시투 혼성화에서 형광을 사용하여 뮤린 위장에서 칸디다 알비칸스의 시각화

이 프로토콜은 칸디다 알비칸스가 포유류 위장관에 어떻게 살고 있는지에 대한 우리가 지금까지 가지고있는 최고의 통찰력의 일부를 산출했다. 예를 들어, 최근까지, 우리는 칸디다가 창자 내에서 지역화되는 곳이나 이 틈새 시장 내에서 가정하는 많은 형태 학적 형태 중 어느 것을 정말로 알지 못했습니다. 이 기술의 주요 장점은 곰팡이가 숙주 구조 또는 미생물의 박테리아와 함께 하는 3차원 상호 작용을 방해하지 않고 자연 환경 내에서 칸디다를 시각화할 수 있다는 것입니다.

창자는 복잡한 환경이기 때문에 실험실에서 모델링하기가 매우 어렵기 때문에 호스트 모델에서 칸디다 생물학을 직접 조사 할 수있는 방법을 찾는 것이 매우 만족스러웠습니다. 칸디다 알비칸스를 포함한 장내 미생물의 특정 성분은 염증성 장 질환과 같은 질병에서 역할을 하는 것으로 의심된다. 이 기술은 잠재적으로 환자에게서 얻은 생검 견본에 있는 특정 미생물의 존재를 진단하기 위하여 이용될 수 있습니다.

개비지 기술의 숙달과 장기를 찢어하지 않고 위장 세그먼트를 해부하는 능력은 최적의 결과를 얻는 데 중요합니다. 시작하려면 각 동물을 지정된 접종의 계산된 부피를 가리게 합니다. 1 밀리리터 주사기에 자동 동물 먹이 바늘을 부착하고 모든 거품을 제거하는 하나의 gavage 볼륨으로 주사기를 채웁니다.

멸균 표면에 주사기를 놓습니다. 동물을 고정하려면 지배적 인 손으로 꼬리 의 바닥에 잡고 귀 바로 뒤에 느슨한 피부에 동물의 뒷면을 밀어. 엄지와 집게 손가락으로 스크러프를 단단히 모으면 됩니다.

동물을 스크러프에 집어 들고 뒤집고 꼬리 주위에 같은 손의 작은 손가락을 반복하여 동물의 손바닥에 고정시하십시오. 동물의 머리를 부드럽게 확장하여 몸과 직선으로 감습니다. 그런 다음 지배적 인 손으로 주사기를 집어 들고 곡선 바늘이 아래로 가리키는 동물에게 수직으로 잡습니다.

바늘의 공을 사용하여 입 안구석을 부드럽게 연결하고 입 의 측면을 따라 바늘을 목 뒤쪽으로 진급한 다음 바늘을 중앙으로 옮습니다. 바늘의 공이 동물의 목 뒤쪽에 있으면 바늘을 기울여 동물의 신체 선과 평행하게 목을 부드럽게 미끄러질 수 있습니다. 바늘이 목구멍 아래로 매끄럽게 미끄러지지 않으면 바늘이 제대로 배치되지 않을 수 있으며 재배치하고 다시 시도하려면 철회해야합니다.

바늘을 부드럽게 진행하여 동물이 바늘을 삼키는 것은 몇 밀리미터만 보일 때까지 유지됩니다. 바늘의 공이 플런저를 부드럽게 전진시켜 위장에 있고 저항이 없는 경우, 계속해서 접종을 전달한다는 것을 테스트합니다. 접종이 투여되면 천천히 바늘을 철회하고 동물을 케이지에 놓습니다.

5~10분 동안 동물을 계속 모니터링하여 호흡이나 요난의 징후를 보이고, 동물이 있는 직후 정상적인 활동을 재개했는지 확인합니다. 다음 동물에게 동일한 접종을 하면 알코올 닦아바늘을 청소하십시오. 다른 접종을 사용하는 경우 바늘을 교체하십시오.

무딘 단면포를 사용하여 복부 피부의 한 부분을 꼬집고 가위를 사용하여 골반 의 바닥 근처에 피부와 기본 근막을 절개하십시오. 복막 구멍의 각 측면을 따라 흉곽까지 U 자수를 확장한 다음 피부의 길을 들어 올립니다. 무딘 단면의 집게를 사용하여 가위를 사용하여 복막 구멍에서 cecum을 부드럽게 추출하여 cecum과 소장 사이의 연결을 분리하십시오.

전체 cecum을 작단간 카세트에 넣고 왜곡되지 않고 평평하게 놓습니다. 두 번째 폼 패드를 위에 놓고 카세트를 닫습니다. 그런 다음 카세트를 메타칸이 들어 있는 나사 캡 항아리에 넣습니다.

1 ~ 2 개의 배설물 펠릿을 포함하고 카세트보다 길이가 적은 대장의 섹션을 소비합니다. 조직을 카세트에 넣고 평평하고 왜곡되지 않은 상태로 유지합니다. 두 번째 폼 패드로 오버레이카세트를 닫고 메타칸에 넣습니다.

샘플링할 소장의 각 섹션에 대해 소화 물질을 포함하는 1~2센티미터 세그먼트를 절제합니다. 카세트에 티슈를 넣고 두 번째 폼 패드로 오버레이하고 카세트를 닫고 메타칸에 넣습니다. 위장을 절제 할 때 식도와 소장과의 연결을 끊습니다.

카세트에 티슈를 넣고 카세트를 메타칸에 넣습니다. 카세트를 실온에서 3시간 이상 또는 2주 이내에 그대로 둡니다. 고정 후 폼 패드를 제거하고 각 손상되지 않은 조직 섹션을 카세트로 반환합니다.

그런 다음 조직을 100% 메탄올로 35분 동안 두 번, 100% 에탄올에서 25분 동안 두 번, 자일렌에서 20분 동안 두 번 세척합니다. 카세트를 종이 타월에 말리고 혼성화 오븐에서 섭씨 70도에서 2시간 동안 미리 녹은 파라핀 왁스에 넣습니다. 그런 다음 왁스에서 카세트를 제거하고, 여분의 왁스가 왁스 블록에 내장 될 때까지 실온에서 배출하고 보관 할 수 있습니다.

자일렌으로 채워진 미리 데워진 항아리에 슬라이드를 삽입하여 파라핀이 내장된 조직학적 섹션을 드왁스합니다. 항아리를 섭씨 60도에서 10분간 방치한 다음 자일렌 세척을 폐기하십시오. 항아리에 신선한 실온 자일렌을 붓고 인큐베이션을 반복합니다.

그런 다음 항아리를 100 % 에탄올로 채우고 실온에서 5 분 동안 배양하십시오. 인큐베이션 후, 항아리에서 슬라이드를 제거하고 공기 건조. 물고기 프로브로 C.albicans를 염색하려면 팻 펜을 사용하여 조직 섹션 주위에 원을 그리는 것으로 시작합니다.

혼성화 용액을 함유한 프로브의 파이펫 50 마이크로리터를 고정 된 조직에 부드럽게 퍼뜨리십시오. 거품을 방지하기 위해 하이브리드화 커버 슬립액체를 오버레이. 그런 다음 슬라이드를 물 꽉 혼성화 챔버에 밀봉하고 어둠 속에서 혼성화 오븐에서 섭씨 50도에서 3 시간 동안 섹션을 배양합니다.

인큐베이션 후 코플린 항아리에 세척 용액을 추가합니다. 조심스럽게 집게슬라이드에서 커버슬립을 제거하고 슬라이드를 세척 용액에 놓습니다. 항아리를 알루미늄 호일로 덮고 섭씨 50도에서 20분 동안 배양합니다.

다음으로, 세척 용액을 붓고 PBS로 항아리를 다시 작성하여 슬라이드를 씻으십시오. 즉시 붓고 총 2 개의 세차재에 대한 과정을 반복 신선한 PBS로 리필. 섬세한 작업 닦아와 PBS를 멀리 심지 팻 펜으로 장 조직 섹션을 동그라미.

불투명플라스틱 용기에 슬라이드를 넣고 조직 섹션에 뮤신 핵 염색 용액 50 마이크로리터를 추가합니다. 알루미늄 호일로 용기를 덮고 섭씨 45분 동안 인큐베이션합니다. 인큐베이션 후, 코플린 항아리에 슬라이드를 넣고 PBS로 두 번 씻어.

종이 타월에 여분의 PBS를 탭한 다음 티슈로 마지막 방울을 심지 하십시오. 각 섹션에 마운팅 매체 1방울을 놓고 유리 커버슬립으로 오버레이하여 거품을 방지합니다. 전체 커버슬립 아래에 장착 매체를 퍼뜨리십시오.

커버슬립을 모서리에 매니큐어로 고정하고 형광 현미경을 사용하여 슬라이드를 이미지합니다. 이 프로토콜은 체외 및 호스트 조직에서 C.albicans를 형광으로 라벨에 사용할 수 있습니다. 체외 전파 최해, 둥근 효모 세포, 창 자 세포 및 불투명 세포고정, permeabilized, 형광 및 위상 대비 현미경으로 구별되었다.

둥근 효모와 고도로 길쭉한 최면은 마우스 큰 내장에서 심상화되었다. 호스트 조직은 C.albicans 특정 프로브 또는 panfungal 프로브로 염색되었다. C.albicans는 빨간색, 숙주 세포 핵 청, 및 점액 층 녹색으로 표시되었다.

C.albicans는 숙주 점막및 창자 루멘의 더 중앙 지구에 즉시 인접한 지역을 포함하여 뮤린 기장의 상이한 세그먼트에서 검출되었다. 이전에 gavage 기술을 수행하지 않은 과학자를 위해,이 방법을 시도하기 전에 전문 교육을 얻는 것이 중요합니다. 물고기 염색 에 이어, 면역 형광 기술은 숙주 점막의 추가 특징을 얼룩지게 하기 위하여 이용될 수 있습니다.

이것은 호스트의 조직 손상 또는 면역 반응의 특성화를 허용할 수 있습니다. 이 기술은 우리가 치료를 개발할 때 활용할 수있는 칸디다 알비칸 생물학의 우리의 이해를 촉진 호스트 내에서 칸디다 알비칸 돌연변이의 곰팡이 세포 형태와 생존 사이의 관계를 특성화 할 수 있었습니다.