노화 뇌 수집, 처리 및 특성화를 위한 Abbiategrasso 브레인 뱅크 프로토콜
June 3rd, 2020
이 프로토콜은 뇌 기증 프로그램과 뇌의 적절한 특성을 통해 개별 뇌 노화 궤적을 추적하는 방법을 설명합니다. 두뇌 기증자는 연쇄 다차원 평가를 포함하여 장기 종방향 연구 결과에 관여합니다. 이 프로토콜에는 뇌 처리에 대한 자세한 설명과 정확한 진단 방법론이 포함되어 있습니다.
신경인지 장애 보급이 지속적으로 증가함에 따라, 우리의 목표는 정확한 진단을 달성하고 신경 퇴행성 메커니즘에 빛을 비추기 위해 양질의 뇌 조직 샘플을 획득, 특성화 및 저장하는 것입니다. 뇌 비대칭을 고려할 때, 당사의 샘플링 방법론은 반구 모두에서 조직학적으로 잘 정의된 조직에 대한 모든 메타 연구를 수행할 수 있게 하며 많은 데이터는 딥 러닝을 통해 수집되고 상관관계가 있을 수 있습니다. 여러 병리학에 의한 뇌 손상에 대한 첨가제 효과는 자주 관찰됩니다.
명확한 진단은 질병 병인을 발견하기 위하여 신경 병리학 사실 인정과 임상 증후군을 결합하고, 가능한 치료가 필요합니다. 새로운 절단 절차와 매크로 섹션 관리는 까다롭지만 좋은 결과를 달성하는 데도 필수적입니다. 훈련되고 단단한 팀은 이 어려움을 극복하는 데 매우 중요합니다.
우리의 프로토콜에는 포유류 손재주가 필요한 일련의 단계가 포함되어 있으므로 시각적 데모는 이러한 기술을 습득하고자하는 연구자를위한 설명 텍스트보다 더 유용 할 수 있습니다. 탄태법을 확인한 후, 날카로운 메스를 사용하여 한쪽면의 마스토이드 공정 끝에서 다른 쪽으로 관상 판에 모발 피부와 피하 조직을 통해 두피 절개를 하고 정점을 통과한다. 두개골에서 두피의 두 주름을 조심스럽게 분리하고 노란색 슈퍼 궤도 지방이 보일 때까지 절개를 계속합니다.
두피를 앞쪽으로 반사하고 조직의 다른 부분을 후방으로 당깁니다. 메스와 집게를 사용하여 두개골의 각 측면에 있는 측두근의 작은 샘플을 수확하여 한 표본을 4% 포름알데히드에 넣고 다른 샘플을 섭씨 4도에 넣습니다. 전동 톱을 사용하여 정면측의 V 컷에서 두개골을 자르고 두개골캡을 제거합니다.
수막을 절단 한 후, 고정을 위해 두라의 한 조각을 수확하고 다른 하나는 동결. 코퍼스 캘러섬을 통해 10 밀리리터 주사기에 부착된 20 게이지 3.5 인치 바늘을 삽입하여 세 번째 심실에 도달하고 플런저를 철회하여 뇌척수액의 약 10 밀리리터를 얻습니다. 유체의 외관 색상과 탁도를 평가하고 pH를 측정합니다.
뇌를 들어 올리고 두 시신경 인fundibulum, 내부 경동맥 및 세 번째, 네 번째, 다섯 번째 및 여섯 번째 두개골 신경을 모두 잘라 두 전두엽을 부드럽게 당깁니다. 분단을 잘라 후방 포사에 도달하고 척추 동맥과 낮은 두개골 신경을 잘라. 그런 다음 메둘라의 가장 많은 소들 부분을 잘라 조심스럽게 전체 뇌를 제거하기 위해 foramen 매그넘을 통해 가능한 한 깊은 메스를 삽입합니다.
메스를 사용하여 메켈의 동굴 위에 뼈에 나타나고 고정 및 동결을 위해 양쪽에서 개서리안 신경절을 수집합니다. 외과 말렛과 끌을 사용하여 뼈 셀라 포란카를 골절하고 4 % 포름알데히드에 고정하기 위해 뇌하수체를 제거하십시오. 두개골과 전체 뇌를 거시적인 변화및 혈관 변화에서 검사합니다.
측정 테이프를 사용하여 뇌의 횡방향 및 전방 자세 직경을 측정하고 뇌의 무게를 측정합니다. 해부학 적 변이체, 병변 또는 혈관 협착증의 존재에 대한 거시적 평가를 위해 윌리스의 원을 신중하게 검색합니다. 개별적으로 조직을 계량하기 전에 뇌원, 소뇌 및 뇌간을 분리하고 검사합니다.
1-2, 2~ 4센티미터의 렙토멘딩 조각을 대공에서 제거하고 완전한 고혈당 DMEM 배양 배지에서 샘플을 섭씨 4도에서 보존한다. 4%포름알데히드에 고정을 위해 송과선선수확을 하고 각 쌍의 고정 및 동결을 위해 후각 전구와 시신경을 제거합니다. 뇌경, 소뇌, 뇌간을 얼음 위에 섭씨 4도에 놓습니다.
관심있는 모든 조직이 수확되었을 때 뼈를 다시 부착하고 수술 바늘을 사용하고 흡수할 수없는 봉합사를 사용하여 두피를 다시 바느질하십시오. 뇌방제의 경우 해부 칼을 사용하여 뇌간을 축시 절단하고 우수한 콜리큘러스를 통해 로스트랄 중뇌의 수준에서 첫 번째 컷을 만들어 실질적인 니그라를 노출시키는 두 조각을 얻습니다. 뇌간을 10, 8밀리미터 슬라이스로 잘라내어 4차 심실의 우수한 여백 근처의 로스트랄 폰을 통과하는 컷을 포함하여 메딜라 외피를 관찰하고, 4구실의 열등한 저자극을 통해 네 번째 심실의 열등한 저자극을 통해 저세포를 통해 저자극제의 저자극을 통해 저세포를 포함한 저자극을 얻을 수 있다.
모든 슬라이스를 뇌간용 BS로 로스트랄 코골 방식으로 라벨을 붙인 다음 아랍어 숫자로 표시됩니다. 마지막 뇌간 섹션 후에, 아랍어 숫자 다음에 척수에 대한 지정 SC를 사용합니다. 처진 평면의 소뇌를 잘라 두 소뇌 반구를 vermis의 수준에서 분리하고 각 반구에서 5 개의 조각을 얻기 위해 처진 단면을 수행합니다.
vermis의 모든 조각을 오른쪽 및 왼쪽 소뇌에 대한 CBR 또는 CBL로 지정하고 아랍어 숫자를 사용하여 각 섹션을 식별합니다. 다음으로, 뇌의 두 반구를 궁정 평면의 코퍼스 캘로섬을 통해 분리한 후 전두엽 측두엽, 전방 수축기, 전방 교양, 전방 교양, 경미한, 기저 조직 의 핵을 통해 광학 치아즘과 매밀러 체사이의 관상 동맥 평면을 따라 단독으로 반구를 슬라이스합니다. 약 1센티미터 정도 의 두 번째 절단을 만들며 유방병대 몸을 지나기 위해 기저 신경망, 전방 시상, 편도체를 노출시하십시오.
각 반구에 대해 15~21센티미터 의 슬라이스를 얻을 때까지 전방 및 후방 영역을 해부하기 위해 계속 슬라이스합니다. 슬라이스를 평평한 표면에 배치하여 정면에서 후두극까지 전방 후방 방향으로 원래 위치를 따라 가며, 이전 슬라이드가 위쪽으로 향하는 부분이 연속됩니다. 모든 슬라이스가 배치되면 이전에 획득한 섹션과 해마, 정수리 및 후수 섹션을 포함하여 조직 병리학에 대해 고정할 주요 섹션을 선택하고 슬라이스가 고정또는 동결되어야 하는지 여부를 나타내는 라벨을 포함하는 아랍어 숫자로 슬라이스를 라벨로 표시합니다.
모든 조직이 단면화되고 레이블이 지정되면 고정 또는 동결 전에 각 일련의 섹션에 대한 이미지를 가져옵니다. 시료를 동결하려면 미리 냉동 된 알루미늄 트레이에 예약 된 대체 조직 섹션을 배치하고 평평하게 유지하기 위해 연동 알루미늄 플레이트로 섹션을 덮습니다. 그런 다음 액체 질소로 슬라이스를 3분 동안 얼리어린 시료를 해당 식별 코드와 슬라이스 번호로 표시된 비닐 봉지 내부에 넣고 80°C의 적절한 극저온 상자에 보관합니다.
샘플을 수정하려면 예약 된 대체 조직 섹션을 거즈의 개별 조각에 배치하고 섭씨 4도 의 차가운 방에서 5 일 동안 10 %인산염 완충 포어틴 용액에 슬라이스를 배치합니다. 수확된 27개의 두뇌 중 24개는 명확한 임상 병리학 진단을 가진 완전한 신경 병리학 특성증을 수신했습니다. 36명의 두뇌 기증자의 일련의 예비 정량적 뇌전도 분석은 일반적인 노인 경증 신경인식 무질서보다는 주요 신경 인식 무질서에서 주요 알파 리듬 비율이 현저하게 낮다는 것을 나타냅니다.
여기서 비대칭 병리학의 예는 왼쪽에 비해 오른쪽 관상 섹션에서 관찰된 심한 심실 팽창과 함께 명백한 매크로로 명백한 위축으로 표시됩니다. 또 다른 케이스는 오른쪽 반구의 경색을 표시하고, 다른 표본은 오른쪽 유방 병신체의 명확한 위축을 보여줍니다. 매크로 섹션은 반구 내의 모엘린 손실 또는 면역 반응성 분포를 식별하기 위해 염색될 수 있습니다.
이 견본은 후성 유전학및 환경 요인 때문에 다른 기간에 있는 알츠하이머 병의 임상 개시가 있던 쌍둥이에서 입니다. 그럼에도 불구 하 고, 현미경 분석 높은 알 츠 하이 머 병 병 병 및 아 밀 로이드 혈관 증을 나타내는 매우 유사한 신경 병 증 그림을 밝혀. 그러나 이 두 환자에서는 알츠하이머 병의 동일한 임상 진단이 신경 병리학적 특징과 정확히 일치하지 않았으며, 이는 다중 병인에서 치매 듀오를 드러냈다.
사실, 첫 번째 경우는 자이루스 단일 거짓말과 실질적인 니그라에 루이 시체를 제시했다. 그리고 두 번째 케이스는 편도체및 미성년자 핵에 있는 Lewy neurites와 관련되었던 Lewy 바디를 보여주었습니다. 슬라이스의 사진은 현미경 분석 중에 해부학 적 영역을 정확하게 식별하기 위해 신중하게 입니다.
단하나 슬라이스의 고정 및 동결은 또한 조직 미세 구조 Omics 유전자 활성화 및 단백질 분포의 지형을 보존하고 조직 병리학과 이 데이터를 상관연관하는 데 중요합니다. 잘 특징적인 조직에서 세포 배양, 또한 질병 병인에 대한 조사. 기득권 뇌 조직으로 항상 적절한 개인 보호 장비를 착용하는 것은 잠재적으로 전염성이 있는 것으로 간주되며 날카로운 계측기 및 액체 질소와 같은 위험한 도구의 사용이 필요하기 때문입니다.
개요
이 프로토콜은 뇌 기증 프로그램을 통해 개별 뇌 노화 궤도를 추적하는 방법을 개요하며, 뇌 조직의 적절한 특성화에 중점을 둡니다. 고품질 조직 샘플을 얻기 위한 포괄적인 처리 및 진단 방법론을 설명합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 신경퇴행성 메커니즘
- 뇌 노화
배경
- 신경인지 장애의 유병률이 증가하여 정확한 진단을 위해 고품질 뇌 조직이 필요합니다.
- 종단적 연구는 포괄적인 이해를 위해 다차원 평가를 활용합니다.
- 샘플링 방법론은 효과적인 메타 연구를 위해 뇌 비대칭성의 고려사항을 통합합니다.
- 복잡한 뇌 해부 과정을 탐색하기 위해 훈련된 팀이 필수적입니다.
연구 목적
- 신경퇴행성 질환을 진단하기 위해 뇌 조직을 특성화하고 저장합니다.
- 포괄적인 분석을 통해 질병 발병 메커니즘 및 잠재적 치료법을 탐색합니다.
- 뇌 조직 수확 및 보존을 위한 견고한 방법론을 확립합니다.
사용된 방법
- 이 프로토콜은 상세한 뇌 처리 및 보존 기술을 포함합니다.
- 다양한 뇌 영역의 조심스러운 해부 및 뇌척수액 수집을 포함합니다.
- 방법론은 뇌 처리 작업에 필요한 정밀도를 위해 훈련된 팀의 사용을 강조합니다.
- 연구자들 사이의 기술 마스터리를 향상시키기 위해 시각적 시연이 제안됩니다.
주요 결과
- 상세한 방법론을 통해 다양한 병리학을 통해 일관되고 고품질의 뇌 샘플 수확이 가능합니다.
- 이 프로토콜은 뇌의 해부학적 및 병리학적 변화에 대한 더 나은 이해를 촉진합니다.
- 임상 증후군 및 신경병리학적 소견의 통합이 명확한 진단을 위해 강조됩니다.
결론
- 이 연구는 신경퇴행성 질환의 진단 및 연구를 향상시킬 수 있는 효과적인 뇌 조직 특성화 프로토콜을 시연합니다.
- 이는 미래의 뇌 노화 연구를 위한 정밀한 수확 기술의 중요성을 강조합니다.
- 연구 결과는 뇌 건강 및 잠재적 치료 개입을 이해하는 데 중요한 함의를 가지고 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
This protocol supports target validation in neurodegenerative disease research by enabling histologically well-defined tissue collection from both hemispheres, facilitating mechanistic de-risking through correlated omics and pathology data. It enhances predictive confidence in preclinical models by providing neuropathologically verified human brain samples linked to longitudinal clinical and lifestyle data. The approach strengthens translational continuity by integrating ante-mortem phenotyping with post-mortem neuropathology, reducing biological uncertainty in target selection.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through direct comparison of frozen and fixed tissue from contralateral hemispheres for omics and histology alignment.
- Operational Value: Supports biological de-risking by providing neuropathologically confirmed tissue to validate target engagement and pathway modulation.
- Strategic Value: Improves target confidence by linking clinical syndrome with definitive neuropathological diagnosis, reducing false-positive target assumptions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares well-characterized brain tissue for biomarker assay development using histologically defined regions from both hemispheres.
- Operational Value: Enables assay standardization through reproducible tissue processing and fixed/frozen pairing for cross-platform validation.
- Strategic Value: Enhances screening readiness by supplying qualified human tissue for target-based and phenotypic screening cascades.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates disease-relevant system modeling by providing human tissue with matched clinical and neuropathological profiles for target validation.
- Operational Value: Supports preclinical continuity by allowing omics studies on histologically validated tissue, improving biomarker translatability.
- Strategic Value: Enables risk-adjusted advancement decisions through mechanistic de-risking using human-derived pathological and molecular data.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by supplying validated human brain tissue for target identification, assay development, and preclinical validation stages, particularly in neurodegenerative programs requiring pathological confirmation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling molecular analysis of histologically defined brain regions linked to clinical phenotypes.
- Screening: Enhances assay readiness through standardized tissue preservation and longitudinal donor data for reproducible biomarker measurement.
- Analytics: Generates quantitative neuropathological and omics readouts that enable cross-condition comparison and target prioritization.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical validation by providing human tissue with verified pathology, improving predictive modeling of target modulation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable tissue characterization pipeline for longitudinal neurodegenerative studies across multiple therapeutic programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity through neuropathologically verified human tissue.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via paired fixed/frozen processing and detailed labeling protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing pathological confirmation to de-risk targets before preclinical investment.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by integrating clinical, lifestyle, and neuropathological data for target validation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuroanatomy, neuropathology, and aseptic tissue handling for proper dissection and preservation.
- Depends on instrumentation including scalpels, saws, forceps, cryogenic storage, and formalin fixation systems.
- Necessitates cross-team standardization between clinical coordinators, neuropathologists, and molecular biologists for consistent data collection.
- Involves adaptation considerations for different brain regions and pathologies due to asymmetric disease distribution.
- Limited by geographic donor availability and resource intensity of longitudinal clinical assessment and neuropathological processing.
