Name: FRET 기반 센서 ATeam1.03YEMK를 사용하여 마우스 뇌의 오르가노티픽 조직 슬라이스에서 세포 내 ATP 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: 배우세요 마우스 뇌 오르가노티픽 슬라이스에서 ATeam1.03 YEMK FRET 센서를 활용한 뉴런과 성상세포 내 ATP 동적 이미징 방법을. 이 기술은 살아있는 뇌 조직에서 에너지 대사를 연구하여 허혈성 뇌졸중과 같은 에너지 결핍 관련 질병의 병태기전을 이해하는 데 기여합니다.

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저자는 전문 기술 지원에 대한 클라우디아 로데리고와 시몬 듀리에게 감사드립니다. 니클라스 제이 게르카우 박사와 조엘 넬슨 M.Sc 오르가노티픽 슬라이스 문화를 준비하는 데 도움을 주신 것에 감사드립니다. 저자의 실험실에서 연구는 독일 연구 협회에 의해 투자되었다 (DFG; 2795년: Ro 2327/13-1 및 SPP 1757: Ro 2327/8-2 에서 CRR; 및 SPP 1757: RL에 젊은 Glia 스타트업 자금).

저자는 경쟁적인 이익을 선언하지 않습니다. 저자는 비디오 기사에 사용되는 악기를 생산하는 니콘 현미경 솔루션, 뒤셀도르프, 독일에 의해 오픈 액세스 출판을 가능하게 재정 지원을받았다. 이 회사는 여기에 제시된 실험이나 실행, 데이터 처리 또는 원고 작성에 관여하지 않았습니다.

여기서, 마우스 뇌의 골상세포 또는 뉴런에서 ATP 수준의 변화를 측정하기 위한, FRET 기반의 유전자 부호화나노센서(14)인ATeam1.03YEMK의세포형 특이적 발현에 대한 시술을 입증한다15. 예시적인 기록에서, 우리는 세포 외 칼륨 농도의 증가가 뉴런의 ATP 농도의 변화를 초래하지 않는다는 것을 보여주고, 성상 세포 ATP 수준은 이 조작에 응하여 상승합니다. 더욱이, 우리의 결과는 세포 대사의 억제시, ATeam1.03YEMK FRET 비율이 두 세포 유형 모두에서 급격히 감소한다는 것을 입증하여 세포 내 ATP의 급격한 감소를 나타낸다.
오르노티픽 슬라이스 배양물에서 ATeam1.03YEMK의 발현은 적어도 7-10일 동안 조절된 조건 하에서 배양중인 조직의 유지를 필요로 한다. 대안적으로, ATeam1.03YEMK는 또한 급성 으로 단리된 뇌 조직 슬라이스 및 마우스13,15의시신경에서 ATP의 측정을 위해 사용될 수 있다. 그러나 급성 으로 분리 된 조직에서 측정, 유전자 변형 동물의 생성 또는 뇌에 바이러스 벡터의 입체 응용 프로그램을 필요로, 동물 실험 및 엄격한 동물 관리 프로토콜을 포함. 이와 관련하여, ATeam1.03YEMK 발현은 오르노티픽 조직 슬라이스 배양에서 유용하고 가치 있는대안(22,23)을나타낸다. 몇 년 동안, organotypic 조직 슬라이스 배양은 신경 특성, 연결 성 및 개발24,25,26을연구하는 확립 된 모델 시스템으로 서용을 한다. 이들은 일반적인 조직 구조 및 적층(그림1)을유지할 뿐만 아니라 우수한 접근성 및 실험 조건의 직접 제어와 같은 세포 배양의 우대 특성을 숙주한다. Organotypic 조직 슬라이스 배양은 또한 바이러스벡터(27)를이용하여 외국 유전자를 발현하기 위해 일상적으로 사용된다. 바이러스 벡터의 몇몇 모형은 뇌 조직으로 종족을 전달하기 위하여 보고되었습니다16,28. 아데노바이러스 벡터는 신경교 세포에서 높은 발현을 유도하지만, 해마뉴런(16)은아니며, 신경교반응성(17)을생성할 수 있다. 여기서 사용되는 아데노-관련 바이러스 벡터는 좋은대안(15)으로등장하고, 그 효과는 또한생체내 29에서나타났다.
주로 신경 특성의 연구에 사용 되 고 하는 동안, 최근 연구는 organotypic 조직 슬라이스 배양 또한 성상 세포의 분석에 대 한 고용 될 수 있다 설립. 배양된 슬라이스는 일반적으로 반응성 성상 세포층 층(19,30)에 의해 커버되지만, 성상세포는 더 깊은층19,30(그림 5)에서보다 네이티브, 비반응성 형태 및 세포아키텍처를 나타낸다. 본 연구에서, 우리는 적절한 organotypic 조직 층 내에서 네이티브 성상 세포의 더 나은 실험 및 광학 접근성을 초래하는 외부 신경교 흉터의 기계적 제거를위한 절차를 설명합니다. 더욱이, 그것의 제거는 organotypic 조각의 더 깊은 층에서 발현 효험을 향상시킨다; 신경교 흉터가 제거되지 않으면 AAV에 의한 전이가 피상적 세포 층으로 제한되는 경향이 있습니다.
조직 조각에서 실험을 수행 할 때 몇 가지 외부 기계적 요인을 고려해야합니다. 목욕 관류 속도의 변화는 전체 준비의 움직임을 유도하거나 초점의 변화를 유도하여 센서 신호의 인위적인 과도 변화를 초래할 수 있습니다. 더욱이, 성상세포및 뉴런 모두 높은 관류율32,33에의해 부과되는 기계적 변형에 반응하는 것으로 보고되었다. 우리의 손에, 신뢰할 수있는 연동 펌프를 사용하여, 조직과 목표 사이의 식염수의 작고 안정적인 볼륨을 유지와 함께 (반월 상 연골) 여기에 사용되는 관류 속도에서 기준 선 조건 하에서 안정적인 FRET 신호 결과 (1.5-2.5 mL / 분; 그림 8).
본 연구에서, 우리는 또한 ATeam1.03YEMK를 가진 FRET 기지를 둔 화상 진찰이 뉴런과 성상 세포에 있는 ATP 수준을 감시하기 위하여 이용될 수 있다는 것을 보여줍니다. 세포 ATP의 측정을 위해 이전에 도입된 대안수단은 소위 루시페린-루시퍼라아제분석분석34,35,36,37이다. 그러나 이 접근법은 생물 발광의 이미징을 기반으로 하며 배경 소음 수준이 높기 때문에 다소 낮은 시간및 공간 해상도를 제공합니다. 최근 몇 년 동안 일상적으로 사용되는 또 다른 방법은 이온에 민감한 플루오로포레 마그네슘 그린38,39,40을이용하여 세포내 마그네슘 농도의 변화를 이미징하는 것이었다. 이 접근법은 ATP를 섭취하면 마그네슘의 공동 인자 방출이 초래한다는 관측과 관련이 있습니다. 마그네슘 녹색으로 이미징하면 ATP 수준의 변화에 대한 보조 추정치만 제공합니다. 또한, 마그네슘 그린은 세포내 칼슘의 변화에 민감하며, 이 방법으로 얻은 결과를 해석할 때 또 다른 어려움을 초래합니다.
세포 대사 산물의 직접 이미징을위한 유전자 부호 화 된 나노 센서의 최근 개발, 따라서, 앞으로 큰 단계를 나타냈다11,12. 세포내 ATP36,41, 42,43의측정에 사용할 수 있는 여러 개의 상이한 센서가 생성되었다. 그 중 에는 ATP:ADP 비율42를감지하는 PercevalHR뿐만 아니라 비율메트릭 형광 ATP 표시기 "QUEEN"(41)이 있습니다. 후자의 프로브는 세포의 에너지 상태를 연구하는 데 유용한 도구이지만 pH42의변화를 동시에 측정해야합니다.
ATeam은 여러 변종이 존재하는 나노 센서로 ATP14에대한 구속적 친화성이 다릅니다. 시험관내에서, ATeam1.03YEMK는 37°C에서 1.2 mM의 Kd를 나타내며, 이는 시상하부 및 소뇌34에서 해마37,44,45에이르는 상이한 뉴런 세포 유형에서 결정된 세포 ATP 수준에 가깝다. 큐벳 측정에서 온도를 10°C로 낮추면 ATeam1.03YEMK에서 ATP로의 결합 친화도가 현저하게 감소하여 실온14에서세포 이미징에 적합하지 않을 수 있음을 시사합니다. 그러나 우리의 이전 연구15는,다른 조작에 신경과 성상 세포에서 표현된 ATeam1.03YEMK의 행동 그리고 반응이 거의 생리적 및 실온에서 유사하다는 것을 보여주었습니다, 센서가 두 조건 하에서 세포 내 ATP 수준의 믿을 수 있는 측정을 허용한다는 것을 나타내는. 또한, 우리의 이전 실험은 세포내부발현ATeam1.03YEMK의 pH 민감도를 해결하되, 약 0.1-0.2 pH 단위로 세포내 pH의 변화에 민감하지 않음을 나타냈다. 낮은 mM 범위의 Kd가 우려되는 경우, 대체 ATeam 변형이14,그 중 ATeam ("GO-ATeam")의 적색 변종 ("GO-ATeam")의14를사용할 수 있습니다.
ATeam1.03YEMK를 사용한 실험은 세포외 칼륨 농도가 3mMM에서 8mM까지만 증가하면 Organotypic 슬라이스 배양에서 성상 세포에서 ATeam1.03YEMK 비율이 일시적으로 증가한다는 것을 보여줍니다. 이 관찰은 이전 연구15,46을 확인하고 명확하게 성상세포가 ATP 생산의 증가와 활성 뉴런에 의해 칼륨의 방출에 반응한다는 것을 나타냅니다, 대부분 가능성이 Na+/ K+-ATPase및 Na+HCO3의자극의 결과로- cotransporter, 각각47,48. 이와 는 대조적으로, 뉴런은 이전 작업뿐만 아니라15와일치하는 응답을 보여주지 않았다. 그러나 두 세포 유형모두, 15일이전에 도시된 바와 같이 세포 당해 및 미토콘드리아 호흡의 억제에 신속하고 강하게 반응한다. 화학 허혈의 조건에서, ATeam FRET 비율은 세포 ATP의 명목 고갈을 나타내는 새로운 안정 수준으로 떨어졌다. 후자의 결과 제안 두 신경 세포 뿐만 아니라 성상 세포 는 또한 시 냅 스 활성화 또는 신경 전달 물질의 응용 프로그램에 의해 추가 자극 없이 정상 상태 조건 하에서 ATP의 관련 소비를 전시. 종합하면, 우리는 유전자 인코딩 된 나노 센서를 가진 FRET 기반 이미징, 그 중 ATeam1.03YEMK,다른 조건하에서 세포 내 ATP 수준 및 세포 ATP 소비의 변화에 대한 책임이있는 세포 과정을 해명하는 귀중한 접근 방식을 제공 할 것이라고 결론을 내렸다.

뉴런의 흥분성 전기 적 활성은 주로 나트륨 (Na+) 및 칼륨 (K+)과같은 양이온의 플럭스에 기초합니다. 따라서 이 두 이온의 전기화학적 구배의 유지보수가 신호화에 필요합니다. 이는 세포 밖 공간에서 2 K+를 대가로 세포에서 3 Na+를 압출하는 유비쿼터스 발현 된 전기 제닉 트랜스 멤브레인 펌프인 Na+/K+-ATPase (NKA)에 의해 달성되며, 수송 주기 당 ATP의 한 분자의 소비를요구한다. NKA 이외에, 혈장 막Ca2+-ATPase를 포함하여 몇몇 다른 ATP 소모이온 수송기는, 세포내 Ca2+ 항상성 및 그 수출 에 필수적인 활동 유도한 유입2. 시냅스 소포에서, 공병형 H+-ATPase(v-ATPase)는 이 구획으로 신경 전달 물질 섭취에 필요한 양성자 구배를 생성한다3.
뉴런의 활성은 이렇게 상당한 양의 ATP4를필요로하지만, 그들은 에너지의 저장을위한 상당한 용량을 나타내지 않는다. 대신, 그(것)들은 두뇌에 있는 주요 글리코겐 저장인 이웃 성상 세포와의 신진 대사 상호 작용에 의존하는 것처럼 보입니다5. 그것은 성상 세포 글리코겐 실제로 신경 에너지 요구를 지 탱하는 데 중요 한 역할을 제안 되었습니다.; 그리고 두 세포 유형 간의 제안된 신경 대사 결합의 주요 현상은 신경 활성6,7,8에반응하여 ATP 생산을 증가시키는 성상세포의 능력이다. 성상 세포 -뉴런 락테이트 셔틀 (ANLS)으로 알려진이 가설은 여전히 논쟁의 여지가 있습니다, 다른 연구는 뉴런이자극에대한 응답으로 당해의 자신의 속도를 증가시킬 수 있다는 증거를 제공했기 때문에9,10,신경 - glia 상호 작용을 연구하는 추가 방법 및 접근의 필요성을 반영.
신경-glia 대사 상호 작용을 해명 하는 신경-glia 대사 상호 작용을 해명 하는 신경 및 성상 세포에서 세포 에너지 대사 및 ATP 수준의 조사 긴 뇌 조직에서 살아있는 세포에서 대사 산물 농도의 변화의 변화에 대 한 적합 한 프로브의 부족에 의해 방해 되었습니다. 그러나 지난 10년 동안 ATP, 젖산, 피루바테 및 기타11,12의센서를 포함하여 다른 대사 산물에 대한 새로운 도구 및 새로운 유전자 부화 형광 프로브의 개발에 급증을 제공했습니다. 이러한 도구를 이용하여, 이제 는 세포 ATP 소비와 관련된 질문을 직접 해결할 수 있으며, 단일 세포 수준에서 세포 형 특정 방식으로 세포 형 에너지 레벨의 변화와 관련된 문제를 그대로 뇌조직(13)으로해결할 수 있다.
본 작품에서, 우리는 뉴런과 배양 organotypic 뇌 조각의 성상 세포에 세포성 ATP 역학을 시각화하는 절차를 설명합니다. 우리는 몇주동안 세포 배양에서 유지될 수 있는 마우스 뇌의 뉴런 및 성상세포에서 유전자 부호분석된 ATP-나노센서 ATeam1.03 YEMK(14)의 세포형 특이적 발현을 위해 아데노 관련 바이러스 벡터(AAV)를 사용하는 방법을 보여준다. 배양 된 조직 조각을 덮는 신경교 흉터를 제거하는 방법에 대한 절차가 설명되어, 이는 광학 접근성및 아래 organotypic 조직 층에서 세포의 이미징을 향상시킵니다. 마지막으로, 우리는 ATeam1.03YEMK가 이 준비에 있는 세포 ATP 수준에 있는 변경의 FRET 기지를 둔 화상 진찰을 능력을 발휘하기 위하여 이용될 수 있는 방법을 보여줍니다. 이 방법은 외과적 뇌 시술을 필요로 하지 않는 주요 장점을 숙주하고, 배양된 뇌 슬라이스에서 센서 및 세포 유형 특이성의 높은 수준의 발현을 제공하며, 다른 바이러스 벡터와 전기천공 또는 형질전환과 같은 다른 방법과 비교하여 세포의 침습성 또는 스트레스를감소시키며, 10,16,17. 또한, 이 프로토콜은 ATP14에대해 낮은 결합 친화도를 제공하는 ATeam1.03의 변형들 중에서도 다른 FRET 기반 나노센서에 적용될 수 있다.

<table><tbody><tr><td>2-deoxyglucose</td><td>Alfa Aesar</td><td>L07338</td><td>Non-metabolizable glucose analog</td></tr><tr><td>36-IMA-410-019 Argon laser</td><td>Melles Griot</td><td></td><td>488 nm 파장 아르곤</td></tr><tr><td>아스코르브산</td><td>Carl Roth</td><td>3525.1</td><td>항산화제, 비타민 C</td></tr><tr><td>대역 통과 필터 483/32</td><td>AHF Analysentechnik AG</td><td></td><td>Splitter 호환 방출 필터</td></tr><tr><td>대역 통과 필터 542/27</td><td>AHF Analysentechnik AG</td><td></td><td>스플리터 호환 방출 필터</td></tr><tr><td>Beamsplitter T 455 LP</td><td>AHF Analysentechnik AG</td><td></td><td>여기 이색성 거울</td></tr><tr><td>Beamsplitter T 505 LPXR</td><td>AHF Analysentechnik AG</td><td></td><td>스플리터 이색성</td></tr><tr><td>컨포칼 레이저 scannig 현미경 C1</td><td>Nikon Microscope Solutions</td><td></td><td>모듈식 컨포칼 현미경 시스템 C1</td></tr><tr><td>데이터 처리 Origin Pro 9.0.0 (64-bit)</td> <td>OriginLab corporation</td><td></td><td>Scientific graphing and data analysis software</td></tr><tr><td>D-glucose monohydrate</td><td>Caelo</td><td>2580-1kg</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>GIBCO/Life</td><td>14190250</td><td>Dulbecco's phosphate-buffered saline</td></tr><tr><td>Eclipse E 600FN upright microscope</td><td>Nikon Microscope</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solutions Eclipse FN1 upright 현미경</td><td>Nikon Microscope Solutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>실험 챔버</td><td>라이브</td><td>셀 이미징을 위한 맞춤형 빌드</td><td></td> 관류 챔버</tr><tr><td>EZ-C1 Silver 버전 3.91</td><td>Nikon Microscope Solutions</td><td></td><td>컨포칼 현미경용 이미징 소프트웨어</td></tr><tr><td>Hanks의 Balanced Salt 솔루션</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9394</td><td>pH 모니터링용 페놀 레드</td></tr><tr><td>HERAcell 150</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>CO2 인큐베이터 HERAcell &reg; 150 with decontamination routine</td></tr><tr><td>HERAsafe KS/KSP</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Safety Cabinet</td></tr><tr><td>Horse serum</td><td>GIBCO/Life</td><td>26050088</td><td>Heat inactivated</td></tr><tr><td>Huygens Professional</td><td>SVI Imaging</td><td></td><td>Deconvolution software</td></tr><tr><td>Image J 1.52i</td><td>Wayne Rasban 국립 보건 연구소 (National Institute of Health</td><td></td><td>) 이미지 처리 소프트웨어 공개 도메인에서 사용 가능</td></tr><tr><td>인슐린</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6634</td><td>소 췌장에서 인슐린</td></tr><tr><td>IP 시리즈 연동 펌프</td><td>Ismatec</td><td></td><td>고정밀 다중 채널 펌프</td></tr><tr><td>레이아웃 소프트웨어, 일러스트 레이터 CS6</td><td>Adobe</td><td></td><td>Vector 그래픽 편집기</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>GIBCO / Life</td><td></td><td></td>25030024</tr><tr><td>Microm HM 650 V</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>진동 마이크로톰. Thermo scientific은 그 동안 장치의 생산을 중단했습니다. 살아있는 조직을 절단하기 위해 사용할 수 있는 다른 슬라이서 또는 조직 절단기도 괜찮습니다.</td></tr><tr><td>현미경 스테이지</td><td>사용자 정의 빌드</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel 16</td><td>기본 데이터 처리를 위한</td><td>Microsoft</td><td></td> 스프레드시트 소프트웨어</tr><tr><td>밀리셀 배양 삽입</td><td>Merck Millipore</td><td>PICM0RG50</td><td>친수성 PTFE, 기공 크기 0.4 &mu; m</td></tr><tr><td>최소 필수 매체 Eagle</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7278</td><td>합성 세포 배양 매체</td></tr><tr><td>모노크로메이터 폴리크롬 V</td><td>Thermo Scientific/FEI</td><td></td><td>초고속 스위칭 모노크로메이터</td></tr><tr><td>NaN3(아지드화나트륨)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-8032</td><td>미토콘드리아 억제제(복합 IV 억제제). 주의 : 아지드는 독성이 있습니다. 실수로 섭취하거나 흡입하지 않도록 주의하고 피부를 통한 중독을 방지하십시오.</td></tr><tr><td>Nikon Fluor 40x / 0.80 W DIC M &infin;/0 WD 2.0</td><td>Nikon 현미경 솔루션</td><td></td><td>수침 현미경 대물렌즈</td></tr><tr><td>NIS 요소 4.50 고급 연구</td><td>Nikon 현미경 솔루션</td><td></td><td>이미징 소프트웨어. FRET 이미징</td></tr><tr><td>ORCA-Flash4.0</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td></td><td>디지털 CMOS 카메라</td></tr><tr><td>관류 튜브</td><td>Pro Liquid GmbH</td><td></td><td>Tygon 튜브, 1.52 x 322 mm (Wd: 0.85)</td></tr><tr><td>Photoshop CS 6 버전 13.0</td><td>Adobe</td><td></td><td>이미지 처리 소프트웨어</td></tr><tr><td>Sodium L-lactate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71718-10G</td><td></td></tr><tr><td>ssAAV-2/2- hSyn1-ATeam1.03YEMK-WPRE-hGHp(A)</td><td>ETH Z&uuml; </td><td>human synapsin 1 promoter fragment hSyn1의 제어 하에 ATeam1.03YEMK의 발현을 유도</td>하는 rich <td>v244</td> Single-stranded AAV vector.</tr><tr><td>ssAAV-5/2-hGFAP-hHBbI/E-ATeam1.03YEMK-WPRE-bGHp(A)</td><td>ETH Z&uuml; 인간</td><td>신경교섬유산성 단백질 프로모터 단편 ABC1D의 제어 하에 ATeam1.03YEMK의 발현을 유도</td>하는 풍부한 <td>v307</td> 단일 가닥 AAV 벡터.</tr><tr><td>WVIEW GEMINI 광학 시스템</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td></td><td>방출 이미지 분배기</td></tr></tbody></table>

fret 기반 센서 ateam1.03yemk를 사용하여 마우스 뇌의 오르가노티픽 조직 슬라이스에서 세포 내 atp 이미징

Imaging of Intracellular ATP in Organotypic Tissue Slices of the Mouse Brain using the FRET-based Sensor ATeam1.03YEMK

중추 신 경계에서 신경 활동 (CNS) 아데노신 삼인산의 고장에 의해 제공 하는 세포 에너지에 높은 수요를 불러 일으킨다 (ATP). ATP의 큰 몫은 뉴런의 전기 신호에 의해 저하 플라즈마 멤브레인에 걸쳐 이온 그라데이션을 다시 설치하는 데 필요합니다. 성상 세포는 - 빠른 전기 신호를 생성하지 않는 동안 - 신경 활동에 응하여 ATP의 증가 생산을 겪고 그(것)들에게 에너지 대사 산물을 제공해서 활성 뉴런을 지원한다는 기록이 있습니다. 다른 대사 산물에 대한 유전자 부신 센서의 최근 개발은 이제 뉴런과 성상 세포 사이의 이러한 대사 상호 작용의 연구를 가능하게. 여기서, 우리는 아데노 관련 바이러스 벡터(AAV)를 사용하여 마우스 해마 및 피질의 오르노티피 조직 슬라이스 배양에서 ATP 민감성 형광 에너지 전달-(FRET-) 센서 ATeam1.03YEMK의 세포 형 특이적 발현에 대한 프로토콜을 기술한다. 또한, 우리는 이 센서가 세포 외 칼륨의 증가와 화학 적 허혈의 유도 (즉, 세포 에너지 대사의 억제)에 따라 뉴런과 성상 세포에서 세포 ATP 수준의 변화의 동적 측정을 위해 사용될 수있는 방법을 보여줍니다.

AAV 벡터는 살아있는 조직16내의 세포에서 외래 유전자를 선택적으로 발현하는 신뢰할 수 있는 도구이다. ATeam1.03YEMK 및 특정 프로모터의 서열 카세트를 함유하는 AAV의 직접 적용은 선택된 세포 유형에서 센서의 높은 발현을 초래한다. DIV 14 (전이 후 ~ 10 일) 인간 시냅신 프로모터 하에서 ATeam을 발현하는 뉴런은 슬라이스 표면 아래 최대 50 μm의 깊이에서 배양 된 조직 슬라이스의 신피질에서 고밀도로 발견됩니다(그림 5A). 비교 가능한 결과는 해마에서 달성될 수있다(도 5B).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60294/60294fig5a.jpg"> 그림 5: 배양된 기생충 뇌 슬라이스에서 ATeam1.03YEMK를 발현하는 뉴런의 시각화. 왼쪽의 이미지는 해마 조직의 피질조직(A)및(B)70개의 광학 섹션(각각 0.6 μm)의 43개의 광학 섹션(각 1.05 μm)의 확장된 초점 투영에 해당한다. 오른쪽 이미지는 동일한 투영의 볼륨 뷰를 나타냅니다. 셀은 오른쪽의 색상 축척에 의해 표시된 대로 슬라이스 표면을 기준으로 깊이에 따라 색상으로 구분됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60294/60294fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
성상 세포에서 ATP 수준의 측정을 위해, ATeam1.03YEMK는 인간 신경교 섬유성 단백질(GFAP) 프로모터의 제어 하에 발현된다. 이것은 배양된 조직 조각의 신피질 및 해마 둘 다에 있는 세포의 능률적인 transduction 결과(그림 6). 특히, 슬라이스 제제의 표면에 비해 깊이에 따라 두 개의 상이한 형태학적 표현형이 구별될 수 있다. 첫 번째, 표면 층에서, 세포는 주로 표면에 병렬로 배열되는 두꺼운 기본 프로세스를 특징으로한다. 이 세포는 명백하게 반응성 성상 세포의 조밀한 메쉬워크를 만드는 강하게 겹치는 도메인을 전시합니다(그림 6). 더 깊은 층 (표면에서 30-60 μm)에서, 트랜스 듀룩 성상 세포는 크게 구형 도메인을 형성하는 미세 한 세포 과정을 전시하고 그들의 형태는이전보고로 그 안에 성상 세포의 유사19,20, 21 (그림 6). 더 깊은 층 성상 세포의 더 나은 transduction을 얻기 위하여 는 이 더 깊은 층에 더 나은 광학 접근, 신경교 흉터 조직은 단계 4에서 기술한 것과 같이 제거될 수 있습니다.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60294/60294fig6a.jpg"> 그림 6: 배양된 기생충 성모 뇌 슬라이스에서 ATeam1.03YEMK를 발현하는 성상 세포의 시각화. 왼쪽의 이미지는 191개의 광학 섹션(각각 0.45 μm)의 확장된 초점 투영에 해당합니다. 그림의 목적을 위해, 신경교 흉터는 성상 세포의 투영에서 제외되었다. 오른쪽 이미지는 신경교 흉터를 제거하기 전과 후에 동일한 투영의 볼륨 뷰를 나타냅니다. 셀은 오른쪽의 색상 축척에 의해 표시된 대로 슬라이스 표면을 기준으로 깊이에 따라 색상으로 구분됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60294/60294fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
ATeam1.03YEMK의 성공적인 발현은 사용된 프로모터에 따라 뉴런 또는 성상 세포에서 ATP 수준의 변화의 동적 측정을 허용합니다(위 참조). 실험은 E-ACSF로 지속적으로 공류된 실험용 욕조에서 수행하였다(95%O2/5%CO2로버블링). 해마 뉴런에서 ATeam1.03YEMK를 발현하는 오르노티픽 슬라이스에서, 관심 영역(ROI)을 기록을 시작하기 전에 선택하였고, 피라미드 세포의 소마타를 나타내고(도7A). 또한 배경 빼기 영역이 선택되었습니다(그림7A). eCFP 형광뿐만 아니라 금성의 방출은 이들 각각의 ROI에 대해 별도로 수집된 후 시간에 따라 형광 방출 수준으로 도시하였다(도7B). 안정한 기준선을 보장하기 위해 몇 분 동안 조절 조건 하에서 형광을 기록한 후, 5 mM 나트륨 아지드(NaN3)를1분 동안 첨가한 포도당 프리 식염수에 슬라이스 제제를 노출시킴으로써 세포 대사를 억제하였다(도7B). 이러한 조작은 FRET 쌍의 방출 강도(도7B,좌측 패널)의 반대 변화, 금성(527 nm)의 감소 및 eCFP(475 nm) 방출의 증가와 함께 유도되었다. eCFP(F 금성/F eCFP)의 광석 방출을 eCFP(F금성/FeCFP)로나누어 FRET 비율을 계산하면 세포내 ATP 수준에서 상대적 변화를 반영하는 신호가 생성되었고, 소위 "ATeam FRET 비율"(그림7B,오른쪽 패널). 모든 기록된 뉴런(N = 70개의 N =5슬라이스의 세포)에서 NaN3는 세포 대사를 억제할 때 세포내 ATP 수치의 가역적 감소를 나타내는 ATeam FRET 비율의 가역적 감소를 일으켰다.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60294/60294fig7a.jpg"> 그림 7: 타임랩스 ATeam FRET 비율 이미징의 데모. (A)왼쪽 위: 뉴런에서 ATeam1.03YEMK를 발현하는 배양된 오르가노티픽 해마 슬라이스의 CA1 영역의 피라미드층 및 지층 라디툼의 광야 형광 이미지. 오른쪽 상단: 왼쪽에 표시된 대로 박스섹션의 확대보기입니다. 백색선은(B)에서분석을 위해 선택된 CA1 피라미드 뉴런의 세포체를 나타내는 관심 영역(ROIs) 1-3을 묘사한다. BG는 배경 보정을 위해 선택한 ROI를 나타냅니다. 아래: 금성(녹색), eCFP(보라색) 및 금성/eCFP의 비율을 나타내는 가짜 색 이미지. (B)신경 세포 체를 나타내는 ROIs 1-3의 시간 경과 기록(A참조). 좌측의 트레이스는 금성(녹색) 및 eCFP(마젠타)의 정규화된 형광 방출을 보여준다. 오른쪽의 트레이스는 해당 ATeam FRET 비율을 표시합니다. 1분 동안 세포외 포도당이 없는 상태에서 5 mM NaN3을 가진 관류는 ATeam FRET 비율의 가역적 감소를 유도하여 세포내 ATP 농도의 감소를 나타낸다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60294/60294fig7alarge.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
장기 실험 조건하에서 제제 및 센서의 안정성을 보장하기 위해, 뉴런 또는 성상 세포에서 ATeam을 발현하는 슬라이스는 장시간 ACSF와 지속적으로 관류하였다(&gt;50 분; n = 각 세포, N = 3개의 뇌에서 3개의 OTC). 이러한 조건하에서, ATeam FRET 비율은 변경되지않았다(그림 8). 대사 억제제("화학 허혈", 표 1참조)를 함유하는 CIS에 제제를 노출시키는 것은 대조적으로, 위에서 관찰된 바와 같이 ATeam FRET 비율의 예상 하락을 초래하였다.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60294/60294fig8a.jpg"> 그림 8: ATeam을 사용하는 기준선 실험. 뉴런 (상단) 및 성상 세포 (아래)의 기준선 조건 하에서 14 개의 다른 세포에서 장기 ATeam FRET 비율 이미징. 데이터는 다른 실험 데이터와 유사한 조건에서 촬영되었습니다. 각 측정의 끝에서, 화학 허혈은 화살표에 의해 표시된 바와 같이 CIS와 관류에 의해 유도되었다. 참고: 기준선 ATeam FRET 비율은 기준 선 조건하에서 시간이 지남에 따라 안정적입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60294/60294fig8large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
다음으로, 세포외 칼륨 농도의 증가로 ATeam1.03YEMK를 발현하는 뉴런및 성상세포의 반응을 분석했습니다. 안정한 기준선을 확립한 후, 뉴런은 칼륨 농도가 3분 동안 3~8 mM으로 증가시킨 식염수로 관과하여(도9A). 그러나 이 조작은 ATeam FRET 비율(N = 5개의 슬라이스에서 n = 56셀)에서 감지 가능한 변경을 초래하지 않았습니다. 센서가 ATP 수준의 변화에 반응하도록 하기 위해, 슬라이스는 CIS에 의해 E-ACSF를 대체하여 유도된 화학 적 허혈의 지속적인 기간에 다시 노출되었습니다. 화학적 허혈은 ATeam FRET 비율이 새롭고 안정된 수준으로 급격히 감소하여 2-3분 후 ATP의 명목 고갈을나타냅니다(그림 9A).
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60294/60294fig9a.jpg"> 그림 9: 뉴런및 성상세포에서 ATP 수준의 변화를 보여주는 대표적인 실험. (A,B):왼쪽의 이미지는 오르가노티픽 슬라이스의 해마 CA1 영역에 위치한 뉴런과 성상세포로부터 ATeam 형광을 보여줍니다. 오른쪽의 트레이스는 단일 세포 체 위에 위치된 ROI로부터 얻은 ATeam FRET 비율의 타임랩스 기록을 나타냅니다. 두 실험에서, 슬라이스는 먼저 세포외 칼륨 농도의 증가를 3분 동안 실시하였다(바 참조), 화학적 허혈에 대한 최종 노출. 뉴런이 세포외 칼륨(A)의상승에 반응하지 않는 동안, 성상 세포는 ATP(B)의증가와 함께 반응합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60294/60294fig9large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
동일한 실험 프로토콜은 ATeam1.03YEMK가 성상 세포로 표현된 슬라이스로 수행되었습니다. 뉴런에서 관찰된 것과는 대조적으로, 성상세포는 ATeam FRET 비율의 가역적 증가에 의해 세포외 칼륨의 증가에 반응하여, 세포내 ATP 수치의 증가를 나타낸다(N = 5슬라이스의 70세포)(그림 9B). 화학 적 허혈에 대한 후속 노출은 예상대로 ATeam FRET 비율의 큰 하락으로, 세포 내 ATP의 명목 고갈을 나타냅니다(그림 9B).

우리는 마우스 전뇌의 오르노티픽 슬라이스 배양에서 유전자 로 코딩된 FRET 기반 센서 ATeam1.03YEMK의 세포 형 특이적 발현에 대한 프로토콜을 기술한다. 또한, 우리는 뉴런과 성상 세포에서 세포 ATP 수준의 동적 이미징을 위해이 센서를 사용하는 방법을 보여줍니다.

FRET 기반 센서 ATeam1.03YEMK를 사용하여 마우스 뇌의 오르가노티픽 조직 슬라이스에서 세포 내 ATP 이미징

Neuronal activity in the central nervous system (CNS) evokes a high demand on cellular energy provided by the breakdown of adenosine triphosphate (ATP). A ...

여기서는 ATP에 민감한 FRET 센서 ATeam 1.03 YEMK를 사용하여 유기성 배양 마우스 해마 슬라이스에서 신경 및 성상세포 ATP 수준의 변화를 역동적으로 측정하는 방법을 시연합니다. 이 기술의 주요 장점은 제어 된 환경에서 살아있는 뇌 조직에서 에너지 대사를 연구 할 수 있다는 것입니다, 높은 센서 발현 수준을 가진 환경. 이 기술은 병원체 기계장치, 근본적인 질병, 또는 두뇌 손상, 예를 들면, 허혈성 치기 같이 에너지 박탈에 기인한 두뇌 손상에 통찰력을 얻는 데 도움이 될 수 있습니다.그것은 수 있습니다., 원칙적으로, ATP 수준을 공부 하는 데 사용할 수 있습니다., 뿐만 아니라 뇌 조직에서, 하지만 다른 장기에서 뿐만 아니라. 이 실험을 성공적으로 실행하려면 조직을 매우 신중하게 배양하고 불임을 유지하는 데 관련된 모든 단계를 수행하는 것이 필수적입니다. 더욱이, 세포 형광 화상 진찰의 몇몇 지식이 필요합니다.가장 정교한 접근 방식과 시각화의 조직 처리는 적절한 절차를 이해하는 데 필수적입니다. 이미징 실험도 마찬가지입니다. 절차를 시연하는 것은 포스트독인 로드리고 르춘디와 실험실의 석사 학생인 나 황이 될 것입니다.ACSF로 채워진 얼음 차가운 페트리 접시에 뇌를 필터 멤브레인에 놓습니다. 반구를 분리하고 45도 각도로 기생 절단을 수행합니다. 진동 조직 단계에서 한 반구를 슈퍼 접착제로 수정하고, 즉시 5 %의 이산화탄소와 95 %의 산소로 버블 얼음 차가운 ACSF를 포함하는 진동 욕조로 조직 블록을 전송합니다.진동 욕조의 조직을 정렬합니다. 슬라이스 할 때까지 얼음 차가운 ACSF에 두 번째 반구를 유지합니다. 진동을 조정하여 250~400마이크로미터의 슬라이스를 잘라냅니다.슬라이스를 절단 한 후, 전형적인 형태학적 외관에 따라 해마 형성을 식별하고 피하 바늘을 사용하여 분리하여 해마에 인접한 대뇌 피질의 일부를 유지합니다. ACSF의 메쉬에 슬라이스를 놓고 섭씨 34도까지 데워지고 모든 조각이 수집될 때까지 이산화탄소 5%와 산소로 거품을 낸다. 슬라이스를 라미나르 플로우 캐비닛으로 이송하여 멸균 조건에서 계속합니다.반전된 멸균 유리 파스퇴르 파이펫을 사용하면 ACSF의 슬라이스를 멸균 행크스 의 소금 용액으로 채워진 미리 따뜻하게 데운 페트리 요리 중 하나로 부드럽게 전달합니다. 파이펫을 변경하고 두 번째 문화 접시에 조각을 전송합니다. 전체적으로 프로세스를 다섯 번 반복합니다.가능한 한 적은 HBSS를 다음 문화 판으로 옮길 수 있습니다. 파이펫을 사용하여 배양 인서트의 상단에 한 번에 한 조각을 부드럽게 놓습니다. 파이펫의 난기류를 피하고 슬라이스가 파스퇴르 파이펫 끝으로 내려갈 때까지 기다립니다.각 슬라이스에 대한 프로세스를 반복합니다. 멤브레인에 두 조각을 놓습니다. 미세 팁을 사용하여 삽입 상단에서 초과 행크 용액을 조심스럽게 제거합니다.가습된 인큐베이터에 배양을 5%의 이산화탄소와 섭씨 37도로 유지하여 실험 당일까지 보관하십시오. 매 2 ~3 일마다 매체를 교체하십시오. 조직을 건드리지 않고 희석된 벡터의 0.5 마이크로리터를 각 슬라이스의 맨 위에 직접 적용하십시오.마지막으로, 조각을 인큐베이터에 다시 넣고 적어도 6 일 동안 보관하십시오. 실험을 시작하기 직전에 배양 된 조각을 포함하는 삽입을 멸균 후드에 옮기고 organotypic 슬라이스 배양 배지 1 밀리리터 또는 최소한의 필수 매체를 포함하는 30mm 접시에 넣습니다. 접시를 스테레오스코프 아래에 놓고 슬라이스 표면에 초점을 맞춥니다.두 개의 멸균 피하 주사바늘을 사용하여 선택한 슬라이스의 좁은 가장자리와 아래 조직을 손상시키지 않고 상부 층에서 짧은 교차 컷을 만듭니다. 인서트에서 준비된 슬라이스를 제거하려면 멤브레인의 가장자리를 핀셋으로 잡고 멸균 메스를 사용하여 멤브레인에 직선적이고 병렬로 절단하여 중앙에 슬라이스가 있는 사각형 또는 삼각형을 형성합니다. 인서트가 추가 조각을 호스팅하는 경우 원래 플레이트로 다시 전송하고 인큐베이터로 옮김합니다.매체의 표면 장력은 멤브레인의 표면에 누출되는 것을 방지합니다. 실험 ACSF를 준비하고 적어도 30분 동안 카보겐 공급에 연결된 삽입된 튜브를 통해 95%의 산소와 5%의 이산화탄소로 버블링하여 7.4의 pH를 얻을 수 있다. 전체 실험 중에 식염수 거품을 유지합니다.그런 다음 흑백의 형광원을 켭뜨꿉을 켭뜨꿉타. 조직형 슬라이스 문화를 실험 챔버로 옮킨다. 배양에 닿지 않고 프레임 아래로 오르가노티픽 슬라이스 배양 위에 격자를 놓고, 실을 위로 올려 멤브레인에 닿습니다.현미경 단계에 챔버를 놓고 관류 시스템에 연결합니다. 분당 1.5~2.5밀리리터의 유량으로 연동 펌프를 켭타보합니다. 관류 시스템의 누출이 없는지 확인하십시오.전송 광을 사용하여 배양 된 조각을 초점으로 가져 와서 실험이 수행되어야하는 영역을 식별하십시오. 이미징 실험을 시작하기 전에 적어도 15분 동안 기다렸다가 슬라이스가 식염수 조건에 적응한 다음 카메라와 이미징 소프트웨어를 전환할 수 있습니다. 435 나노미터에서 기증자 형광 단백질을 흥분시킵니다.노출 시간을 40~90밀리초 로 설정합니다. 그런 다음 이색 거울과 필터를 빔 스플리터 장치에 삽입합니다. 방출 영상 스플리터로 500 나노미터에서 형광 방출을 분할하고, 482 플러스 또는 마이너스 16 및 542 플러스 또는 마이너스 13.5 나노미터에서 밴드 패스 필터를 사용하여 기증자와 수용자 형광을 더욱 격리시합니다.배경 감산에 대한 셀룰러 형광이 없는 관심 영역을 선택합니다. 화면에 표시된 조직의 단일 구조를 원로하여 ROI를 만듭니다. 이미지 수집 빈도및 전체 녹화 시간을 설정합니다.30분 이상 실험을 할 경우, 광독성을 방지하기 위해 0.2~0.5Hertz의 획득 빈도를 권장합니다. 그런 다음 레코딩을 시작합니다. 세포 내 ATP의 변화를 유도하기 위해, 관혈관을 표준 ACSF에서 대사 억제제가 함유된 식염수로 전환합니다( 예: 화학허혈 용액).또는, 활성 뉴런에서 칼륨 이온의 방출을 모방 하는 8 밀리 머에서 높은 칼륨 농도와 식염수를 사용 하 여. 레코딩 직후, 실험 ACSF를 힙 버퍼링 ACSF로 교환합니다. 그런 다음 슬라이스 배양을 포함하는 기록 챔버를 공초점 레이저 스캔 현미경으로 이송한다.주어진 광학 구성에서 가능한 가장 높은 Z 해상도로 Z 스택 이미지를 가져옵니다. 이 프로토콜에서, 10일 후에, ATeam 1.03 YEMK를 표현하는 뉴런은 슬라이스 표면 아래 최대 50 마이크로미터의 깊이에서 배양된 조직 조각의 신혈구에서 고밀도에서 발견되었다. 유사한 결과는 해마에서 달성되었습니다.성상세포의 경우, ATeam 1.03 YEMK는 인간 신경교 섬유라리 산성 단백질 프로모터의 통제하에 발현되었으며, 선택된 ROI는 피라미드 세포의 소마타를 나타내는 해마 뉴런에서 ATeam 1.03 YEMK를 발현하는 조직화 슬라이스를 발현하였다. 1분 동안 세포외 포도당이 없는 상태에서 5 밀리몰라 나트륨 아지드에 슬라이스를 노출한 후, FRET 쌍의 방출 강도에서 반대의 변화가 유도되었다. ATeam FRET 비율의 가역적 감소도 관찰되었다.뉴런과 성상세포의 기준조건 하에서 14개의 다른 세포에서 장기 ATeam FRET 비율은 ATeam이 안정적이고 안정적인 센서임을 보여줍니다. 화학적 허혈은 이 실험이 끝날 때 두 세포 유형모두에서 ATeam 비율이 강해집니다. 세포외 칼륨 농도가 3~8밀리미터에서 3분 으로 증가하여 ATeam 1.03 YEMK를 발현하는 뉴런의 검출 가능한 변화를 초래하지 못했다.대조적으로, 성상 세포 칼륨의 증가에 반응 ATeam FRET 비율의 가역적 인 증가에 의해, 세포 내 ATP 수준의 증가를 나타내는. 다시 말하지만, 화학 적 허혈은 ATeam 비율이 즉각적인 감소를 일으켜 센서가 ATP의 변화를 감지 할 수 있음을 보여줍니다. 여기에 설명된 바와 같이 FRET 기반 세포 이미징을 시도할 때, organotypic 문화권에서 고품질 슬라이스의 생산이 중요한 단계라는 것을 명심하는 것이 중요합니다.또한, 신경교 흉터와 전문가 수준의 이미징을 주의 깊게 제거해야합니다. 이 절차에 따라, 하나는 또한 세포 대사 산물에 대 한 다른 다른 FRET 기반 나노 센서를 통합 하는 실험을 수행 할 수 있어야. 예를 들면, 포도당 또는 젖산을 위한 그.마지막으로, 동물 보호를 위한 관련 행위를 항상 준수해야 한다는 점을 강조해야 합니다. 이것은 또한 유전자 변형 된 유기체의 처리를 지배하는 효과적인 법률에 대한 사실이다.

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배우세요 마우스 뇌 오르가노티픽 슬라이스에서 ATeam1.03 YEMK FRET 센서를 활용한 뉴런과 성상세포 내 ATP 동적 이미징 방법을. 이 기술은 살아있는 뇌 조직에서 에너지 대사를 연구하여 허혈성 뇌졸중과 같은 에너지 결핍 관련 질병의 병태기전을 이해하는 데 기여합니다.

FRET 기반 센서 ATeam1.03^YEMK를 사용하여 마우스 뇌의 오르가노티픽 조직 슬라이스에서 세포 내 ATP 이미징

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