은 전체 장기에 대한 개요를 허용하고 고해상도 측정에 대한 관심의 양을 식별하는 데 도움이.

동일한 마우스 신장은 고해상도 마이크로 CT 데이터를 얻기 위해 사용되었다. 피질, 외부 수질 및 내부 수질과 같은 해부학 적 구조에 대한 보다 상세한 시각이 달성됩니다. 관심 도량 렌더링은 수질 영역과 선박을 통한 가상 섹션을 보여줍니다.

나노 CT는 세포 수준에서 신장 샘플의 상세한 보기를 얻기 위해 사용되었다. 전체 마우스 신장에서 얻은 작은 조직 조각은 약 400 나노 미터의 복셀 크기로 헨의 루프의 두꺼운 상승 사지를 이미지하는 데 사용되었다. 나노 CT가 조직 병리학과 완전히 호환되도록 비교 연구가 수행되었습니다.

다중모달 이미징 접근법은 두 가지 방법으로 얻은 결과를 확인하였다. 인큐베이션 단계에서는 샘플이 염색 용액에 완전히 둘러싸여 있는 것이 중요합니다. 또한 CT x-ray 이미징을 수행할 때 가장 중요한 사실은 데이터 수집 중에 샘플 안정성을 보장하는 것입니다.

우리의 프로토콜로 분석된 연조직 견본은 헤마톡신에 반사하는 것과 같은 표준 조직학 기술을 사용하여 추가 분석될 수 있습니다. 우리의 염색 프로토콜은 3D 엑스레이 히스토로지 발전에 실질적으로 기여할 것입니다. 의학 연구는 특히 이 비파괴 3D 화상 진찰 기술에서 유익할 것입니다.