Name: 고분해능 공초점 현미경검사법에 의한 3D 종양 스페로이드 침습에 대한 Migrastatic 억제제의 특성화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-16T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: 배우세요 고분해능 공초점 현미경을 활용한 3D 종양 스페로이드에서 교종 세포 이동 억제제의 효과 평가 방법입니다. 이 기술은 암 연구에서 약물 효능을 정확히 분석하는 데 활용됩니다.

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KNS42 세포주에 기여한 크리스 존스 교수님께 감사드립니다. 이 작업에 사용되는 AiryScan을 갖춘 Zeiss LSM880 공초점 현미경은 리즈 시 지역 기업 파트너십 (LEP) 성장 거래를 통해 자금을 조달 한 허더즈필드 혁신 및 인큐베이션 프로젝트 (HIIP)의 일부입니다. 현미경 이미지에대한 신용 그림 3 : 칼 자이스 현미경 GmbH, microscopy@zeiss.com.

1. 세포 스페로이드의 생성
1일차
<ol><li>조사 중인 세포주에서 요구하는 표준 배양 배지를 준비한다.</li>
	<li>멸균 처리 기술을 사용하여 조직 배양 후드에서 모든 조직 배양 관련 단계를 수행합니다.</li>
	<li>트립시니화 하고 암 세포를 계산합니다. 플레이트당 20 mL의 셀 서스펜션을 사용하십시오. 셀 현탁액을 명확하게 라벨이 부착된 멸균 범용 튜브에 보관하십시오.</li>
	<li>각 웰에 미리 정해진 수의 셀을 추가합니다. 필요한 세포의 초기 수와 궁극적인 스페로이드 크기는 조사중인 세포강의 증식 속도에 달려 있습니다. 참고: U251 및 KNS429,10,5 x 103 세포/mL과 같은 확립된 신경교종 세포주들의 경우 4일간의 배양 후 현미경으로 보이는 스페로이드(200 또는 800 μm)를 생성합니다.</li>
	<li>세포 응집을 피하기 위해 부드러운 반전으로 범용 튜브의 세포를 다시 중단하십시오. 피펫 200 μL의 셀 현탁액을 96웰 플레이트의 각 웰내로. 모든 웰이 필요하지 않은 경우 증발을 피하기 위해 각 빈 우물에 200 μL의 1x PBS를 추가하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>37 °C에서 정상적으로 인큐베이터에서 세포를 배양합니다. 참고: 신경교종 암 세포주와 같은 세포주들은 24시간 내에 스페로이드를 형성할 것입니다. 72 시간 동안 스페로이드를 배양하여 3D 세포 아키텍처를 형성할 수 있습니다.</li>
</ol>2일차
<ol start="7"><li>24 시간 후에 밝은 필드 현미경 검사법에 의하여 세포를 검사하십시오. 세포주에 따라, 세포는 우물의 바닥에 검출 가능한 스페로이드를 형성할 수 있습니다. 참고: 확립된 신경교종 암 세포주는 24시간 이내의 스페로이드를 쉽게 형성합니다.</li>
</ol>2. 콜라겐 침공 분석
3일차
<ol><li>콜라겐, 5x 배양 배지, 1 M NaOH, 얼음 에 20 mL 튜브 1개를 놓습니다.</li>
	<li>차갑게 차가운 콜라겐 10.4 mL을 차가운 배양 튜브에 조심스럽게 천천히 넣습니다. 거품을 피하십시오. 이 양의 콜라겐은 96웰 플레이트 한 개에 충분합니다. 업 스케일링은 가능하지만 플레이트 당 20 mL 튜브 1 개를 한 번에 준비하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>1.52 mL의 차가운 멸균 5x 배양 매체를 부드럽게 첨가하십시오. 거품을 피하십시오.</li>
	<li>사용 직전에 72 μL의 차가운 멸균 1 M NaOH를 부드럽게 첨가하십시오. 얼음에 솔루션을 유지합니다.</li>
	<li>파이펫팅하여 부드럽게 섞으세요. 거품을 피하십시오. 효율적인 혼합은 배지에서 적색에서 주황색-빨간색(pH 7.4)까지의 색상 변화를 유도합니다. 혼합물을 얼음에 넣고 사용할 때까지 그대로 둡니다.</li>
	<li>결정적인 단계: 1일째에 제조된 96웰 플레이트에서 상급190 μL을 제거합니다. 우물의 바닥에 형성 된 스페로이드를 방해하지 않도록 매우주의하십시오. 파이펫을 우물의 중심이 아닌 측면을 향한 각도로 사용하십시오.</li>
	<li>콜라겐 혼합물 100 μL을 각 웰에 부드럽게 넣습니다. 어떤 spheroid 방해를 방지하기 위해, 파이펫 우물의 측면 아래로 믹스. 거품을 피하십시오. 남은 콜라겐 혼합물을 20 mL 튜브에 실온에서 보관하여 중합을 평가합니다.</li>
	<li>인큐베이터에서 적어도 10분 동안 인큐베이터 플레이트를 배양하여 콜라겐이 중합되도록 하였다. 지침으로, 남은 콜라겐이 설정된 경우, 반고체 및 스폰지 같은되고, 스페로이드는 억제제로 처리 될 준비가되어 있습니다.</li>
	<li>배양 배지에 2배 농도로 약물 또는 억제제를 첨가한다. 각 우물에 부드럽게 매체를 추가합니다 (잘 당 100 μL). 다시, 피펫 은 스페로이드 교란을 피하기 위해 우물의 측면 아래로 매체.</li>
	<li>관찰 및 시간 T = 0 시간, 24 시간, 48 시간, 및 72 시간에 밝은 필드 현미경 검사법에 의해 각 스페로이드를 관찰하고 약물 활동을 평가하기 위해. 그런 다음 접시를 인큐베이터로 되돌려 놓습니다. 참고: 세포주의 침략적 거동에 따라, 원래의 스페로이드 코어로부터의 이동은 24시간 이후부터 관찰될 수 있다.</li>
</ol>3. 공초점 현미경 검사법을 위한 콜라겐 내장된 구형 및 철새 세포의 준비
<ol><li>플레이트를 조직 배양 후드에 놓고 상판(200 μL)을 부드럽게 제거한다. 다시 말하지만, 스페로이드를 방해하지 않도록주의하고 콜라겐을 만지지 않도록주의하십시오.</li>
	<li>상급체를 1x PBS의 100 μL로 교체하십시오. 이 세척 단계를 3x 반복합니다.</li>
	<li>최종 세척을 제거하고 1x PBS (웰 당 100 μL)에서 4 % 포름 알데히드로 교체하십시오. 주의 사항: 포름알데히드는 잠재적인 발암 물질입니다. 건강 및 안전 지침에 따라 주의하십시오.</li>
	<li>실험실 벤치에 96 웰 플레이트를 놓고 호일로 덮고 실온에서 24 시간 동안 둡니다.</li>
	<li>조심스럽게 포름알데히드를 제거하고 1x PBS로 교체하십시오. 이 1x PBS 세척을 3배 반복합니다.</li>
	<li>1x PBS에서 0.1% 트리톤 X-100을 준비합니다. 1x PBS 세척을 제거하고 트리톤 X-100 용액의 100 μL로 교체하십시오. 실온에서 30 분 동안 배양하십시오. 그 동안, 1x PBS와 0.05 % 탈지 분유로 차단 용액을 준비하고 철저히 혼합하십시오.</li>
	<li>트리톤 X-100을 제거하고 1x PBS로 3x를 씻으소서. 각 웰에 100 μL의 차단 용액을 추가하고 15 분 동안 배양하십시오.</li>
	<li>소정의 농도에서 완충액 차단에 필요한 1차 항체를 희석한다. 여기서, 항마우스 IgG 아세틸화 투불린 항체(1:100)를 사용한다.</li>
	<li>원심분리기 15,682 x g에서5분 동안 1차 항체 차단 완충제 혼합. 조심스럽게 차단 용액을 제거하고 각 우물에 상급 (25−50 μL)을 추가하십시오. 1 시간 동안 실온에서 어둠 속에서 배양하십시오.</li>
	<li>항체 용액을 제거하고 1 x PBS (웰 당 100 μL)로 3 x를 씻으하십시오.</li>
	<li>임의의 추가형광 얼룩 이외에 권장 또는 소정의 농도에서 차단 완충액에서 이차 항체를 희석한다. 여기서, 1:500 항마우스 플루오로포어-488 공액항체, 팔로이드-594(1:500) 액틴 염색, 및 DNA 얼룩(DAPI)을 사용한다.</li>
	<li>다시, 13,000 rpm에서 5 분 동안 이차 항체 용액을 원심 분리.</li>
	<li>각 우물에서 차단 용액을 제거하고 보조 항체 / 판지로이드 / DAPI 혼합물의 25-50 μL을 추가하십시오. 실온에서 1.5 시간 동안 어둠 속에서 배양하십시오.</li>
	<li>이차 항체 염료 용액을 제거하고 1 x PBS (잘 당 100 μL)로 3 x씻어.</li>
	<li>플라스틱 파이펫(200 μL)으로 흡입하여 개별 콜라겐 플러그를 고품질 일반 유리 슬라이드의 중앙에 조심스럽게 들어 올립니다.</li>
	<li>콜라겐 플러그에 적합한 마운트를 한 방울 추가하여 플러그가 완전히 덮여 있는지 확인합니다. 거품을 피하십시오.</li>
	<li>이미징에 사용될 현미경 목표에 대한 최적의 두께의 커버슬립을 적용하고 하룻밤 사이에 설정할 수 있습니다. 슬라이드를 어두운 실내 온도에서 보관하십시오.</li>
</ol>4. 형광 현미경 검사법
<ol><li>적절한 공초점 현미경을 사용하여 형광등 이미지를 캡처합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

고분해능 공초점 현미경을 사용하여 경화약 활성을 식별하기 위한 암세포 스페로이드를 만드는 새로운 방법이 기술되어 있다. 매달려 방울(15)과같은 다른 기술에 낮은 부착 플레이트의 사용은 콜라겐 이동 및 침략 검정에 사용하기 위해 재현 가능하고 균일 한 스페로이드를 생성하는 수단을 용이하게하고있다. 이 프로토콜의 중요한 점은 콜라겐 매트릭스에 세포 스페로이드가 포함되기 전에 96 웰 플레이트로부터 성장 배지를 제거하고 그 후 스페로이드를 함유하는 콜라겐 플러그를 주의 깊게 취급하는 것이다. 디지털 미세 유체 공학16과 같은 새로운 기술을 사용할 수 있으며, 더 비싸지 만 미디어 및 유체의 수동 제거에 대한 대안을 제공 할 수 있습니다. 기술된 프로토콜의 주요 한계는 억제제 약물 활성을 평가하기 위해 단일 스페로이드를 이미지화한 다음 밝은 필드 현미경검사법에 의해 수동으로 분석할 때 시간이 많이 걸린다는 것입니다. 또한, 공정의 모든 단계에 필요한...

전임상 신약 발견 및 잠재적인 항암제 개발을 위한 3차원 스페로이드 기술이 기존의 약물 스크린보다 점점 더 선호되고 있다; 따라서, migrastatic의 더 많은 개발이있다 ―이주 및 침략 방지 - 마약. 암 치료에 있는 이 발달의 뒤에 근거는 분명합니다: 3D spheroid 어설아지는 세포 단층 배양 보다는 더 충실하게 3D 종양 건축을 모방하기 때문에 잠재적인 항암약을 검열을 위한 보다 현실적인 접근을 나타냅니다, 약물-종양 상호 작용(역학)을 보다 정확하게 재구성하고 종양 관련 설정에서 약물 활성의 특성화를 허용한다. 또한, 많은 암 유형에서 화학 독성 약물에 대한 내성의 증가와 암 세포가 먼 종양 부위로 이동하는 능력에 의해 전이에 의한 높은 사망률은 화학 요법 제의 포함을 뒷받침합니다. 향후 임상시험에서 보조치료제로 암세포의 철새전위를 표적으로1. 이것은 고도로 침략적인 암에 있는, 고급 교모세포종 (GBM)와 같은 경우에 특히 입니다. GBM 관리에는 수술, 방사선 요법 및 화학요법이 포함됩니다. 그러나, 조합 처리로조차, 대부분의 환자는 11-15 달의중간 생존을 가진 초기 진단의 1 년 안에 재발2,3. 3D 기술 분야의 거대한 발전은 지난 몇 년 동안 이루어졌다 : 회전 시스템, 미세 제작 구조 및 3D 스캐폴드, 및 기타 개별 실험은 지속적으로 대규모4에서일상적인 테스트를 허용하기 위해 개선되고있다4 , 5,6,7. 그러나 이러한 분석에서 얻은 결과는 2D 이미지 분석 시스템으로 3D 생성 데이터를 분석하려는 시도로 인해 데이터 해석이 종종 방해되기 때문에 의미 있는 방식으로 분석되어야 합니다.
이미지 수집 속도와 광 독성 감소 측면에서 바람직함에도 불구하고 대부분의 광시야 시스템은 해상도8에의해 제한됩니다. 따라서, 약물 효능과 관련된 데이터 판독과는 별개로, 광시야 시스템을 사용하여 이미지화하면 이동 세포의 3D 세포 구조에 대한 약물 작용의 상세한 효과는 필연적으로 손실됩니다. 반대로 공초점 레이저 스캐닝 현미경(CLSM)은 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 3D 후 수집으로 재구성및 렌더링할 수 있는 고품질의 광학 섹션 이미지를 캡처합니다. 따라서 CLSM은 복잡한 3D 세포 구조에 쉽게 적용가능하여 3D 구조에 대한 항미정 억제제의 영향과 세포 이동 메커니즘의 심층 분석을 가능하게 합니다. 이것은 의심 할 여지없이 미래의 신경질성 약물 개발을 안내 할 것입니다. 여기서, 고분해능 공초점 현미경에 의한 스페로이드 생성, 약물 치료, 염색 프로토콜 및 특성화의 결합된 워크플로우가 설명된다.

<table><tbody><tr><td>콜라겐 I, 쥐 꼬리,</td> 신경교종 침입 분석을 위한 100mg <td>Corning</td><td>354236</td><td>; 이는 많은 유통업체/제조업체에서 제공하며 의도한 분석 유형과 사용된 세포주 모두에 대해 결정해야 합니다. 신경교종 암 세포주의 경우 콜라겐 쥐꼬리 유형 1(예: Corning)이 선호되는 선택입니다. 콜라겐은 4 &deg에서 보관해야 합니다. C, 어둠 속에서, 필요할 때까지. 다른 배치의 콜라겐을 혼합하는 것은 중합된 콜라겐의 일관성에 영향을 줄 수 있으므로 바람직하지 않습니다. &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Coverslips,</td><td></td><td>현미경 검사, 화상 진찰을 위해</td><td></td></tr><tr><td>각종 각종 DMEM 분말</td><td>, 시그마</td><td>D5648</td>, <td>신경교종 침입 분석을 위한 교원질 해결책을 위한 5x 농도에 필요한; &nbsp; 이것은 이중 증류수로 구성된 분말 형태로 구입할 수 있으며 성장 매체의 최종 구성에 따라 필요한 첨가제로 완성 할 수 있습니다. 완전한 5x 용액은 주사기 필터 시스템(0.22 &mu; m) 사용하기 전에.</td></tr><tr><td>태아 송아지 혈청</td><td>Sigma</td><td>F7524-500ML</td><td>신경교종 세포주의 세포 배양에 필요</td></tr><tr><td>유리 슬라이드</td><td>현미경 이미징에</td><td></td><td>다양한</td></tr> 고<tr><td>포도당 DMEM</td><td>Gibco</td><td>41965062</td><td>신경교종 세포주의 세포 배양에 필요</td></tr><tr><td>억제제</td><td>Tocris</td><td>다양한</td><td>다양 한 - 실험 설계에 따라; 억제제는 Selleckchem 및 Tocris와 같은 제조업체에서 구입할 수 있습니다. 이러한 제조업체는 억제제 특성에 대한 자세한 설명, 관련 참고 문헌에 대한 링크 및 작업 농도에 대한 제안을 제공합니다. 모든 억제제와 마찬가지로 잠재적으로 독성이 있을 수 있으므로 건강 및 안전 지침에 따라 취급해야 합니다. 억제제는 제조업체가 권장하는 원액으로 제조됩니다. 예를 들어, 우리는 이러한 억제제의 사용을 입증하기 위해 migrastatic 억제제 MI-192를 사용했습니다. 우리는 이러한 방식으로 다양한 편이중력 억제제를 테스트했으며 유사한 결과를 얻었습니다.</td></tr><tr><td>현미경 이미징을 위한</td><td>다양한</td><td></td> <td>Mountant</td></tr><tr><td>NaOH (1 M)</td><td>다양한&nbsp;</td><td>다양한</td><td>NaOH는 필요한 몰 농도에서 구입하거나 고체 형태로 제조 할 수 있습니다. 준비된 용액은 주사기 필터 시스템을 사용하여 필터 멸균해야 합니다. One M NaOH는 부식성이 있으므로 용액 준비 중에 주의해야 합니다.</td></tr><tr><td>파라포름알데히드&nbsp;</td><td>스페로이드와 세포를 고정하기 위한 다양한 종류; 4%로 구성하며, 건강 위험을 주의하고, 침습 분석을 위한 콜라겐 용액에 대한 건강 및 안전 규정이 준수되도록 보장합니다</td><td></td><td></td></tr>. <tr><td>Pastettes (졸업 피펫, 3 mL)</td><td>는 침입 분석, 용액 제거</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>PBS, 조직 배양을 위한 sterile</td>을 위해 다양하게 사용됩니다. <td>Sigma</td><td>D1408-500ML&nbsp; &nbsp;</td><td>신경교종 세포주의 세포 배양에 필요 및 염색을 위한 세척</td></tr><tr><td>Pen/strep (항생제)</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td>신경교종 세포주의 세포 배양에 필요</td></tr><tr><td>1차 항체, 2차 항체, DAPI, Phalloidin</td><td>등</td><td>다양한</td><td>시약을 제조하고 있으며, 2차 표지 항체의 경우 Alexa Fluor(Molecular Probes)를 권장합니다. 여기에서는 1차 항체에 대해 마우스 항아세틸화 튜불린 항체(1/100, Abcam)를 사용했습니다. 2차 항체의 경우 1/500 anti-mouse Alexa Fluor 488 복합 항체인 Molecular Probes를 사용했습니다. 핵 염색의 경우 DAPI(많은 제조업체)와 액틴 염색 Phalloidin(많은 제조업체)을 사용했으며, 둘 다 1/500의 권장 희석으로 사용되었습니다.</td></tr><tr><td>중탄산나트륨</td><td>Sigma</td><td>S5761</td>은 <td>5배 농도의 신경교종 침습 분석을 위한 콜라겐 용액에 필요</td></tr><tr><td>피루브산 나트륨</td><td>Sigma</td><td>P5280</td>은 <td>5배 농도의 신경교종 침습 분석을 위한 콜라겐 용액에 필요</td></tr><tr>트립<td>신</td><td>Sigma</td><td>T4049</td><td>초</td></tr><tr><td>저 부착 플레이트</td><td>Sigma/Nunc</td><td>CLS7007-24EA</td><td>신경교종 침입 분석용; 낮은 접착성 플레이트가 필요하며, 조사 중인 화합물의 대규모 스크리닝을 허용하기 위해 96웰 플레이트가 선호됩니다. 상업적으로 이용 가능한 몇 가지 낮은 접착 플레이트가 있습니다. 최적의 스페로이드 생성을 위해 다양한 플레이트를 테스트하는 것이 좋습니다. 우리의 경험에 따르면 뚜껑이 있고 바닥이 둥근 Costar Ultra Low Cluster는 100% 스페로이드 형성 및 재현성 측면에서 신경교종 암세포에서 스페로이드 생성에 가장 적합합니다. 이 플레이트는 또한 우리 실험실에서 환자 유래 물질, 방광 및 난소암 세포에서 신경교종 스페로이드를 생성하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 또한, 줄기 또는 전구 신경구는 표준화 된 신경 구체 - 스페로이드</td></tr><tr><td>스트라이프 (혈청 학적 피펫, 멸균, 5 mL 및 10 mL)</td>의 생성을 촉진하기 위해 이러한 플레이트에 사용될 수 있습니다 <td>(예 : Costar</td><td>CLS4488-50; 조직</td><td>배양 및 콜라겐 준비를 위한</td>CLS4487-50</tr><tr><td>다양한 다중 채널(50 - 250 &mu; L) 및 싱글채널 피펫(10 &mu; L, 50 &mu; L, 200 &뮤; L 1 mL)</td><td></td> <td>세포 및 스페로이드 처리를 위한</td> <td>다양한</td></tr><tr><td>와이드필드 현미경 다양</td><td>한&nbsp;</td><td></td><td>스페로이드 생성 및 스페로이드 이미징 관찰을 위해 다양함; 여기서는 EVOS FL 세포 이미징 시스템(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 광시야 형광 이미지를 캡처했습니다</td></tr>. Plan <tr><td>Apochromat 63x 1.4 NA 오일 대물렌즈가 장착된 Zeiss LSM 880 CLSM</td><td></td><td>컨</td><td>포칼 이미지는 Plan Apochromat 63x 1.4 NA 오일 대물렌즈가 장착된 Zeiss LSM 880 CLSM을 사용하여 캡처했습니다. 다이오드 405nm, 458/488/514nm 아르곤 멀티라인 및 HeNe 594nm 레이저를 사용하여 각각 Phalloidin 594, Alexa Fluor 488 및 DAPI를 여기시켰습니다. 각 이미지에 대해 하나의 대표적인 광학 섹션이 캡처되었으며, 사전 및 사후 이미지 캡처의 모든 설정은 비교 목적으로 유지되었습니다. 모든 이미지는 관련 Zen 이미징 소프트웨어 및 Adobe Photoshop을 사용하여 이후에 처리되었습니다.</td></tr></tbody></table>

고분해능 공초점 현미경검사법에 의한 3d 종양 스페로이드 침습에 대한 migrastatic 억제제의 특성화

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

암 연구의 약물 발견 및 개발은 점점 더 3D 형식으로 약물 스크린을 기반으로하고 있습니다. 암세포의 철새 및 침습적 잠재력을 표적으로 하는 새로운 억제제, 그리고 결과적으로 질병의 전이성 퍼짐은, gliomas와 같은 고침성 암에 있는 상보적인 처리로 발견되고 고려되고 있습니다. 따라서, 약물을 첨가한 후 3D 환경에서 세포의 상세한 분석을 가능하게 하는 데이터를 생성하는 것이 요구된다. 여기서 설명한 방법론은 공초점 레이저 스캐닝 현미경(CLSM)에 의한 고해상도 이미지 캡처 및 데이터 분석과 스페로이드 침입 분석법을 결합하여 잠재적인 항철 억제제의 효과에 대한 상세한 특성 분석을 가능하게 했습니다. 신경교종 세포에 MI-192. 스페로이드는 낮은 부착 성 96 웰 플레이트에서 침략 분석세포주에서 생성된 다음 CLSM 분석을 위해 제조하였다. 설명된 워크플로우는 용이성과 재현성 모두로 인해 일반적으로 사용되는 다른 스페로이드 생성 기술보다 선호되었습니다. 이는 기존의 광시야 접근법에 비해 공초점 현미경 검사법에 의해 달성된 향상된 이미지 해상도와 결합하여 3D 환경에서 철새 세포의 뚜렷한 형태학적 변화를 식별하고 분석할 수 있었습니다. mi-192 의 제과약물로 치료할 수 있습니다.

3차원 스페로이드 기술은 암 특이적 환경을 보다 대표하기 때문에 약물-종양 상호작용에 대한 이해를 증진시키고 있다. 스페로이드의 생성은 여러 가지 방법으로 달성 될 수있다; 낮은 준수 96 웰 플레이트는이 프로토콜에 사용되었다. 다른 제조업체의 여러 제품을 테스트 한 후, 여기에서 사용되는 플레이트는 성공적인 스페로이드 생산 및 균일성 측면에서 일관되게 최고의 성과를 보였기 때문에 선택되었습니다. 성장 배지가 콜라겐 매트릭스로 대체되는 대체 단계는 프로토콜의 중요한 점입니다. 세심한주의는 스페로이드 자체를 방해하지 않고 매체의 대부분을 제거하기 위해 주의해야합니다. 광시야 현미경 검사법에 의한 약물 유발 효과의 특성화를 위한 자동 이미징은 처리기 편향을 제거하는 것으로 간주될 수 있지만, 현재 시판되는 기기는 이미징 접근법보다 상당히 더 비쌉처리됩니다. 여기에 설명되어 있습니다.
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신경교종 암 세포 이동에 대한 신경교암 억제제의 효과는 히스톤 탈아세틸라제(HDAC) 억제제를 이용한 3차원(3D) 침입 분석에 대한 고해상도 공초점 현미경검사법을 특징으로 한다.

고분해능 공초점 현미경검사법에 의한 3D 종양 스페로이드 침습에 대한 Migrastatic 억제제의 특성화

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

이 프로토콜은 우리가 지금 3D 암 모형에서 상세히 migrastatic 억제제의 효력을 결정할 수 있다는 것을 보여주고 있습니다. 주요 장점은이 기술을 수행 할 수있는 용이성과 올인원 접근 방식입니다. 이 기술은 3D 조정에 있는 암 연구에서 미그레정성 약의 평가를 허용하고, 더 종양 환경 관련 조정에 있는 약의 시험을 허용합니다.이 방법은 암에 있는 세포독성 약의 시험에 적용될 수 있고, 예를 들면, 암 증식 및 세포 이동에 방사선의 효력을 평가하기 위하여. 중간 제거 단계와 콜라겐 교체를 일반 96웰 플레이트로 연습하여 자신감이 되는 것이 유용합니다. 또한, 공초점 현미경에 대한 교육은 필수적입니다.이 기술의 시각적 데모는 연구원이 구체형의 필수 섬세한 취급과 공초점 현미경 검사법에서의 사용을 이해하는 데 중요합니다. 실험 첫날에는 표준 배양 배지가 있으며, 이 경우 U251은 적절한 세포주에 대비한다. 조직 배양 후드에서, 암세포를 트립시니화하기 위해 배양에 트립신의 0.5 밀리리터를 추가합니다.혈종계에 암세포를 계산하고 밀리리터 당 세 번째 세포에 5 배 10의 농도로 희석. 세포 현탁액을 명확하게 표지된 멸균 범용 튜브에 보관하십시오. 세포 응집을 피하기 위해 부드러운 반전으로 세포를 다시 중단합니다.파이펫을 사용하여 96웰 플레이트의 각 웰에 세포 배양의 200 마이크로리터를 추가합니다. 증발을 피하기 위해 빈 웰에 1X PBS200 마이크로리터를 추가합니다. 섭씨 37도에서 인큐베이터에서 세포를 배양합니다.24 시간 후에, 밝은 필드 현미경 검사법에 의해 세포를 확인하십시오. 신경교종 암 세포주와 같은 세포주들은 24시간 이내에 우물 의 바닥에 있는 스페로이드를 형성한다. 3D 셀룰러 아키텍처가 형성되도록 48시간 동안 스페로이드를 배양합니다.셋째 날에는 콜라겐, 5X 배양 배지, 수산화 나트륨 1개, 얼음 위에 20밀리리터 튜브 1개를 배치합니다. 차가운 컬러젠 10.4 밀리리터를 차갑게 식힌 배양 튜브에 조심스럽게 천천히 넣습니다. 거품을 피하십시오.그런 다음, 냉멸 균 5X 배양 배지의 1.52 밀리리터를 부드럽게 추가합니다. 거품을 피하십시오. 사용하기 직전에 72마이크로리터의 냉멸 살균 원 어금니 나트륨 수산화나트륨을 부드럽게 추가하고 얼음에 용액을 보관하십시오.피펫팅과 거품을 피하여 부드럽게 섞습니다. 효율적인 혼합은 중간 크기의 빨간색에서 주황색-빨간색으로 색상 변화를 유도합니다. 사용이 될 때까지 혼합물을 얼음위에 둡니다.다음으로, 첫날에 준비된 96웰 플레이트에서 190마이크로리터의 초판을 제거하려면, 파이펫을 웰의 측면을 향해 비스듬히 사용한다. 우물의 바닥에 형성 된 스페로이드를 방해하지 않도록주의하십시오. 콜라겐 믹스 100마이크로리터를 각 웰에 부드럽게 추가하여 우물의 측면을 피펫으로 바릅니다.거품과 스페로이드 방해를 피하십시오. 20 밀리리터 튜브에 남은 콜라겐 믹스를 실온에서 유지하여 중합을 평가합니다. 콜라겐이 중합할 수 있도록 적어도 10분 동안 인큐베이터에서 플레이트를 배양한다.남은 콜라겐이 반고체및 스폰지같이 되면 스페로이드는 억제제로 치료할 준비가 되어 있습니다. 배양 배지의 5밀리리터에 2X 농도의 억제제를 추가합니다. 스페펫 100 마이크로리터의 배지는 스페로이드 교란을 피하기 위해 각 우물의 측면을 부드럽게 아래로 내려.관찰 및 약물 활동을 평가하기 위해 0 시간, 24 시간, 48 시간 및 72 시간의 시간에 밝은 필드 현미경 검사법에 의해 각 스페로이드를 이미지. 그런 다음 접시를 인큐베이터로 되돌려 놓습니다. 이제 접시를 조직 배양 후드에 놓고 상판을 1X PBS의 100 마이크로리터로 부드럽게 교체하십시오.스페로이드를 방해하지 말고 콜라겐을 만지지 않도록 주의하십시오. 이 워시 단계를 3번 더 반복하십시오. 각 우물의 최종 세척을 제거하고 1X PBS에서 4 %의 포름 알데히드의 100 마이크로 리터로 대체하십시오.96웰 플레이트를 실험실 벤치에 놓고 호일로 덮고 실온에서 24시간 동안 둡니다. 다음 날, 포름알데히드를 조심스럽게 제거하고 1X PBS로 교체하십시오. 이 세척을 세 번 더 반복합니다.그런 다음 1X PBS 워시를 갓 준비한 Triton X-100 용액 100 마이크로리터로 교체하십시오. 실온에서 30분 동안 배양하세요. 한편, 블로킹 용액은 1X PBS 50 밀리리터와 05%의 탈지 된 분유로 50 밀리리터 튜브에 준비하여 철저히 섞습니다.30분 후 트리톤 X-100을 제거하고 1X PBS로 세 번 세척합니다. 블로킹 솔루션 100마이크로리터를 각 웰에 추가하고 15분 동안 배양합니다. 다음으로, 1 대 100의 비율로 차단 완충제에서 항 마우스 IgG 아세틸화 튜룰린 항체를 희석한다.원심분리기 1차 항체 차단 버퍼 믹스는 15, 682g에서 5분 동안 혼합한다. 각 웰의 차단 용액을 조심스럽게 제거하고 튜브에서 완충제 슈퍼상극을 차단하는 항체 차단의 25~50마이크로리터를 추가합니다. 실온에서 1 시간 동안 어둠 속에서 배양하십시오.이어서, 항체 용액을 각 웰에서 제거하고 1X PBS의 100 마이크로리터로 세 번 세척한다. 추가형 얼룩 이외에 권장 농도에서 차단 버퍼에 이차 항체를 희석시. 다시, 원심 분리는 15, 682 g에서 5 분 동안 이차 항체 용액을 원심 분리합니다.각 우물에서 차단 용액을 제거하고 이차 항체 상체의 25 ~50 마이크로 리터를 추가합니다. 실온에서 1 1/2 시간 동안 어둠 속에서 배양하십시오. 이차 항체 염료 용액을 제거하고 1X PBS, 100 마이크로리터로 세 번 세척하십시오.개별 콜라겐 플러그를 플라스틱 200 마이크로리터 파이펫으로 흡입하여 유리 슬라이드의 중앙에 조심스럽게 들어올립니다. 콜라겐 플러그를 덮기 위해 적합한 마운트젠 1방울을 추가합니다. 샘플 위에 커버슬립을 배치하고 어두운 실온에서 슬라이드를 보관합니다.3차원 스페로이드 기술은 암 특이적 환경을 보다 대표하기 때문에 약물-종양 상호 작용에 대한 이해를 증진시키고 있다. 이 연구에서는 잠재적인 항철기 또는 프로 철새 효과가 발견되었습니다. 이것은 제어 또는 처리된 스페로이드에 있는 겉보기 마이그레이션이 없는 KNS42에서 특히 두드러지습니다.세포사멸은 10마이크로몰러의 가장 높은 억제제 농도에서 관찰되었다. U251 세포에서 핵 분열과 이동 세포가 분명하게 드러났습니다. U251 세포 스페로이드는 원래 스페로이드에서 멀리 방출 스파이크를했다, 증가 억제제 농도와 명백한 세포반올림 증가와.KNS42에서 붕괴된 소소와 핵 분열이 관찰되었다. 단일 셀 스파이크가 있는 시트 모양의 돌출은 KNS42 마이그레이션을 나타냅니다. 가장 낮은 억제제 농도에서, 이 표현형은 발음되었지만 억제제 농도가 증가함에 따라 손실되었다.준비될 때까지 모든 시약을 얼음 위에 두는 것이 중요합니다. 그렇지 않으면, 콜라겐은 모두 스페로이드에 추가되기 전에 중합을 시작합니다. 예를 들어, 세포 형태에 대한 미정 약물의 효과를 평가하기 위해 공초점 현미경 검사법에 의해 생성된 이미지를 정량화하는 범위가 있다.그것은 우리가, 처음으로, 미세 투하 염 분화 수준에 migrastatic 억제제 MI-192의 효력을 확인하고 세포 이동의 관점에서 이것을 더 탐구하는 것을 허용했습니다. 고정 단계를 위해 포름알데히드를 다룰 때는 각별한 주의를 기울여야 합니다. 일반적인 건강 및 안전 지침이 적용됩니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

양적 성장 인자 (TGF) - β - 유도 3 차원 콜라겐 젤의 침공을 변형 측정하는 분석이 설명되어 있습니다. 이 분석은 유방암 개발의 다른 단계를 나타내는 세포 라인의 MCF10A 시리즈의 활용합니다. 이 방법은 다른 세포 라인과 함께 사용하는 다른 가능성 activators 또는 침해의 억제제를 조사하기 위해 사용될 수 채택 수 있습니다.

TGF - β - 유발 침략을 측정하는 회전 타원체 분석

입체 세포외 매트릭스에 종양 세포 침공의 모델이 더...

모델링 및 3 차원 이미징 단체 셀 침략

출처: Guyon, J., et al. 교모세포종에 대한 3D 스페로이드 모델. J. Vis. Exp. (2020)이 비디오는 종양 세포 침입의 3차원 스페로이드 모델의 생성을 보여줍니다. 스페로이드는 인간의 뇌종양 세포에서 형성되며 콜라겐 매트릭스에 내장되어 있습니다. 스페로이드 말초의 종양 세포는 침습적 표현형을 채택하여 프로테아제를 분비하여 콜라겐을 분해하고 전진하여 주변 기질을 침범합니다.

종양세포 침입의 3차원 스페로이드 모델 생성

주변 정상 조직의 침입은 악성 종양을 정의하는 특징입니다. 우리는 여기에서 여러 진행성 인간 암 모델로 예시된 자연 3D 바이오매트릭스로의 침입에 대한 간단한 반자동 마이크로 플레이트 분석을 제공합니다.

3 차원 (3D) 종양 회전 타원체 침공 분석

이 방법은 스페로이드에서 주변 3D 매트릭스로의 암세포 침입을 평가합니다.  스페로이드는 행잉 드롭 배양 방법을 통해 생성된 다음 기저막 재료와 I형 콜라겐으로 구성된 매트릭스에 내장됩니다.  이후에 스페로이드 외부로의 침입이 모니터링됩니다.

암 세포 회전 타원체 분석은 3D 설정에 침략을 평가하기 위해

이 프로토콜의 목표 3 차원 섬유 소 매트릭스 내에서 셀 마이그레이션에 프로 및 안티 migratory 요인의 효과 평가 하는 것입니다.

환경 상처 3 차원 생체 외에서 내 셀 마이그레이션 특성화

방광 암 침공을 관리 하는 프로세스는 바이오 마커 및 치료 개발을 위한 기회를 나타냅니다. 여기 우리는 종양 spheroids 시간 경과 화상 진 찰, confocal 현미경 검사 법의 3 차원 문화를 통합 하는 방광 암 침공 모델 제시. 이 기술은 침략 과정의 기능을 정의 하 고 치료제 심사에 대 한 유용 합니다.

침공을 공부 하 고 방광 암에서 치료제를 평가 하기 위한 3 차원 셀 문화 시스템

종양 미세 환경은 암 성장과 침략의 필수적인 부분입니다. 암의 진행을 모방 하기 위해 생물학적으로 관련 된 인간 매트릭스가 필요 합니다. 이 프로토콜은 인간 평활 근 종 기반 매트릭스를 적용 하 여 시험관 내 3 차원 세 포스 페 로이드 침입 검정에 대 한 개선을 도입 한다. 이 프로토콜은 또한 컴퓨터 기반 세포 침입 분석을 소개 합니다.

3 차원 세 포스 페 로이드 침입 분석에서 완전 한 인간 종양 기반 매트릭스

이 프로토콜의 목표는 면역 형광, 전사와 같은 다른 분석 시스템에서 해결 될 수있는 종양 벌크와 같은 환경에서 암 관련 섬유 아세포 (CAFs)의 분화를 연구하는 3D 체외 모델을 확립하는 것입니다. 분석 및 생명 세포 화상 진찰.

3D 스페로이드 모델은 시험관 내 암 관련 섬유아세포 분화 및 침입을 위한 보다 생리적 시스템으로

여기에서는 교모세포종에 대한 사용하기 쉬운 침략 분석방법을 설명합니다. 이 분석은 교모세포종 줄기 와 같은 세포에 적합합니다. 침략, 마이그레이션 및 확산의 쉬운 정량화를 위한 피지 매크로도 설명되어 있습니다.

교모세포종을 위한 3D 스페로이드 모형

여기에 제시된 스페로이드 이미징 장치의 제조를 위한 프로토콜이 있습니다. 이 장치는 암 세포 스페로이드의 동적 또는 세로 형광 이미징을 가능하게합니다. 이 프로토콜은 또한 암세포 침입의 분석을 위한 간단한 화상 처리 절차를 제공합니다.

3D 스페로이드 모델에서 암세포 침입의 시간 해결 형광 화상 진찰 및 분석

배우세요 고분해능 공초점 현미경을 활용한 3D 종양 스페로이드에서 교종 세포 이동 억제제의 효과 평가 방법입니다. 이 기술은 암 연구에서 약물 효능을 정확히 분석하는 데 활용됩니다.

고분해능 공초점 현미경검사법에 의한 3D 종양 스페로이드 침습에 대한 Migrastatic 억제제의 특성화

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