Name: 뮤린 맘모스피어 문화에서 자체 갱신의 정량화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: 배우세요 뮤린 맘모스피어 문화에서 자체 갱신을 정량화하는 방법을. 이 기법은 유방암 줄기세포 증식 및 유전자 발현 연구에 활용될 수 있는 간단하고 비용 효율적인 도구입니다.

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Rosa26-MycER 형질전환 마우스 모델의 친절한 선물에 브루노 아마티에게 감사드립니다. 이 작품은 WWCR, AIRC, ERC, 그리고 P.G.P. T.V. 및 X.A.에 대한 이탈리아 보건부의 보조금으로 FIRC및 A.S.의 FUV 보조금에 의해 지원되었습니다.

생체 내 절차는 EU 지침 2010/63에 따라 수행되었으며, 기관 윤리 위원회(동물 복지-OPBA)와 이탈리아 보건부(IACUC 번호 762/2015 및 537/2017)의 승인을 받은 후 수행되었습니다.
1. 뮤린 맘메리 글랜드 수집 및 소화
<ol><li>일반적인 실험을 위해,CO2 흡입에 의해 8-10 주 령 처녀 암컷 마우스를 희생하십시오. 실험의 목적에 따라 5-30 개의 마우스를 사용하십시오. 마우스를 해부 보드에 후드 아래에 놓습니다. 바늘을 사용하여 앞다리를 펴고 동물의 털을 에탄올로 씻어 내보소소.</li>
	<li>집게로 피부를 들어 올리고 골반 부위의 수준에서 시작하여 자궁 경부까지 이동하여 복막을 그대로 두는 수직 절개를 수행합니다. 피부나 후막이 파열되지 않도록 하려면 둥근 가위를 사용하십시오.</li>
	<li>가위의 부드러운 움직임으로 몸의 측면 축을 가로 질러 조심스럽게 피부를 분리합니다.</li>
	<li>피부가 흉부와 복부 영역에서 완전히 분리되면 동물의 네 팔다리를 가로 질러 4 개의 절개를 수행하고 바늘로 피부를 고정합니다. 가위와 집게를 사용하여 확장 된 피부에서 동물의 몸을 완전히 분리하십시오.</li>
	<li>포셉을 사용하여 이제 완전히 노출된 유방 지방 패드를 부드럽게 들어 올리고 가위를 도움으로 조심스럽게 피부에서 분리하십시오. 각 마우스의 하부 흉부 및 복부 유방 땀샘을 수집하고 50 mL 원엽 튜브에 Dulbecco의 인산완충 식염수 (DPBS)에 담급. 튜브 당 최대 20 땀샘을 수집합니다. 얼음에 조직을 유지합니다. 참고: 필요한 경우 땀샘은 밤새 얼음 위에 남아있을 수 있습니다. 이것은 안전한 중지 지점입니다. 다음 단계는 멸균 조건하에서 수행해야 합니다.</li>
	<li>소화 매체를 준비하고 여과하십시오: Dulbecco의 수정된 독수리 배지(DMEM)는 2 mM글루타민, 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신, 200 U/mL 콜라게나아제 및 100 μg/mL 히알루로니다제(표 참조)로 보충됩니다. </li>
	<li>최대 20개의 땀샘을 100mm 페트리 접시로 옮기고 메스 나 곡선 가위를 사용하여 조직을 다듬습니다. 대량의 DPBS를 접시에 옮기지 마십시오.</li>
	<li>각 페트리 접시에 10 mL의 소화 매체를 추가하고 25 mL 의 혈청학적 파이펫을 사용하여 다진 조직을 50 mL 원엽 튜브로 옮김을 옮김을 넣습니다.</li>
	<li>파라필름으로 튜브를 밀봉하고 회전자 위에 놓습니다. 회전을 저속(0.03 x g)으로설정하고 5%CO2를함유하는 습한 분위기에서 37°C에서 2.5시간 동안 배양한다.</li>
	<li>다음 단계로 진행하기 전에 서스펜션을 시각적으로 검사합니다. 큰 조직 조각이 소화되지 않은 채로 남아 있으면, 37°C에서 배양을 30분 더 연장합니다. 참고: 대안으로, 소화는 37°C, 5%CO2에서하룻밤 동안 수행될 수 있고, 부드러운 콜라게나아제/히알루로나이다제 효소 믹스13을사용하여 수행될 수 있다.</li>
</ol>2. 1차 뮤린 MEC의 격리
<ol><li>회전기를 중지하고 인큐베이터에서 튜브를 제거합니다. 5mL 연로질 파이펫 개구부에서 P1000 팁을 조정합니다. 서스펜션이 P1000 팁을 통과하면 다음 단계로 진행합니다. 그렇지 않으면, 37°C에서 30분 동안 배양을 연장한다.</li>
	<li>100 x g에서원심 분리기, 4 °C에서 5 분 동안. 조심스럽게 상류를 장식하고 DPBS의 3 mL에서 각 튜브의 펠릿을 다시 일시 중단하십시오. 참고: 낮은 원심 분리 속도는 림프구와 지방 조직 세포의 제거를 허용합니다. 이 단계에서 펠릿을 분리하지 않으려면 부드러운 조작이 필요합니다.</li>
	<li>100, 70 및 40 μm 셀 스트레이너를 사용하여 각 튜브의 셀 현탁액을 개별적으로 필터링합니다. 각 필터링 단계에서 스트레이너를 2 mL의 DPBS로 세척한 후 통과를 수집합니다. 참고: 이 시점부터 셀 서스펜션을 함께 풀화하고 처리할 수 있습니다.</li>
	<li>300 x g에서원심 분리기, 4 °C에서 5 분 동안. 조심스럽게 상류를 decant및 DPBS의 나머지 볼륨에서 세포를 다시 일시 중단.</li>
	<li>적혈구(RBC) 용해암모늄-염화칼륨(ACK) 용해 완충액을 동등한 부피를 첨가하여 용혈을 진행한다(재료 표참조). 파이펫팅으로 섞어서 얼음에 최대 5분 동안 배양합니다.</li>
	<li>4 °C에서 5 분 동안 300 x g에서DPBS 및 원심 분리기 10 mL을 추가하십시오. 조심스럽게 상류를 decant하고 시각적으로 펠릿을 검사합니다. 펠릿이 흰색이면 다음 단계로 진행합니다. 그렇지 않으면 RBC 라시스 단계를 반복한다(단계 2.5).</li>
	<li>유방 스피어 배지의 1-5 mL에서 세포 펠릿을 다시 중단 : 유방 상피 세포 성장 기저 배지 (MEBM), 2 mM 글루타민으로 보충, 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신, 5 μg/mL 인슐린, 0.5 μg/mL 하이드로코르티손, 2% B27, 20 ng/mL 표피 성장 인자(EGF), 20 ng/mL 기본 섬유아세포 성장 인자(bFGF) 및 0.4 IU</li>
</ol>3. 직렬 매머지스피어 재도금
<ol><li>유방 구배 배양의 확립을 위해, 유방구배지에서 200,000개의 생존 가능한 세포/mL의 밀도에서 비조직 배양처리(초저 접착) 6웰 플레이트에 세포를 플레이트한다. 37 °C, 5%CO2에서7-10 일 동안 세포를 배양합니다.</li>
	<li>95% 에탄올로 1% 폴리-HEMA 용액을 준비하고 걸료합니다(재료 표참조). 다음 구절에 대해 초저 접착 력 6 웰 플레이트를 코팅하고, 웰 당 1 % 폴리 HEMA 용액 400 μL을 추가하고 에탄올이 완전히 건조 될 수 있도록합니다. 더 나은 결과를 얻으려면 코팅을 두 번 반복하십시오. 참고: 제 1 통로 동안 코팅되지 않은 플레이트를 사용하면 배양으로부터 섬유아세포의 선택적 제거가 가능합니다.</li>
	<li>7-10 일 배양이 끝나면 모든 우물에서 1 차 매머스피어를 수집하고 300 x g에서원심 분리기를 4 °C에서 5 분 동안 수집합니다.</li>
	<li>조심스럽게 상류층을 장식하고 여과 된 팁이있는 P200 파이펫을 사용하여 매머스피어의 기계적 해리를 진행하십시오. 약 100 배 파이펫 및 시각적으로 큰 스페로이드의 존재에 대한 현탁액을 검사합니다. 참고: 37°C, 5%CO2에서트립신 또는 아쿠타제의 낮은 부피(0.2-0.5 mL)로 구체 펠릿의 짧은 배양(2-5 분)을 기계적 해리를 용이하게 하기 위해 사용될 수 있다. 각 통로의 도금에 대해 신선한 매머스피어 배지(단계 2.7)를 준비한다.</li>
	<li>신선한 유방구형 배지의 1-5 mL에서 재중단하고 생존 세포를 계산합니다. 적용 가능한 경우, 치료 군 또는 배양 조건에서 세포를 분할한다.</li>
	<li>플레이트 20,000 가능한 세포/mL을 폴리-HEMA 코팅 초저 유착 6웰 플레이트에 37°C, 5%CO2에서배양한다. 참고: 매머지스피어는 셀 도금 후 5-7일 이내에 최대 크기에 도달합니다. 가능하면 각 샘플 또는 조건의 셀을 여러 웰에 분배하여 기술 복제본을 얻습니다. 도금 밀도는 세포 응집을 피하기 위해 낮게 유지되어야 합니다. 6웰 플레이트에는 최대 20,000개의 셀/mL, 24웰 플레이트의 경우 5,000셀/mL을 권장합니다.</li>
	<li>5-7일 후, 웰당 구수 수를 계산합니다. 이 작업은 10x 배율 렌즈가 장착된 현미경을 사용하거나 디지털 이미지 분석을 사용하여 수동으로 수행할 수 있습니다(4단계 참조).</li>
	<li>각각의 유방구를 별도로 수집하고 300 x g에서원심분리기를 4°C에서 5분 동안 수집합니다.</li>
	<li>조심스럽게 상류층을 장식하고 여과 된 팁이있는 P200 파이펫을 사용하여 매머스피어의 기계적 해리를 진행하십시오. 약 100 배 파이펫 및 시각적으로 큰 스페로이드의 존재에 대한 현탁액을 검사합니다.</li>
	<li>신선한 유방구형 배지 의 1 mL에서 다시 중단하고 생존 세포를 계산합니다. 각 샘플 또는 조건의 셀을 풀풀고 3.6-3.10 단계를 반복합니다. 도금된 셀 수와 각 계면에 대해 잘 계산된 구및 셀 수를 기록합니다. 누적 증가 계산을 위해 5단계로 진행합니다.</li>
</ol>4. 디지털 이미지 분석(DIA)을 사용한 구 열거형
<ol><li>각 통로의 끝에서, 모든 우물의 전체 표면을 스캔하고 스테레오 스코프에 장착 된 디지털 카메라를 사용하여 구체의 이미지를 획득. 이미지를 .tif 파일로 저장합니다.</li>
	<li>ImageJ14를사용하여 스테레오스코프 이미지를 이미지 시퀀스로 가져옵니다. 이미지의 배율과 유형을 8비트로 설정합니다.</li>
	<li>이미지 스택을 복제하고 메뉴 모음의 탭 프로세스에서 배경을 뺍니다. 옵션 라이트 배경 및 슬라이딩 포물선을 확인하고 확인버튼을 클릭합니다. 스택의 모든 이미지를 처리합니다.</li>
	<li>조정을 선택한 다음 메뉴 막대의 이미지 탭에서 임계값을 선택합니다. 적용을클릭하면 스택변환에서 바이너리로 변환이라는 대화 창이 나타납니다. 디폴을 메소드로 선택하고 배경을 밝게 합니다. 각 이미지에 대한 임계값 계산 상자를 확인하고 확인 버튼을 클릭합니다. </li>
	<li>명령 유역, 열기 및 메뉴 모음의 탭 프로세스 아래의 바이너리 목록에서 침식 명령을 순차적으로 선택합니다. 나타나는 대화 상자의 예 버튼을 클릭하여 스택의 모든 이미지를 처리합니다. 참고: 이러한 프로세스를 통해 오브젝트가장자리에서 만지고, 오브젝트를 스무딩하고, 픽셀을 제거할 수 있습니다.</li>
	<li>메뉴 분석 에서 입자 분석 기능을 선택합니다. 최소 크기 임계값을 10,000 μm2로 설정하고 0.50에서 1.00 사이의 원형을 설정합니다. 드롭다운 표시 메뉴에서 타원 옵션을 선택합니다. 요약을확인 , 가장자리및 에서 제외 표시 및 확인버튼을 클릭합니다 . 스택의 모든 이미지를 처리합니다.</li>
	<li>구와 타원의 대응을 시각적으로 검사하고 필요한 경우 그에 따라 파티클 수를 수정합니다. 웰 당 매머드스피어의 총 수를 얻기 위해 각 우물의 모든 프레임에서 수를 합산합니다.</li>
</ol>5. 누적 성장 곡선 계산
참고: 각 계의 말단에서 각 웰로 계산된 매머모어의 수(PN)는PN의시작 부분에서 시드된 매머스피어 개시 세포의 수를 반영한다.
<ol><li>각 계통과(PN)에대해, 도금된 셀의 수와 웰당 계산된 셀 및 구의 수를 등록한다. 각 구절의 끝에 있는 구 크기를 계산합니다. 구 크기 PN (셀 / 구) = 셀 카운트 PN / 구 수 계수 PN 참고: PN에서의 구체 크기는 PN에서시드된 각 매머스피어-시팅 셀의 증식 전위를 측정한 것이다.</li>
	<li>PN에 대해 도금된 셀 수를 이전 구절의 끝에서 계산된 구 크기로 나누어 도금된 구의 수를 추론합니다(PN-1): 구도금 PN = 셀 도금 PN / 구 크기 PN-1 참고: 규칙에 의해, 구크기는 배양물의 제1 통로 동안 안정적으로 가정된다(즉, 구 크기P0 = 구 크기P1). 여러 웰이 기술 복제본으로 사용되는 경우 PN-1의 평균 구 크기를 분모로 사용합니다.</li>
	<li>구절당 각 웰에 대한 누적 셀 및 구 수를 계산합니다. 누적 수 PN = (카운트 PN / 도금 PN)X 누적 번호 PN-1. 참고: 규칙에 따라 누적 번호 P0 = 도금 P1. 여러 웰이 기술 복제로 사용되는 경우 각 계에 대한 샘플 또는 조건당 평균 누적 수를 계산합니다.</li>
	<li>데이터 점을 반로그 축척으로 플로팅합니다. x축(선형 눈금)에 통로 번호(P0 ~ PN)와y축(로그축 눈금)에 누적 셀 또는 구 번호를 표시합니다.</li>
	<li>지수 추세선을 데이터 점에 맞추고 측정 계수(R2)를 계산하여 적합도를 측정합니다. 참고: 데이터 점에 맞는 추세선은 일정한 속도로 증가하거나 죽는 셀 모집단에 대해 예상되는 기준 곡선을 근사화해야 합니다. R2는 0에서 1 사이의 값을 취하고 값이 1에 가장 가깝기 때문에 더 나은 맞춤을 나타냅니다.</li>
	<li>추세선의 방정식을 문화어의 성장률(GR)을 추론하는 자연스러운 지수 함수로 묘사합니다. y = y0 e(GR)x, 여기서 y0은 x = 0일 때 y의 값입니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

여기서, 우리는 시험관 내 의 MaSC 성장 특성의 정량적 설명에 대한 프로토콜을 설명한다. 일례로, 우리는 일반적인 뮤린 MaSCs에 낮은 수준의 구성 Myc 표현의 효과를 제시한다. 그러나 이 방법은 다양한 컨텍스트에 동일하게 적용할 수 있습니다. 인간 또는 뮤린 1차 세포는 확립된 세포주뿐만 아니라, 연속적으로 계류될 수 있는 유방구배양을 확립하기 위해 앵커리지 독립적인 조건에서 배양될 수 있다. 유전자 과발현 및 RNA 간섭은 제1 계의 말단에 바이러스 성 환전 단계를 첨가하여 프로토콜에 용이하게 도입될 수 있다(3.5단계 후). 양자택일로, 세포는 유착에서 감염되고 그 때 유방구로 도금될 수 있습니다.
여기에 제시된 분석의 중요한 양상은 시딩 셀 밀도이며, 이는 결과16,17의해석을 방해하는 응집체의 생성을 피할 수 있을 만큼 충분히 낮아야 한다. 매머지피어의 형태는 이러한 모호성을 해결하는 데 유익할 수 있습니다. 각 구절의 끝에 는 작고 둥근 구만 지정해야 합니다. 스페로이드의 원형과 크기를 모두 고려해야합니다. DIA의 자동화된 프로세스를 사용하여 이 단계는 객관적이고 절대적인 방식으로 적절한 임계값으로 보장됩니다. 종종, 선조는 유방 구수 에서 제외되어야 하는 세포의 acinar 구조물 또는 더 작은 군집을 형성할 것입니다. 엄지 손가락의 규칙으로, 우리는 100 μm 직경의 임계 값을 사용합니다. 마지막으로, 한 구절에서 다음 통로로 손상되지 않거나 완전히 해리되지 않은 유방이 옮겨지지 않도록주의해야합니다. 다른 한편으로는, 과잉 파이펫팅은 증가한 세포 죽음으로 이끌어 낼 것입니다. 따라서, 이러한 어려움이 발생하는 경우, 우리는 경미한 트립시네화 또는 Accutase 처리를 사용하고 단세포 현탁액의 생성을 보장하기 위해 40 μm 스트레이너를 통해 해리 된 구체를 전달하는 것이 좋습니다.
구체 형성 효율(SFE)은 유방스피어 배양에서 SC 또는 CSC 정량 ex vivo에 대한 대리로서 대안적으로 사용되어 왔다. SFE는 실제로 주어진 세포 집단에 있는 줄기 같이 세포의 측정입니다. 그러나 별개의 시점에서만 정보를 제공하기 때문에 덜 양심적인 접근 방식을 나타냅니다. 누적 구체 수와 누적 성장 곡선의 생성을 계산하면, 대신, 배양이 배출될 때까지 초기 세포 파종 단계로부터 배양배양물의 성장 속도를 추론하거나, 불멸의 배양의 경우, 원하는 수의 대구에 대해 유추할 수 있다. 성장 특성의 평가는 계수R2를 통해 지수 성장으로부터의 편차를 평가하고, 두 번째 단계에서, GR 값 자체의 평가를 허용한다.
중요하게도, 누적 매머스피어 성장 곡선은 CSC 레벨6,11에서소분자 억제제 또는 다른 화학치료제의 효과를 선택적으로 평가하는데 사용될 수 있다. 5-7 개의 구절에서 기능적으로 소모되는 일반적인 1 차 적인 유방구와는 달리, 종양 유방구는 무기한 확장하는 경향이 있습니다. 이 기능은 무제한 CSC 자체 갱신 기능에 연결되어 있습니다. 증식 및 CSC 자기 재생에 미치는 영향은 각각 종양 세포 및 유방구 성장 곡선의 생성을 통해 결합되지 않을 수 있다. CSC 특이적 효과는 누적 세포 성장속도6,11에영향을 미치거나 관계없이 누적 매머스피어 성장률의 감소를 초래할 것으로 예상된다.
마지막으로, 관심의 또 다른 영역은 성인 조직 SC 재프로그래밍중 하나입니다. 완전히 자란 유방구는 현상형 이질적인 세포 집단으로 구성되며, 이 때 단지 사소한 분획만이 생체 내에서 이식시 유방권 개시 능력 및 유방선 재생을 포함하는 줄기와 같은 특징을 유지한다6,9,11,18,19. 유방 전조기는 이렇게 확립된 표면 마커2,3을사용하여 시험관내 라벨 고정 검정6,9,11 또는, ex vivo를 사용하여 단리될 수 있다. 특히, 유방 선조는 anoikis를 살아남지 않으며 유방 구를 형성할 수 없습니다. 강제 Myc 발현은 PKHneg11로격리된 유방 선조에게 유방 전진기에게 유방 구개시 가능성을 부여하는 것으로 나타났으며, 그 결과 무기한으로 통과될 수 있는 배양물의 생성을 초래한다. 유사하게, 생리적 재프로그래밍의 음성 조절제의 간섭은 동일한 분석법을 사용하여 시험될 수 있다. 이 컨텍스트에서 발생할 수 있는 일반적인 문제는 제한된 수의 셀 입력입니다. 세포 입력이 10,000 셀보다 낮은 경우, 우리는 24 웰 플레이트 (최대 5,000 가능한 세포 / mL)에 시드하는 것이 좋습니다. 그럼에도 불구하고, 앵커리지 독립적인 문화 조건은 특히 재프로그래밍 효과가 즉각적이지 않은 경우 재프로그래밍 점수를 매기기에는 너무 가혹한 것으로 입증될 수 있습니다. 이러한 경우, 지지 매트릭스 및 3차원 오르노이드 배양물의 사용은20보다적절할 수 있다.
전반적으로, 유방구분석은 정상 및 종양 MEC 집단에서 줄기와 같은 성질을 채점하기 위해 쉽게 사용할 수 있는 비용 효율적인 옵션이다. 이 프로토콜에서 취해진 정량적 접근법은 상이한 조건에서 수행되거나 다양한 자극에 노출된 배양물 간의 비교를 용이하게 한다. 엄격하게 따를 때, 그것은 생체 내에서 줄기 특성을 정의하는 여러 선수의 분리를 허용하는 상대적으로 간단한 ex vivo 모델 시스템을 제공, 더 상세한 기계론 연구의 가능성을 제공.

유방 상피 줄기 및 전구 세포의 격리 및 시험관 내 배양은 유방 세포 생물학에 있는 그들의 속성을 이해하는 것이 필수적이 되었습니다. 우아한 계보 추적 및 연속 이식 은 그들의 생체 내 틈새 의 맥락에서 줄기 세포 (SCs) 및 기타 조직 하위 세트의 연구를 가능하게했다. 그러나, 이 접근법은 시간이 많이 걸리고 리포터 마우스 모델1,2,3,4,5의생성이 요구된다. 따라서, 시험관 내 배양 및 유방 줄기 세포 (MaSCs)의 전파는 주요 줄기 기능, 즉 자기 갱신 및 분화 능력을 아끼면서 현장에서 가장 큰 과제 중 하나입니다. 지난 몇 년 동안, 유방스피어 분석제는 정상 유방 조직 및 유방암 성장을 모델링하고, 정상 또는 암 SCs(CSC)를 정량화하고, 생체 내 문맥6,7,8,9,10,11에서그들의 활동의 대리 리포터로서 그들의 자기 갱신 능력을 평가하는 데 널리 사용되어 왔다.
유방 스피어 분석법은 효율적이고 비용 효율적인 접근법으로, 새로 분리된 유방 상피 세포(MECs)가 비부착 조건에서 배양되는 데, 이는 MaSCs만이 생존하고 현탁액에서 구를 형성하고 다른 모든 세포 유형은 anoikis에 의해 죽는다는 전제하에. 더욱이, 연속적인 비부착 구절에서 여러 세대의 맘모스피어를 형성하는 능력은 MaSCs6,9,11의자체 갱신 능력과 관련이 있다. 여기서, 우리는 처음에 Dontu 및 동료7에 의해 개발된 정량적 매머스피어 분석법의 상세한 프로토콜을 상세한 프로토콜로 설명하고, 선구적인 신경구분석법(12)의변형으로서, 적절한 성장 인자7,12의첨가와 함께 비부착, 무혈청 조건에서 가설성 SC의 성장을 가능하게 한다.

<table><tbody><tr><td>ACK 용해 완충액</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td>암모늄-염화물-칼륨 용해 버퍼, 100mL.</td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>B27 보충제 50X(10mL). 최종 농도 2% v/v.</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>인간 재조합 섬유 아세포 성장 인자 - 기본, 50 > 재고 솔루션 100 & 지/&무; 트리스 5mM pH 7.6의 L. 최종 희석 0.02% v/v.</td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소</td><td>Sigma</td><td>C2674</td><td>Clostridium histolyticum의 콜라겐 분해 효소. 유형 I-A, 동결 건조 분말, 1g. DMEM으로 20,000 U/mL 재고. 최종 희석 1% v/v.</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Lonza</td><td>12-614F</td><td>Dulbecco의 변형 된 독수리의 매체</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Microgem</td><td>S17859L0615</td><td>Dulbecco의 인산 완충 식염수</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Tebu-Bio</td><td>AF-100-15</td><td>재조합 인간 상피 성장 인자. 재고 용액 100 &mu; 멸균 dH2O의 g/mL. 최종 희석 0.02% v/v.</td></tr><tr><td>글루타민</td><td>Lonza</td><td>17-605E</td><td>L-글루타민, 200 밀리미터. 최종 희석 1% v/v.</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>PharmaTex</td><td>34692032</td><td>재고 농도 5,000 IU/mL. 최종 희석 0.008% v/v.</td></tr><tr><td>히알루로니다아제</td><td>시그마</td><td>H4272</td><td>유형 IV-S, 분말, 750-3,000 U/mg 고체, 30 mg. 멸균 dH2O의 원액 10 mg/mL. 최종 희석 1% v/v.</td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>Sigma</td><td>H0888</td><td>재고 농도 100 &mu; g/mL입니다. 최종 희석 0.5% v/v.</td></tr><tr><td>인슐린</td><td>SAFCBiosciences</td><td>91077C</td><td>인슐린, 인간 재조합, 건조 분말, 250 mg. 재고 농도 1 mg/mL. 최종 희석 0.5% v/v.</td></tr><tr><td>낮은 부착성 6웰 플레이트</td><td>Corning</td><td>351146</td><td>투명하고 평평한 바닥과 뚜껑이 있는 멸균 6웰 미처리 세포 배양 플레이트.</td></tr><tr><td>MEBM</td><td>Lonza</td><td>CC-3151</td><td>유방 상피 세포 성장 기저 매체</td></tr><tr><td>페니클린-스트렙토마이신 혼합물</td><td>Lonza</td><td>17-602F</td><td>는 10,000 U 칼륨 페니실린과 10,000 &마이크로를 포함합니다. g 0.85% 식염수 중 mL당 스트렙토마이신 설페이트. 최종 희석 1% v/v.</td></tr><tr><td>Poly-HEMA</td><td>Sigma</td><td>P3932</td>는 <td>55°C에서 하룻밤 동안 95% EtOH에 용해됩니다. 재고 농도 12% w/v. 최종 희석 1% v/v를 95% EtOH에 용해합니다. 필터(0.22 &mu; m) 사용하기 전에.</td></tr></tbody></table>

뮤린 맘모스피어 문화에서 자체 갱신의 정량화

Quantification of Self-renewal in Murine Mammosphere Cultures

유선은 여성의 수명 주기 에 걸쳐 대규모 호르몬 변화를 거치기 때문에 광범위한 재생 능력을 특징으로합니다. 유방 줄기 세포의 역할 (MaSCs) 널리 생리적 / 발달 맥락에서 유방 발암에 관해서 모두 연구된다. 이 양상에서, MaSC 속성에 초점을 맞춘 생체 내 연구는 매우 수요가 많다. 매머지피어 문화는 장기 형성의 대리를 나타내며 기본 및 번역 연구를 위한 귀중한 도구가 되었습니다. 여기서, 우리는 뮤린 1차 맘모스피어 배양및 MaSC 성장 특성의 정량화를 위한 상세한 프로토콜을 제시한다. 프로토콜은 유방 선 수집 및 소화, 1 차 유방 상피 세포의 격리 (MECs), 1 차 유방 골격 배양의 확립, 직렬 통과, 유방 골격 성장 매개 변수의 정량 및 결과의 해석을 포함한다. 예를 들어, 우리는 증가 자기 갱신 및 확산으로 이어지는 정상 MEC에 낮은 수준의 구성 Myc 표현의 효과를 제시한다.

정상 MEC에서 Myc 과발현은, 유방스피어 의 증가된 빈도로 유도하여 세포를 시원하게 한다. 이것은 이중 메커니즘을 통해 달성된다 : Myc는 MaSC 대칭 분열의 속도와 새로운 MaSCs로 선조 재프로그래밍의 주파수를 증가11. 낮은 구성성 Myc 발현의 효과를 테스트하기 위해, 우리는 Myc 활성이 4-하이드록시타목시펜 (4-OHT)15에의해 유도 될 수있는 Rosa26-MycER 형질 전환 마우스 모델을 사용했다. 우리는 먼저 4-OHT가없는 섬유 아세포를 제거하기 위해 초저 접착 력 6 웰 플레이트에 MEC를 도금했습니다. 첫 번째 통로 후, 우리는 두 개의 배양을 분할: 2개의 웰을 처리되지 않은 유지(control) 및 2개의 웰을 200 nM 4-OHT(MycER)로 처리하였다. 3개의 독립적인 실험에 대해 5개의 연속된 구절의 구및 세포 수를 계수하였다(표1). 통로당 누적 셀 및 구 번호는 표 2에나와 있습니다. 4-OHT를 가진 유도는 그림 1에도시된 바와 같이 증가한 구체 및 세포 성장 속도를 이끌어 냅니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60256/60256fig1a.jpg"> 그림 1: 대표적인 결과. 누적구체(A)및세포(B)성장 곡선의 제어 및 MycER 맘모스피어. 3개의 독립적인 실험의 평균 및 표준 편차가 도시된다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60256/60256fig1alarge.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td></td>
			<td colspan="3">1차 도금</td>
			<td colspan="3">2차 도금</td>
			<td colspan="3">3차 도금</td>
			<td colspan="3">제4도금</td>
			<td colspan="3">제5도금</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td></td>
			<td>셀 도금</td>
			<td>셀 수</td>
			<td>구 수</td>
			<td>셀 도금</td>
			<td>셀 수</td>
			<td>구 수</td>
			<td>셀 도금</td>
			<td>셀 수</td>
			<td>구 수</td>
			<td>셀 도금</td>
			<td>셀 수</td>
			<td>구 수</td>
			<td>셀 도금</td>
			<td>셀 수</td>
			<td>구 수</td>
		</tr><tr><td rowspan="4">폭발물 1</td>
			<td rowspan="2">컨트롤</td>
			<td>77,000</td>
			<td>50,000</td>
			<td>31</td>
			<td>65,000</td>
			<td>58,500</td>
			<td>41</td>
			<td>57,000</td>
			<td>30,000</td>
			<td>32</td>
			<td>30,000</td>
			<td>22,000</td>
			<td>5</td>
			<td>22,000</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>77,000</td>
			<td>81,000</td>
			<td>41</td>
			<td>65,000</td>
			<td>55,000</td>
			<td>23</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td rowspan="2">마이커 (미국)의</td>
			<td>77,000</td>
			<td>31,0000</td>
			<td>193</td>
			<td>80,000</td>
			<td>375,000</td>
			<td>323</td>
			<td>80,000</td>
			<td>380,000</td>
			<td>217</td>
			<td>80,000</td>
			<td>220,000</td>
			<td>223</td>
			<td>80,000</td>
			<td>170,000</td>
			<td>155</td>
		</tr><tr><td>77,000</td>
			<td>110,000</td>
			<td>142</td>
			<td>80,000</td>
			<td>505,000</td>
			<td>396</td>
			<td>80,000</td>
			<td>270,000</td>
			<td>149</td>
			<td>80,000</td>
			<td>290,000</td>
			<td>194</td>
			<td>80,000</td>
			<td>250,000</td>
			<td>160</td>
		</tr><tr><td rowspan="4">폭발물 2</td>
			<td rowspan="2">컨트롤</td>
			<td>75,000</td>
			<td>75,000</td>
			<td>71</td>
			<td>60,000</td>
			<td>17,000</td>
			<td>34</td>
			<td>28,000</td>
			<td>45,000</td>
			<td>29</td>
			<td>45,000</td>
			<td>13,000</td>
			<td>2</td>
			<td>13,000</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>75,000</td>
			<td>47,000</td>
			<td>45</td>
			<td>60,000</td>
			<td>11,000</td>
			<td>47</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td rowspan="2">마이커 (미국)의</td>
			<td>75,000</td>
			<td>200,000</td>
			<td>188</td>
			<td>80,000</td>
			<td>225,000</td>
			<td>277</td>
			<td>80,000</td>
			<td>230,000</td>
			<td>155</td>
			<td>80,000</td>
			<td>210,000</td>
			<td>211</td>
			<td>80,000</td>
			<td>100,000</td>
			<td>95</td>
		</tr><tr><td>75,000</td>
			<td>250,000</td>
			<td>192</td>
			<td>80,000</td>
			<td>202,500</td>
			<td>283</td>
			<td>80,000</td>
			<td>305,000</td>
			<td>185</td>
			<td>80,000</td>
			<td>160,000</td>
			<td>237</td>
			<td>80,000</td>
			<td>100,000</td>
			<td>133</td>
		</tr><tr><td rowspan="4">폭발물 3</td>
			<td rowspan="2">컨트롤</td>
			<td>82,500</td>
			<td>130,000</td>
			<td>121</td>
			<td>80,000</td>
			<td>45,000</td>
			<td>105</td>
			<td>80,000</td>
			<td>110,000</td>
			<td>86</td>
			<td>80,000</td>
			<td>58,500</td>
			<td>75</td>
			<td>58,500</td>
			<td>58,500</td>
			<td>78</td>
		</tr><tr><td>82,500</td>
			<td>125,000</td>
			<td>177</td>
			<td>80,000</td>
			<td>71,250</td>
			<td>42</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td rowspan="2">마이커 (미국)의</td>
			<td>82,500</td>
			<td>325,000</td>
			<td>457</td>
			<td>80,000</td>
			<td>610,000</td>
			<td>327</td>
			<td>80,000</td>
			<td>367,000</td>
			<td>309</td>
			<td>80,000</td>
			<td>500,000</td>
			<td>260</td>
			<td>80,000</td>
			<td>115,000</td>
			<td>146</td>
		</tr><tr><td>82,500</td>
			<td>475,000</td>
			<td>463</td>
			<td>80,000</td>
			<td>455,000</td>
			<td>392</td>
			<td>80,000</td>
			<td>415,000</td>
			<td>204</td>
			<td>80,000</td>
			<td>470,000</td>
			<td>295</td>
			<td>80,000</td>
			<td>185,000</td>
			<td>161</td>
		</tr></tbody></table>표 1: 계산된 구의 수와 각 구절에서 도금및 계수된 셀의 수입니다.
<img alt="Table 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60256/60256table2.jpg"> 표 2: 도금된 구번호와 누적 구및 셀 번호 계산. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60256/Table2.xlsx" target="_blank">이 표의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. (다운로드하려면 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다.)</a>

여기서, 우리는 시험관 내 유방동체재생정량분석법의 결과의 이행 및 해석을 설명한다.

The mammary gland is characterized by extensive regeneration capacity, as it goes through massive hormonal changes throughout the life cycle of a female. ...

따라서 유방 구체 배양은 암 유방암 줄기 세포 행동에서 정상의 중요한 측면을 연구하고 해부하기 쉬운 접근 하기 쉬운 운동 시스템을 제공하며, 이는 자가 갱신및 분화 능력을 포함합니다. 우리의 정량적 접근법은 다른 세포 유형과 조건을 직접 비교할 수 있도록 객관적인 방식으로 매머스피어 배양의 증가 속도의 평가를 목표로 합니다. 첫 번째 예심을 위해, 나는 소화를 피하고 각 도금 전에 정확한 세포 수를 보장하기 위하여 잠복기 시간을 엄격하게 통제하는 것을 조언할 것입니다.샤롤라이스 불과 함께 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 기술자인 에리코 델리아(Errico D'Elia)가 될 것입니다. 5에서 30, 8 에서 10 주 된 암컷 마우스의 4 개의 복부 및 하부 흉막 유방 땀샘을 수확 한 후, DPBS의 최소 부피로 100 밀리미터 페트리 접시 당 최대 20 땀샘을 배치합니다. 조직을 작은 조각으로 다진 다음 10 밀리리터의 소화 매체를 조각에 추가합니다.25 밀리리터 세로지컬 파이펫을 사용하여 조직 조각을 50 밀리리터 원내 튜브로 옮기고 파라핀 필름으로 튜브를 밀봉하십시오. 그런 다음 회전기의 조각을 0.03 X G에서 37도에서 2 1/2 시간 동안 배양하고 습도가있는 이산화탄소5 %를 배양합니다. 인큐베이션의 끝에서, 모든 파편이 P1000 파이펫 팁을 통과 할 수 있다면, 원심 분리에 의해 조직 슬러리를 퇴적시키고 신중하게 상체를 디포산한다.PBS의 3 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하고 100, 170, 140 마이크로미터 셀 스트레이너를 통해 튜브 내용을 순차적으로 새로운 원뿔 튜브로 필터링하고 각 필터 후 2 밀리리터의 신선한 DPBS로 각 여과기를 세척합니다. 펠릿은 원심분리에 의해 세포를 환원하고 나머지 DPBS에서 세포를 중단하는 상피 재를 데칭한다. 세포를 동일한 양의 염화 칼륨 분해 버퍼와 혼합하고 얼음에 적혈구를 최대 5 분 동안 리세우하십시오.인큐베이션의 끝에서, DPBS의 10 밀리리터로 용액을 체포하고 원심분리에 의해 세포를 수집합니다. 흰색 펠릿의 존재를 확인하고 계산을위한 매머 스피어 배지의 1 ~ 5 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단합니다. 그런 다음 세포를 비조직 배양처리초저접착 6개 웰 플레이트에 2 x 10의 매머스피어 배지 농도당 5번째 생존 세포에 37°C에서 7~10일 배양하고 이산화탄소 5%로 플레이트한다.7 일에서 10 일 문화의 끝에서, 세포 배양 판의 각 우물에서 1 차 적인 매머스피어를 수집하고 퇴적하여 cetrifugation에 의해 매머스피어를 수집합니다. 상체를 탈포한 후, 여과된 팁이 있는 P200 파이펫을 사용하여 매머스피어를 약 100번 피펫합니다. 단일 세포 환자의 생성은 새로운 lability를 위한 유방 구체 세포의 정확한 정량화를 위해 중요합니다.분리 의 정도를 육안으로 검사하고 필요한 경우 셀 스트레이너를 사용합니다. 다시 5~7일 배양에 대해 매우 낮은 접착 6개 웰 플레이트를 코팅한 폴리헤마에 밀리리터당 4번째 생존 셀에 2 X 10을 계산하고 플레이트 2 X 10에 신선한 매머스피어 배지의 1~5밀리리터로 분리된 유방스피어를 다시 중단한다. 그런 다음 5~7일 후에는 잘 구체 수를 계산합니다.각 통로의 끝에서, 스테레오스코프에 장착 된 디지털 카메라를 사용하여 구체를 이미지하기 위해 모든 우물의 전체 표면을 스캔합니다. 이미지를 tif 파일로 저장한 후 입체 이미지를 ImageJ로 가져오고 이미지의 배율과 이미지 유형을 8비트로 설정합니다. 이미지 스택을 복제하고 프로세스 탭에서 배경을 빼는 것을 선택합니다.라이트 배경 및 슬라이딩 포물선 옵션을 확인하고 확인을 클릭하여 스택의 모든 이미지를 처리합니다. 이미지 탭에서 조정 및 임계값을 선택하고 적용을 클릭합니다. 팝업 창이 나타납니다.기본값을 메서드 및 라이트로 선택합니다. 각 이미지 상자에 대한 계산 임계값을 확인하고 확인을 클릭합니다. 스택의 모든 이미지를 처리하려면 유역을 선택하고 예(예)를 클릭합니다. 열기를 선택하고 예(예)를 클릭하고 침식을 선택하고 예(예)를 클릭합니다.다음으로 분석 메뉴에서 입자 분석을 선택하고 최소 크기 임계값을 10, 000 마이크로미터 제곱 및 0.50~1.00 사이의 원형으로 설정합니다. 드롭다운 메뉴 에서 옵션 타원을 선택하고 요약을 확인하고 가장자리에서 제외하고 내부 표시에서 확인합니다. 그런 다음 확인을 클릭하여 스택의 모든 이미지를 처리합니다.각 통로에 대한 누적 성장 곡선을 계산하려면 도금된 셀의 수와 구체 수에 대해 잘 계산하고 각 통로의 끝에 구 크기를 계산한다. 도금구의 수를 추론하여, 이전 구절의 끝에 계산된 구 크기로 각 통로에 대해 도금된 세포의 수를 분할한다. 통로당 각 웰의 누적 셀 수와 통로당 각 웰의 누적 구 수를 계산하고 반 로고리셈치 척도로 데이터 점을 플롯합니다.그런 다음 데이터 포인트에 대한 지수 추세선을 계산하고 적합성의 장점을 측정하기 위한 결정계수를 계산합니다. 그런 다음 배변의 성장률을 추론하는 자연스러운 지수 함수로 추세선의 방정식을 묘사한다. 본 실험에서, 5개의 연속된 구절의 구및 세포 수, 3개의 독립적인 실험을 위해 결정되었다.여기서 는 통로당 누적 셀 및 구 번호가 표시됩니다. 관찰 된 Myc 활성화로, 증가 된 구체와 세포 성장 속도로 이어질. 생물학적 및 관련 시간점은 세포 수집을 위해 또는 세포 분화, 마이그레이션 및 침입을 평가하기 위해 유전자 발현 분석 또는 기타 기능적 자산을 수행하기 위해 선택될 수 있다.이는 여러 응용 프로그램을 통해 간단하고 비용 효율적인 방법입니다. 예를 들어, 암 줄기 세포 증식 및 자기 재생에 미치는 영향을 측정하기 위해 직접 발견에 사용될 수 있다.

quantification-of-self-renewal-in-murine-mammosphere-cultures

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

HC11 lactogenic 차별화는 mammospheres이라고 돔 구조의 형성에 의해 특징 수 있습니다. 구조 lactogenic 차별 quantifying에 투입 위상 콘트라스트 현미경에 의해 열거 수 있습니다.

마우스 내유 상피 세포는 Lactogenic 차별 동안 Mammospheres를 형성

이 비디오는 유방암 세포주에서 암 줄기세포를 분리하는 방법을 설명합니다. 우리는 이러한 암 줄기세포를 배양하여 자가 재생을 평가하고 구 형성 효율성을 계산하기 위한 1차 유방구를 생성하여 다양한 시딩 밀도를 비교할 수 있습니다.

1차 유방구의 생성: 세포 효능을 결정하는 기술

인간의 유방 수술 폐기 자료를 처리하는 방법이 설명되어 있습니다. organoids의 형태로 처리 조직은, 무기한 정지 또는 장기 성장 문화에 배치 저장할 수 있습니다. 이 방법은 실험 정상적인 인간 내피 세포 생물학의 심사 및 외인성 섭동의 효과를 수 있습니다.

세포 배양을위한 인간 감소 Mammoplasty과 유방 절제술의 조직의 처리

손상 조직을 사용 organoids 차 세포 배양은 다세포 생체 내 미세 환경을 모방 모델 시스템을 제공한다. 우리는 효소 조직을 중단하지 않고 형태를 차별화 혼합 세포 배양 계통 및 전시회를 영속 무 혈청 차 유방 상피 조직 배양 모델을 개발했다. 유방 organoids&gt;는 6 개월 가능한 남아있다.

비 효소, Mammospheres의 자연 발생에 대한 사전 침습 유방 병변의 혈청이없는 조직 문화

부유 유방구 분석은 현탁 상태에서 생존하고 마우스에 이식했을 때 향상된 종양 형성을 보여주는 줄기 유사 유방암 세포의 하위 집합을 조사할 수 있습니다.  이 프로토콜은 생체 내 종양 형성의 대용물인 구 형성 능력의 편리한 체외 측정을 제공하는 동시에 줄기 관련 전사 환경의 분석을 용이하게 합니다.

인간 유방암 조직과 세포주에서 Mammosphere 형성 분석

체세포 SCs의 가용성은 재생 의학에 대 한 중요 한 질병 모델링 및 사우스 캐롤라이나 속성에 대 한 통찰력을 얻을. 여기에 우리가 프로그램을 실험 전략 제시 에 체 외, 단일 transcriptional 공동 활성 야프의 과도 식으로 그들의 해당 확장 조직 관련 줄기/시 조 세포로 성인 세포 분화.

드 노 보 그렇 구나/TAZ에 의해 체세포 줄기 세포의 생성

시험관내 모델 시스템은 폐암 관련 섬유아세포(CAFs)와 3차원(3D) 공동 배양에서 폐 편평상피암(LUSC) 진행 동안 조직 건축 변화를 포착하기 위해 개발되었다. 이 오르가노이드 시스템은 종양 표현형을 조절하는 다양한 종양 세포 본질 및 외인성 변화의 역할을 조사하는 독특한 플랫폼을 제공한다.

폐 편평상피암 진행을 모델링하는 다차원 동문화 시스템

유방 동맥은 외부 근상피 및 내부 발광 상피 세포를 포함하는 이중 층 구조입니다. 제시된 것은 차동 트립시니화를 이용하여 오르가노이드를 준비하는 프로토콜이다. 이 효율적인 방법은 연구원이 별도로 유선 양식 및 기능에 있는 그들의 역할에 관하여 질문을 탐구하기 위하여 이 2개의 세포 모형을 조작하는 것을 허용합니다.

차동 시도에 의한 모자이크 유방 오르가노이드 생성

이 프로토콜은 인간 유방 세포의 변환을 평가하기 위해 실험적인 체외 도구를 제공합니다. 지하 막 매트릭스를 가진 3D 배양에서 세포 증식율, 앵커리지 독립적인 성장 능력 및 세포 혈통의 분포를 후속하는 상세한 단계가 설명되어 있습니다.

인간 유방 상피 세포에 있는 종양원성 변환의 시험관 내 평가

이 실험 프로토콜은 BCSC 표현형 및 기능을 평가하는 데 사용할 수 있는 시험 관 내 및 생체 내 분석뿐만 아니라 유방암 세포 및 조직 샘플에서 BCSC의 분리를 설명합니다.

세포 및 조직 샘플에서 인간 유방암 줄기 세포의 분리 및 기능 평가

이 프로토콜은 비종양성 유방 상피세포에서 세포자손멸증 억제제 5(Api5) 유도 암 줄기를 연구하기 위한 유방구형 형성 분석 설정 방법을 설명합니다. 1차 세대 유방구에서 채취한 용해액은 줄기세포 유사 특성의 유도를 평가하기 위해 다양한 줄기 특성 지표를 분석합니다.

유방 구상 분석법은 비종양성 유방 상피 세포주에서 API5 유도 줄기 특성을 밝혀내다

배우세요 뮤린 맘모스피어 문화에서 자체 갱신을 정량화하는 방법을. 이 기법은 유방암 줄기세포 증식 및 유전자 발현 연구에 활용될 수 있는 간단하고 비용 효율적인 도구입니다.

뮤린 맘모스피어 문화에서 자체 갱신의 정량화

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