Name: 세균성 윌트 질병의 간단한 유전 분석을 위한 랄스토니아 솔라나세아룸에 의한 접종에 이어 토마토 뿌리 변환 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: 배우세요 토마토 뿌리 변환 및 Ralstonia solanacearum 접종을 통한 세균성 윌트 질병의 유전 분석 방법을. 이 기술은 최소한의 장비로 신속한 유전자 조작이 가능하며 다른 작물에도 적용할 수 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

우리는 유용한 토론에 대한 마초 실험실의 모든 실험실 구성원, 통계 적 조언 알바로 로페즈 - 가르시아, 이 작업 중에 기술 및 관리 지원을 위한 신유 지안에게 감사드립니다. 우리는 형광 이미징에 대한 지원을 위한 PSC 세포 생물학 핵심 시설에 감사드립니다 이 작품은 중국 과학 아카데미의 전략적 우선 순위 연구 프로그램 (부여 XDB27040204), 식물 스트레스 생물학을위한 상하이 센터 (중국어)에 의해 지원되었습니다. 과학 아카데미) 및 중국 1000 인재 프로그램.

참고 :이 방법의 중요한 부분은 시험관에서 식물 재료를 처리하는 것을 포함, 따라서 DsRed 형광의 시각화를 포함하여 이러한 모든 절차 동안 멸균 조건을 유지하는 것이 중요하다. 모든 변형 과정에서 토마토 모종은 25-28 °C 및 16 h /8 h /8 빛 / 어두운 (130 μmol 광자 m-2s-1 빛)에서 자랍니다. 플레이트는 가스 교환 및 증발을 용이하게하기 위해 마이크로 포어 테이프로 밀봉됩니다.
1. 토마토 식물과 아그로박테리움 뿌리줄기의 준비
<ol><li>멸균 토마토 씨앗(Solanum lycopersicum cv. Moneymaker, LA2706, 토마토 유전학 자원 센터, TGRC) 5 % (v / v) 나트륨 하이포아 염소산염을 5 분 동안 씻어 증류수로 4-5 회 씻어 내고 세균을 촉진하기 위해 밤새 멸균 수에서 천천히 흔들리는 씨앗을 유지하십시오.</li>
	<li>토마토 씨앗을 자당없이 반 강도무라시게와 스쿠그 (1/2 MS) 배지로 옮긴다 (2.21 g/L MS, 8% w/v agar). 씨앗을 3일 동안 25-28°C에서 어둠 속에서 유지합니다(그림1A). 참고 : 각 구문에는 일반적으로 약 40 개의 씨앗이 필요합니다.</li>
	<li>오토 클레이브 8.5 cm2 정사각형 필터 용지. 정사각형 필터 용지를 1/2 MS 배지가 들어있는 9cm2 사각형 페트리 접시 안에 놓고 (한천 위에 종이를 놓습니다) 각 접시에 6 개의 발아 된 토마토 씨앗을 놓습니다(그림 1B). 마이크로 포어 테이프로 접시를 밀봉하고 3-4 일 동안 25-28 °C에서 발아 된 씨앗을 배양하십시오.</li>
	<li>아그로박테리움 뿌리줄기 유전자 MSU440을 식물 변형 2일 전 28°C에서 고체 LB 배지(적절한 항생제)에서 성장시다. 참고: A. 뿌리 줄기는 후안 안토니오 로페즈 라에즈 박사, EEZ-CSIC, 그라나다, 스페인에 의해 제공됩니다. 본 문서에 설명된 실험에서, A. pK7GWIWG2_II-RedRoot를 함유하는 근경유전자::CESA6 또는 빈 벡터를 대조군으로 사용하였다. pK7GWIWG2_II-RedRoot는 애기장대 유비퀴틴 프로모터(pAtUBQ10)에 의해pAtUBQ10구동되는 리포터 유전자 인 DsRed를함유하고 있으며, 스펙토마이신(50 μg/mL)에 대한 내성을 부여한다. 5전에 보고된 바와 같이 유전자 과발현을 위해 다른 벡터를 사용할 수 있다. 이 작품에서, SlCESA6 침묵에 대한 특이적 단편의 증폭은 토마토로부터 분리된 RNA를 이용하여 역전사(RT) PCR에 의해 수득되었고(S.lycopersicum cv. Moneymaker) 및 p-ENTR/D-TOPO 벡터로 결찰하였다(표1). 이어서, SlCESA6-RNAi 단편을 pK7GWIWG2_II-RedRoot 이진 벡터로 복제하였다.</li>
</ol>2. 식물 변환 및 선택
<ol><li>멸균 메스를 사용하여 토마토 모종의 파문과 하부의 바닥을 잘라냅니다(그림 1C,D).</li>
	<li>수확 A. LB 배지의 표면으로부터 바이오매스를 플라스틱 팁 또는 메스 블레이드를 사용하여 세균 바이오매스에 잘라낸 토마토 묘목을 조심스럽게 찍어 낸다(도1E).</li>
	<li>A. 뿌리 줄기로접종 한 후, 높은 습도를 유지하고 생존과 새로운 뿌리 개발을 용이하게하기 위해 2cm x 4cm 반원형 필터 용지(그림 1F)로토마토 모종을 덮습니다.</li>
	<li>변형 된 토마토 묘목을 6-7 일 동안 보관하십시오. 그런 다음 멸균 된 메스를 사용하여 새로운 새로운 털이 많은 뿌리를 자르고(그림 1G,H; 이 단계에서 뿌리는 아직 변형되지 않음) 모종에서 새로운 털이 많은 뿌리를 생성 할 수 있습니다.</li>
	<li>2세대 의 털이 많은 뿌리가 나타나면(그림 1I),모종 위에 있는 여과지를 제거하고, 다시 마이크로포공 테이프로 접시를 밀봉한다. 참고: 이 시점에서 변환 벡터에 DsRed 형광 마커가 있으면 새 루트의 변환 효율성을 시각화할 수 있습니다.</li>
	<li>DsRed 형광을 시각화하려면 생체 내 이미징 에 있는 식물을 위한 입체 현미경 또는 다른 장비를 사용하십시오(그림 1J). 양성 (적색 형광) 형질 전환 뿌리를 표시하고 멸균 메스를 사용하여 부정적인 비 형질 (적색 형광 없음)을 제거합니다.</li>
	<li>1/2 MS 배지를 포함하는 새로운 플레이트에 적색 형광을 나타내는 모종을 옮기고, 변형된 뿌리의 발달을 주 뿌리로 용이하게한다(도 1K). 같은 판에 적색 형광이 나타나지 않는 묘목을 보관하여 후기 시점에서 형광뿌리(도1L)의출현을 확인한다.</li>
	<li>항생제 선택에 기초한 대체 방법<ol>
<li>2.5단계에 대한 대안으로, 적절한 항생제로 1/2 MS 배지를 함유하는 반충전 9 cm2 정사각형 플레이트를 준비한다. 배지 없이 빈 공간을 생성하기 위해 준비 과정 동안 플레이트를 약 5° 기울게하고(그림 2A),항생제와의 접촉을 피하여 싹이 자라도록 한다.</li>
		<li>2.6단계의 대안으로, 제1 비형형 털뿌리를 절단한 후(단계 2.4), 뿌리 없이 모종을 적절한 크기의 여과지를 이용하여 반충전된 판으로 옮긴다(도2B). 참고 : 긍정적 인 대조군으로서 동일한 항생제 내성과 리포터 유전자를 포함하는 플라스미드로 여러 모종을 변형시키는 것이 좋습니다 (이 프로토콜에서 pK7GWIWG2_II-RedRoot; 카나마이신 50 μg / mL).</li>
		<li>단계 2.7에 대한 대안, 모종은 새로운 털이 뿌리를 개발하고 이러한 뿌리는 항생제 선택을 피할 수 있기 때문에, 필터 샌드위치 논문의 표면과 직접 접촉하지 않는 그 뿌리를 잘라 보자. 참고 : 항생제 효과로 인해 뿌리 발달은 항생제가없는 판보다 느릴 수 있습니다. 새로운 변형 된 털이 뿌리는 반 채워진 접시에 뿌리없이 모종을 옮긴 후 14-18 일 이내에 나타납니다 (단계 2.8.2)(그림 2C-E).</li>
	</ol></li>
	<li>2cm x 4cm 반원형 필터 페이퍼로 모종을 덮고 접시를 밀봉하고 모종을 배양하여 새로운 털이 많은 뿌리를 개발하게하십시오. 참고 : 항생제를 사용하여 A. 뿌리 줄기 유전자를 제거 할 필요가 없습니다. MS 배지 상의 필터 종이와 자당의 부족은 플레이트5상에 있는 A. 뿌리줄기유전자의 확산을 억제한다.</li>
	<li>첫 번째 루트 선택 후 5~7일 후에 선택 프로세스를 반복하여 변환된 새 루트를 선택하고 변형되지 않은 루트를 제거합니다. 변형된 뿌리를 포함하는 모종을 1/2 MS 배지를 포함하는 새로운 판으로 옮김.</li>
</ol>3. 접종 냄비로 옮기기
<ol><li>뿌리의 표면이 세균 접종에 노출 될 예방 접종 냄비를 준비 : 물로 접종 냄비를 흡수, 여분의 물을 부어, 플라스틱 심기 트레이에 배치합니다. 핀셋을 사용하여 접종 냄비에 변형 뿌리와 선택한 묘목을 전송(그림 3A).</li>
	<li>비닐 랩 또는 투명 뚜껑으로 트레이를 덮고 25-28 °C 및 65 % 습도 (16 시간 / 8 h 빛 / 어두운 130 μmol 광자 m-2s-1 빛)에서 보관하여 높은 수준의 습도를 유지합니다 그림 3B). 5~6일 후에 뚜껑을 제거합니다. 참고 : 변형 된 토마토 식물은 토양으로 옮김 후 2 ~ 3 주 동안 접종 할 준비가되어 있습니다(그림 3C). 토양에 성장 하는 동안, 토마토 식물 변환 되지 않은 새로운 뿌리를 생산할 수 있습니다. 이 현상의 정도를 결정하기 위해, 붉은 형광은 3 주 된 변형 된 토마토 식물의 뿌리에서 시각화되었습니다. 대부분의 뿌리 (80%-100%) 적색 형광이 나타났으며, 이는 실제로 변형되었음을나타낸다(그림 3D,E).</li>
</ol>4. 토양 흠뻑 예방 접종
<ol><li>28°C에서 28°C에서 궤도 셰이커(200 rpm)에서 피액배지(표 211)에서 R. 솔란사룸(이 프로토콜에서 균주 GMI1000)을 성장시다.</li>
	<li>600 nm(OD 600)에서 세균 배양물의600광학 밀도를 측정하여 세균 수를 결정한다. 0.1의 OD600에 물로 세균 배양을 희석 (여기서 사용되는 조건에서, 이것은 약에 해당 108 콜로니 형성 단위 [CFU]/mL).</li>
	<li>접종 트레이 (29cm x 20cm)에 변형 된 토마토 식물을 포함하는 16-20 접종 냄비를 놓습니다. 그림 4A).</li>
	<li>접종 냄비를 포함하는 트레이에 세균 접종 (OD600 의 0.1)의 300 mL (식물 당 ~ 15 mL)를 부어. 20분 동안 접종에 담그게한다(그림 4B).</li>
	<li>화분 토양의 층으로 새로운 트레이를 준비합니다. 접종된 냄비를 새트레이(그림 4C)에옮기고 트레이를 75% 습도, 26-28°C, 12시간 빛 및 12시간 암흑의 포토기간(130 μmol 광자m-2s-1광)으로 성장 챔버에 놓습니다.</li>
</ol>5. 감염 매개 변수 및 통계 분석의 결정
<ol><li>앞서 설명한 바와 같이 질병 증상을 점수매기기(12,,13)0(증상 없음)에서 4(완전한 wilting)(도4D-H)까지의척도를 사용하여, 2주 동안 랄스토니아 접종 후 매일. 참고: 질병 지수 데이터는 시간이 지남에 따라 동일한 실험 단위(각 식물)에서 수집됩니다.</li>
</ol>6. 유전자 발현 분석
참고: 표적 유전자의 이식유전자 또는 침묵의 발현은 RT-PCR 또는 정량적 RT-PCR(qRT-PCR)에 의해 결정될 수 있다.
<ol><li>샘플을 수집하고 형질전환된 루트 시스템의 대표적인 부분에서 RNA를 추출(표적 유전자에 미치는 영향을 평가하기 위해) 및 잎(내부 대조군으로서).</li>
	<li>총 DNase 처리 RNA의 1 μg를 사용하여 cDNA를 합성합니다.</li>
	<li>qRT-PCR에 의한 표적 유전자의 유전자 발현을 분석한다. 2-ΔΔCT 방법(14)을사용하여 상대 전사 수준을 계산하고, SlEFα-1을 하우스키핑유전자(15)로사용한다. 참고: 프라이머 시퀀스는 표 1에나열되어 있습니다.</li>
</ol>

<ol><li>Jiang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Wilt+in+China%3A+History%2C+Current+Status%2C+and+Future+Perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial Wilt in China: History, Current Status, and Future Perspectives.</a> Frontiers in Plant Science. 11 (8), 1549(2017).</li>
<li>Mansfield, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Top+10+plant+pathogenic+bacteria+in+molecular+plant+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+plant+pathology%22%5BJournal%5D)">Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology.</a> Molecular plant pathology. 13 (6), 614-629 (2012).</li>
<li>Elphinstone, J. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aElphinstone%2C+JG+%22The+current+bacterial+wilt+situation%3A+a+global+overview.+In%3A+Bacterial+Wilt+Disease+and+the+Ralstonia+solanacearum+Species+Complex%22">The current bacterial wilt situation: a global overview. In: Bacterial Wilt Disease and the Ralstonia solanacearum Species Complex</a>. Allen, C., Prior, P., Hayward, A. C. , American Phytopathological Society Press. St Paul, MN. 9-28 (2005).</li>
<li>Jones, J. B., Jones, J. P., Stall, R. E., Zitter, T. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJones%2C+JB+%22Compendium+of+Tomato+1094+Diseases%22">Compendium of Tomato 1094 Diseases</a>. , APS Press. St Paul, MN. (1991).</li>
<li>Ho-Plágaro, T., Huertas, R., Tamayo-Navarrete, M. I., Ocampo, J. A., García-Garrido, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+Agrobacterium+rhizogenes-mediated+transformation+of+tomato+suitable+for+the+study+of+arbuscular+mycorrhizal+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">An improved method for Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of tomato suitable for the study of arbuscular mycorrhizal symbiosis.</a> Plant Methods. 14, 34(2018).</li>
<li>Wydra, K., Beri, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+changes+of+homogalacturonan%2C+rhamnogalacturonan+I+and+arabiogalactan+protein+in+xylem+cell+walls+of+tomato+gentoypes+in+reaction+to+Ralstonia+solanacearum%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+and+Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Structural changes of homogalacturonan, rhamnogalacturonan I and arabiogalactan protein in xylem cell walls of tomato gentoypes in reaction to Ralstonia solanacearum.</a> Physiological and Molecular Plant Pathology. 68, 41-50 (2006).</li>
<li>Wydra, K., Beri, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+changes+in+methyl-ester+distribution+of+homogalacturonan+and+side+chain+composition+of+rhamnogalacturonan+I+as+possible+components+of+basal+resistance+in+tomato+inoculated+with+Ralstonia+solanacearum%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+and+Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical changes in methyl-ester distribution of homogalacturonan and side chain composition of rhamnogalacturonan I as possible components of basal resistance in tomato inoculated with Ralstonia solanacearum.</a> Physiological and Molecular Plant Pathology. 70, 13-24 (2007).</li>
<li>Hernández-Blanco, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impairment+of+cellulose+synthases+required+for+Arabidopsis+secondary+cell+wall+formation+enhances+disease+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Impairment of cellulose synthases required for Arabidopsis secondary cell wall formation enhances disease resistance.</a> Plant Cell. 19 (3), 890-903 (2007).</li>
<li>Denancé, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+wat1+%28walls+are+thin1%29-mediated+resistance+to+the+bacterial+vascular+pathogen%2C+Ralstonia+solanacearum%2C+is+accompanied+by+cross-regulation+of+salicylic+acid+and+tryptophan+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis wat1 (walls are thin1)-mediated resistance to the bacterial vascular pathogen, Ralstonia solanacearum, is accompanied by cross-regulation of salicylic acid and tryptophan metabolism.</a> Plant Journal. 73 (2), 225-239 (2013).</li>
<li>Digonnet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+route+of+Ralstonia+solanacearum+colonization+in+Arabidopsis+thaliana+roots+during+a+compatible+interaction%3A+focus+at+the+plant+cell+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Deciphering the route of Ralstonia solanacearum colonization in Arabidopsis thaliana roots during a compatible interaction: focus at the plant cell wall.</a> Planta. 236 (5), 1419-1431 (2012).</li>
<li>Sang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ralstonia+solanacearum+type+III+effector+RipAY+targets+plant+redox+regulators+to+suppress+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">The Ralstonia solanacearum type III effector RipAY targets plant redox regulators to suppress immune responses.</a> Molecular Plant Pathology. 19 (1), 129-142 (2018).</li>
<li>Remigi, P., Anisimova, M., Guidot, A., Genin, S., Peeters, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+diversification+of+the+GALA+type+III+effector+family+contributes+to+Ralstonia+solanacearum+adaptation+on+different+plant+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Functional diversification of the GALA type III effector family contributes to Ralstonia solanacearum adaptation on different plant hosts.</a> New Phytologist. 192, 976-987 (2011).</li>
<li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+assignment+to+positively+selected+sites+in+the+core+type+III+effector+RipG7+from+Ralstonia+solanacearum%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Functional assignment to positively selected sites in the core type III effector RipG7 from Ralstonia solanacearum.</a> Molecular Plant Pathology. 17, 553-564 (2016).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2-%CE%94%CE%94CT+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>León-Morcillo, R. J., Martín-Rodríguez, J. A., Vierheilig, H., Ocampo, J. A., García-Garrido, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Late+activation+of+the+9-oxylipin+pathway+during+arbuscular+mycorrhiza+formation+in+tomato+and+its+regulation+by+jasmonate+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Late activation of the 9-oxylipin pathway during arbuscular mycorrhiza formation in tomato and its regulation by jasmonate signalling.</a> Journal of Experimental Botany. 63 (10), 3545-3558 (2012).</li>
<li>Amrhein, V., Greenland, S., McShane, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retire+statistical+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Retire statistical significance.</a> Nature. 567, 305-307 (2019).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

랄스토니아 솔라나세아룸은 농업에 중요한 위협이 됩니다. 그러나, 농업 중요성의 자연 호스트와의 상호 작용은 여전히 제대로 다른 세균성 병원 체에 비해 이해, 특히 작물 식물 종에. 대부분의 경우, 유전 분석은 호스트 식물을 유전적으로 수정하는 데 필요한 시간과 비용에 의해 방해됩니다. 이러한 문제를 해결하고 토마토에 있는 R. solanacearum 감염의 유전 분석을 용이하게 하기 위하여, 우리는 토마토 뿌리의 아그로박테리움뿌리줄기-매개형형질에 기초한 쉬운 방법을 개발했습니다(그림1),토양 흠뻑 접종(그림 3). 형질전환된 뿌리는 형광 리포터(이 프로토콜에서 DsRed)를 사용하여 선택된다(그림1). 또한, 우리는 또한 비형질공중부분을 손상시키지 않는 항생제 선택에 기초한 대체방법을 개발하였다(도<strong class=...

Ralstonia solanacearum,세균성 wilt 질병의 인과 에이전트는, 감자, 토마토, 담배, 바나나, 후추 및 가지를 포함하여 식물 종의 큰 범위를 감염시킬 수 있는 세계적인 분포를 가진 파괴적인 토양 품어진 혈관 병원체, 그 외의 사이에서1,,2. 랄스토니아에 의한 수율 손실은 품종, 기후, 토양 및 기타 요인에 따라 토마토, 감자 또는 바나나생산의 80-90 %에 도달 할 수 있습니다3. 그러나, 랄스토니아 모델은 슈도모나스 주사기 또는 산토모나스 종과같은 세균성 식물 병원균을 포함하는 다른 모델과 비교하여 상당히 미개척이다. 추가적으로, 식물 미생물 상호 작용에 있는 대부분의 연구 결과는 모델 식물 애기장대 탈리아나에 집중됩니다. 비록 이러한 모델을 사용 하 여 연구는 크게 식물-박테리아 상호 작용의 우리의 이해에 기여, 그들은 작물 식물에서 이러한 상호 작용을 이해 하는 현재 필요성을 해결 하지 않습니다. 랄스토니아와 작물 식물 사이의 상호 작용을 이해하는 것을 목표로 연구는 세균성 wilt 질병에 맞서 싸울 수있는 지속 가능한 솔루션을 개발하는 데 필수적이지만 현재 상호 작용의 다른 구성 요소를 특성화하는 간단한 실험 분석의 부족에 의해 방해된다. 특히, 랄스토니아의천연 숙주인 토마토는 전 세계적으로 두 번째로 중요한 채소 작물이며 세균성 질병을 포함한 과다한 질병4의영향을 받습니다. 이 작품에서, 우리는 토마토의 랄스토니아 감염의 유전자 분석을 수행하는 쉬운 방법을 개발했다. 이 방법은 Agrobacterium 뿌리 줄기-중재 된 토마토 뿌리의 매개 형질에 기초하여, 선택 마커5로DsRed 형광을 사용하여, 그 결과 식물의 랄스토니아 토양 흠뻑 접종, 관심의 구성을 표현하는 변형 뿌리를 포함. 근형 형질분석법의 다양성은 RNAi에 의해 매개된 유전자 과발현 또는 유전자 침묵을 능력을 발휘할 수 있게 한다.
이 방법의 잠재적 제한은 변형되지 않은 뿌리의 잔류 성장에 있습니다. 이것은 플라스미드가 사용된 경우에 특히 중요합니다 형질전환된 뿌리의 선택을 허용하는 리포터 유전자가 결여됩니다. 이 문제를 해결하기 위해, 우리는 건강한 항생제 내성 형질전환 뿌리의 성장을 허용하면서 비 형질전환 뿌리의 성장을 억제하는 항생제 선택에 기초한 대체 방법을 개발했습니다. A. 뿌리 줄기 유전자는 싹의 변형을 유발하지 않기 때문에 항생제에 취약하므로 항생제 함유 배지와 분리되어 보관해야합니다.
랄스토아에 대한 식물 저항이 잘 이해되지 않지만, 여러 보고서는 세균 윌트6,7,7,8,,9에대한 향상된 저항에 세포벽 변경을 연관시켰습니다. 이러한 세포벽 변경이 혈관 발달에 영향을 미친다는 것이 제안되었으며, 이는 식물10내부의 랄스토니아 의 생활 방식에 필수적인 측면입니다. 애기장대에서 셀룰로오스 synthases CESA4, CESA7 및 CESA8을 코딩하는 유전자의 돌연변이는 이차 세포벽 무결성을 손상시키는 것으로 나타났으며, 이는 ABA신호8에연결된 것으로 보이는 랄스토니아에대한 향상된 저항성을 유발한다. 따라서, 우리의 방법에 대한 개념의 증거로, 우리는 SlCESA6의 RNAi 매개 유전자 침묵(Solyc02g072240),이차 세포 벽 셀룰로오스 synthase, 및 AtCESA8의 직교(At4g18780)를수행했다. 랄스토니아와 후속 토양 흠뻑 접종은 SlCESA6 침묵 세균성 시류 증상에 대한 저항을 강화 것으로 나타났다, 랄스토니아에 세포 벽 매개 저항가능성이 토마토에 보존 제안, 토마토 뿌리에서 세균 윌트 저항의 유전자 분석을 수행하는 우리의 방법을 검증. 여기에서는 이 방법을 자세히 설명하여 비교적 짧은 시간 및 장비 및 식물 성장 공간의 작은 요구 사항으로 세균성 질병을 이해하는 유전 적 접근법을 가능하게합니다.

<table><tbody><tr><td>90mm 정사각형 페트리 접시</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>한천 분말</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacto 펩톤</td><td>BD (Becton 및 Dickinson)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>카사미노 산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>여과지</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>In Vivo 식물 이미징 시스템 NightShade LB 985</td><td>Berthold Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>지피 냄비</td><td>지피 제품 국제 AS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>미세 기공 테이프</td><td>3M</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Murashige and Skoog medium (M519)</td><td>Phytotechlab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pindstrup 기판</td><td>Pindstrup Mosebrug A/S</td><td></td><td></td></tr><tr><td>메스 및 블레이드</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>차아염소산나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>멸균 클린 벤치</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>핀셋</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wahtman 종이</td><td>Wahtman International Ltd. 맥아 석</td><td></td><td></td></tr><tr><td>효모 추출 물</td><td>OXOID</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

세균성 윌트 질병의 간단한 유전 분석을 위한 랄스토니아 솔라나세아룸에 의한 접종에 이어 토마토 뿌리 변환

Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease

랄스토니아 솔라나세아룸은 광범위한 식물 종을 감염시켜 농업에 중요한 위협을 야기할 수 있는 파괴적인 토양 매개 혈관 병원체입니다. 그러나, Ralstonia 모형은 애기장대에있는 슈도모나스 주사기와 같은 세균성 식물 병원체를 관련시키는 그밖 모형에 비해 상당히 미개척입니다. 랄스토니아와 작물 식물 사이의 상호 작용을 이해하는 것을 목표로 연구는 세균성 wilt 질병에 맞서 싸울 수있는 지속 가능한 솔루션을 개발하는 데 필수적이지만 현재 네이티브 호스트 식물에서 상호 작용의 다른 구성 요소를 특성화하는 간단한 실험 분석의 부족에 의해 방해된다. 이 시나리오에서는, 우리는 토마토의 랄스토니아 감염의 유전 분석을 수행하는 방법을 개발했다, 랄스토니아의자연 호스트. 이 방법은 아그로박테리움 뿌리줄기-매개형질전환, 그 다음에 생성된 식물의 랄스토니아 토양-흠뻑 적시성 접종, 관심의 구성을 표현하는 형질전환 뿌리를 함유한다. 근형 형질분석법의 다양성은 RNAi에 의해 매개된 유전자 과발현 또는 유전자 침묵을 능력을 발휘할 수 있게 한다. 개념의 증거로, 우리는 RNAi 매개 토마토 뿌리에서 SlCESA6의 침묵이 랄스토니아에저항을 부여 것을 보여주기 위해이 방법을 사용 . 여기에서는 이 방법을 자세히 설명하여 비교적 짧은 시간 및 장비 및 식물 성장 공간의 작은 요구 사항으로 세균성 질병을 이해하는 유전 적 접근법을 가능하게합니다.

도 5는 SlCESA6(Solyc02g07240)를 대상으로 RNAi 시공체로 SlCESA6 변형된 뿌리를Solyc02g072240빈 벡터(EV)로 변형시킨 뿌리를 가진 토마토 식물의 질병 증상의 발달을 나타낸다. 질병 지수데이터(도5A)는0에서 4까지의 임의의 척도에 따라 시간에 따라 동일한 실험 단위(각 식물)로부터 수집되며, 가우시안 분포를 따르지 않고, 파라메트릭 데이터에 대한 표준 시험의 사용을 배제한다. 더욱이, 식민지 및 감염 역학 때문에 실험의 이 종류에 있는 본질적인 식물-식물 변이가 있습니다. 아래에서 우리는 랄스토니아 감염과 관련된 증상의 표현 및 통계 분석을위한 다른 방법을 고려했습니다.
<p class="jove_content" fo:keep-together...

여기에서, 우리는 세균성 wilt 질병의 연구 연구를 위한 간단한 유전 분석을 능력을 발휘하기 위하여 랄스토니아 solanacearum를 가진 접종에 선행된 토마토 뿌리 변환을 위한 다재다능한 방법을 제시합니다.

Ralstonia solanacearum is a devastating soil borne vascular pathogen that can infect a large range of plant species, causing an important threat to ...

이 프로토콜은 과학자들이 토마토에서 세균성 wilt 질병의 간단한 유전 분석을 수행 할 수 있기 때문에 중요합니다. 이 기술의 주요 장점은 유전자 발현 및 후속 검사의 조작이 단기간에 장비 및 식물 성장 공간의 작은 요구 사항으로 수행 될 수 있다는 것입니다. 이것은 방법이 매우 다재다능하며 병원체 접종 및 기타 생리적 검사를 수행하기 위해 다른 작물 식물에 적용 될 수 있습니다.체외에서 모종을 조작하는 동안 멸균을 유지하기 위해, 그들은 흐름 후드 의 외부에있을 때 플레이트를 닫아 유지하는 것이 중요하다. 이것은 쉬운 기술이지만 조작을 위해 여러 단계가 필요합니다. 이 방법의 시각화는 원고에서 설명하기 어려운 작은 트릭을 보는 데 도움이 될 것입니다, 자신의 실험실에서 방법을 구현하는 다른 연구자 도움.이 절차를 입증하는 데 도움이 아헨 자오, 대학원생이 될 것입니다. 토마토 씨를 살균하고 세척한 후, 자당없이 반강도 무라시게와 스쿠그 배지로 옮긴다. 3 일 동안 25 ~28도 사이의 온도에서 어둠 속에서 씨앗을 유지합니다.반강도 무라시게와 스쿠그 매체가 포함된 9평방센티미터 페트리 접시 안에 오토클레이브 8.5평방센티미터 의 필터를 놓고 각 접시에 발아 토마토 씨앗 6개를 놓습니다. 마이크로포어 테이프로 접시를 밀봉하고 발아 씨앗을 3~4일 동안 섭씨 25~28도에서 배양합니다. 식물 변환 전에 섭씨 28도에서 2 일 동안 적절한 항생제로 고체 LB 배지에서 Agrobacterium rhizogenes MSU440을 성장하십시오.멸균 메스를 사용하여 토마토 모종의 고체 코틸의 방광과 바닥을 자른다. 플라스틱 팁이나 메스 블레이드를 사용하여 LB 배지 표면에서 A.rhizogenes 바이오매스를 수확하고 박테리아 바이오 매스에서 잘라낸 토마토 묘목을 조심스럽게 담급하십시오. 그 후, 높은 습도를 유지하고 생존과 새로운 뿌리 개발을 용이하게하기 위해 2 센티미터 4 센티미터 반원형 필터 용지와 토마토 묘목을 커버.모종을 고습도 유지하게 하는 환경의 경우 발생이 가능합니다. 이렇게 하려면 모종을 필터 용지로 덮고 마이크로포어 테이프로 플레이트를 닫습니다. 변형된 토마토 묘목을 섭씨 25~28도의 온도로 성장 챔버에 6~7일 동안 보관하십시오.그런 다음 멸균 메스를 사용하여 새로운 털이 많은 뿌리를 자르고 모종이 새로운 털이 많은 뿌리를 생성 할 수 있게합니다. 새로운 털이 뿌리의 2 세대가 나타나면, 묘목 위에

tomato-root-transformation-followed-inoculation-with-ralstonia

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

세포가 스트레스 조건을 만났을때 반응 산소 종 수준이 상승하고 있습니다. 여기 3'-3 'diaminobenzidine의 염색법의 예제뿐만 아니라 산화 환원 프로테옴을 프로파일하기 위해 cysTMT 라벨 및 질량 분광법을...

동위 원소 태그 질량 분광법을 사용하여 Thiol 산화 환원 프로테옴 프로 파일링

출처: Hassan, JA, et al. Pseudomonas syringae pv에 대한 내성의 고처리량 식별.  묘목 홍수 분석을 사용한 토마토의 토마토. J. Vis. 경험. (2020).이 비디오는 박테리아 현탁액을 접종한 10일 된 묘목을 사용하여 다양한 토마토 균주에서 박테리아 내성을 스크리닝하는 방법을 보여줍니다. 박테리아가 기공을 통해 침입하고, 식물 면역을 억제하기 위해 이펙터 단백질을 전달하는 방법, 감수성 균주와 내성 균주 간에 식물 반응이 어떻게 다른지 설명합니다. 결과는 눈에 보이는 성장 차이를 관찰하여 평가되며, 저항성 식물은 건강하게 유지되고 취약한 식물은 조직 손상을 보입니다.

토마토의 박테리아 내성 스크리닝을 위한 묘목 홍수 분석

출처: Matthysse, A. G. 실험실에서 측정한 박테리아의 식물 표면 부착 현상. J. 비스캐스트 익스피스, (2018)이 영상은 야생형 및 셀룰로오스 결핍 병원성 박테리아에 의한 토마토 묘목의 뿌리 정착 측정 프로토콜을 시연합니다. 밀착된 박테리아의 유효한 개체 수는 야생형 균주에 의한 더 높은 부착력과 미세군집 형성을 보여주며, 셀룰로오스가 안정적인 뿌리 집락화에서 역할을 함을 강조합니다.

생존 세포 수를 이용한 병원성 박테리아에 의한 토마토 묘목의 뿌리 정착 평가

DNA 조립체를 사용하여, 여러 CRISPR 벡터가 CRISPR 다수의 구성을 하나 복제 반응에 병렬로 구성 될 수있는 간단한 작업 벡터. 토마토 털이 뿌리는 CRISPR 경로를 확인하고 돌연변이 물질을 생성 할 수있는 훌륭한 모델 시스템입니다.

토마토 털이 뿌리의 생성에 의한 높은 처리량 CRISPR 벡터 건설 및 DNA 수정의 특성

여기, 우리 감자 식물을 변환 하는 데 두 프로토콜을 제시. Agrobacterium tumefaciens 변환 Agrobacterium rhizogenes 야생 타입 촬영 자체 전파 될 수 있는 유전자 변형 털 뿌리를 생성 하는 동안 완전 한 유전자 변형 식물에 지도 한다. 우리는 다음 변환 된 뿌리에 얼룩이 지 거 스 여 발기인 활동 감지.

Agrobacterium tumefaciens 및 Agrobacterium rhizogenes-감자의 변환 중재와 거 스 얼룩에 의해 Suberin 유전자의 발기인 활동

모종 홍수 분석은 슈도모나스 주사기 박테리아에 대한 저항성을 위한 야생 토마토 접근물의 신속한 스크리닝을 용이하게 한다. 이 분석법은, 모종 세균 성장 분석과 함께, 박테리아에 대한 근본적인 저항성을 더욱 특성화하는 데 도움을 줄 수 있으며, 저항의 유전적 기초를 결정하기 위해 매핑 인구를 스크리닝하는데 사용될 수 있다.

슈도모나스 주사기 pv에 대한 저항의 높은 처리량 식별. 모종 홍수 분석을 사용하여 토마토토마토

이 프로토콜은 식물 뿌리에 토양 매개 미생물을 접종하는 전략에 대한 자세한 요약을 제공합니다. 진균 Verticillium longisporum 및 Verticillium dahliae에 대해 예시된 세 가지 상이한 뿌리 감염 시스템이 기술된다. 잠재적 응용 분야와 가능한 다운스트림 분석이 강조되고 각 시스템에 대한 장단점이 논의됩니다.

식물 뿌리를 토양 매개 미생물로 감염시키는 접종 전략

여기에서 우리는 형질전환 대두 털 뿌리의 고효율 생산을 위한 프로토콜을 제시합니다.

유전자 기능 분석을 위한 콩 털이 뿌리 형질전환

이 프로토콜은 표준화된 종자 표면 멸균과 통제된 발아를 결합하여 씨앗에서 묘목으로 전환하는 동안 토마토 씨앗 관련 미생물군을 재현 가능하게 합니다. 이 접근법은 건조 씨앗에서 과소대표되는 배양 가능한 미생물의 회수를 높이고, 초기 묘목 발달 중 비교 배양 연구를 지원합니다.

통제된 발아 및 비교 배양을 통한 토마토 씨앗 관련 미생물군 분리

여기에서는 플라스미드 접합에 관여하는 관심 유전자를 knockout하고 나중에 짝짓기 분석을 사용하여 그 부재의 영향을 분석하는 프로토콜을 제시합니다. 유전자의 기능은 결실 또는 점 돌연변이를 사용하여 염기서열의 특정 영역까지 더 탐구됩니다.

접합에 참여 전송 단백질의 서열 별 분석을위한 공역 결합 분석 실험

배우세요 토마토 뿌리 변환 및 Ralstonia solanacearum 접종을 통한 세균성 윌트 질병의 유전 분석 방법을. 이 기술은 최소한의 장비로 신속한 유전자 조작이 가능하며 다른 작물에도 적용할 수 있습니다.

세균성 윌트 질병의 간단한 유전 분석을 위한 랄스토니아 솔라나세아룸에 의한 접종에 이어 토마토 뿌리 변환

더 많은 동영상 탐색