공초점 현미경을 사용하여 크로스 킹덤 생물막에서 세포 외 pH 모니터링

이 프로토콜은 연쇄상 구균으로 구성된 크로스 킹덤 생물막의 재배를위한 수행하기 쉬운 방법을 제시한다. 뮤탄과 칸디다 알비칸스. 후속 공초점 현미경 기반 pH 비율측정은 그 생물막의 세포외 매트릭스 내부의 pH 발달의 정확한 모니터링을 허용합니다.

이미지 수집 매개 변수의 신중한 선택은 후속 분석을 위한 충분한 대비를 가진 이미지 데이터를 얻는 것이 가장 중요합니다. pH 비율측정법은 크로스 킹덤 생물막에서 수평 및 수직 pH 그라데이션을 실시간으로 연구하는 신속하고 정밀하며 저렴한 방법입니다. pH 비율 측정은 또한 순전히 곰팡이 및 세균성 생물막에서 수행 될 수있다.

이 방법은 생물막에서 미생물 대사에 대한 이해를 높이는 데 기여합니다. 생물막 성장 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 기술자 인 아네트 아크하에르 톰슨 (Anette Aakjaer Thomsen)이 될 것입니다. 호기성 조건하에서 섭씨 37도에서 혈액 천막 접시에 S.mutans와 C.albicans를 성장.

그런 다음 각 유기체의 단일 식민지를 옮겨 뇌 심장 주입의 5 밀리리터로 채워진 튜브를 테스트하고 추가로 18 시간 동안 재배합니다. 다음 날, 원심분리기는 5분간 1, 200배 g로 문화를 폐기하고 상복부을 폐기한다. 생리식염수에 세포를 다시 중단하고 C.albicans 및 S.mutans 둘 다에 대한 OD 550에서 0.5를 조정합니다.

그런 다음 S.mutans 현탁액을 1 대 10으로 희석하여 동등한 농도를 달성합니다. 피펫 50 마이크로리터의 멸균 침액용액은 현미경 검사를 위한 광학 하단 96웰 플레이트의 우물에 들어갑니다. 37°C에서 30분 동안 접시를 배양한 다음, 멸균 생리식염수 100마이크로리터로 접시를 세 번 씻고 우물을 비웁습니다.

C.albicans 서스펜션 100마이크로리터를 각 웰에 넣고, 90분 동안 섭씨 37도에서 플레이트를 배양한 다음 식염수로 잘 세 번 씻습니다. 다음으로, 각 우물에 열 비활성화 태아 소 혈청 100 마이크로 리터를 추가합니다. 접시를 2시간 동안 배양한 다음 식염수로 세 번 씻습니다.

우물을 비우지만 과도한 전단력을 피하기 위해 20 마이크로리터 저장소를 둡니다. S.mutans 서스펜션 100마이크로리터와 BHI 150마이크로리터를 각각 5%의 자당에 추가합니다. 그런 다음 24 시간 이상 섭씨 37도에서 접시를 배양합니다.

오래된 생물막을 재배할 때는 매일 매체를 교체하십시오. 크로스 킹덤 성장 단계의 끝에서, 멸균 생리식염수로 접시를 5 번 세척하십시오. 비메트릭 pH 이미징의 경우 63X 오일 또는 수분 침수 렌즈, 543 나노미터 레이저 라인 및 스펙트럼 이미징 시스템을 갖춘 반전된 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 사용하십시오.

인큐베이터를 사용하여 현미경 단계를 섭씨 35도까지 데워보겠습니다. 녹색 형광의 동시 검출을 위해 검출기를 설정 576 받는 사람의 608 나노 미터 와 적색 형광 629 받는 르 661 나노 미터. 그런 다음 적절한 레이저 전원을 선택하고 과다 노출을 피하기 위해 이득을 얻습니다.

핀홀 크기를 하나의 공기 장치 또는 약 0.8 마이크로미터의 광학 조각으로 설정합니다. 그런 다음 이미지 크기를 512x512픽셀로 설정하고 스캔 속도를 2개로 설정합니다. 평균 옵션을 사용하여 2개의 줄 평균을 선택합니다.

pH 7에 적정된 0.4%의 포도당으로 멸균 생리식염수 100마이크로리터를 준비한다. 그런 다음 C-SNARF-4의 스톡 용액을 만들고 염료를 30 마이크로몰라의 최종 농도에 추가합니다. 20 마이크로 리터 저수지를 떠나 크로스 킹덤 생물 막우물 중 하나를 비우고 포도당과 비율 염료와 식염수를 추가합니다.

현미경 단계에 접시를 놓고 이미징을 시작합니다. 섭씨 35도에서 0.2 pH 단위로 pH 4 ~ 7.8로 적정된 50 밀리머 MES 버퍼 시리즈를 준비한다. 파이펫 150 마이크로리터의 각 버퍼 용액을 광학 하단 96웰 플레이트의 우물에 넣습니다.

30 마이크로몰러의 농도에서 완충로 채워진 우물에 염료를 추가하고 5 분 동안 평형하게합니다. 현미경 단계를 섭씨 35도로 따뜻하게 하고 이전에 설명한 비율 측정 pH 이미징과 동일한 설정을 선택합니다. 현미경 단계에 96 웰 플레이트를 놓고 우물바닥에 집중하십시오.

모든 버퍼 솔루션에 대한 녹색 및 빨간색 채널 이미지를 획득합니다. 정기적으로 레이저를 끄고 이미지를 사용하여 검출기 오프셋을 보정합니다. 트리플리케이트에서 교정 실험을 수행하고 모든 이미지를 TIFF 파일로 내보냅니다.

녹색과 빨간색 이미지를 별도의 폴더에 저장하고 순차번호가 있는 두 파일 의 이름을 변경합니다. ImageJ와 같은 전용 이미지 분석 소프트웨어로 이미지를 가져옵니다. 레이저 끄기로 촬영한 이미지에서 분석 및 히스토그램을 클릭하여 평균 형광 강도를 결정합니다.

프로세스, 수학 및 빼기제거를 클릭하여 생물막 이미지에서 이 값을 뺍니다. 그런 다음 두 이미지 시리즈를 다임으로 가져오고 세그먼트, 자동 세분화 및 사용자 지정 임계값을 클릭하여 빨간색 채널 이미지의 임계값 기반 세분화를 수행합니다. 곰팡이 세포벽과 박테리아의 강도 보다 낮은 임계값을 곰팡이 세포질의 형광 강도 와 높은 임계값보다 높게 설정합니다.

그런 다음 세그먼트이미지 시리즈의 오브젝트 레이어를 세그먼트를 클릭하고 개체 레이어를 전송하여 녹색 채널 이미지 시리즈로 옮김합니다. 빨간색 및 녹색 채널 시리즈에서 개체가 아닌 픽셀을 삭제합니다. 이제 생물막 이미지는 세균 및 곰팡이 세포에서 제거되고 TIFF 파일로 내보낼 수 있습니다.

이미지 시리즈를 ImageJ로 다시 가져오고 빨간색 이미지 시리즈를 그 자체로 나눕니다. 그런 다음 원본 이미지 계열에서 결과를 곱합니다. 생성된 이미지 계열은 모든 0 강도 픽셀이 제거되는 것을 제외하고는 원본과 동일합니다.

녹색 이미지 계열로 프로세스를 반복합니다. 다음으로 두 이미지 계열의 평균 필터를 사용하여 검출기 노이즈를 보정합니다. 녹색을 빨간색 이미지 계열로 나눈 다음 모든 오브젝트 픽셀에 대한 녹색 대 빨간색 비율을 생성합니다.

24 시간 48 시간 후에 웰 플레이트에서 개발 된 견고한 크로스 킹덤 생물막. 곰팡이 최해 와 큰 세포 내 공간 주위에 그룹화 된 S.mutans의 단일 세포 및 체인은 방대한 매트릭스의 존재를 나타냈다. 세포외 공간의 pH는 조회 테이블을 사용하여 시각화되었다.

생물막의 세포 외 pH는 포도당에 노출 된 후 처음 5 분 만에 빠르게 떨어졌습니다. 그 후, 산성화는 15분 후에 일반적으로 5.5에서 5.8의 값에 도달하는 것을 둔화시켰다. 국소 pH 변화로 인해 생물막의 형광 강도는 시간이 지남에 따라 변경되었습니다.

이미지 세분화 하는 동안, 높고 낮은 임계값 적절 하 게 세균 및 곰 팡이 세포에 의해 덮여 모든 영역을 제거 하기 위해 선택 되었다. 파란색과 녹색 영역은 각각 낮고 높은 임계값에 의해 제거되었습니다. 이미지 획득 파라미터의 신중한 선택은 세균 세포, 곰팡이 세포 및 생물막 매트릭스 사이의 좋은 대비를 얻는 데 중요합니다.

크로스 킹덤 생물막이 유량 세포에서 재배되는 경우, pH 개발은 구강 내 생물을 모방하는 유동 조건하에서 모니터링될 수 있다. pH 비율 측정은 특히 낮은 pH를 가진 치과 생물막의 지역 지역을 식별하기 위하여 채택되었습니다, 소위 산성 핫스팟.