Name: ショウジョウバエメラメラノガスターにおける学習誘発シナプス可塑性の生体内光学カルシウムイメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: 学ぶシナプスカルシウムイメージングによる学習と記憶の神経機構。Drosophila melanogasterを用いた古典的条件付けと生体内カルシウムダイナミクス可視化法で、シナプス可塑性のリアルタイム観察を実現します。

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本研究は、共同研究センターSFB 889「感覚処理のメカニズム」と2705「脳回路の解剖:脳回路の解剖:構造、可塑性および行動機能」を通じてドイツ研究評議会の支援を受けた。ショウジョウバエキノコボディ」。

1. トランスジェニックフルーツハエ、ショウジョウバエメラノガスター
<ol><li>所望のGal4とUASをそれぞれ25を運ぶクロスメスの処女と雄のハエ(12時間の光/暗いサイクルで60%の相対湿度で25°Cで上昇)は、それぞれ、目的の特定のニューロンが遺伝的にコードを発現するハエを生成するカルシウムインジケータ。</li>
	<li>彼らは3-6日のポストエクロションの範囲になるまで、上記の十字架の女性の子孫を年齢。メスのハエは、そのわずかに大きなサイズのために好ましいです。</li>
</ol>2. 生体内カルシウムイメージング用フルーツフライの調製
<ol><li>単一の女性のハエを選択し、5分以上氷の上に麻酔します。</li>
	<li>微細な鉗子を使用して、画像室内にハエを置きます(図1cに示します)。胸郭と脚がチャンバの底部の電線と接触し、頭部が平らに置かれることを確認します。透明な粘着テープを使用してハエの位置を修正します。 注:このプロトコルは、ハエが固定され、ヘッドカプセルが開口部にアクセス可能で、ハエがアンテナへの臭気刺激と胸部と脚への感電の両方を受け取ることができるカスタム構築されたチャンバーを必要とします(図1)。</li>
	<li>メスのハンドルに固定された外科メスブレード(材料の表を参照)を使用して、ハエの頭部の周りのテープの窓をカットし、アンテナを覆い、胸郭の最も前の部分だけを露出させたままにします。</li>
	<li>青光硬化接着剤で頭の側面と背面を囲み、凹凸の顎が保持する昆虫ピンを使用して慎重に操作します。青色発光LEDランプを使用して接着剤を設定します。</li>
	<li>接着剤が完全にセットされているのを確認し、フライヘッドの背面から残留されていない接着剤をクリアします。</li>
	<li>リンガーの溶液24(材料の表を参照)の滴を適用して、頭部の露出したキューティクルを覆う。</li>
	<li>非常に細かい刃の刺しナイフを使用して、キューティクルを切り取ります。キューティクルの最も効率的な除去のために、最初に出発点としてオチェリを使用して頭の後部を横切ってカットします。次いで、両側を切り取り、目に中間に、鉗子を用いて容易に引き裂くことができるキューティクルのフラップを形成する。</li>
	<li>目的の脳領域をブロックする可能性のある余分なキューティクルを削除します。.</li>
	<li>細かい鉗子を使用して気管の後部を慎重にクリアし、脳組織自体の破壊を回避します。組織の破片の領域をクリアするために必要に応じて、リンガーの溶液24(材料の表を参照)を取り外してリフレッシュします。</li>
	<li>皮下臭分針をハエの頭部から約1cmの位置に置きます。アンテナへの臭気の配信を妨げるものがないことを確認します。</li>
	<li>顕微鏡で、画像化チャンバを皮下臭送達針を介して臭気送システムに接続する。</li>
	<li>ハエが麻酔や手術から完全に回復し、空気の流れに適応できるようにするために、この段階で10分の休息期間を実施する。</li>
</ol>3. インビボカルシウムイメージング
<ol><li>赤外線レーザーと水浸しの目的(材料の表を参照)を備えたマルチフォトン顕微鏡を使用して、振動絶縁テーブルに設置します。GFPベースのカルシウム指標を可視化するには、レーザーを920nmの励起波長に調整し、GFPバンドパスフィルタを取り付します。</li>
	<li>粗いZ調整ノブを使用して、脳のZ軸をスキャンし、目的の脳領域を見つけます。トリミング機能を使用して、スキャン時間を最小限に抑え、ヘッドの前部が下向きに向かうようなスキャン ビューを回転させるために、この領域のみにスキャンを集中させます。</li>
	<li>フレーム サイズを 512 x 512 px に調整し、スキャン速度を > 4 Hz に調整し、領域をスキャン(Y 寸法)して、対象のニューロンがカバーするようにします。</li>
</ol>4. 嗅覚調節を通じた臭気誘発カルシウム過渡の可視化
<ol><li>一時的に正確な方法でいくつかの臭気刺激を送ることができる臭気送達システム19、26を使用する。<ol>
<li>追加のコンピュータを使用してデバイスを制御し、イメージング顕微鏡ソフトウェアと通信して、実験中の画像キャプチャと臭気刺激を調整します。</li>
		<li>画像取得ソフトウェアと臭気配信プログラム(顕微鏡制御ソフトウェアにインストールされたVBAマクロパッケージなど、外部入力に応答する「材料の表」を参照)をリンクできる事前プログラム済みのマクロパッケージを開始します。別のプログラムで臭気配信プロトコルの開始によって提供されるトリガ)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>「事前訓練」/ナイーブ臭気誘発カルシウムトランジェントを512 x 512 pxの解像度で監視し、4 Hzのフレームレートで測定を開始します。0ベースライン値)と、臭気オフセット後の 12.5 s。これを2番目の臭気で繰り返し、次に第3の臭気で繰り返します。</li>
	<li>古典的なコンディショニング(「トレーニング」)フライでこの測定の後3分続けます。<ol>
<li>「事前トレーニング」フェーズで提示された臭いのいずれかを選択してCS+臭いになり、もう1つはCS-臭気になります。12の90 V電気ショックと一緒に60秒のためのコンピュータ制御の臭気配達システムを使用してCS+臭気を提示します。</li>
		<li>60sブレークの後、CS- 60 s.臭気4-メチルシクロヘキサノールおよび3-オクタノールとして使用するCSを単独で提示する。このトレーニング中に第3の臭気(例えば、1オクテン-3-ol)を提示しないでください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>「トレーニング後」の臭気誘発カルシウム過渡を「事前トレーニング」臭気刺激プロトコル(ステップ4.2.)を3分繰り返して、トレーニングフェーズを終了した後(ステップ4.3)。 注:このステップのタイミングは、メモリ形成後の関心時間を反映する必要があります(例えば、短期記憶を調べるコンディショニングステップの後にこのステップを3〜4分後に実行する)。通常、ハエはこの準備で数時間生き残ることができます。</li>
	<li>後で画像解析を行うために、イメージング ファイルを適切な形式 (Tiff など) に保存します。</li>
</ol>5. 画像解析
<ol><li>画像を分析するには、フィジー27などの画像解析ソフトウェアで Tiff (または類似の) ファイルを開きます。</li>
	<li>移動補正アルゴリズムを使用してスタックを位置合わせし、X 方向と Y 方向の動きを最小限に抑えます。Z 軸で強い動きを示す録音を破棄します。</li>
	<li>検査対象地域 (ROI) をマークするために使用するソフトウェアのツールを選択します。これは、背景蛍光の影響を制限するために、可能な限り正確でなければなりません。</li>
	<li>ソフトウェアのそれぞれのツールを使用して、選択したROIからデータファイルとして時間蛍光強度データを抽出し、記録の各フレームに対して値が生成されます。</li>
	<li>データ分析プログラムを使用してデータを開き、各臭気トレースの ΔF/F0値を計算します。F0=臭気発症前の2sにおける平均蛍光。ΔF = 所定のフレーム内の生蛍光とF0の差。これらの値から、匂気刺激期間全体の相対蛍光を反映するために時間に対してプロットできる各フレームのΔF/F0値を計算します。</li>
</ol>

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</ol>

著者は何も開示していない。

学習と記憶の基礎となる神経回路の解剖は、神経科学の分野で顕著な目標です。ショウジョウバエの遺伝的アクセシビリティと行動検査の幅と容易さは、このような現象を調査するための理想的なツールです。ここで、個々のハエの中で、嗅覚調節の結果として細胞内レベルで起こる変調を可視化することができる方法が提示される。当社グループ17が最初に設立した臭気誘発カルシウムダイナミクスの事前訓練と後のトレーニングビジュアライゼーションの両方を行うことで、素朴な匂気反応と学習した臭気反応との間の直接的な動物内比較を描き、したがって、目的のニューロンの可塑性を調べる。これは、トレーニング前および後の状態を個人に対して定量的に評価できるため、一括評価(古典的な嗅覚調節で使用される)よりもこのプロトコルに有利です。変動。さらに、顕微鏡下で直接行われるトレーニング手順は、通常行動実験で使用される古典的な嗅覚調節パラダイムとほぼ同等であり、ニューロンの人工光遺伝学的刺激を伴いません。もちろん、小さなハエを扱い、感覚器官をそのまま維持しながら脳組織を傷つけずにヘッドカプセルを慎重に開くには、細...

学習を通じて脳内で情報を取得し、その後メモリとして保存する場所と方法を解読することは、神経科学1の中で最も困難なタスクの1つです。神経科学的研究は、学習と記憶形成2、3の根底にあるニューロン基板としてのシナプス伝達の変化の概念につながっています。学習中に、刺激の知覚中に活動するニューロンアンサンブル間のシナプス接続が、記憶リコール中にそれらの結合された活動パターンを取り出すことができるよう変更され、それによって指示されるのが仮説である。将来の行動行動4.これらの「エングラム細胞」とそのシナプスは、多くの場合、脳領域と処理のレベルに分散され、タスクまたは刺激の学習にシナプス伝達の観察された変化を割り当てることが困難になります。特定の学習タスクに因果的にリンクされているシナプスの変更をローカライズして視覚化するには、それらのシナプスを正確に限定できる適切なモデル システムが必要です。
このような試みのために、ショウジョウバエメラノガスターは、相対的な脳の単純さ、行動の豊かさ、および実験的なアクセシビリティを兼ね備えているため、特に適しています。確立されたモデル生物の中で、ショウジョウバエは、線虫C.エレガンスと神経の複雑さの面でマウスのような遺伝的に扱いやすい哺乳類の間に位置しています。C.エレガンスでは、ニューロンの立体数(〜300)と限られた行動レパートリーが観察される。一方、哺乳類は何百万ものニューロンを持ち、驚異的な行動の複雑さを持っています。フルーツフライの脳は、その〜100,000で、ほとんどの脊椎動物の脳よりも有意に小さいニューロンであり、ニューロンの多くは個別に識別可能5である。しかし、ショウジョウバエは、40年以上前に最初に説明された、堅牢な連想嗅覚学習および記憶形成を示す能力を含む、複雑な行動の広いスペクトルを示す6。この古典的な調節手順の過程で、ハエの群れは、条件付き刺激(CS+)として臭いを受け、無条件刺激(米国)として罰せられる感電を受ける。第二の臭い(CS-)は、任意の罰なしで提示されます。それによって、動物は、2つの臭い、CS+およびCS- の間の後続の選択状況でテストすることができる罰に関連する臭気を避けることを学ぶ。ショウジョウバエにおけるこの行動の根底にある神経基板の解剖に関する研究は、キノコ体(MB)を「エングラム」7、8、9、10の主要部位として同定した。したがって、この脳領域の回路は、メモリエングラムが取得および保存されるロジックを明らかにするために、激しい研究の対象であった(最近11、12で検討)。
ショウジョウバエMBは、半球当たり約2,000個の固有ニューロン(ケニヨン細胞)からなる、並列軸法突起13で編成される。嗅覚投影ニューロンの軸索は、横プロトセレブラとMBカリセス、MBの主な樹状入力部位に拡張され、アンテナローブからの嗅覚入力を受け取る。ケニヨン細胞の長い平行軸線束は、ペダンクルとローブを構成します。ほとんどのケニヨン細胞は、脳の中線に向かって1つの担保を拡張することにより、水平β/β'-ローブを形成し、後部前方向に2番目の担保を伸ばすことによって垂直α/α'-ローブを二股に形成する。ケニヨン細胞の他のグループは、学習プロセスおよびその後の短期記憶形成が10に局在することができるMBの水平γ-葉13を形成する。MBローブは、アフェレント入力を受け取り、エフェレント出力を提供し、どちらも通常、ケニヨンセル軸に沿った別個の区画サブ領域に制限されています14,15,16.特に、アフェレント・ドーパミン作動性MB入力ニューロンは、価値ベースを仲介することが示されており、例えば、懲罰的、連想嗅覚学習における効果を強化する15、17。キノコの体葉からのステレオタイピックおよび個別に識別可能なEFFerent MB出力ニューロンは、多数のケニヨン細胞間で情報を統合し、多様な脳領域を標的とし、行動に有益な食欲または嫌悪情報15.このニューロンアーキテクチャは、連想エングラムの組織の概念につながっています。臭気は、ケニヨン細胞のまばらに活性化されたアンサンブルによって比較的正確にコードされる。これらのケニヨン細胞アンサンブルの偶然の活動とドーパミンの放出 - 刺激を罰することによって誘発される - 動物は、その後、動物が後でこの特定の匂いを避けるようにMB出力ニューロンにケニヨン細胞プレシナプスからの伝達を調節します10 、12.このエングラムをパラダイマティックなケースとして使用し、シナプス活性におけるこれらの学習依存的変化をどのように決定および監視するかを示します。
モデルシステムとしてのショウジョウバエの価値は、複雑な回路内の単一ニューロンを同定、監視、および制御するためのトランス遺伝子を発現することを可能にする比類のない遺伝的ツールボックスに強く依存しています18.ここで説明するカルシウムイメージングなどの神経活動モニタリングのための技術の出現は、特定の刺激に応答してニューロン活性パターンの決定を可能にした。遺伝的にコードされたカルシウム指標(GEC)の特定のGal4駆動発現と嗅覚刺激を組み合わせることにより、19の目的のニューロンの臭気誘発カルシウムダイナミクスを可視化することができる。このプロトコルでは、この技術を古典的なコンディショニングパラダイムとさらに結合することにより、学習の文脈でこれらの嗅覚応答を調べことが可能であることを示す。学習誘発可塑性は、単一の特定のニューロンに局在するだけでなく、ニューロンの特定のサブコンパートメントにも局在するGECを使用してさらに解剖することができます。Pech et al.20は、まさにこれを可能にするツールの選択を確立しました。GCaMP321を前または後のナプスに標的化することにより、脊椎動物シナプトフィシンまたはdホーマーへの連結を介して、それぞれ20-これらの部位の差動変調を区別することができる。このローカリゼーションは、この文脈において、サイトソル全体にユビキタスに存在するほとんどのGEC(例えば、GCaMP 22、GCaMP321、またはGCaMP623)に対する優位性を与える。ニューロン活性化の結果として生じる全体的な統合カルシウム流入と区別されます。これは、学習と記憶の形成を引き起こす結果として発生する可塑性の場所と種類に関する手がかりを提供することができます。一例として、ここで提供されるプロトコルは、カルシウムセンサの発現をポストシナプスのみに標的化することにより、嗅覚連想学習中のMB出力ニューロンの変調を解読する際のこのツールの価値を示す。モニタリングすることにより、個々のハエの中で、嗅覚調節の前後に臭気誘発活性を、ナイーブな臭気応答と学習された臭気応答との間で直接比較することができる。同じイメージングチャンバーに固定されている間、ハエは臭いの選択にさらされています。次に、これらの臭気の1つが電気ショック(CS+になる)と対になり、補強なしで別の臭いが提示される(CS-になる)逆連想調節プロトコルを受け取ります。最後に、ハエは再び最初のステップと同じ臭いにさらされます。カルシウムダイナミクスは、2光子顕微鏡を用いて観察される。

<table><tbody><tr><td>1-Octen-3-ol</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>O5284</td><td>化学薬品を匂わせる</td></tr><tr><td>3-Octanol</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>218405</td><td>匂い物質として使用する化学薬品</td></tr><tr><td>4-Methylcyclohexanol</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>153095</td><td></td></tr><tr><td>EGFP (525/50 nm)の匂い物質バンドパスフィルター</td>として使用する化学物質Carl <td>Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>透明粘着テープ</td><td>Tesa SE, Norderstedt, Germany</td><td></td><td>標準透明粘着テープ</td></tr><tr><td>凹凸顎</td><td>Fine Science Tools, ノースバンクーバー, カナダ</td><td>10053-09</td><td>凹凸顎付きブレードホルダー</td></tr><tr><td>Fine 鉗子</td><td>Fine Science Tools, ノースバンクーバー, カナダ</td><td>11412-11</td><td>先端付き鉗子 0.1 x 0.06mm</td></tr><tr><td>皮下注射針</td><td>Sterican - B. Braun, Melsungenk, Germany</td><td>4665120</td><td>1.20x40mm</td></tr><tr><td>Insect Minutien pins</td><td>Fine Science Tools, North Vancouver, Canada</td><td>26002-10</td><td>直径0.1mm、先端0.0125mm</td></tr><tr><td>Kentoflow</td><td>Kent Express Dental Supplies, Gillingham, UK</td><td>953683</td><td>Blue light-curing glue</td></tr><tr><td>Microscope slide</td><td>Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany</td><td>0656.1</td><td>標準対物レンズスライド 76 x 26 mm</td></tr><tr><td>鉱物油</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>M8410</td><td>匂い物質の希釈剤として使用</td></tr><tr><td>モードロック Ti-Sapphire レーザー カメレオン Vision 2</td><td>Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA</td><td></td><td>チューナブル赤外線フェムト秒レーザー</td></tr> 多<tr><td>光子顕微鏡 LSM 7MP BiG検出器搭載</td><td>Carl Zeiss Microscopy GmbH, イエナ, ドイツ</td><td></td><td>多光子顕微鏡、複数の企業が同様のデバイスを提供しています。</td></tr><tr><td>Plan-Apochromat 20x (NA = 1.0) 水浸対物レンズ</td><td>Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany</td><td>421452-9900-000</td><td>対物レンズ W "Plan-Apochromat" 20x/1.0 DIC M27 70mm</td></tr><tr><td>Ringer's solution</td> n.a.n.a.5mM <td></td><td></td><td>KCl, 130mM NaCl, 2mM MgCl2, 2mM CaCl2, 5mM Hepes-NaOH, 36mM スクロース, pH = 7.4</td></tr><tr><td>スタブナイフ</td><td>Sharpoint, Surgical Specialties Corporation, Reading, PA, USA</td><td>72-1551</td><td>5.0mm 刃の深さ</td></tr>制限 <tr><td>外科用メス刃</td><td>Swann-Morton, Sheffield, UK</td><td>0303</td><td>製品番号 11</td></tr><tr><td>外科用メスハンドル</td><td>Swann-Morton, Sheffield, UK</td><td>0907</td><td>製品番号 7S/S</td></tr><tr><td>Visual Basics of Applicatons(VBA)ソフトウェアは、臭気伝達装置からトリガー を受け取り、電気ショック アプリケーションデバイス(電源)と対話して、顕微鏡を制御するZeissの ZENソフトウェアと対話します。</td><td>カスタムメイドで、ご要望に応じてご利用いただけます</td><td></td><td>。</td></tr></tbody></table>

ショウジョウバエメラメラノガスターにおける学習誘発シナプス可塑性の生体内光学カルシウムイメージング

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

多くのモデル生物の研究の数十年は、学習と記憶形成の基礎となるシナプス可塑性の現在の概念につながっています。シナプス伝達の学習誘発変化は、多くのニューロンと脳内の処理のレベルに分散されることが多い.そのため、ニューロン間で学習依存性シナプス可塑性を可視化する方法が必要である。フルーツフライショウジョウバエメラノガスターは、学習の基礎となる神経回路を研究するために特に有利なモデル生物を表す。ここで提示されるプロトコルは、連想嗅覚記憶の形成の基礎となるプロセス、すなわちシナプス活性とその変化を生体内で監視する方法を示す。ショウジョウバエで利用可能な幅広い遺伝的ツールを使用して、決定された細胞集団および単一細胞において遺伝的にコードされたカルシウム指標を特異的に発現することが可能である。ハエを所定の位置に固定し、ヘッドカプセルを開くことで、嗅覚刺激を送りながらこれらの細胞のカルシウムダイナミクスを可視化することが可能です。また、ハエを同時に身体に感電させるセットアップを実演します。これは、ハエが古典的な嗅覚調節を受けることができるシステムを提供します - それによって、以前にナイーブな臭いが電気ショック罰に関連付けられていることを学ぶ - この臭いの表現と同時に(および他の訓練されていない臭い)は、2光子顕微鏡を介して脳内で観察される。私たちの研究室は以前に、蛍光カルシウム信号を前または後のコンパートメントに閉じ込めるシナプス的に局在するカルシウムセンサーの生成を報告しました。2光子顕微鏡は、微細な構造を空間的に解決する方法を提供します。我々は、昆虫脳の高次中心であるキノコ体からの情報を統合するニューロンに焦点を当てることによって、これを例示する。全体として、このプロトコルは、嗅覚学習の結果として活動が調節されるニューロン間のシナプス接続を調べる方法を提供する。

上記のプロトコルで取得した画像の例を図 2に示します。dホーマー-GCaMP3は、デンドライトがMB γ-ローブのコンパートメント1を内向するMB出力ニューロンで発現され(ニューロンはMVP228,29と呼ばれている)、スプリットGal4ラインMB112C16を使用して遺伝的に標的化される。また、細胞細胞細胞の細胞内局在化とシナプス後の局在性カルシウム指標の違いも実証されています。図2aと図2fを比較すると、dHomer-GCaMP3センサ14の具体的で区分された発現を、ニューロンの軸室に発現がなく、句読点が見える信号をはっきりと観察できる。樹状のコンパートメントで。クリア -低い振幅- 臭気応答は、d</em...

ここでは、ショウジョウバエの学習と記憶の文脈で、前および/または後のカルシウムを視覚化できるプロトコルを提示する。シナプス的に局在するカルシウムセンサを用いた生体内カルシウムイメージングでは、この種の連想学習の根底にあるシナプス可塑性が決定され得るように、古典的な嗅覚調節パラダイムと組み合わされる。

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. ...

この技術は、ショウジョウバエメラノガスターにおける学習および記憶形成の基礎となる細胞プロセスの生理学的パラメータとしてのシナプスカルシウム活性のリアルタイムでの観察を容易にする。連想トレーニングの前後の臭いに対する神経応答を比較することで、シナプス活性と個々のフルーツハエにおける記憶痕跡の形成との間に直接的な相関関係を引き出すことができます。特定の関心ニューロンが遺伝的にコード化されたカルシウム指標を発現するトランスジェニックフルーツハエを生成するには、所望のGAL4およびUAS構造を運ぶ女性と雄のハエを横切り、エクロセクション後3〜6日まで女性の子孫を老化させる。イメージング用のフライを準備するには、細かい鉗子を使用して、氷麻酔フライをカスタムで準備されたイメージングチャンバーに配置します。解剖顕微鏡を使用して、胸郭と脚をチャンバーの底部の電線に接触させ、頭部を平らに横たわらせます。明確な粘着テープでハエを所定の位置に固定し、外科的メスブレードを使用して頭の周りのテープの窓を切断し、アンテナを覆い、胸郭の大部分だけを露出させます。凹凸顎で保持されている昆虫ピンを使用して、青色光硬化接着剤で頭部の側面と背面を慎重に囲みます。そして、接着剤を設定するために青色の発光LEDランプを使用してください。接着剤が完全に設定されたら、ハエヘッドの後側表面から残留未硬化の接着剤を取り除き、リンガーの溶液の滴で頭の露出したキューティクルを覆います。非常に細かい刃の刺し傷ナイフを使用して、頭の後部を横切ってキューティクルを切り取り、オセリから始まり、各側の内側を目に切り取り、鉗子を使用して簡単に引き裂くことができるキューティクルのフラップを形成します。関心のある脳領域をブロックする可能性のある余分なキューティクルを取り除き、細かい鉗子を使用して気管の後ろ側表面を慎重にクリアし、脳組織自体の破壊を避けるように注意してください。必要に応じてリンガーの溶液を取り出してリフレッシュし、組織の破片の領域を取り除きます。そして、ハエの頭部から約1センチメートルの皮下臭の送出針を置き、気をつけて、アンテナへの臭いの送達を妨げるものは何もない。次に、画像チャンバーを皮下臭の送達針を介して臭気供給システムに接続します。そして、フライ10分が麻酔と手術から回復することを許可します。GFP ベースのカルシウムインジケーターの視覚化のために、赤外線レーザーと振動単離テーブルに取り付けられた水浸漬目的を搭載したマルチ光子顕微鏡のレーザーを 920 ナノメートルの励起波長に調整し、GFP バンドパス フィルターを取り付けます。コースZ調整ノブを使用して、脳のZ軸をスキャンして、対象の脳領域を見つけます。スキャン時間を最小限に抑えるために、目的の領域のみにスキャンを集中させるためにcrop機能を使用してください。そして、頭の前部が下向きになるようにスキャンビューを回転させます。次に、フレームサイズを 512 x 512 ピクセルに調整し、スキャンする領域を選択します。各フレームの計算されたスキャン時間を考慮して、少なくとも4つのヘルツのフレームレートを達成する。臭気誘発カルシウム過渡的可視化のために、画像取得ソフトウェアと臭気送達プログラムをリンクできる事前プログラムされたマクロパッケージを開始し、6.25秒間顕微鏡ソフトウェアで測定を開始してF0ベースライン値を確立します。臭気供給システムでは、特定の臭いカップバルブの開閉によって引き起こされるLEDの照明によってここに示される2.5秒の臭気刺激を提供する。臭いオフセットの終わりに記録の12.5秒が続きます。その後、同じ方法で第二および第三の臭気の配信を繰り返します。この設定で連想調整を行うために、コンピュータ制御の臭気供給システムを使用して、12 90ボルトの感電と一緒に60秒間、条件付き刺激プラス臭を提示します。60秒の休憩の後、電感電なしで60秒間、調整された刺激マイナス臭気を単独で提示する。トレーニングフェーズを終了した3分後に事前トレーニング臭刺激プロトコルを繰り返して、再びカルシウム一過性を誘発した後のトレーニング臭を測定する。その後、後でイメージ解析を行うために、イメージング ファイルを適切な形式で保存します。ここで代表的なキノコ本体出力ニューロン画像は、実証されるように取得が観察できる。ニューロンの軸索コンパートメントでは発現されないdHomer-GCaMP3センサーの特定の区画化された発現は、樹状コンパートメント内の句読点信号を示す。明瞭ではあるが、チトーソリックGCaMP6fを発現するハエと比較して、dHomer-GCaMp3を発現するハエでは低振幅臭応答が観察される。ここで、1つの個々のハエからの代表的なカルシウムトレースは、個々の調製物間で得ることができる騒音レベルと振幅の差異を示す。この技術は、細胞下レベルで視覚化する可能性、嗅覚表現がどのように変調され、コンディショニングを通じてメモリ相がどのように形成されるかを開いた。このような実験は、キノコの体のような複雑な脳構造の理解を深め、ニューロンの分布した集団全体でどのように連想記憶がどのように保存されているかを特徴付けるために不可欠です。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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