Name: 인간 줄기 세포 유래 내피 세포 및 GABAergic 뉴런에 대한 이동, 화학 적 매력 및 공동 배양 어세포 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: 배우세요 인간 줄기 세포 유래 내피 세포와 GABAergic 뉴런 간 이동 및 화학적 매력을 평가하는 세 가지 간단한 시험관 내 분석법을 통해 뇌 질환의 병인을 이해하는 방법을 알아보세요.

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이 작품은 국립 정신 건강 연구소 (R01MH110438)와 국립 신경 장애 및 뇌졸중 연구소 (R01NS100808)에서 AV에 대한 상을 지원했습니다.

1. 인간 심구 내피 내피 세포의 배양 및 저장
<ol><li>지하 막 매트릭스 코팅에 인간 상피 내피 세포를 유지 (재료의 표참조) 아구실 내피 세포 배지에서 6 웰 플레이트 (E6 배지 를 포함하는 50 ng/mL VEGF-A, 100 ng/mL FGF2 및 5 μM GABA) 37 °C 및 5%CO2. 매일 번갈아 매체를 변경합니다.</li>
	<li>4°C에서 지하 멤브레인 매트릭스를 해동하고, 차가운 DMEM/F12 배지에서 희석하여 1:100 용액을 만든다. 매트릭스 용액 1 mL로 6 웰 플레이트의 각 우물을 코팅하십시오. 사용 전에 적어도 1 시간 동안 37 °C에서 플레이트를 배양하십시오.</li>
	<li>인간의 피실 내피 세포가 80%-90%의 합류에 도달할 수 있도록 하십시오. 우물에서 배지를 흡인합니다. 우물 당 멸균 1x PBS 1 mL로 우물을 한 번 씻으소서.</li>
	<li>잘 당 1 mL의 세포 해리 액을 추가하여 세포를 분리합니다 (재료 표참조). 37°C에서 5분 동안 배양합니다. 5 분 후, 상피 내피 세포 배지 1 mL를 추가하십시오. 셀 용액을 15 mL 원엽 튜브로 옮김. 참고 : 우리는 섹션 3과 4에서 TrypLE반대로, 여기에 세포 해리에 대한 Accutase를 사용합니다.</li>
	<li>원심분리기 세포는 실온에서 5분 동안 5분 동안, 상월체를 흡인하고 상피내심 세포 배지의 1 mL에서 세포 펠릿을 재중단한다.</li>
	<li>trypan 파란색 제외 방법을 사용하여 라이브 셀을 계산합니다. 1.2 x 105 세포 /cm2의밀도로 신선한 매트릭스 코팅 플레이트의 종자 세포. 37 °C 및 5 %CO2에서배양하십시오.</li>
	<li>동결 배지에서 냉동 보존하여 인간 심상 외 피내피 세포를 저장합니다 (90 % 내피 내피 세포 배지 및 10 % DMSO).<ol>
<li>위의 1.3 단계 및 1.4 단계에 따라 세포를 해리하고 수집합니다. 트라이판 블루 배제 방법으로 용액의 셀을 카운트합니다.</li>
		<li>실온에서 5 분 동안 500 x g의 원심 분리전 세포. 상급체를 흡인하고 동결 배지의 5 x 106 세포 / mL에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다.</li>
		<li>냉동 배지 와 극저온 당 세포 1 mL을 분배하십시오. 바이알을 이소프로판올 충전 챔버에 놓고 1°C/min에서 -80°C에서 하룻밤 동안 식힙니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 분석에 대한 인간의 심실 내피 세포의 준비
<ol><li>인간의 피실 내피 세포가 70%-80% 동률에 도달할 수 있도록 하십시오.</li>
	<li>전술한 바와 같이 1.3~ 1.5단계에 따른 세포를 해리한다. 트라이판 블루 제외 방법을 사용하여 셀을 계산합니다.</li>
</ol>3. 분석에 대 한 인간의 GABAergic 인터뉴런의 준비
참고: 인간 유도 만능 줄기 세포(iPSC)-유래 GABAergic 인터뉴런 및 뉴런 배지를 상업적으로 구입하였다(물질표참조). 뉴런은 제조사에 의해 개발된 프로토콜에 따라 인간 섬유아세포 유래 iPSC 라인을 분화시킴으로써 생성된다. 세포를 해동하고 제조자의 프로토콜에 따라 배양하였다.
<ol><li>인간 GABAergic interneurons를 해동 하 고 70%-80%의 합류에 2 주 동안 12 잘 플레이트에서 그들을 배양.</li>
	<li>분석의 날에, 따뜻한 세포 해리 액 (재료 표참조) 및 사용 하기 전에 10 분 동안 37°C에서 신경 배지의 aliquot.</li>
	<li>세포를 함유하는 각각의 웰로부터 배지를 흡인한다. 잘 당 멸균 1x PBS의 1 mL로 세포를 씻어.</li>
	<li>웰당 0.5 mL의 미리 온화된 해리액을 첨가하여 세포를 분리하고 37°C에서 5분 동안 배양하였다. 15 mL 원엽 튜브로 셀 솔루션을 전송합니다. 세포 덩어리를 해리하기 위해 부드럽게 삼중화.</li>
	<li>원심분리기 세포는 실온에서 5분 동안 380 x g에서, 상월체를 흡인하고 1 mL의 뉴런 배지에서 세포 펠릿을 재중단한다. trypan 파란색 제외 방법을 사용하여 라이브 셀을 계산합니다.</li>
</ol>4. 분석에 대한 제어 인간의 내피 세포의 준비
참고: 제어 인간 iPSC 유래 내피 세포 및 내피 세포 배지를 상업적으로 구입하였다(표의 물질). 이러한 내피 세포는 제조자에 의해 개발된 프로토콜에 따라 인간 섬유아세포 유래 iPSC 라인을 내피 운명으로 분화시킴으로써 생성된다. 세포를 해동하고 제조자의 프로토콜에 따라 Fibronectin 기판상에서 배양하였다. Fibronectin 코팅 플레이트는 제조업체의 프로토콜에 따라 제조되었다.
<ol><li>해동 제어 인간 내피 세포및 배양 6-웰 플레이트80%-90%의 컨플루엔성.</li>
	<li>분석의 날에, 따뜻한 세포 해리 액 (재료 표참조) 및 사용 하기 전에 10 분 동안 37°C에서 내피 배지의 aliquot.</li>
	<li>세포를 함유하는 각각의 웰로부터 배지를 흡인한다. 잘 당 멸균 1x PBS의 1 mL로 세포를 씻어.</li>
	<li>웰 당 미리 온난화 된 해리 액0.5 mL를 추가하여 세포를 분리합니다. 실온에서 5 분 동안 배양. 해리 용액을 중화시키기 위해 잘 당 내피 세포 배지 1 mL를 추가하십시오. 15 mL 원엽 튜브로 셀 솔루션을 전송합니다.</li>
	<li>실온에서 5 분 동안 200 x g의 원심 분리전 세포. 흡위하 및 내피 세포 배지의 1 mL에서 세포 펠릿을 재중단한다. trypan 파란색 제외 방법을 사용하여 라이브 셀을 계산합니다.</li>
</ol>5. 원웰 컬쳐 인서츠 준비
<ol><li>실온에서 또는 4°C에서 하룻밤 동안 1 mg/mL 라미닌 용액을 해동합니다.</li>
	<li>0.01 % 폴리 L-오르니틴 용액 (접시 당 1 mL)으로 적절한 수의 35mm 접시를 코팅하십시오. 적어도 1 시간 동안 실온에서 접시를 배양하십시오.</li>
	<li>1 mg/mL 라미닌 용액 1:300을 멸균수에서 사용 직전에 3.3 μg/mL의 최종 농도로 희석하십시오.</li>
	<li>각 요리에서 폴리-L-오르니틴을 완전히 흡인합니다. 각 접시를 멸균수로 3배 철저히 헹구고 폴리-L-오르니틴 유발 세포 독성을 피하기 위해 완전히 흡인합니다.</li>
	<li>각 접시에 3.3 μg/mL 라미닌 용액 1mL를 넣고 밤새 37°C 또는 적어도 1시간 동안 배양하십시오. 참고: 또는 라미닌 함유 접시를 4°C에 보관하십시오. 사용하기 전에 37°C 세포 배양 인큐베이터에서 접시를 평형화하였다.</li>
	<li>2웰 실리콘 배양 삽입물의 1면의 3면을절단(도 1A)을이용하여 멸균 블레이드를 사용하여 원웰 인서트를 생성한다(도1B). 참고: 2웰 인서트를 원래 포장의 표면에 단단히 부착하고 절단하여 매끄러운 절단을 보장하고 인서트를 접착성을 보호합니다.</li>
	<li>접시에서 흡인 라미닌 용액. 참고 : 라미닌 배양 후 멸균 PBS 또는 물로 설거지 마십시오. 젖은 표면은 배양 삽입물의 단단한 접착을 방지합니다.</li>
	<li>멸균 핀셋으로 원웰 인서트를 제거하고 폴리-L-오르니틴/라미닌 코팅 접시의 중앙에 놓습니다. 인서트 가장자리를 따라 눌러 접시 표면에 고정합니다.</li>
	<li>접시를 거꾸로 뒤집어 서 인서트가 단단히 부착되었는지 확인하십시오.</li>
	<li>접시를 거꾸로 유지하고 초미세 팁이 있는 영구 블랙 마커를 사용하여 인서트 구획의 경계를 표시합니다(그림1C).</li>
</ol>6. 장거리 이주 분석
<ol><li>의 농도에서 인간의 GABAergic 인터 뉴런을 일시 중단 3 x 104 세포/70 신경 매체의 μL. 종자 70 μL의 세포 용액은 각 원웰 배양 삽입물 내부에 있다. 참고: 인터뉴런의 파종 밀도는 제조업체의 권장 사항에 따라 다수 입니다.</li>
	<li>인간 심상 외 외 외 피 세포의 농도에서 중단 3 x 104 세포/70 초심실 내 피 세포 매체의 70 μL. 종자 70 μL의 세포 용액은 각 원웰 배양 삽입물 내부에 있다. 참고 : 인간 심실 내피 세포의 수는 시드 뉴런의 수와 1 :1 비율로 시드.</li>
	<li>뉴런 접시에 1 mL의 뉴런 배지를 추가하여 삽입 주위 의 영역을 채우고 코팅이 건조되는 것을 방지합니다. 유사하게, 상피내피 세포 접시에 상피내피 세포 배지 1 mL를 추가합니다. 참고: 인서트가 방해받지 않도록 접시 가장자리를 따라 중간 을 천천히 추가합니다.</li>
	<li>현미경으로 확인하여 세포가 삽입 구획에서 새지 않는지 확인합니다.</li>
	<li>37°C 및 5%CO2에서24시간 동안 세포를 배양한다. 24 시간 배양 후 현미경으로 확인하여 세포가 제대로 부착되었는지 확인하고 밤새 누출이 없는지 확인하십시오.</li>
	<li>48시간 의 시딩 후 멸균 트위저를 사용하여 인서트를 부드럽게 제거합니다. 현미경으로 확인하여 세포층이 방해받지 않고 남아 있는지 확인합니다(0일째).</li>
	<li>뉴런 접시에서 배지를 제거하고 신선한 뉴런 배지 1 mL을 추가합니다. 유사하게, 피실 내피 세포 접시에서 배지를 제거하고 신선한 심실 내피 세포 배지 1 mL을 추가합니다. 참고: 필요한 수의 요리를 따로 떼어 놓고 0일 이미지에 대해 4% PFA로 수정하십시오.</li>
	<li>37°C 및 5%CO2에서5일 동안 세포를 배양한다. 5 일 후, 배지를 제거하고 10 분 동안 4 % PFA로 세포를 고정하고 1 x PBS로 3 x를 씻으하십시오.</li>
	<li>항인간 β-투불린 또는 항인간 MAP2 항체를 가진 스테인드 뉴런, 및 항인간 CD31 항체를 가진 내피 세포. 면역 염색이 끝나면 각 접시에 안티 페이드 장착 매체 1 mL을 추가하십시오.</li>
</ol>7. 공동 문화 이주 분석
<ol><li>공동 중단 3 x 104 GABAergic 인터뉴런 과 3 x 104 인간 심실 내피 세포 70 공동 배양 배지의 μL (GABA없이 50% 심낭 유지 매체 및 50% 신경 배지). 원웰 인서트를 내부로 이 셀 용액을 시드합니다. 적절한 수의 분석 요리를 준비합니다. 참고: GABA는 이동에 외인성 GABA의 효과 제외 하기 위해 공동 배양 매체에 추가 되지 않았습니다.</li>
	<li>현미경으로 확인하여 세포가 삽입 구획에서 새지 않는지 확인합니다.</li>
	<li>코팅이 건조되는 것을 방지하기 위해 접시 의 측면을 따라 1 mL의 공동 배양 매체를 천천히 추가하십시오. 참고: 인서트가 방해받지 않도록 접시 가장자리를 따라 중간 을 천천히 추가합니다.</li>
	<li>제1 대조군으로서, 종자 3 x 104 인간 GABAergic 인터뉴런은 1웰 삽입당 70 μL의 공동 배양 배지에서만. 그러한 요리의 적절한 수를 준비합니다.</li>
	<li>제2 대조군으로서, 공동 시드 3 x 104 GABAergic 인간 인터뉴런과 3 x 104 대조군 인간 내피 세포를 1-웰 삽입당 70 μL의 공동 배양 배지로 대조한다. 적절한 수의 요리를 준비합니다.</li>
	<li>37 °C 및 5 %CO2에서24 시간 동안 요리를 배양하십시오. 24 시간 배양 후 현미경으로 확인하여 세포가 제대로 부착되어 누출이 없는지 확인하십시오.</li>
	<li>48시간 의 시딩 후 멸균 트위저를 사용하여 인서트를 부드럽게 제거합니다. 현미경으로 확인하여 세포층이 방해받지 않았는지 확인합니다(0일째).</li>
	<li>중간 을 제거하고 신선한 공동 배양 매체 1 mL을 추가합니다. 참고: 0일차 이미지를 획득하기 위해 적절한 수의 요리를 따로 두십시오.</li>
	<li>37°C 및 5%CO2에서5일 동안 세포를 배양한다.</li>
	<li>5 일 후, 배지를 제거하고 10 분 동안 4 % PFA로 세포를 고정하고 1 x PBS로 3 x를 씻으하십시오.</li>
	<li>항-인간 β-투불린 또는 항인간 MAP2 항체로 염색하여 뉴런에 라벨을 붙인다. 면역 염색이 끝나면 각 접시에 안티 페이드 장착 매체 1 mL을 추가하십시오.</li>
</ol>8. 화학 매력 분석
<ol><li>멸균 핀셋을 사용하여 폴리 L-오르니틴/라미닌 코팅 된 35mm 접시의 중앙에 3 웰 배양 인서트를 놓습니다.</li>
	<li>접시를 거꾸로 뒤집습니다. 매우 미세한 팁이 있는 영구 검정 마커를 사용하여 인서트 의 중간 구획 주위의 경계를 표시합니다.</li>
	<li>종자 3 x 104 뉴런 배지의 중간 구획에서 인간 GABAergic 인터뉴런(그림 3A).</li>
	<li>종자104 인간 심낭 내피 세포는 각각 2개의 외부 구획에서 70 μL의 내피 세포 배지에서 내피 내피 세포 배지의 70 μL및 104 대조군 내피 세포의 70 μL에서 의 내피 세포의 70 μL에서 의 내피 내피 세포이다(도3A).</li>
	<li>접시 측면에 1 mL의 공동 배양 배지 (GABA없이 50 % periventricular 유지 보수 매체 및 50 % 신경 배지)를 추가하여 접시에 코팅이 건조되는 것을 방지합니다.</li>
	<li>현미경으로 확인하여 세포가 삽입 구획에서 새지 않는지 확인합니다.</li>
	<li>37°C 및 5%CO2에서24시간 동안 세포를 배양한다. 24 시간 배양 후 현미경으로 확인하여 세포가 제대로 부착되어 누출이 없는지 확인하십시오.</li>
	<li>48시간 의 시딩 후 멸균 트위저를 사용하여 인서트를 부드럽게 제거합니다. 현미경으로 확인하여 세포층이 방해받지 않았는지 확인합니다(0일째).</li>
	<li>중간 을 제거하고 신선한 공동 배양 매체 1 mL을 추가합니다. 참고: 0일차 이미지에 필요한 수의 요리를 따로 두십시오.</li>
	<li>37°C및 5%CO2에서36시간 동안 세포를 배양한다. 36 시간 후, 흡인 매체, 10 분 동안 4 % PFA로 세포를 고정하고 1x PBS로 3 x를 씻으하십시오.</li>
	<li>항인간 β-투불린 또는 항인간 MAP2 항체로 인간 GABAergic 인터뉴런을 염색한다. 염색 절차가 끝나면 각 접시에 안티 페이드 장착 매체 1 mL를 추가하십시오.</li>
</ol>9. 이미징 및 데이터 분석
<ol><li>면역 염색 분석 접시를 현미경으로 4배 배율로 놓습니다.</li>
	<li>직사각형 경계의 긴 모서리(위의 5.10단계에서 만든)를 뷰 필드에 유지합니다. 해당 경계에 인접한 셀 없는 공간에서 셀의 이미지를 가져다. 직사각형 경계의 오른쪽 긴 가장자리와 왼쪽 긴 가장자리를 따라 이미지를수집합니다(그림 2B). 참고: 사각형과 관련하여 대각선으로 배치된 셀은 시작 표시로 짧은 또는 긴 가장자리를 선택할 때 모호성으로 간주되지 않습니다. 또한 짧은 가장자리를 가로질러 이동하는 셀 의 수는 종종 현저히 적으며(짧은 가장자리를 따라 시작되는 셀수가 적기 때문일 수 있음) 고려되지 않습니다.</li>
	<li>ImageJ에서 이미지를 엽니다. ImageJ를 사용하여 각 셀과 경계 표시 사이의 거리를계산합니다(그림 2D).</li>
	<li>셀 번호 측면에서 마이그레이션을 평가하려면 ImageJ에서 획득한 이미지의 경계에서 특정 거리를 설정합니다. 이 거리 내에 있는 셀 수를 계산합니다. 적절한 소프트웨어를 사용하여 평균 수, 표준 편차 및 통계 적 유의를 계산합니다.</li>
</ol>

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<li>Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ability+of+polymorphonuclear+leukocytes+to+orient+in+gradients+of+chemotactic+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors.</a> Journal of Cell Biology. 75 (2), 606-616 (1977).</li>
<li>Zicha, D., Dunn, G., Jones, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+chemotaxis+using+the+Dunn+direct-viewing+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Analyzing chemotaxis using the Dunn direct-viewing chamber.</a> Methods in Molecular Biology. 75, 449-457 (1997).</li>
<li>Kim, B. J., Wu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+for+mammalian+cell+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Microfluidics for mammalian cell chemotaxis.</a> Annals of Biomedical Engineering. 40 (6), 1316-1327 (2012).</li>
</ol>

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

여기서, 우리는 함께 인간 심실 내피 세포 특이적 특성의 정량적 평가를 제공하는 3개의 시험관내 분석시험을 기술했다. 이 해약은 인간 interneurons와 인간 적인 심실 내피 세포의 상호 작용에 기계론적인 통찰력을 얻기에 귀중할 것입니다. 리간드, 억제제 또는 유전자 특이적 녹다운 또는 과발현을 가진 세포를 이용한 실험은 내피 세포 유도 된 세포 유도 인터뉴런 이동 또는 심실 내피 세포의 장거리 철새 특성을 중재하는 분자 플레이어를 식별하거나 검증합니다. 이 세포 시간 경과 마이그레이션 연구를 수행하기 위하여 이 고아학은 또한 수정될 수 있습니다. 또한, 인터뉴런 이외의 세포와 내피 세포의 상호 작용에 대한 증거가있다. 우리 그룹 및 다른 사람으로부터의 연구는 돌기 뉴런의 패터닝및 신경 전구체세포의증식에 대한 심실 내피 세포의 영향을5,14,15. 분석 설정...

내피 세포는 혈관의 안대기를 형성하고 혈관 벽 투과성의 유지 보수, 혈류 조절, 혈소판 응집 및 새로운 혈관형성을 포함하는 중요한 기능을 중재합니다. 뇌에서, 내피 세포는 단단히 뇌와 혈류 량 사이의 물질의 교환을 제어하는 중요한 혈액 - 뇌 장벽의 일부를 형성1. 지난 10 년간 우리의 연구는 두뇌 발달및행동2,3,4,5를위한 중요한 연루가 있는 두뇌 내피 세포의 새로운 신경성 역할을 확인했습니다 . 우리는 마우스 배아 전뇌가 해부학, 기원 및 발달 프로필2에서다른 혈관, pial 혈관 및 심실 혈관의 두 가지 별개의 특수형에 의해 혈관화되는 것으로 나타났습니다. 이 2개의 혈관 특수형을 일렬로 세우는 내피 세포는 그들의 유전자 발현 단면도에 있는 명백한 다름을 보여줍니다. 피알 내피 세포는 주로 염증 및 면역 반응과 관련된 유전자를 발현하는 반면, 내피 세포는 신경 발생, 신경 이동, 화학변증 및 축세포유도와일반적으로 연관된 유전자의 발현에서 유일하게 풍부하다. 심실 내피 세포는 또한 전통적인 신경 GABA 신호 통로에서 구별되는 새로운 GABA 신호 통로를 수용5. 그것의 유전자 발현과 수반, 상외 내피 세포는 개발 신피질에서 GABAergic 인터뉴런의 이동 및 분포를 조절하는 것으로 나타났다. 배아 발달 동안, 심실 내피 세포는 심실 혈관 네트워크2,3을확립하기 위해 복부 등쪽 구배를 따라 장거리 이동을 겪는다. 이 철새 경로는 하루 후 인터뉴런에 의해 미러됩니다. 인터뉴런을 이동하는 것은 미리 형성된 심실 혈관 네트워크와 물리적으로 상호 작용하고 신피질에서 최종 목적지에 도달하기 위한 가이드레일로 사용합니다. 물리적 기질로 작용하는 것 이외에, 상피내피 세포는 뉴런을 이동하기위한 탐색 단서의 소스 역할을합니다. 상피 내피 세포 분비 GABA는 인터 뉴런 마이그레이션을 안내하고 최종 분포 패턴을 조절4. 인터뉴런 이동 및 분포의 결함은 자폐증, 간질, 정신 분열증 및 우울증6,7,8,9,10과같은 신경 정신 장애와 관련이 있습니다. 따라서, 상복부 내피 세포 기능의 연구와 인간의 맥락에서 인터 뉴런 이동에 미치는 영향은 이러한 장애의 발병 기전을 해결하기위한 중요하게된다.
우리 실험실11에서인간 배아 줄기세포로부터 인간 심상외형 내피세포를 생성하였을 때, 유도된 만능 줄기세포(iPSC) 기술12,13을이용하여 생성하였다. 인간 심상외 외 피실 내피 세포가 마우스 심구 내피 세포를 충실하게 모방하는지 확인하고, 간 신경 세포 이동에 미치는 영향을 정량적으로 평가하기 위해, 우리는 세 가지 시험관 내 분석분석( 장거리 이동 분석, 공동 배양 이동 분석 및 화학 적 매력 분석)을 개발했습니다. 여기에서 우리는 이 분석에 대한 프로토콜을 자세히 기술합니다. 세 가지 모든 측정법은 실리콘 배양 인서트의 사용을 기반으로 세포가 없는 공간으로 둘러싸인 작은 직사각형 세포 패치(고정 치수)를 생성합니다. 마이그레이션 거리는 0일째에 설명된 직사각형 패치의 테두리로부터 셀의 최종 위치 사이의 거리를 측정하여 평가됩니다. 장거리 이동 분석에서, 인간 심실 내피 세포는 35 mm 접시의 중심에 패치로 시드되고, 오랜 시간 동안 세포에 의해 이동된 거리가 계산된다. 공동 배양 이동 분석에서, 인간 심실 내피 세포는 35 mm 접시에 하나의 패치로 인간 인터뉴런과 공동 시드된다. 이 설치는 interneurons의 이동의 비율에 이 두 세포 모형의 직접적인 물리적 상호 작용의 효력의 시험을 허용합니다. 화학 적 매력 분석 인간 심구 내피 세포에 의해 분비 된 화학 매력적인 단서에 대한 응답으로 인터 뉴런의 이동을 측정합니다. 인터뉴런은 직사각형 패치로 시드되고, 인간 심상 외 내피 세포와 함께 양쪽에 비슷한 크기의 패치로 시드된 비-심실 내피 세포를 제어합니다. 각 세포 패치는 500 μm의 세포 없는 간격에 의해 분리됩니다. interneurons의 반응은 비-periventricular 내피 세포를 대조하기 위하여 비교된 심실 내피 세포로 이동한 세포의 수를 정량화해서 평가됩니다.
이 해약은 인간 periiicular 내피 세포 기능및 interneuron 이동에 대한 그들의 영향의 강력한 평가를 제공합니다. 새로운 장거리 분석 및 공동 배양 이동 분석법은 센티미터(~1-1.5cm) 범위의 무세포 공간을 제공하여 장거리 이동을 감지할 수 있도록 합니다. 다른 인기 있는 어세이에 비해 당사의 검사의 특징에 대한 요약은 표 1에제시되어 있다. 집합적으로, 여기에서 기술된 계산은 정신 분열증, 자폐증 또는 간질 같이 두뇌 무질서의 iPSCs에서 생성된 "병든" 내피 내피 세포 및 interneurons를 평가하기 위한 발판으로 봉사할 것입니다. 이 계산은 또한 어떻게 다른 조건 (예를 들면 억제제, 리간드, RNAi)가 세포 이동에 영향을 미치는지 결정하기 위하여 이용될 수 있습니다. 마지막으로, 이 측정은 장거리 이동, 화학 적 인매력 또는 세포 매개 이동을 측정하기 위하여 그밖 세포 모형을 위해 최적화될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Accutase 해리 용액</td><td>Millipore Sigma</td><td>SCR005</td><td>세포 해리 용액 (뇌실 주위 내피 세포, 1.4 단계)</td></tr> <tr><td>항 인간 &beta; - Tubulin 항체</td><td>Biolegend</td><td>802001</td><td></td></tr><tr><td>항 human CD31 항체</td><td>Millipore Sigma</td><td>CBL468</td><td></td></tr><tr><td>항 MAP2 항체</td><td>Neuromics</td><td>CH22103</td><td></td></tr><tr><td>Anti-active Caspase 3 항체</td><td>Millipore Sigma</td><td>AB3623</td><td></td></tr><tr><td>제어 인간 내피 세포</td><td></td> 역학 <td>R1022</td><td></td></tr><tr><td>제어 내피 세포 매체 보충제</td><td>세포 역학</td><td>M1019</td><td></td></tr><tr><td>극저온 바이알</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-7Y</td><td></td></tr><tr><td>DMEMF/12 매체</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>E6 매체</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A1516401</td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>PHG0261</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>33016-015</td><td></td></tr><tr><td>냉동 용기</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>5100</td><td></td></tr><tr><td>GABA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2129</td><td></td></tr><tr><td>혈구계</td><td>시그마-알드리치</td><td>Z359629</td><td></td></tr><tr><td>인간 GAB인간 뉴런 세포</td><td>역학</td><td>R1013</td><td></td></tr><tr><td>인간 GAB인간 뉴런 기본 매체</td><td>세포 역학</td><td>M1010</td><td></td></tr><tr><td>인간 GAB인간 GAB인간 뉴런 신경 보충제</td><td>세포 역학</td><td>M1032</td><td></td></tr><tr><td>라미닌</td><td>시그마</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356230</td><td>기저막 매트릭스</td></tr><tr><td>마운팅 매체</td><td>벡터 실험실</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>폴리-L-오르니틴</td><td>Sigma</td><td>p4957</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>12563011</td><td>Cell dissociation solution (GABAergic interneurons 및 endothelial cells, section 3 and 4)</td></tr><tr><td>VEGF-A</td><td>Peprotech</td><td>100-20</td><td></td></tr><tr><td>VascuLife VEGF Medium Complete Kit</td><td>Lifeline Cell Technologies</td><td>LL-0003</td><td>Component of control human endothelial cell medium</td></tr><tr><td>2-well silicone culture-Insert</td><td>ibidi</td><td>80209</td><td></td></tr><tr><td>3-well silicone 배양 삽입</td><td>ibidi</td><td>80369</td><td></td></tr><tr><td>35mm 접시</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>15ml 원추형 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-886</td><td></td></tr><tr><td>4% PFA 용액</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ19943K2</td><td></td></tr><tr><td>6웰 조직 배양 플레이트</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-832-11</td><td></td></tr><tr><td>반전 위상차 현미경</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss Axiovert 40C</td><td></td></tr><tr><td>형광 현미경</td><td>Olympus</td><td>FSX-100</td><td></td></tr></tbody></table>

인간 줄기 세포 유래 내피 세포 및 gabaergic 뉴런에 대한 이동, 화학 적 매력 및 공동 배양 어세포

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

신경계 발달과 뇌 질환의 병인학에서 뇌 혈관의 역할은 점점 더 주목받고 있습니다. 우리의 최근 연구는 혈관 세포의 특별한 인구를 확인했다, 심실 내피 세포, 그 배아 발달 동안 전뇌 GABAergic 인터뉴런의 마이그레이션 및 분포에 중요한 역할을. 이것은, 그들의 세포 자율 기능과 더불어, 정신 분열증, 간질 및 자폐증 같이 신경 정신병학 무질서의 병리에 있는 심실 내피 세포의 새로운 역할을 암시합니다. 여기에서, 우리는 집합적으로 상피실 내피 세포의 기능 및 GABAergic interneurons와의 그들의 상호 작용을 평가하는 3개의 다른 시험관내 검문학을 기술했습니다. 이러한 검소의 사용, 특히 인간의 맥락에서, 우리는 심실 내피 세포와 뇌 질환 사이의 링크를 식별 할 수 있습니다. 이 어설션은 간단하고, 저렴하며, 재현 가능하며, 모든 부착 세포 유형에 쉽게 적응할 수 있습니다.

35mm 접시 내부에 원웰 배양 인서트를 설정하는 단계는 도 1에나와 있다. 장거리 이동 분석 및 공동 배양 이동 분석은 폴리-L-오르니틴/라미닌 코팅 된 35 mm 접시의 중심에 원하는 수의 세포를 시드하기 위해 원웰 인서트를 사용했다. 0일째에, 세포는 직사각형 패치로서존재하였다(도 2A,C). 0일 차 이미지에서는 셀 레이어의 날카로운 가장자리(그림2C의흰색 점선)로 일0 줄을 쉽게 식별할 수 있습니다. 48시간까지, 세포는 세포가 없는 공간으로 이동하였다(그림2B,D). 포스트 데이 0 이미지에서 인서트 주위에 그려진 검은 색 테두리 (접시 뒷면)는 검은 색 간격...

우리는 3개의 간단한 시험관내 분석-장거리 이동 분석, 공동 배양 이동 분석, 및 화학-유도 분석-인간 줄기 세포 유래 의 기능을 집합적으로 평가하는 시험관 내 외 내피 세포 및 그들의 GABAergic 인터 뉴런과 상호 작용.

인간 줄기 세포 유래 내피 세포 및 GABAergic 뉴런에 대한 이동, 화학 적 매력 및 공동 배양 어세포

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

이 프로토콜은 인간 심실 내피 세포의 기능과 인간 GABAergic interneurons와의 상호 작용을 종합적으로 평가하는 3개의 체외 분석서를 설명합니다. 이 assays에서 결과는 심실 내피 세포와 두뇌 무질서 사이 링크에 중요한 통찰력을 제공할 것입니다. 이러한 저법은 간단하고 저렴한 비용으로 다른 기존 에세이에 의해 달성되지 않는 센티미터 범위에서 세포 이동을 측정할 수 있습니다.GABAergic interneurons의 이주 및 분포에 있는 결점은 자폐증, 간질, 정신 분열증 및 불경기와 같은 정신 장애와 연관됩니다. 따라서, 이러한 장애의 발병을 해결하기 위해 인간의 맥락에서 GABAergic interneurons와 periventriricular 내피 세포의 상호 작용을 연구하는 것이 중요합니다. 분석에 대한 인간 세포를 준비하여 시작합니다.인간 대기실 내피 세포가 70~80%의 합류에 도달한 다음 원고의 지시에 따라 해리하여 trypan blue 배제 방법을 사용하여 계산하도록 허용합니다. 인간 GABAergic 인터뉴런을 준비하려면, 따뜻한 세포 해리 액스와 10 분 동안 섭씨 37도에서 신경 매체의 알리쿼트. 그런 다음 세포를 포함하는 각 우물에서 배지를 흡인하고 잘 당 PBS의 1 밀리미터로 씻어.우물당 0.5 밀리리터의 예온 된 해리 용액을 추가하고 5 분 동안 섭씨 37도에서 배양하여 세포를 분리하십시오. 인큐베이션 후, 잘 당 신경 매체의 1 밀리리터를 추가하고 15 밀리리터 원추형 튜브로 세포 용액을 전송, 부드럽게 세포 덩어리를 해리. 실온에서 5분 동안 380배 G의 세포를 원심분리하고, 슈퍼나탄을 흡인시키고, 뉴런 배지의 1밀리리터에서 세포 펠릿을 재연한다.그런 다음 trypan 파란색 제외를 사용하여 라이브 셀을 계산합니다. 세포 해리 용액과 내피 배지의 알리쿼트(aliquot)를 사용하기 10분 전섭씨 37도에서 따뜻하게 하여 인체 내피 세포를 조절할 수 있다. 각 우물에서 배지를 흡인하고 잘 당 PBS의 1 밀리리터로 씻어.각 우물에 예온 된 해리 용액의 0.5 밀리리터를 추가하고 5 분 동안 실온에서 플레이트를 배양하여 세포를 분리하십시오. 이어서, 내피 세포 배지의 1밀리리터를 잘 첨가하여 해리 용액을 중화시키고 세포를 15밀리리터 원뿔형 튜브로 이송한다. 세포를 5분 동안 200배 G로 원심분리하고, 수퍼나티를 흡인시키고 내피 세포 배지의 1밀리리터로 세포를 재연한다.그런 다음 trypan 제외 방법을 사용하여 셀을 계산합니다. 멸균 블레이드를 가진 2개의 잘 실리콘 배양 인서트의 1개의 웰의 3개의 쪽을 절단하여 하나의 웰 배양 인서트를 준비합니다. 멸균 핀셋으로 인서트를 제거하고 폴리 L-ornithine 및 라미닌 코팅 접시의 중앙에 배치한 다음 인서트의 가장자리를 따라 눌러 표면에 고정합니다.접시를 거꾸로 뒤집어 인서트가 단단히 부착되었는지 확인하고, 초미세 팁이 있는 영구 암시장을 사용하여 인서트 구획의 경계를 표시합니다. 70 마이크로리터 당 30, 000의 농도에서 신경 배지 및 인간 심실 내피 세포 및 내피 세포 배지에서 인간 GABAergic interneurons를 중단한 다음 각 음배양 삽입 내부의 세포 용액의 70 마이크로리터를 시드한다. 뉴런 배지 1밀리리터를 뉴런 접시에 추가하여 삽입 주변 영역을 채우고 코팅이 건조되는 것을 방지합니다.마찬가지로, 심실 내피 세포 접시에 내피 세포 배지 의 1 밀리리터를 추가합니다. 현미경의 밑에 세포를 확인하여 삽입 구획에서 누출되지 않는지 확인한 다음 섭씨 37도및 이산화탄소 5%에서 24시간 동안 배양합니다. 잠복 후 현미경으로 세포를 다시 확인하여 제대로 부착되었는지 확인하십시오.파종 후 48시간 후, 멸균 핀셋으로 인서트를 부드럽게 제거하고 현미경으로 세포를 확인하여 세포층이 방해받지 않고 남아 있는지 확인합니다. 뉴런과 심실 내피 세포 접시모두에서 배지를 제거하고 각 접시에 신선한 배지 1 밀리리터를 추가합니다. 세포를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 5일간 배양합니다.그런 다음, 매체를 제거하고, 세포를 4%PFA로 10분 동안 수정하고 PBS로 세 번 세척합니다. 공동 배양 분석법을 수행하기 위해, 30, 000 GABAergic 인터뉴런 및 30, 000 인간의 periventriricular 내피 세포70 마이크로리터의 공동 배양 배지를 중단한 다음 이 세포 용액을 하나의 잘 삽입 구획 내부에 시드한다. 48시간 후에 인서트를 제거합니다.5일 동안 공동 배양을 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 배양합니다. 인큐베이션 후, 배지를 제거하고, 4%의 PFA로 세포를 수정하고 PBS로 세 번 세척합니다. 화학 어트랙션 분석작업을 수행하려면 폴리 L-ornithine 및 라미닌 코팅 35mm 접시의 중앙에 3개의 웰 배양 인서트를 배치하고, 접시를 거꾸로 뒤집어 초미세 팁이 있는 영구 마커를 사용하여 인서트의 중간 구획 주위에 경계를 표시합니다.종자 30, 000 GABAergic interneurons 70 중간 구획에 있는 뉴런 배지의 마이크로 리터, 다음 씨앗 10, 000 periventriricular 내피 세포 와 10, 000 제어 내피 세포와 70 두 개의 외부 구획에 그들의 각각의 매체의 마이크로 리터. 접시 의 측면을 따라 공동 배양 매체의 1 밀리리터를 추가하여 접시의 코팅이 건조되는 것을 방지합니다. 48시간 후, 인서트를 제거하고 세포를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 36시간 동안 배양합니다.인큐베이션 후, 매체를 제거하고 세포를 수정하고 PBS로 세 번 세척합니다. 장거리 및 공동 배양 이동 소는 심실 내피 세포와 GABAergic 뉴런 사이의 상호 작용을 조사하는 데 사용되었습니다. 장거리 마이그레이션 분석에서 세포는 0일째에 직사각형 패치로 시작했지만 48시간으로 셀이 없는 공간으로 마이그레이션했습니다.세포사멸의 마커인 항활성 Caspase-3 항체를 사용하여 면역세포화학 염색은 종자 뉴런에서 세포사멸 신호를 보이지 않았다. 공동 배양 이동 분석에서 인터뉴런이 인간 심실 내피 세포와 공동 시드되었을 때, 뉴런은 인터뉴런이 단독으로 시드되거나 대조 내피 세포와 공동 시드될 때와 비교하여 더 먼 거리를 여행했습니다. 화학-어트랙션 분석에서, 내피 세포를 제어하는 것에 비해 심실 내피 세포를 향해 이동하는 인터뉴런의 수가 상당히 높으며, GABAergic interneurons가 대기실 내피 세포에 의해 분비된 화학 요법 매력적인 단서에 선택적으로 반응한다는 것을 확인합니다.이러한 분석안은 인간 간 신경 세포와 인간의 심실 내피 세포의 상호 작용에 대한 기계론적 통찰력을 얻기 위해 리간드, 억제제 또는 분석 아렌을 사용하여 수정될 수 있습니다. 그(것)들은 또한 우리의 단 및 그 외에 의해 보고된 것과 같이 그밖 신경 세포와 인간 심실 내피 세포의 상호 작용을 연구하기 위하여 이용될 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때, 접시에 삽입을 단단히 고정하고 분석 전반에 걸쳐 방해받지 않도록 유지하는 것이 중요하며, 그렇지 않으면 구그린 경계로 삽입물의 세포 누설, 세포 분리 또는 정렬 불량으로 이어질 수 있습니다.우리의 일은 정신 분열증, 간질 및 자폐증 같이 정신 장애의 병기에서 인간 심실 내피 세포의 세포 자율적인 역할을 표시했습니다. 이러한 assays는 그러므로 IPSC 기술을 사용하여 이 무질서를 가진 환자에게서 파생된 병든 심실 내피 세포의 평가를 허용할 것입니다.

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이 비디오는 뇌실주위 내피 세포(PVEC)의 화학인력 신호에 대한 반응으로 뉴런 간 이동을 테스트하는 방법을 보여줍니다. 인터뉴런은 중앙 구획에 배치되며, PVEC와 대조 세포는 양쪽에 있습니다. PVEC로의 이주가 증가하면 화학인력 신호에 대한 긍정적인 반응을 나타냅니다.

뇌실주위 내피 세포의 화학매력 신호에 대한 인터뉴런 반응 평가

개체 발생 과정 억제 GABA 성 시냅스의 형성을 좌표 공동 분자 메커니즘은 크게 알려져 있지 않다. 이러한 프로세스를 연구하기 위해, 우리는 기능 GABA의 수용체를 표현 안정적으로 형질 전환 된 인간 배아 신장 293 (HEK293) 세포와 함께 배양 한 배아 매체 가시 GABA 성 신경 세포를 통합하는 공동 문화 모델 시스템을 개발했다.

공동 문화 모델, 설립 GABA 성 중간 가시 신경 세포 및 HEK293 세포에서 억제 시냅스 형성 안정적으로 GABA를 표현 수용체

효율적인 심사 프로토콜 astroglial 분화 세포종 줄기 세포 (GSCs)에 홍보 하는 작은 분자의 식별을 위해 제공 됩니다. 분석 결과 줄기 세포 감 별 법 기자에 의하여 향상 된 GFP (eGFP)의 식을 인간의 GFAP 발기인에 의해 구동 됩니다 기반으로 합니다.

교류 Cytometry 기반 약물 세포종 줄기 세포의 세포 분화를 촉진 하는 작은 분자의 식별에 대 한 시스템 검사

여기, 양적 측정 마이그레이션 및 시간이 지남에 조건 하에서 여러 치료 세포종 뇌 종양 줄기 세포의 내 습을 라이브 세포 이미징 기술을 설명 합니다.

라이브 셀 이미징 분석 실험 연구 세포종 뇌 종양 줄기 세포 이동과 내 습을

여기서 우리는 인간 신경교종 세포(hGC) 이동을 실시간으로 연구하기 위한 전 생체내 혼합 단층 배양 시스템을 제시한다. 이 모형은 구획화된 약실 내의 hGCs와 myelinated 및 비 myelinated 축색둘다 사이 상호 작용을 관찰하는 기능을 제공합니다.

등쪽 뿌리 신경절 축삭-올리고젠드로시트 공동 배양에 대한 인간 신경교종 세포 이동의 실시간 모니터링

이 프로토콜은 인간 유도 만능 줄기 세포를 분화하여 얻은 뇌 미생물 내피 세포를 도출, 확장 및 냉동 보존하고, 전 생체 모델에서 혈액 뇌 장벽 특성을 연구하는 적응된 방법을 자세히 설명합니다.

인간 유도 만능 줄기 세포에서 뇌 미세 혈관 내피 세포의 파생, 확장, 냉동 보존 및 특성화

여기서는 패턴 뉴런에서 교모세포종(GBM) 마이그레이션을 분석하기 위해 사용하기 쉬운 공동 배양 분석을 제시합니다. 우리는 뉴런에 GBM 세포 마이그레이션의 쉬운 정량화를 위한 FiJi 소프트웨어에 있는 매크로를 개발하고, 뉴런이 GBM 세포 침습 용량을 수정한다는 것을 관찰했습니다.

이동 및 세포 상호 작용을 연구하기 위해 패턴 뉴런에 교모 세포 종 줄기 와 같은 세포의 공동 배양

최근 작품은 고급 소아 신경 교종에 신경 영향을 발견 (pHGG) 세포와 그들의 상호 작용. 본 작품은 생체 외 모델의 발달을 pHGG 세포와 글루타미터기뉴런과 기록하여 그 간 작용을 모방하였다.

글루타미터기뉴런과 소아 고학년 신경교세포의 공동 배양을 미세유체 장치로 결합하여 전기 적 상호 작용을 평가합니다.

배우세요 인간 줄기 세포 유래 내피 세포와 GABAergic 뉴런 간 이동 및 화학적 매력을 평가하는 세 가지 간단한 시험관 내 분석법을 통해 뇌 질환의 병인을 이해하는 방법을 알아보세요.

인간 줄기 세포 유래 내피 세포 및 GABAergic 뉴런에 대한 이동, 화학 적 매력 및 공동 배양 어세포

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