Name: 시투 혼성화에서 형광을 사용하여 뮤린 위장에서 칸디다 알비칸스의 시각화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: 학습하세요 생쥐 위장관에서 형광 시투 혼성화를 이용해 Candida albicans를 시각화하는 방법을. 이 기술은 병원균의 형태와 위치를 파악하여 장내 미생물 상호작용 연구에 활용됩니다.

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저자는 FISH 기술 개발에 지도에 대한 캐롤라이나 트로피니, 캐서린 Ng, 저스틴 소넨 버그, KC 황에게 감사드립니다. 테레사 오메라(Teresa O'Meara)는 원고에 대한 유용한 의견을 제공했고, 미리암 레비는 사진 촬영을 도왔다. 이 작품은 NIH 교부금 R01AI108992, R01DK113788, 및 감염증의 병인에서 버로우 환영 상에 의해 지원되었다.

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저자는 공개 할 것이 없다.

여기에 기술된 방법은 어떤 성또는 균주의 공동식민지화된 마우스의 기관에서 C. 알비칸스 효모 및 하이픈의 시각화를 허용한다. FISH 프로브는 곰팡이 세포질 에 걸쳐 분포되는 23S rRNA로 혼성화됩니다. 우리의 방법은 창자 박테리아를 시각화하기 위한 이전에 보고된 프로토콜에서 적응되었습니다20. C. albicans는 호스트 내의 그것의 형태를 바꾸기 때문에, 방법은 진균 세포 모양 뿐만 아니라 현지화를 감시하기 위하여 유용합니다. 예를 들어, 우리는 효모가 소화관 전체에 우세하다는 가설을 반증하고, 특정 "필라멘션-결함" 돌연변이체의 생체내 표현형과 체외 표현형 사이의 불일치를 드러내기 위해 이 방법을 사용하였다12.
C. albicans 공존 식민지에 대 한 여러 마우스 모델 존재. 실험실 마우스와 인간의 microbiota는 구별 하 고, 쥐에서, 항생제 또는 전문된 다이어트의 사용 안정적인 식민지를 설정 하는 데 필요한. 항생제를 가진 처리는 또한 C. albicans 인간을 강화하고 전파한 질병10를위한 중요한 위험 요소입니다. 이 연구에서 사용된 항생제는 상대적으로 저렴하고 세균성 미생물의 신뢰할 수 있는 감소를 산출한다. 항생제는 동물에서 모든 박테리아를 제거 하지, 길 항 성 세균 종의 부담을 줄이기 위해 사용 됩니다. 연구원은 C. albicans-박테리아의부재에 호스트 상호 작용을 공부 하고자 하는 경우 또는 항생제 또는 특별 한 다이어트의 사용을 피하기 위해, 세균 없는 동물 은 전통적으로 사육 동물에 대 한 대체 될 수 있다; 그러나, gnotobiotic 마우스 전시 특정 면역 및 해부학 이상 및 따라서 모든 목적에 적합 하지 않을 수 있습니다.
성공적인 FISH 염색을 위해 몇 가지 단계가 중요합니다: 권장되는 고정 방법은 GI 조직의 구조적 무결성, 특히 점액 층 및 3차원과 같은 장 루멘의 깨지기 쉬운 내용체를 보존하는 데 중요합니다. 곰팡이와 박테리아의 조직16. 물을 포함하는 많은 일반적으로 사용되는 고정 솔루션은 발광 아키텍처에 매우 손상을 입힙니다. 이 프로토콜에서 권장하는 고정식 세차용 고정식 및 솔루션에는 물이 포함되어 있지 않으며, 물에 대한 오염을 피하는 것이 중요합니다. 또 다른 중요한 단계는 혼성화 오븐에서 슬라이드의 배양 동안 혼성화 용액의 증발을 피하는 것이 중요한 혼성화 단계이다. 이 문제를 피하기 위해 슬라이드를 방수 용기에 넣는 것이 좋습니다. 양자택일로, 하나는 마이크로어레이의 혼성화를 위해 원래 사용된 것과 같은 방수 혼성화 챔버를 사용할 수 있습니다.
C. 알비칸스-특정FISH 프로브는 이 프로토콜에 설명되어있다. 그러나, 많은 실험실 사육 마우스 그들의 자연적인 창 자 microbiota의 일환으로 C. albicans 또는 다른 곰 팡이 포함 하지 않기 때문에, panfungal 프로브 는 실험적으로 식민지 동물에서 C. 알비칸스를 구체적으로 얼룩 수 있습니다. 판곰팡이 프로브의 치환은 우수한 혼성화 특성과 더 높은 신호 대 잡음 비 로 인해 바람직할 수 있습니다. panfungal 프로브가 C. albicans에대한 의사 특이적 프로브로 사용되는 경우, 감염되지 않은 동물 (즉, 항생제로 치료하지만 C. albicans)에서염색의 부족을 문서화하는 것이중요합니다. 비식민지화된 대조군 동물의 염색은 또한 FISH 프로브를 식품 미립자까지 준수함으로써 발생할 수 있는 배경 염색을 평가하는 데에도 유용합니다. 전반적으로, FISH 프로브의 사용은 칼코플루어 백색 (키틴, 세포 모형 사이에서 다를 수 있는 세포벽 분대), GMS, 또는 상업적으로 이용가능한 항진균성 항체와 같은 곰팡이염색의 대부분의 다른 방법에 비해 향상된 특이성을 제공한다. 또한, 물고기 염색은 종 특정 rRNAs에 차별화 표지 된 물고기 프로브를 사용하여 여러 유기체의 코스타링을 허용합니다.
이 기술의 한 가지 주의점은 특정 C. albicans 효모 세포 유형이 FISH (예 : 불투명 및 GUT 세포 유형)에 의해 매우 유사하다는 것입니다. 이러한 세포 유형 사이에서 구별하기 위해, 세포 유형 별 곰팡이 mRNA에 혼성화 프로브를 개발하는 것이 유용 할 것이다. 그럼에도 불구하고, 현재의 형태로, FISH 기술은 이미 두 조건 하에서 평가된 C. albicans 돌연변이체의 생체 내 행동과 체외 행동 사이의 놀라운 불일치를밝혀냈으며,이는 기존 시험관 내 검사법에 의해 적절히 모방되지 않은 자연 적인 환경. 추가 야생 유형 및 돌연변이 호스트에 다른 C. albicans 얼룩의 추가 연구 곰 팡이 호스트 상호 작용에 추가 통찰력을 얻을 가능성이. 특히, 인간21에서 C. 알비칸스의 높은 적분과 연관되는 염증성 장 질환의 모델에서 C. albicans를 프로파일화하는 것이 유익할 것이며, 다른 모델인 C. albicans 과성장 및 질병의 다른 모델이다. FISH 기술은 또한 특정 숙주 세포를 얼룩화하기 위하여 면역성화학과 결합될 수 있습니다. 전반적으로, 여기에 제시된 방법은 포유류 기관 내의 C. 알비칸스 국소화 및 형태를 결정하는 합리적으로 빠르고 신뢰할 수 있는 수단을 제공한다.

칸디다 알비칸스는 곰팡이 공생뿐만 아니라 기회 인간 병원체입니다. 이 효모는 정의된 환경 틈새 시장이 결여되고 대신 인간과 그밖 포유동물의 위장관 (GI) 관, 피부 및 비뇨 생식기 내의전파1. C. albicans에 초기 연구는 그것의 독성 잠재력에 주로 초점을 맞춘 반면, 몇몇 최근 보고서는 창 자 내에서 유기 체를 전파 하는 것이 정상적인 건강에 중요 한 역할을 할 수 있습니다 제안, 의 면역 개발을 포함 하 여 호스트2,3,4. 포유류 장 내의 C. albicans 의 기원에 대한 조사를 용이하게 하기 위해, 우리는 안정적인 GI 식민지화의 마우스 모델을 개발하고 현장 혼성화 (FISH) 기반 의 형광 을 통해 곰팡이 효모 세포와 하이픈을 시각화하는 방법 장 내강자.
몇 가지예외5,실험실 에서 자란 마우스는 일반적으로 소화관의 곰팡이 식민지화에 대한 저항성을 나타낸다. 식민지 저항은 특정 세균성 종에 의해 중재 될 것으로 생각 된다; 그러나, 이것은 항생제6,7 또는 아마도 세균 종 조성물을 변경하는 화학적으로 정의 된 식이요법의 사용으로 동물의 치료에 의해 극복 될 수있다8,9. 유사하게, 인간에서, 광범위한 항생제의 사용은 C. albicans 과성장 및 보급 과성장과 연관되었습니다10. 우리의 뮤린 식민지 화 모델은 광범위한 항생제를 사용하여 C. albicans 면역 적격, 종래의 사육 된 마우스의 식민지화를 확립합니다. 페니실린과 스트렙토마이신은 C. 알비칸스의 108 개의 식민지 형성 단위 (CFUs)로 위장하기 전에 일주일 동안 동물의 식수에 제공됩니다. 항생제 주입 물이 계속되는 한, C. albicans는 10 6-108 CFU/g의 대변역가에 도달하여 위장관을 통해 전파됩니다. 곰팡이 식민지의 높은 수준에도 불구하고, 동물은 건강하게 유지하고 감염되지 않은 대조군과 같은 속도로 체중을 얻는다. 이 모델은 여러 C. albicans 의 비열성 요인11,12를스크리닝하고 특성화하는 데 성공적으로 사용되었습니다.
곰팡이 왕국의 다른 구성원과 마찬가지로, C. albicans는 엄청난 형태 학적 가소성13할 수있다 . 시험관내 조건하에서, 적어도 6개의 단세포 효모 세포 유형들 사이에서 전이하는 것으로 나타났으며, 다세포 하이페 및 가성하이파뿐만 아니라. 효모-하이파 전이는 가장 잘 특징지어지는 독성 속성 중 하나이며, 대부분의 포유류 질병 모델뿐만 아니라 감염된 인간 조직에서 하이페와 슈도하이파가 우세하다. Murine 소화관 내의 C. albicans 현지화 및 세포 형태학을 결정하기 위하여, 우리는 고정된 조직학 단면도에 효모 및 hyphae를 염색하기 위한 FISH 기술을 개발했습니다. 프로브는 곰팡이 세포질 에 걸쳐 분포되는 곰팡이 23S 리보소말 RNA (rRNA)에 혼성화형형으로 표지된 DNA 올리고뉴클레오티드로 구성됩니다. 숙주 조직은 숙주 점막, 소화 물질, 세균성 미생물 및 장 내 점액을 포함한 장의 3 차원 구조를 보존하는 방식으로 고정되기 때문에이 기술은 곰팡이의 국소화를 허용합니다. 얼룩이 있을 때 이러한 랜드마크와 관련하여 세포를 제거합니다. FISH 기술은 주기산 Schiff (PAS) 또는 고모리의 메테나민 실버 (GMS)와 같은 곰팡이에 대한 전통적인 조직 학적 얼룩뿐만 아니라 시판되는 항진균 항체와 유리하게 비교됩니다. C. 알비칸스. 또한, 표준 고정제는 점액 층을 제거하고 창자 루멘14,15의다른 내용을 방해한다.
이 문서에서는, 우리는 마우스 위장관의 고급 C. albicans 식민지를 확립하기위한 자세한 지침을 제공합니다, 안락사 동물에서 소화 관의 해부, 발광을 보존하는 방식으로 조직 고정에 대한 FISH를 사용하여 숙주 조직 내에서 C. 알비칸스를 검출할 수 있습니다. C. albicans의 야생 모형 그리고 돌연변이 긴장 이외에, gavage 기술은 그밖 미생물을 전달하기 위하여 이용될 수 있습니다. 고정 기술은 창자 내용물의 보존이 요구되는 모든 연구에 유용 할 것입니다. FISH 절차는 하루 안에 완료될 수 있으며 여러 개의 차별화된 프로브를 사용하여 여러 곰팡이 종을 현지화하는 데 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>1 mL 주사기</td><td>BD</td><td>309659</td>는 <td>모든 공급 업체에서 대체 할 수</td></tr> 있습니다 <tr><td>BHI 혈액 한천</td><td></td><td></td><td>은 모든 공급 업체에서 대체 할 수 있습니다</td></tr> <tr><td> C. albicans FISH 프로브</td><td>IDT DNA Technologies</td><td>맞춤 주문</td><td></td></tr><tr><td>혼성화 배양</td><td></td><td></td><td>용 챔버 증발을 줄이기 위한 방수 챔버</td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>Sigma</td><td>C2432</td><td>>=99.5%</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Roche</td><td>10236276001</td>는 <td>모든 공급업체에서 대체할 수 있습니다</td></tr>. <tr><td>섬세한 작업 와이퍼 티슈</td><td>Kimberley-Clark</td><td>34256CT</td><td>Kimwipes</td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Sigma</td><td>G7021-5KG</td><td>는 모든 공급업체에서 대체할 수 있습니다</td></tr>. <tr><td>에탄올</td><td>Sigma</td><td>E7023</td><td>분자 생물학 등급</td></tr><tr><td>수유 바늘</td><td>케이던스, Inc.</td><td>7910</td><td>금속; 20 X1-1/2" W/2-1/4; 멸균을 위해 고압멸균 가능</td></tr><tr><td>FITC-UEA-1</td><td>Sigma</td><td>L9006-1MG</td><td>기타 형광단 사용 가능</td></tr><tr><td>FITC-WGA</td><td>Sigma</td><td>L4895-2MG</td><td>기타 형광단 사용</td></tr><tr><td>가능 폼 패드</td><td>Fisher</td><td>22038221</td><td>카세트에 맞는 폼 패드 포</td></tr><tr><td>름아미드</td><td>Sigma</td><td>47671</td><td>분자 생물학 등급</td></tr><tr><td>빙초산</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>MK881746</td><td>ACS 시약, >=99.5%</td></tr><tr><td>Glass Coplin jar</td><td>Fisher</td><td>08-815</td><td>hold to 10 slides back to back</td></tr><tr><td>Histology cassettes</td><td>Simport</td><td>M512</td><td>Deep cassettes so so cecum is tquished</td></tr><tr><td>Hybridization coverslips</td><td>Sigma</td><td>GBL712222</td><td>RNase-free</td></tr><tr><td>Hybridization oven</td><td></td><td></td><td>LB</td></tr><tr><td></td><td></td>는 Lee et al. 1975 Methanol Sigma 179337 ACS reagent, >=99.8%Mice Charles River Laboratories 028 adult BALB/c; 18-21 grams (8-10 weeks)Paraformaldehyde에 기술된 바와 같이 제조된 모든 공급업체<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>로부터 대체될 수</td>있습니다.<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher</td><td>50-980-487</td><td>16% 용액</td></tr><tr><td>파라핀 왁스</td><td>시그마</td><td>P3558-1KG</td><td>조직 임베딩용 파라플라스트</td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>UCSF 세포 배양 시설 배지 생산 단위</td><td></td><td>CCFAL003 칼슘, 마그네슘 프리; 모든 공급업체에서 대체 가능</td></tr><tr><td>Penicillin G</td><td>Sigma</td><td>PENNA-100MU</td><td></td></tr><tr><td>Sabouraud 포도당 한천</td><td></td><td></td><td>은 모든 공급업체에서 대체</td></tr>됨 <tr><td>Saline</td><td>Baxter</td><td>2F7123</td><td>sterile, 모든 공급업체에서 대체 가능</td></tr><tr><td>염화나트륨(NaCl)</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td>는 모든 공급업체에서 대체 가능; RNase-free</td></tr><tr><td>유지, 도데실황산나트륨(SDS)</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td>은 모든 공급업체에서 대체 가능, RNase-free</td></tr><tr><td>스트렙토마이신</td><td>유지 Sigma</td><td>S9137-100G</td><td></td></tr><tr><td>Super PAP 펜</td><td>Life Technologies</td><td>8899</td>는 <td>모든 공급 업체에서 대체 할 수</td></tr> 있습니다 <tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma</td><td>T3253</td><td>은 모든 공급 업체에서 대체 할 수 있습니다. RNase-free</td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td>에는 DAPI</td></tr><tr><td>Xylenes</td><td>Sigma</td><td>214736</td><td>시약 등급</td></tr><tr><td>YEPD</td><td></td><td></td>가 포함되어 <td>있지 않습니다. 모든 공급업체에서 대체됨</td></tr></tbody></table>

시투 혼성화에서 형광을 사용하여 뮤린 위장에서 칸디다 알비칸스의 시각화

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

칸디다 알비칸스는 인간과 다른 많은 포유류에서 장내 미생물의 곰팡이 성분입니다. C. albicans는 대부분의 식민지 호스트에 있는 현상을 일으키는 원인이 되지 않더라도, 공생 저장소는 전염병을 위한 저장소역할을 하고, 창자에 있는 높은 진균 역가의 존재는 선동적인 장 질병과 연관됩니다. 여기서, 우리는 안정적인 위장 식민지의 마우스 모델에서 C. albicans 세포 형태및 국소화를 시각화하는 방법을 설명한다. 식민지는 경구 항생제로 처리 된 동물에서 C. 알비 칸의 단일 복용량을 사용하여 설립된다. 창자 조직의 세그먼트는 발광 내용체 (미생물 및 점액)뿐만 아니라 숙주 점막의 구조를 보존하는 방식으로 고정됩니다. 마지막으로, 실화에서 형광은 C. 알비칸및 하이픈에 대한 얼룩을 진균 rRNA에 대하여 프로브를 사용하여 수행된다. 이 프로토콜의 주요 장점은 C. albicans 세포 형태와 위장 식민지 동안 숙주 구조와의 공간 협회의 동시 관찰을 허용 한다는 것입니다.

제공된 지침에 따라, 이 기술의 결과는 단면된 GI 조직에서 숙주 상피, 점액 및 C. 알비칸스에서 핵의 형광 라벨링될 것이다. 야생형 칸디다 알비칸스 세포는 둥글고 단세포 효모 세포또는 고도로 길쭉한, 때로는 분지, 다세포 하이픈(세포-세포 분열이 하이픈에서 명백하지 않을 것이다)으로 나타나야 한다. C. albicans의 돌연변이는 추가로 더 작고, 약간 길쭉한 "회색" 효모 또는 더 크고, 약간 길쭉한 "GUT"(위장 유도 전이) 또는 "불투명" 효모로 나타날 수 있습니다.
그림 1은 구강 관저에 사용되는 수유 바늘뿐만 아니라 신체 절차 동안 바늘의 주요 위치를 묘사합니다. 도 2는 마우스의 장기 분절 및 GI 세그먼트의 모양에 사용되는 일반적인 설정을 제공한다.
도 3은 시험관 내 및 마우스 모델 내에서 전파된 후 상이한 C. 알비칸스 세포 유형의 FISH 염색을 표시한다. 도 3A는 체외에서 전파된 고정, 투과, 히파의 형광 및 위상 이미지를 나타낸다. 하이파 형성은 37°C에서 2% N-아세틸루코사민, pH 6.8로 액체 리의배지(18)로 유도하였다. 도 3B는 체외에서 전파된 효모 세포의 고정, 투과, 위상 이미지의 형광 및 위상 이미지를 나타낸다. 도 3C,D는 각각 고정, 투과, 시험관 내 전파 GUT 세포 및 불투명 세포를 나타낸다. GUT 및 불투명 세포 모형은 전자 현미경 검사법을 스캐닝하여 가시화할 때를 제외하고는 형태학적으로 구별할 수 없습니다. 세포가 잘 투과되지 않은 경우 시험관 내 전파 세포의 FISH 염색은 최적이 될 것입니다. 그림 3C에약하고 확산되는 염색의 예가 나와 있습니다. 최상의 결과를 위해, 세포 고정 및 투과 조건은 조사될 각 세포 모형 및 종에 대해 경험적으로 결정되어야 합니다. 다행히도, 절편 된 조직에서 C. albicans를 시각화 하기 위한 권장된 프로토콜 보다 일관 된 투과화를 생산.
도 3E-G는 마우스 대장에서 C.albicans를 묘사하고, C. albicans-특이적프로브(도3E)또는 판곰팡이 프로브(그림3F,G)로염색하였다. C. albicans는 이 심상에서 빨간색으로 나타나고, 숙주 세포 핵은 파랗고, 점액 층은 녹색입니다. 둥근 효모와 고도로 길쭉한 하이픈 (흰색 화살촉)은 대장에서 발생합니다. 판곰팡이 프로브로 염색이 더 밝아두심을 유의하시기 바랍니다. 그림 3G는 동일한 구획에 있는 ume6 돌연변이체를 도시하고, 판곰팡이 프로브로염색한 . Ume6는 시험관 내 조건 하에서 히파 형성에 필요한 전사 인자를 인코딩한다19 . 흥미롭게도, 시험관 내 조건 하에서 이러한 돌연변이체에 의해 표시되는 효모-잠긴 표현형은 장 내에서 재분해되지 않으며, 이는 숙주12내에서 중복 인자가 활성화되어야 함을 시사한다. 도 4는 숙주 점막과 장 내루멘의 더 많은 중앙 영역에 인접한 지역을 포함하는 뮤린 기관의 상이한 세그먼트에서 야생형 C. 알비칸스의 출현을 도시한다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60283/60283fig01.jpg"> 그림 1: 위봉 시 키 공급 바늘 위치. (A)먹이 바늘. (B)혀 의 측면에 삽입 된 바늘 공을 먹이. (C)식도에 삽입된 바늘을 똑바로 세워 서 먹이. (D)코 위에 몇 밀리미터 를 표시하여 위장에 바늘을 삽입하십시오. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60283/60283fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60283/60283fig02.jpg"> 그림 2: 해부 레이아웃 예제입니다. (A)해부 패드 및 도구. (B)절제된 위장관을 빼내. 근위 (식도) 말단에 (항문) 섹션: I. 위. II. 근위 소장. III. 내측 소장. IV. 말단 소장. V. 세쿰. VI. 대장. 분홍색 파선 테두리 상자는 고정할 조직을 나타냅니다. (C)카세트에 배치 된 티슈. 로마 숫자는 패널 B와 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60283/60283fig02large.jpg" target="_blank">동일합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60283/60283fig03.jpg"> 도 3: 생선 염색 된 C. albicans의대표적인 이미지. (A) C. albicans hyphae의 물고기 액체 리의 매체에서 성장18% N-아세틸루코사민, pH 6.8. (B) 생선 의 C. 알비칸스 둥근 효 모 세포 YEPD + 2% 한천 접시에 성장. (C)YEPD + 2% 한천 접시에서 자란 C. 알비칸스 장세포(ySN1045)의 생선. (D)YEPD + 2% 한천 접시에서 자란 불투명 세포C. 알비칸스의 생선. (E)야생형 C. 알비칸스(ySN250)를 대장에서, C. 알비칸스-특이적프로브로 염색하였다. (F)야생 형 C. 알비 칸을 대장에서, 판곰 프로브로 염색. (G) Ume6 돌연변이체(ySN1479)는 대장에서, 판곰팡이 프로브로 염색: 빨간색은 C. 알비칸스,청색은 숙주 상피 핵, 녹색은 뮤신이다. 화살촉은 하이픈을 나타냅니다. 화살표는 효모를 나타냅니다. 배율 막대 = 20 μm. 이미지 F와 G는 Witchley 외12에서적응됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60283/60283fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60283/60283fig04.jpg"> 그림 4: 다른 창 자 구획에 물고기 얼룩C. 알비칸의 외관. 야생형 C. 알비칸스는 마우스 위장관의 지시된 세그먼트에 도시된다. 각 구획 내에서, 이미지는 호스트 점막과 창자 루멘의 중앙 지역에 인접한 지역을 묘사합니다. 염색을 판곰팡이 프로브로 수행하였습니다. 스케일 바 = 20 μm. 이미지는 Witchley 외12에서조정됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60283/60283fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">항생제 주식 (200x)</td>
		</tr>
<tr>
<td>페니실린 G</td>
			<td>181 mg/mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>연쇄상 구균</td>
			<td>400 mg/μL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">메타칸 주</td>
		</tr>
<tr>
<td>주식</td>
			<td>최종 농도</td>
			<td>볼륨</td>
			<td>단위</td>
		</tr>
<tr>
<td>메탄올</td>
			<td>60%</td>
			<td>300</td>
			<td>Ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>포 름</td>
			<td>30%</td>
			<td>150</td>
			<td>Ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>빙하 아세트산</td>
			<td>10%</td>
			<td>50</td>
			<td>Ml</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">하이브리드화 솔루션</td>
		</tr>
<tr>
<td>주식</td>
			<td>최종 농도</td>
			<td>볼륨</td>
			<td>단위</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M 트리스-HCl, pH 7.4</td>
			<td>20 mM</td>
			<td>20</td>
			<td>μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 M 나클</td>
			<td>0.9 M</td>
			<td>180</td>
			<td>μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>10% SDS</td>
			<td>0.10%</td>
			<td>10</td>
			<td>μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>100% 포마미드</td>
			<td>1.00%</td>
			<td>10</td>
			<td>μL (사용 사이에 -20 °C에서 작은 알리쿼트에 보관)</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNase 무료 물</td>
			<td></td>
			<td>780</td>
			<td>μL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">생선 세척 솔루션</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M 트리스-HCl, pH 7.4</td>
			<td>20 mM</td>
			<td>1</td>
			<td>Ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 M 나클</td>
			<td>0.9 M</td>
			<td>9</td>
			<td>Ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNase 무료 물</td>
			<td></td>
			<td>40</td>
			<td>Ml</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">뮤신 핵 염색 용액</td>
		</tr>
<tr>
<td>DAPI, 10 μg/mL</td>
			<td>20 ng/mL</td>
			<td>2</td>
			<td>μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>렉틴, 40 μg/mL</td>
			<td>1.6 μg/mL</td>
			<td>40</td>
			<td>μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td></td>
			<td>958</td>
			<td>μL</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 이 프로토콜에 사용되는 솔루션의 일반적인 볼륨 및 농도입니다.

이 프로토콜의 목적은 포유류 위장관에서 칸디다 알비칸스 세포 모양 및 국소화를 시각화하는 것입니다.

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...

이 프로토콜은 칸디다 알비칸스가 포유류 위장관에 어떻게 살고 있는지에 대한 우리가 지금까지 가지고있는 최고의 통찰력의 일부를 산출했다. 예를 들어, 최근까지, 우리는 칸디다가 창자 내에서 지역화되는 곳이나 이 틈새 시장 내에서 가정하는 많은 형태 학적 형태 중 어느 것을 정말로 알지 못했습니다. 이 기술의 주요 장점은 곰팡이가 숙주 구조 또는 미생물의 박테리아와 함께 하는 3차원 상호 작용을 방해하지 않고 자연 환경 내에서 칸디다를 시각화할 수 있다는 것입니다.창자는 복잡한 환경이기 때문에 실험실에서 모델링하기가 매우 어렵기 때문에 호스트 모델에서 칸디다 생물학을 직접 조사 할 수있는 방법을 찾는 것이 매우 만족스러웠습니다. 칸디다 알비칸스를 포함한 장내 미생물의 특정 성분은 염증성 장 질환과 같은 질병에서 역할을 하는 것으로 의심된다. 이 기술은 잠재적으로 환자에게서 얻은 생검 견본에 있는 특정 미생물의 존재를 진단하기 위하여 이용될 수 있습니다.개비지 기술의 숙달과 장기를 찢어하지 않고 위장 세그먼트를 해부하는 능력은 최적의 결과를 얻는 데 중요합니다. 시작하려면 각 동물을 지정된 접종의 계산된 부피를 가리게 합니다. 1 밀리리터 주사기에 자동 동물 먹이 바늘을 부착하고 모든 거품을 제거하는 하나의 gavage 볼륨으로 주사기를 채웁니다.멸균 표면에 주사기를 놓습니다. 동물을 고정하려면 지배적 인 손으로 꼬리 의 바닥에 잡고 귀 바로 뒤에 느슨한 피부에 동물의 뒷면을 밀어. 엄지와 집게 손가락으로 스크러프를 단단히 모으면 됩니다.동물을 스크러프에 집어 들고 뒤집고 꼬리 주위에 같은 손의 작은 손가락을 반복하여 동물의 손바닥에 고정시하십시오. 동물의 머리를 부드럽게 확장하여 몸과 직선으로 감습니다. 그런 다음 지배적 인 손으로 주사기를 집어 들고 곡선 바늘이 아래로 가리키는 동물에게 수직으로 잡습니다.바늘의 공을 사용하여 입 안구석을 부드럽게 연결하고 입 의 측면을 따라 바늘을 목 뒤쪽으로 진급한 다음 바늘을 중앙으로 옮습니다. 바늘의 공이 동물의 목 뒤쪽에 있으면 바늘을 기울여 동물의 신체 선과 평행하게 목을 부드럽게 미끄러질 수 있습니다. 바늘이 목구멍 아래로 매끄럽게 미끄러지지 않으면 바늘이 제대로 배치되지 않을 수 있으며 재배치하고 다시 시도하려면 철회해야합니다.바늘을 부드럽게 진행하여 동물이 바늘을 삼키는 것은 몇 밀리미터만 보일 때까지 유지됩니다. 바늘의 공이 플런저를 부드럽게 전진시켜 위장에 있고 저항이 없는 경우, 계속해서 접종을 전달한다는 것을 테스트합니다. 접종이 투여되면 천천히 바늘을 철회하고 동물을 케이지에 놓습니다.5~10분 동안 동물을 계속 모니터링하여 호흡이나 요난의 징후를 보이고, 동물이 있는 직후 정상적인 활동을 재개했는지 확인합니다. 다음 동물에게 동일한 접종을 하면 알코올 닦아바늘을 청소하십시오. 다른 접종을 사용하는 경우 바늘을 교체하십시오.무딘 단면포를 사용하여 복부 피부의 한 부분을 꼬집고 가위를 사용하여 골반 의 바닥 근처에 피부와 기본 근막을 절개하십시오. 복막 구멍의 각 측면을 따라 흉곽까지 U 자수를 확장한 다음 피부의 길을 들어 올립니다. 무딘 단면의 집게를 사용하여 가위를 사용하여 복막 구멍에서 cecum을 부드럽게 추출하여 cecum과 소장 사이의 연결을 분리하십시오.전체 cecum을 작단간 카세트에 넣고 왜곡되지 않고 평평하게 놓습니다. 두 번째 폼 패드를 위에 놓고 카세트를 닫습니다. 그런 다음 카세트를 메타칸이 들어 있는 나사 캡 항아리에 넣습니다.1 ~ 2 개의 배설물 펠릿을 포함하고 카세트보다 길이가 적은 대장의 섹션을 소비합니다. 조직을 카세트에 넣고 평평하고 왜곡되지 않은 상태로 유지합니다. 두 번째 폼 패드로 오버레이카세트를 닫고 메타칸에 넣습니다.샘플링할 소장의 각 섹션에 대해 소화 물질을 포함하는 1~2센티미터 세그먼트를 절제합니다. 카세트에 티슈를 넣고 두 번째 폼 패드로 오버레이하고 카세트를 닫고 메타칸에 넣습니다. 위장을 절제 할 때 식도와 소장과의 연결을 끊습니다.카세트에 티슈를 넣고 카세트를 메타칸에 넣습니다. 카세트를 실온에서 3시간 이상 또는 2주 이내에 그대로 둡니다. 고정 후 폼 패드를 제거하고 각 손상되지 않은 조직 섹션을 카세트로 반환합니다.그런 다음 조직을 100% 메탄올로 35분 동안 두 번, 100% 에탄올에서 25분 동안 두 번, 자일렌에서 20분 동안 두 번 세척합니다. 카세트를 종이 타월에 말리고 혼성화 오븐에서 섭씨 70도에서 2시간 동안 미리 녹은 파라핀 왁스에 넣습니다. 그런 다음 왁스에서 카세트를 제거하고, 여분의 왁스가 왁스 블록에 내장 될 때까지 실온에서 배출하고 보관 할 수 있습니다.자일렌으로 채워진 미리 데워진 항아리에 슬라이드를 삽입하여 파라핀이 내장된 조직학적 섹션을 드왁스합니다. 항아리를 섭씨 60도에서 10분간 방치한 다음 자일렌 세척을 폐기하십시오. 항아리에 신선한 실온 자일렌을 붓고 인큐베이션을 반복합니다.그런 다음 항아리를 100 % 에탄올로 채우고 실온에서 5 분 동안 배양하십시오. 인큐베이션 후, 항아리에서 슬라이드를 제거하고 공기 건조. 물고기 프로브로 C.albicans를 염색하려면 팻 펜을 사용하여 조직 섹션 주위에 원을 그리는 것으로 시작합니다.혼성화 용액을 함유한 프로브의 파이펫 50 마이크로리터를 고정 된 조직에 부드럽게 퍼뜨리십시오. 거품을 방지하기 위해 하이브리드화 커버 슬립액체를 오버레이. 그런 다음 슬라이드를 물 꽉 혼성화 챔버에 밀봉하고 어둠 속에서 혼성화 오븐에서 섭씨 50도에서 3 시간 동안 섹션을 배양합니다.인큐베이션 후 코플린 항아리에 세척 용액을 추가합니다. 조심스럽게 집게슬라이드에서 커버슬립을 제거하고 슬라이드를 세척 용액에 놓습니다. 항아리를 알루미늄 호일로 덮고 섭씨 50도에서 20분 동안 배양합니다.다음으로, 세척 용액을 붓고 PBS로 항아리를 다시 작성하여 슬라이드를 씻으십시오. 즉시 붓고 총 2 개의 세차재에 대한 과정을 반복 신선한 PBS로 리필. 섬세한 작업 닦아와 PBS를 멀리 심지 팻 펜으로 장 조직 섹션을 동그라미.불투명플라스틱 용기에 슬라이드를 넣고 조직 섹션에 뮤신 핵 염색 용액 50 마이크로리터를 추가합니다. 알루미늄 호일로 용기를 덮고 섭씨 45분 동안 인큐베이션합니다. 인큐베이션 후, 코플린 항아리에 슬라이드를 넣고 PBS로 두 번 씻어.종이 타월에 여분의 PBS를 탭한 다음 티슈로 마지막 방울을 심지 하십시오. 각 섹션에 마운팅 매체 1방울을 놓고 유리 커버슬립으로 오버레이하여 거품을 방지합니다. 전체 커버슬립 아래에 장착 매체를 퍼뜨리십시오.커버슬립을 모서리에 매니큐어로 고정하고 형광 현미경을 사용하여 슬라이드를 이미지합니다. 이 프로토콜은 체외 및 호스트 조직에서 C.albicans를 형광으로 라벨에 사용할 수 있습니다. 체외 전파 최해, 둥근 효모 세포, 창 자 세포 및 불투명 세포고정, permeabilized, 형광 및 위상 대비 현미경으로 구별되었다.둥근 효모와 고도로 길쭉한 최면은 마우스 큰 내장에서 심상화되었다. 호스트 조직은 C.albicans 특정 프로브 또는 panfungal 프로브로 염색되었다. C.albicans는 빨간색, 숙주 세포 핵 청, 및 점액 층 녹색으로 표시되었다.C.albicans는 숙주 점막및 창자 루멘의 더 중앙 지구에 즉시 인접한 지역을 포함하여 뮤린 기장의 상이한 세그먼트에서 검출되었다. 이전에 gavage 기술을 수행하지 않은 과학자를 위해,이 방법을 시도하기 전에 전문 교육을 얻는 것이 중요합니다. 물고기 염색 에 이어, 면역 형광 기술은 숙주 점막의 추가 특징을 얼룩지게 하기 위하여 이용될 수 있습니다.이것은 호스트의 조직 손상 또는 면역 반응의 특성화를 허용할 수 있습니다. 이 기술은 우리가 치료를 개발할 때 활용할 수있는 칸디다 알비칸 생물학의 우리의 이해를 촉진 호스트 내에서 칸디다 알비칸 돌연변이의 곰팡이 세포 형태와 생존 사이의 관계를 특성화 할 수 있었습니다.

visualization-candida-albicans-murine-gastrointestinal-tract-using

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

zebrafish의 급속한 발전, 소형 크기 및 투명성은 감염의 타고난 면역 제어 연구를위한 엄청난...

Zebrafish 애벌레의 분해해 칸디다 증의 비침습 이미징

출처: Ng, K. M., Tropini, C. 장내 미생물-숙주 상호작용의 형광 제 자리 하이브리다이제이션, 렉틴 염색 및 영상 촬영을 통한 시각화. J. Vis. 경험 (2021).이 영상은 형광 프로브를 박테리아 rRNA(리보솜 리보뉴클산)로 하이브리다이징하여 미세 분석을 위해 숙주 구조를 대염색하여 쥐 장 내 장내 미생물군을 염색하는 형광 현장 잡종화(FISH) 과정을 시연합니다.

쥐 장 절편에서 장내 박테리아의 형광 제자리 하이브리드화

이 비디오는 피하 조직에서 칸디다 알비칸스의 생물막 형성을 연구하기 위한 생체 내 마우스 모델의 개발을 보여줍니다. 이 실험은 생물막 발달을 위해 동물의 등 부위에 칸디다균에 감염된 장치를 이식하는 것을 포함합니다.

칸디다 알비칸스 In Vivo 마우스 모델의 생물막 형성

마우스 피하 모델에서 칸디다 알비칸스 생물막 발달의 실험적 절차를 제시합니다. 진균 생물막은 군집 형성 단위의 수를 결정하고 생성되는 빛의 양이 생존 가능한 세포의 수와 일치하는 비침습적 생물 발광 이미징에 의해 정량화되었습니다.

생물 발광 영상에 이어 마우스 피하 모델의 의학 관련 외국 기관에 칸디다 알비 칸스 (Candida albicans)에 바이오 필름 ​​개발

여기에서는 zymosan 및 IgG 코팅 비드를 포함하여 0.5μm보다 큰 곰팡이, 칸디다 알비칸스 및 미립자와 같은 병원체의 식세포작용 중 이벤트의 초기 폭포를 시각화하고 정량화하는 현미경 기반 기술에 대해 설명합니다.

탐식의 초기 단계를 시각화

칸디다 알비칸스 생물막의 내부 특징을 보고 정량화하기 위해 굴절률 매칭을 통해 명확히 된 고정 된 손상되지 않은 표본을 준비합니다. 이어서, 광학 단면 현미경 검사법은 생물막의 전체 두께를 가하지만 3차원 이미지 데이터를 얻기 위하여 이용될 수 있다.

칸디다 알비칸스 바이오필름 의 명확화 및 이미징

이 연구에서 기장 균질 추출물과 면역형광 스테인링을 사용하여 기술된 전 생체 분석법은 기관에서 칸디다 알비칸스의 최면 형태 발생을 검사하는 새로운 방법을 나타낸다. 이 방법은 창자에 있는 형태유전학 전이를 통제하는 환경 신호를 조사하기 위하여 이용될 수 있습니다.

칸디다 알비칸스 위장관에서 최면 모포 발생을 연구하는 Ex vivo 분석

이 간소화된 프로토콜은 조직을 고정하는 것에서부터 시투 혼성화에서 형광을 함유한 미생물을 염색하는 것까지 복잡한 조직 샘플에서 박테리아를 감지하고 이미지화하는 워크플로우를 자세히 설명합니다.

시투 혼성화, 렉틴 염색 및 이미징에서 형광을 통한 장내 미생물군유립 상호 작용의 시각화

세포 외 박테리아와 오르세 바이러스 및 미세 포자충 (곰팡이)과 같은 세포 내 병원체를 포함한 장내 미생물은 종종 야생 Caenorhabditis 선충류와 관련이 있습니다. 이 기사에서는 C. elegans 선충류에 서식하는 미생물을 검출 및 정량화하고 실험실에서 통제 된 감염 후 병원체 부하를 측정하기위한 프로토콜을 제시합니다.

RNA 형광 제자리 혼성화(FISH)를 통해 Caenorhabditis elegans 장에서 미생물 집락화 및 감염을 시각화합니다.

이 원고는 비침습적 공초점 현미경을 사용하여 포유류 숙주에서 활성 감염 동안 형태 형성 표현형에 대해 중간 크기의 칸 디다 알비칸스 돌연변이 라이브러리를 스크리닝하는 방법을 설명합니다.

포유류 숙주에서 활성 감염 중 칸디다 알비칸스 돌연변이 균주에서 형태형성 표현형을 스크리닝하기 위한 생체 내 이미징 사용

우리는 카테터에 생물막이 형성되고 C.albicans와 숙주 간의 상호 작용이 임상 CRI와 잘 상관되는 C.albicans 관련 카테터 관련 감염(CRI)의 마우스 모델을 확립합니다. 이 모델은 C.albicans 생물막 관련 CRI에 대한 치료법을 스크리닝하여 임상 혁신을 위한 토대를 마련하는 데 도움이 됩니다.

마우스의 카테터 관련 칸디다 알비칸스 감염 모델

학습하세요 생쥐 위장관에서 형광 시투 혼성화를 이용해 Candida albicans를 시각화하는 방법을. 이 기술은 병원균의 형태와 위치를 파악하여 장내 미생물 상호작용 연구에 활용됩니다.

시투 혼성화에서 형광을 사용하여 뮤린 위장에서 칸디다 알비칸스의 시각화

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