Name: 초파리 멜라노가스터에서 학습 유발 시냅스 가소성의 생체 내 광학 칼슘 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: 학습하세요 Drosophila melanogaster에서 생체 내 광학 칼슘 이미징을 이용한 시냅스 가소성 연구 방법. 이 기술은 연합학습 중 칼슘 역학을 실시간으로 시각화하여 기억 형성의 신경 메커니즘을 이해하는 데 활용됩니다.

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이 작품은 공동 연구 센터 SFB 889 "감각 처리의 메커니즘"과 2705 "뇌 회로의 해부 : 구조, 가소성 및 행동 기능의 연구 단위를 통해 독일 연구위원회에 의해 지원되었다 초파리 버섯 몸".

1. 형질전환 과일 파리, 초파리 멜라노가스터
<ol><li>교차 여성 처녀와 수컷 파리 (12 시간 빛 / 어두운 주기에 60 % 상대 습도에서 25 °C에서 제기) 원하는 Gal4 및 UAS 구성25를운반, 관심의 특정 뉴런이 유전적으로 코딩 을 표현하는 파리를 생산하기 위해 각각 칼슘 표시기.</li>
	<li>그들은 3-6 일 후 에클로션의 범위에때까지 위의 십자가의 여성 자손을 나이. 암컷 파리는 약간 더 큰 크기 때문에 바람직합니다.</li>
</ol>2. 생체 내 칼슘 이미징을위한 과일 플라이의 준비
<ol><li>단일 암컷 플라이를 선택하고 5분 이상 얼음에 마취합니다.</li>
	<li>미세 집게를 사용하여 이미징 챔버에 플라이를 놓습니다(그림 1c에서입증). 흉부와 다리가 챔버 바닥의 전선과 접촉하고 머리가 평평하게 놓여 있는지 확인하십시오. 투명 접착 테이프를 사용하여 플라이의 위치를 고정합니다. 참고 :이 프로토콜은 파리가 고정되어있는 맞춤형 챔버가 필요하며, 헤드 캡슐은 개구에 액세스 할 수 있으며, 파리는 흉부와 다리에 안테나와 전기 충격을 모두 받을 수 있습니다(그림 1).</li>
	<li>메스 손잡이에 고정 된 수술 용 메스 블레이드를 사용하여 (재료 표참조), 안테나가 덮여 있고 흉부의 앞쪽 대부분 부분만 노출된 채로 비행헤드 주위에 테이프로 창을 잘라냅니다.</li>
	<li>오목한 볼록한 턱이 있는 곤충 핀을 사용하여 조심스럽게 조작한 청색광 경화 접착제로 머리의 측면과 뒷면을 둘러싸고 있습니다. 파란색 발광 LED 램프를 사용하여 접착제를 설정합니다.</li>
	<li>접착제가 완전히 설정되어 있는지 확인하고 플라이 헤드의 등지 표면에서 잔류 미경 접착제를 지웁히 하십시오.</li>
	<li>링거 용액24(재료 표참조)를 한 방울 떨어뜨려 머리의 노출된 표피를 덮습니다.</li>
	<li>매우 미세 한 칼칼을 사용 하 여 표피를 잘라 냅니다. 표피를 가장 효율적으로 제거하기 위해 먼저 오켈리를 출발점으로 사용하여 머리 뒤쪽을 가로 질러 잘라냅니다. 그런 다음 각 면을 잘라 내어 눈에 내포하여 집게를 사용하여 쉽게 찢어 질 수있는 표피의 플랩을 형성합니다.</li>
	<li>관심의 뇌 영역을 차단할 수 있는 여분의 표피를 제거합니다.</li>
	<li>미세 한 집게를 사용 하 여 어떤 기관의 등지 표면을 신중 하 게 지우고, 뇌 조직 자체의 중단을 방지. 링거 용액24(재료 표참조)를 제거하고 새로 고침하여 티슈 파편 영역을 제거합니다.</li>
	<li>피하 악취 전달 바늘을 머리에서 약 1cm 떨어진 위치에 놓습니다. 안테나에 냄새 전달을 방해할 수 있는 것이 없는지 확인합니다.</li>
	<li>현미경에서 피하 악취 전달 바늘을 통해 이미징 챔버를 악취 전달 시스템에 연결합니다.</li>
	<li>비행이 마취와 수술에서 완전히 회복되고 공기 흐름에 적응할 수 있도록이 단계에서 10 분 휴식 기간을 구현하십시오.</li>
</ol>3. 생체 내 칼슘 이미징
<ol><li>적외선 레이저가 장착된 다광자 현미경과 진동 절연 테이블에 설치된 수중 침수 목표(재료 표참조)를 사용합니다. GFP 기반 칼슘 지표의 시각화를 위해 레이저를 920 nm의 여기 파장에 조정하고 GFP 밴드 패스 필터를 설치하십시오.</li>
	<li>거친 Z 조정 노브를 사용하여 뇌의 Z 축을 스캔하고 관심있는 뇌 영역을 찾습니다. 자르기 함수를 사용하여 스캔 시간만 이 영역에만 초점을 맞추고 머리 의 앞쪽이 아래쪽을 향하도록 스캔 뷰를 회전시면 됩니다.</li>
	<li>프레임 크기를 512 x 512px로 조정하고, 속도를 > 4Hz로 스캔하고, 관심 있는 뉴런이 커버되도록 영역(Y 차원)을 스캔합니다.</li>
</ol>4. 후각 컨디셔닝을 통해 악취를 유발한 칼슘 과도성 시각화
<ol><li>시간적으로 정확한 방식으로 여러 악취 자극을 전달할 수 있는 악취 전달 시스템19,26을 사용한다.<ol>
<li>추가 컴퓨터를 사용하여 장치를 제어하고 이미징 현미경 소프트웨어와 통신하여 실험 중 냄새 자극을 이미지 캡처와 조정합니다.</li>
		<li>이미지 수집 소프트웨어 및 냄새 전달 프로그램(예: 현미경 제어 소프트웨어에 설치된 VBA 매크로 패키지, 외부 입력에 반응하는 재료 표참조)을 연결할 수 있는 사전 프로그래밍된 매크로 패키지를 시작합니다. 별도의 프로그램에서 악취 전달 프로토콜의 개시에 의해 제공되는 트리거).</li>
	</ol>
</li>
	<li>512 x 512 px의 해상도와 4 Hz의 프레임 속도에서 "사전 교육"/순진한 냄새 유발 칼슘 과도 현상을 모니터링하여 측정을 시작합니다. 0 기준 값) 및 냄새 오프셋 후 12.5 s. 두 번째 냄새와 함께 이것을 반복한 다음 세 번째 냄새와 함께 반복하십시오.</li>
	<li>이 측정 후 3분 간 클래식 컨디셔닝("트레이닝")을 계속합니다.<ol>
<li>CS+ 냄새가 될 수있는 "사전 훈련"단계에서 제시 된 냄새 중 하나를 선택하고 다른 하나는CS가 될 수 있습니다 - 냄새. 12 개의 90 V 전기 충격과 함께 60 s용 컴퓨터 제어 냄새 전달 시스템을 사용하여 CS+ 냄새를 제시하십시오.</li>
		<li>60 년대 휴식 후,CS를 제시 - 60 s. 냄새 4-메틸 사이클로헥사놀 과 3 옥탄올로 사용. 이 훈련 동안 제3 악취제(예를 들어, 1-옥텐-3-ol)는 훈련 단계 전(단계 4.2)과 후(step 4.4)에만 대조군으로 사용되기 때문에 제시하지 않는다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>"훈련 후" 악취 유발 칼슘 과도를 다시 측정하여 "사전 훈련" 악취 자극 프로토콜(단계 4.2.) 3분 후 훈련 단계를 마친 후(단계 4.3). 참고 : 이 단계의 타이밍은 기억 형성 후 관심의 시간을 반영해야합니다 (예를 들어, 단기 기억을 조사하기 위해 컨디셔닝 단계 후 3-4 분 이 단계를 수행). 일반적으로 파리는 이 준비에서 몇 시간 동안 생존할 수 있습니다.</li>
	<li>이미징 파일을 나중에 이미지 분석을 위해 적절한 형식(예: Tiff)으로 저장합니다.</li>
</ol>5. 이미지 분석
<ol><li>이미지를 분석하려면 피지27과같은 이미지 분석 소프트웨어에서 Tiff (또는 유사한) 파일을 엽니다.</li>
	<li>이동 보정 알고리즘을 사용하여 스택을 정렬하여 X 및 Y 방향에서 최소한의 움직임을 보장합니다. Z 축에서 강한 움직임을 보이는 레코딩은 폐기합니다.</li>
	<li>검사할 영역 주변의 관심 영역(ROI)을 표시하는 데 사용되는 소프트웨어 도구를 선택합니다. 이것은 배경 형광의 영향을 제한하기 위해 가능한 한 정확해야합니다.</li>
	<li>소프트웨어의 각 도구를 사용하여 선택한 ROI로부터 의 데이터 파일로서 시간형광 강도 데이터를 추출하여 기록의 각 프레임에 대해 값이 생성되도록 한다.</li>
	<li>데이터 분석 프로그램을 사용하여 데이터를 열어 각 악취 추적에 대한 ΔF/F0 값을 계산합니다. F0 = 악취가 발병하기 전 2s의 평균 형광. ΔF = 주어진 프레임에서의 원시 형광과 F0의차이. 이러한 값에서 악취 자극 기간 동안 상대형 형광을 반영하기 위해 시간에 대해 플롯할 수 있는 각 프레임에 대한 ΔF/F0 값을 계산합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

학습 및 메모리의 기본 신경 회로의 해부는 신경 과학 분야에서 눈에 띄는 목표. Drosophila의 유전 적 접근성과 행동 테스트의 폭과 용이성은 이러한 현상을 조사하기에 이상적인 도구입니다. 여기서, 후각 컨디셔닝의 결과로 세포 내 수준에서 발생하는 변조, 개별 파리 내에서 시각화 할 수있는 방법이 제시된다. 우리 그룹17에의해 처음 확립 된 악취 유발 칼슘 역학의 사전 교육 및 사후 교육 시각화를 모두 수행함으로써 순진한 냄새 반응과 학습 된 냄새 반응 사이의 직접적 인 동물 내 비교를 그릴 수 있습니다. 관심 있는 뉴런의 가소성을 검사합니다. 이것은 사전 및 사후 교육 상태가 개인에 대해 정량적으로 평가 될 수 있기 때문에 대량 평가 (고전적인 후각 컨디셔닝에 사용)를 통해이 프로토콜에 이점을 부여합니다. 가변성. 더욱이, 현미경의 밑에 직접 행해지는 훈련 절차는 행동 실험에서 전형적으로 이용되는 고전적인 후각 조절 패러다임과 크게 동일하며 뉴런의...

학습을 통해 뇌에서 정보를 획득하고 메모리로 저장하는 위치와 방법을 해독하는 것은 신경과학1에서 가장 어려운 작업 중 하나입니다. 신경과학 연구는 학습과 기억 형성의 기초가 되는 신경 기질로서 시냅스 전송의 변화의 개념을 주도하고 있다2,3. 그것은 가설, 학습 하는 동안, 자극의 인식 동안 활성화 되는 신경 앙상블 간의 시 냅 스 연결 메모리 회수 하는 동안 그들의 결합 된 활동 패턴을 검색할 수 있도록 수정 될, 따라서 지시 향후 행동 행동4. 이러한 "engram 세포" 그리고 그들의 시 냅 스는 종종 뇌 영역 및 처리의 수준에 걸쳐 배포, 작업 또는 자극의 학습에 시 냅 스 전송에 관찰 된 변화를 할당 하기 어려운. 특정 학습 작업에 인가적으로 연결된 시냅스 변화를 지역화하고 시각화하려면 시냅스를 정확하게 제한하는 적절한 모델 시스템이 필요합니다.
이러한 노력을 위해, Drosophila 멜라노가스터는 상대적인 두뇌 단순성, 행동 풍요로움 및 실험적 접근성을 결합하기 때문에 특히 적합합니다. 잘 확립 된 모델 유기체 중, Drosophila는 선충 C. 예쁜 꼬마와 신경 복잡성의 관점에서 마우스와 같은 유전적으로 견인 포유 동물 사이에 위치하고 있습니다. 뉴런 (~300)과 제한된 행동 레퍼토리의 입체 수는 C. elegans에서 관찰됩니다. 포유류는, 다른 한편으로는, 뉴런의 수백만있고 엄청난 행동 복잡성이 있습니다. 과일 파리의 뇌는 ~ 100,000, 대부분의 척추 동물의 뇌보다 훨씬 작은 뉴런, 그리고 뉴런의 대부분은 개별적으로 식별 할 수있습니다 5. 그러나, Drosophila는 40 년 전에 처음 기술된 강력한 연관 후각 학습 및 기억 형성을 전시하는 기능을 포함하여 복잡한 행동의 넓은 스펙트럼을 보여줍니다6. 이 고전적인 컨디셔닝 절차의 과정에서, 파리의 그룹은 조건부 자극 (CS+)으로냄새를 받게되고 무조건 자극 (미국)으로 처벌 전기 충격을받습니다. 두 번째 냄새 (CS- )는 어떤 처벌없이 제시된다. 이에 의해, 동물들은 처벌과 관련된 악취를 피하는 법을 배워, 이는 두 냄새,CS+및 CS-사이의후속 선택 상황에서 시험될 수 있다. Drosophila에서 이 행동의 밑에 있는 신경 기질해저에 대한 연구는 버섯 바디 (MB)를 "engram"7,8,9,10의 1차 부위로 확인했습니다 따라서, 이 뇌 영역의 회로는 메모리 엔그램이 획득되고 저장되는 논리를 밝히기 위해 강렬한 연구의 대상이되고 있다 (최근11,12에서검토).
Drosophila MB는 반구당 ~2,000개의 본질적인 뉴런(Kenyon cells)으로 구성되어 있으며, 축삭돌출부 13으로구성된다. 후각 프로젝션 뉴런의 축삭은 MB의 주요 수지상 입력 부위인 MB 칼릭스및 안테나 로브로부터 후각 입력을 수신하는 측면 프로토세레브라 및 MB 칼리세스로 확장된다. 케년 세포의 길고 평행한 축삭 번들은 페던클과 로브를 구성한다. 대부분의 케년 세포는 수평 β/β'-로브를 형성하여 뇌의 중간선쪽으로 하나의 부수적인 것을 확장하고, 등쪽 전방 방향으로 두 번째 부수적 인 투영을 연장시킴으로써 수직 α/α'-로브를 형성합니다. 케년 세포의 다른 그룹은 학습 과정 및 후속 단기 기억 형성이 국소화 될 수있는 MB의 수평 γ-로브(13)를 형성한다 10. MB 로브는 구심성 입력을 수신하고 원심성 출력을 제공하며, 둘 다 일반적으로 케니언 셀 축삭14,15,16을따라 뚜렷한 구획 하위 영역으로 제한된다. 특히, 구심성 도파민성 MB 입력 뉴런은 부가가치 기반, 예를 들어, 연관후각 학습에서 징벌적, 강화 효과를 중재하는 것으로 나타났다15,17. 버섯 체외로부터 의기질적이고 개별적으로 식별 가능한 원추형 MB 출력 뉴런은 많은 수의 케니언 세포에 걸쳐 정보를 통합하고, 다양한 뇌 영역을 표적으로 하며, 행동-유익한 식욕 또는 비열한 정보를 지니고있습니다 15 . 이러한 뉴런 아키텍처는 연관 엔그램의 조직에 대한 개념으로 이어졌다. 냄새는 상대적으로 정확하게 케니언 세포의 드물게 활성화 앙상블에 의해 인코딩된다. 이러한 케니언 세포 앙상블의 일치 활성 및 도파민의 방출 - 자극을 처벌하여 불러일으킨 - 케년 세포 프리시냅스에서 MB 출력 뉴런으로의 전염을 조절하여 동물이 이후에 이 특정 한 냄새를 피할 수 있도록10 ,12. 우리는 시냅스 활동에 있는 이 학습 의존적인 변경이 어떻게 결정되고 감시될 수 있는지 설명하기 위하여 패러다임 사례로 오히려 정확하게 정의되고 현지화된 engram를 이용합니다.
모델 시스템으로 Drosophila의 가치는 복잡한 회로18내의 단일 뉴런을 식별, 모니터링 및 제어하기 위한 트랜스유전자를 표현할 수 있는 타의 추종을 불허하는 유전 적 도구 상자에 강하게 의존합니다. 여기에서 논의된 칼슘 이미징과 같은 신경 활동 모니터링을 위한 기술의 출현은 특정 자극에 반응하여 신경 활동 패턴의 측정을 허용했습니다. 유전자 인코딩된 칼슘 지표(GECIs)의 특정 Gal4 구동 식과 후각 자극을 결합함으로써, 관심 있는 뉴런의 악취유발 칼슘 역학을 시각화할 수 있다19. 이 프로토콜에서는 이 기술을 고전적인 컨디셔닝 패러다임과 추가로 결합함으로써 학습의 맥락에서 이러한 후각 반응을 검사할 수 있음을 보여준다. 학습 유도 가소성은 단일 특정 뉴런뿐만 아니라 뉴런의 특정 하위 구획에 국한되는 GECI를 사용하여 추가로 해부 될 수 있습니다. Pech 등20 정확히 이것을 허용하는 도구의 선택을 설립했다. GCaMP321을 척추동물 시냅토피신 또는 d호머에 대한 연계를 통해 사전 또는 후시냅스를 대상으로 함으로써, 각각20-이들부위의 차등 변조를 구별할 수 있다. 이러한 국소화는 시토솔 전체에 걸쳐 유비쿼터스적으로 존재하는 대부분의 GEC에 비해 이점이 있습니다 -예를 들어, GCaMP22,GCaMP321,또는 GCaMP623 - 사전 및 사후 내시 과도가 될 수 있음을 의미하기 때문에 신경 활성화의 결과로 발생하는 전반적인 통합 칼슘 유입과 구별됩니다. 이 결과 발생 하거나 학습 및 메모리 형성을 일으키는 원인이 되는 가소성의 위치와 종류에 대 한 단서를 제공할 수 있습니다. 일례로, 여기에 제공된 프로토콜은 후각 연관 학습 동안 MB 출력 뉴런의 변조를 해독하는 데 있어서 이 도구의 가치를 나타낸다. 모니터링함으로써, 개별 비행 내에서, 후각 컨디셔닝 전후의 악취 유발 활동은 순진한 냄새 반응과 학습된 냄새 반응 사이에 직접적인 비교를 그릴 수 있습니다. 동일한 이미징 챔버에 고정되어 있는 동안 파리는 다양한 냄새에 노출됩니다. 그런 다음, 이러한 악취 중 하나가 감전과 짝을 이루는 비동기 연관 컨디셔닝프로토콜을 수신하고 (CS +가됨) 또 다른 냄새가 보강없이 제시됩니다(CS가됨 -). 마지막으로, 파리는 첫 번째 단계에서와 같은 냄새에 다시 노출됩니다. 칼슘 역학은 2 광자 현미경 검사법을 사용하여 관찰됩니다.

<table><tbody><tr><td>1-Octen-3-ol</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>O5284</td><td>부취제로 사용되는 화학물질</td></tr><tr><td>3-Octanol</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>218405</td><td>부취제로 사용되는 화학물질</td></tr><tr><td>4-Methylcyclohexanol</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>153095</td><td></td></tr><tr><td>EGFP(525/50 nm)의 부취제 대역통과 필터</td>로 사용되는 화학물질<td>Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>투명 접착 테이프</td><td>Tesa SE, Norderstedt, Germany</td><td></td><td>표준 투명 접착 테이프</td></tr><tr><td>오목-볼록 턱</td><td>Fine Science Tools, North Vancouver, Canada</td><td>10053-09</td><td>오목-볼록 턱이 있는 블레이드 홀더</td></tr><tr><td>Fine</td><td>Science Tools, North Vancouver, Canada</td><td>11412-11</td><td>팁이 있는 집게 0.1 x 0.06mm</td></tr><tr><td>피하 주사 바늘</td><td>Sterican - B. Braun, Melsungenk, Germany</td><td></td><td>4665120 1.20x40mm</td></tr><tr><td>Insect Minutien pins</td><td>Fine Science Tools, North Vancouver, Canada</td><td>26002-10</td><td>직경 0.1mm, 팁 0.0125mm</td></tr><tr><td>Kentoflow</td><td>Kent Express Dental Supplies, Gillingham, UK</td><td>953683</td><td>Blue light-curing</td></tr><tr><td>glue Microscope slide</td><td>Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany</td><td>0656.1</td><td>Standard objective slide 76 x 26 mm</td></tr><tr><td>미네랄 오일</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>M8410</td><td>부취제의 희석제로 사용</td></tr><tr><td>모드 잠금 Ti-사파이어 레이저 Chameleon Vision 2</td><td>Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA</td><td></td> 조정 <td>가능한 적외선 펨토초 레이저</td></tr><tr><td>다광자 현미경 LSM 7MP BiG 검출기</td><td>장착 Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany</td><td></td><td>다광자 현미경, 여러 회사에서 유사한 장치를 제공합니다.</td></tr><tr><td>Plan-Apochromat 20x (NA = 1.0) 수침 대물</td>렌즈 <td>Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany</td><td>421452-9900-000</td><td>Objective W "Plan-Apochromat" 20x/1.0 DIC M27 70mm</td></tr><tr><td>Ringer's solution</td> n.a.n.a.5mM <td></td><td></td><td>KCl, 130mM NaCl, 2mM MgCl2, 2mM CaCl2, 5mM Hepes-NaOH, 36mM 자당, pH = 7.4</td></tr><tr><td>찌르기 칼</td><td>Sharpoint, Surgical Specialties Corporation, Reading, PA, USA</td><td>72-1551</td><td>5.0mm 직선 제한 블레이드</td></tr> 깊이 <tr><td>수술용 메스 블레이드</td><td>Swann-Morton, Sheffield, UK</td><td>0303</td><td>제품 번호 11</td></tr><tr><td>외과용 메스 핸들</td><td>Swann-Morton, Sheffield, UK</td><td>0907</td><td>제품 번호 7S/S</td></tr><tr><td>VBA(Visual Basics of Applicatons) 소프트웨어는 냄새 전달 장치에서 트리거 를 수신하고 전기 충격 응용 장치(전원 공급 장치)는 현미경을 제어하는 Zeiss의 ZEN 소프트웨어와 상호 작용합니다.</td><td>주문 제작되고 요청시 사용 가능</td><td>n.a.n.a</td><td>.</td></tr></tbody></table>

초파리 멜라노가스터에서 학습 유발 시냅스 가소성의 생체 내 광학 칼슘 이미징

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

많은 모형 유기체에 있는 연구의 십년간은 시냅스가 소성의 현재 개념 기초적인 학습 및 기억 형성으로 이끌어 냈습니다. 시 냅 스 전송에 학습 유발 된 변화는 종종 많은 뉴런및 뇌의 처리 수준에 걸쳐 배포. 따라서, 뉴런에 걸쳐 학습 의존 시 냅 스가 소성을 시각화 하는 방법이 필요 하다. 열매 파리 드로소필라 멜라노가스터는 학습의 기초가 되는 뉴런 회로를 연구하는 데 특히 유리한 모델 유기체를 나타낸다. 여기에 제시된 프로토콜은 연관 후각 기억, 즉 시냅스 활성 및 그 변화의 형성의 기초가되는 프로세스가 생체 내에서 모니터링 될 수있는 방법을 보여줍니다. Drosophila에서유효한 유전 공구의 광범위한 배열을 사용하여, 결정된 세포 인구 및 단 하나 세포에 있는 유전으로 부호 매겨진 칼슘 표시기를 구체적으로 표현하는 것이 가능합니다. 제자리에 비행을 고정하고 헤드 캡슐을 열어, 후각 자극을 전달하는 동안 이러한 세포에서 칼슘 역학을 시각화 할 수있다. 또한, 우리는 비행이 신체에 감전을 동시에 실시 할 수있는 설정을 보여줍니다. 이것은 파리가 고전적인 후각 컨디셔닝을 겪을 수있는 시스템을 제공합니다 - 이전에 순진한 냄새가 감전 처벌과 관련이 있는 것으로 배운다 - 동시에이 냄새 (및 기타 훈련되지 않은 냄새)의 표현과 함께 두 광자 현미경 검사를 통해 뇌에서 관찰. 우리 실험실은 이전에 형광 칼슘 신호를 사전 또는 후시 내피 구획에 제한 할 수있는 합성 국소 칼슘 센서의 생성을보고했습니다. 2 광자 현미경 검사법은 공간적으로 미세 한 구조를 해결하는 방법을 제공합니다. 우리는 버섯 몸에서 정보를 통합 하는 뉴런에 초점을 맞추고이 예시, 곤충 두뇌의 높은 순서 센터. 전반적으로, 이 프로토콜은 후각 학습의 결과로 활동이 조절되는 뉴런 간의 시냅스 연결을 검사하는 방법을 제공한다.

위의 프로토콜로 획득한 이미지의 예는 그림 2에서볼 수 있습니다. d 호머-GCaMP3는 MB γ-로브의 구획 1을 내면화하는 MB 출력 뉴런으로 발현되며(뉴런은MVP2,29라고하며) 분할-Gal4 라인 MB112C16을사용하여 유전적으로 표적화된다. 또한, 세포순환 및 사후 공조 국소 칼슘 지표의 세포외 국소화의 차이도 입증되었다. 도 2a와 도 2f를비교할 때, dHomer-GCaMP3센서(14)의 특이적이고 구획화된 발현을 명확하게 관찰할 수 있다- 뉴런의 축색 구획에서 발현되지 않고, 현시부호가 보이는 구두점 신호 수지상에 보관할 수 있습니다. 클...

여기에서 우리는 Drosophila 학습 및 기억의 맥락에서 pre-및/또는 후성 칼슘이 구상될 수 있는 프로토콜을 제시합니다. 합성 국소화 된 칼슘 센서를 사용하여 생체 내 칼슘 이미징은 이러한 유형의 연관 학습의 기초가되는 시냅스 가소성이 결정될 수 있도록 고전적인 후각 조절 패러다임과 결합됩니다.

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. ...

이 기술은 drosophila 멜라노가스터에서 학습 및 메모리 형성의 기본 학습 및 메모리 형성을 위한 생리적 매개 변수로서 시냅스 칼슘 활성의 실시간으로 관찰을 용이하게 한다. 연관 훈련 전후의 냄새에 대한 신경 반응을 비교함으로써 시냅스 활동과 개별 과일 파리의 메모리 추적 형성 사이의 직접적인 상관 관계를 그릴 수 있습니다. 관심의 특정 뉴런이 원하는 GAL4 와 UAS 구조를 운반하는 여성 처녀와 남성 파리를 교차 하는 유전으로 인코딩 된 칼슘 표시기를 표현하는 형질 전환 과일을 생산하기 위해 3 ~ 6 일 후에 여성 자손나이.이미징을 위한 비행을 준비하려면 미세 한 집게를 사용하여 얼음 마취 비행을 사용자 정의 준비 된 이미징 챔버에 배치하십시오. 해부 현미경을 사용하여 흉부와 다리를 챔버 의 하단에있는 전선과 접촉하고 머리가 평평하게 누워 있습니다. 투명한 접착 테이프로 비행을 고정하고 외과 용 메스 블레이드를 사용하여 머리 주위의 테이프의 창을 잘라 안테나가 덮여 있고 흉부의 앞쪽 부분만 노출됩니다.오목한 볼록한 턱이 들고 있는 곤충 핀을 사용하여 파란색 광 경화 접착제로 머리의 측면과 뒷면을 조심스럽게 둘러싸습니다. 그리고 접착제를 설정하는 LED 램프를 방출 하는 파란색 빛을 사용 하 여. 접착제가 완전히 설정되면 플라이 헤드의 등대 표면에서 잔류되지 않은 접착제를 지우고 링거 용액을 한 방울로 머리의 노출된 큐티클을 덮습니다.매우 미세한 칼날을 사용하여, 코엘리에서 시작하여 각 측면 내측을 눈으로 자르기 시작하여 집게를 사용하여 쉽게 찢어질 수 있는 큐티클의 플랩을 형성하기 위해 머리 뒤쪽을 가로질러 큐티클을 잘라냅니다. 관심의 뇌 영역을 차단하 고 신중 하 게 어떤 기관의 등대 표면을 취소 하는 좋은 집게를 사용 하 여 어떤 과잉 큐티클을 제거, 뇌 조직 자체의 중단을 피하기 위해 주의. 조직 파편 영역을 지우기 위해 필요에 따라 링거의 용액을 제거하고 새로 고칩니다.그리고 피하 악취 전달 바늘을 플라이의 머리로부터 약 1센티미터 떨어진 곳에 놓고, 안테나에 악취 전달을 방해할 수 있는 것은 아무것도 없다. 그런 다음 피하 악취 전달 바늘을 통해 이미징 챔버를 악취 전달 시스템에 연결합니다. 그리고 비행이 마취 및 수술에서 회복 10 분 허용합니다.GFP 기반 칼슘 지표의 시각화를 위해 적외선 레이저가 장착된 다광 현미경의 레이저와 진동 격리 테이블에 설치된 수분 침지 목표를 920 나노미터의 난루 파장에 조정하고 GFP 밴드패스 필터를 설치합니다. 코스 Z 조정 노브를 사용하여 뇌의 Z 축을 스캔하여 관심있는 뇌 영역을 찾습니다. 자르기 함수를 사용하여 스캔 시간을 최소화하기 위해 관심 영역에만 스캐닝에 초점을 맞춥니다.그리고 헤드의 전방이 아래쪽을 향하고 있도록 스캔 뷰를 회전합니다. 그런 다음 프레임 크기를 512x512픽셀로 조정하고 스캔할 영역을 선택합니다. 각 프레임에 대해 계산된 스캔 시간을 고려하여 최소 4개의 hertz의 프레임 속도를 달성합니다.악취 유발 칼슘 과도 시각화의 경우 이미지 획득 소프트웨어 및 악취 전달 프로그램을 연결할 수 있는 미리 프로그래밍된 매크로 패키지를 시작하고 6.25초 동안 현미경 소프트웨어에서 측정을 시작하여 F0 기준값을 설정합니다. 악취 전달 시스템에서는, 특정 악취 컵 밸브의 개폐에 의해 트리거된 LED의 조명에 의해 여기에 표시된 2.5 초 악취 자극을 전달합니다. 냄새 오프셋의 끝에 기록의 12.5 초 뒤에.그런 다음 동일한 방식으로 두 번째 및 세 번째 냄새에 대한 배달을 반복합니다. 이 설정에서 연관 컨디셔닝을 수행하려면 컴퓨터 제어 악취 전달 시스템을 사용하여 12 90 볼트 감전과 함께 60초 동안 조절된 자극-플러스 냄새를 제시합니다. 60초 의 휴식 후 감전없이 60 초 동안 조건부 자극 - 마이너스 - 냄새만 제시한다.훈련 후 3분 후 사전 훈련 악취 자극 프로토콜을 반복하여 칼슘 과일성을 다시 측정한다. 그런 다음 이미징 파일을 나중에 이미지 분석을 위한 적절한 형식으로 저장합니다. 여기서 대표적인 버섯 체출력 뉴런 이미지는, 입증된 바와 같이 획득하여 관찰될 수 있다.뉴런의 축축구에서 발현되지 않는 dHomer-GCaMP3 센서의 특이적 구획식 발현은 수지상 구획에서 정점 신호를 나타낸다. 명확한 진폭 냄새 반응은 세포성 GCaMP6f를 표현하는 파리에 비해 dHomer-GCaMp3을 표현하는 파리에서 관찰 될 수 있습니다. 여기서, 한 개별 비행의 대표적인 칼슘 흔적은 개별적인 준비 사이에서 얻을 수 있는 소음 수준 및 진폭의 차이를 보여줍니다.이 기술은 하위 셀룰러 수준에서 시각화의 가능성을 열었습니다, 후각 표현이 변조되는 방법 및 컨디셔닝을 통해 메모리 단계가 형성되는 방법. 이러한 실험은 버섯 몸과 같은 복잡한 뇌 구조에 대한 우리의 이해를 확장하고, 연관 기억이 뉴런의 분산 된 인구에 걸쳐 저장하는 방법을 특성화하는 것이 중요 할 것이다.

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우리는 생활 antennal 엽에서 냄새 evoked 칼슘 반응을 측정하고 분석하기 위해 설립 기법을...

의 냄새-evoked 응답의 칼슘 이미징 Drosophila Antennal 엽

이 비디오는 GCaMP를 사용하여 초파리 뉴런의 생체 내 칼슘 이미징을 설명합니다. 주요 프로토콜 클립은 후각 조절 실험 중 버섯체 뉴런에서 GCaMP 형광의 변화를 기록하는 방법을 보여줍니다.

초파리 In Vivo 칼슘 이미징: 뉴런 활동의 기능적 이미징 방법

이 비디오는 파리에서 시냅스적으로 국소화된 칼슘 센서를 사용하여 생체 내 칼슘 이미징 방법을 보여줍니다. 현미경 검사를 위해 파리를 준비하고, 후각 조절을 수행하고, 냄새로 인한 칼슘 유입을 시각화하는 단계를 간략하게 설명합니다.

생체 내 Drosophila melanogaster에서 Synaptically Localized Calcium Sensors를 사용한 칼슘 이미징

출처: Ishimoto, H. et. al., 초파리의 내분비 신호에 대한 뇌 반응을 시각화하기 위한 생체 외 칼슘 이미징. J. vis. Exp. (2018) 이 비디오는 연구를 위한 칼슘 이미징을 보여줍니다.초파리 뉴로펩티드에 대한 뇌 반응. 형광 칼슘 지표를 발현하는 뉴런은 세포 내 칼슘 역학과 신호 분자에 대한 기능적 반응을 나타냅니다.

뉴로펩티드에 대한 초파리 뇌 반응을 연구하기 위한 Ex vivo 칼슘 이미징

출처: Lark, A. R., et. al., 생물 발광 칼슘 지표 GFP-aequorin을 기반으로 한 생체 내 기능적 뇌 이미징 접근 방식. J. Vis. Exp. (2016)이 비디오는 Green을 사용한 칼슘 역학의 실시간 이미징을 보여줍니다. 초파리 심부 뇌 구조에서의 형광 단백질-aequorin 생물 발광.

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에서 이미징 칼슘<em&gt; 초파리</em&gt; 계란 활성화에

여기에 우리가 설명 단일 분자 사진 활성화 지역화 현미경 라이브 초파리 melanogaster 의 모터 신경 맨끝에 실시 될 수 있습니다 하는 방법 3 유 충 탈피.

Vivo에서 단일 분자 초파리 연 접 모터 신경 맨끝에 추적

여기에서는 간질 활동을 모니터링하기 위해 GCaMP6 발현 성인 초파리의 생체 외 칼슘 이미징 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 생체 외 칼슘 이미징을 통해 성인 초파리의 ictal 사건을 조사하는 데 유용한 도구를 제공하여 세포 수준에서 간질의 잠재적 메커니즘을 탐구할 수 있도록 합니다.

Ex Vivo (체외 주행) 간질의 초파리 모델을 위한 칼슘 영상

칼슘 이미징 접근법은 용액이 라벨에 적용되는 동안 깨어 있는 파리의 뇌에서 미각 유도 반응을 기록할 수 있습니다. Drosophila melanogaster 의 1차 미각 반응이 예로 사용되지만 이 프로토콜은 다운스트림 뉴런 또는 다른 종을 연구하는 데 적용할 수 있습니다.

생체 내 성체 초파리에서 미각 유도 신경 반응의 칼슘 이미징

학습 및 기억과 같은 인지 과정 중 세포 활동을 연구하는 데 있어 중요한 장벽은 생체 내 이미징 준비를 위해 마취제를 사용하는 것입니다. 마취는 초파리(Drosophila)를 포함한 여러 모델에서 단기 기억과 인지를 손상시킵니다.이 연구는 마취 없이 생체 내 이미징을 위해 성인 초파리를 준비하는 독특한 방법을 제시합니다.

생체 내 마취되지 않은 초파리 성충의 신경 활동 이미징

우리는 고정을 위해 국소 조직 접착제를 사용하여 초파리 유충 후각 뉴런에 대한 칼슘 이미징 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 안정성을 향상시켜 신뢰할 수 있는 생체 내 및 생체 외 실험을 용이하게 합니다. 맞춤형 R 스크립트는 칼슘 신호를 분석하여 상세한 신경생리학적 연구를 위한 효율적인 플랫폼을 제공합니다.

3령 초파리 멜라노가스터 유충에서 후각 회로 뉴런의 생체 내 및 생체 외 칼슘 이미징

학습하세요 Drosophila melanogaster에서 생체 내 광학 칼슘 이미징을 이용한 시냅스 가소성 연구 방법. 이 기술은 연합학습 중 칼슘 역학을 실시간으로 시각화하여 기억 형성의 신경 메커니즘을 이해하는 데 활용됩니다.

초파리 멜라노가스터에서 학습 유발 시냅스 가소성의 생체 내 광학 칼슘 이미징

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